Terapia genica

• Inibizione mirata dell’espressione genica per bloccare un processo patologico

• Distruzione mirata geneticamente di specifiche cellule• Supplementazione: fornire una copia funzionante del

gene difettoso• Sostituzione: sostituire il gene mutante con una copia

funzionante in situ

Supplementazione: fornire una copia funzionante del gene difettoso

• ex vivo: trasferire i geni clonati in cellule in coltura, selezionare le cellule, espanderle in vitro e poi immetterle nel paziente

• in vivo: trasferire direttamente i geni nel tessuto bersaglio o in circolo, facendo in modo che poi arrivi al tessuto bersaglio

ex vivo

Vettori non virali per la terapia genica

• Liposomi: vescicole sintetiche che si formano quando alcuni lipidi sono in soluzione acquosa. Possono essere anionici e circondano il DNA o cationici e legano il DNA all’esterno

• iniezione diretta di plasmidi o bombardamento del tessuto del DNA attaccato a pellets di metallo (biolistico). Il trasferimento è molto basso e il DNA non è integrato.

Liposomi

Virus per la terapia genica

• Retrovirus: sono ad RNA e sintetizzano cDNA che integrano casualmente nel genoma dell’ospite quando si dissolve la membrana nucleare (divisione cellulare)

• Adenovirus: sono a DNA e capaci di trasdurre ad alti titoli tutte le cellule, ma in forma episomale. E’ molto forte la reazione immunitaria. Morte di Jesse Gelsinger nel 1999

• Adeno-associati (AAV) hanno DNA a singola elica e si potrebbero integrare sul cromosoma 19q13 grazie al gene rep. Ma il 96% del genoma è deleto. Possono ospitare fino a 4.5kb

• Lentivirus: sono retrovirus specializzati che infettano anche le cellule non in divisione. Sono più complessi dei retrovirus e sono capaci di un’espressione a lungo termine.

Vettori virali per la terapia genica

  Genoma Stato Capacità Target

AAV Dna IntegratoEpisomal

4.7 kb D/ND

Adeno Dna Episomal < 36 kb D/ND

Retro Rna Integrato 8 kb D

Lenti Rna Integrato 8 kb D/ND

HSV Dna Episomal >50kb D/ND

AAV2

Virus Adeno-associato

Famiglia: ParvovirideGenere : DependovirusGenoma : DNAss 4.7kbBersaglio: Cellule in divisione e cellule non in divisioneStato : episomale/integrazione sito specifica su 19q13.3 Sierotipi : 10 AAV1-10

ITR

Rep Cap

ITR

Rep78

Rep68

Rep52

Rep40

VP1

VP2

VP3

AAV RICOMBINANTI

Plasmide Cis

ITR ITR

TRANSGENE

p5 p19 p40ITR ITRREP

TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb

CAP

Tripla trasfezione

HEK 293 cells(E1)

Trans

rep2 cappro

E2A E4 VAI

Adeno Helper

TransgeneITR2 ITR2

Cis

Produzione di vettori rAAV

rAAV

Pro pA

AAV2/1 (6)

AAV2/2 Rep 2 Cap 2

ITR 2ITR 2

AAV2/5 Rep 2 Cap 5

ITR 2ITR 2

AAV2/3 Rep 2 Cap 3

ITR 2ITR 2

AAV2/7 Rep 2 Cap 7

ITR 2ITR 2

AAV2/4 Rep 2 Cap 4

ITR 2ITR 2

AAV2/8 Rep 2 Cap 8

ITR 2ITR 2

Cap 1ITR 2ITR 2

Rep 2gene terapeutico

rAAV Pseudotipizzati

DIFFERENZE TRA SIEROTIPI AAV 1-8

RECETTORIRECETTORI

AAV2 AAV2 FGFR1,EPARINAFGFR1,EPARINA

AAV4AAV4

Ac.SIALICOAc.SIALICO

AAV5 AAV5

PDGFR, Ac.SIALICOPDGFR, Ac.SIALICO

TROPISMOTROPISMO

AAV1AAV1 Muscolo,retina Muscolo,retina

AAV2 AAV2 Muscolo,fegatoMuscolo,fegato

AAV4AAV4 Cervello Cervello

AAV5AAV5 Cervello,polm. Cervello,polm.

AAV6 AAV6 Muscolo,retinaMuscolo,retina

AAV7AAV7 Muscolo,fegato Muscolo,fegato

AAV8AAV8 Fegato Fegato

PROTEINE CAPSIDE

ANTIGENICITA’

•Infezione di cellule in divisione e non in divisione

Vantaggi

Svantaggi

•Produzione di anticorpi anti-AAV AAV2

No risomministrazione del vettore virale

•Dimensioni dell’inserto non superiori alle 4.5kb

•Non patogeni•Espressione genica efficiente e a lungo termine•Pochi effetti immunologici•Ampia varietà di cellule ospiti

Analisi di linkage

Vincenzo Nigro

Dipartimento di Patologia GeneraleSeconda Università degli Studi di Napoli

Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

trasmissione autosomica dominante

Aa aa

aaAaAa aa

un genitore

Aa Aa

AA Aa Aa aa

entrambi i genitori

50% dei figli manifestano il

carattere senza preferenza di sesso

75% dei figli manifestano il

carattere senza preferenza di sesso

A allele patologico dominante

a allele normale recessivo

A aa a

A Aa a

Genotipi:Genotipi: 1/2 Aa, 1/2 aa

Fenotipi: Fenotipi: 1/2 affetti, 1/2 non affetti

Genotipi: Genotipi: 1/4 AA, 1/2 Aa, 1/4 aa

Fenotipi: Fenotipi: 3/4 affetti, 1/4 non affetti

Espressività

•Espressività: grado con il quale la malattia è espressa in un individuo

•al livello di popolazione un fenotipo presenta espressivita’ variabile quando all’interno dell’insieme di soggetti sicuramente portatori il fenotipo presenta gravita’ e/o complessita’ diversa

•anche all’interno della famiglia ci puo’ essere espressivita’ variabile

•importanza di un accurato esame clinico esteso ai consanguinei di un affetto, anche apparentemente sani

•Il tipo e la gravità delle manifestazioni cliniche non sono sempre sovrapponibili negli individui affetti dalla stessa patologia autosomica dominante

mutazioni eterozigoti di PAX3Waardenburg

• sordità (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale, • modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli

(albinismo parziale, in genere piebaldismo) che della pelle,

• anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta neurale

• lateralizzazione del canto mediale • diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito

uno marrone e l'altro blu

SINDROME DI WAARDENBURG Sindrome completa: sordita’ + occhi di colore diverso + ciuffo di capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento

1 sordità2 sordità+ occhi di colore diverso3 sordità+ occhi di colore diverso + ciuffo di capelli bianchi sulla fronte4 ciuffo di capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento

Espressivita’ variabile

esordio variabile

• il fenotipo puo’ comparire in età avanzata

• il fenotipo non è congenito pur essendo ereditario

• dal punto di vista genetico raramente questi fenotipi sono

dovuti a nuove mutazioni

• a livello di popolazione l’allele mutato puo’ essere

frequente, purché l’ insorgenza si verifichi dopo l’inizio

dell’età riproduttiva e non limiti la fitness (capacita’ di

riprodursi)

penetranza

proporzione di individui portatori del gene patologico che

hanno segni clinici della malattia

può dipendere:

– accuratezza diagnostica (esami clinici e di

laboratorio mirati - es. porfiria acuta)

– età (esordio variabile - es. Corea di Huntington)

– meccanismo d’azione del gene (retinoblastoma,

teoria dei 2 hits di Knudson)

tratti autosomici dominantipenetranza

Penetranza 100 %

Penetranza 50 %

Sapere che un gene puo’ non essere completamente penetrante, e’ critico per studiarne la genetica o fornire consulenza genetica: un certo soggetto che non manifesta il carattere puo’ essere portatore del gene.

la penetranza è un concetto che si riferisce alla popolazione

A livello del singolo individuo il carattere ha solo due possibilità

1. si manifesta

2. non si manifesta

è presa in considerazione più frequentemente nei caratteri dominanti

penetranza

Età di insorgenza della Corea di Huntington

a) Probabilità che un individuo portatore del gene mutato abbia sviluppato i sintomi ad una data età

b) Rischio che il figlio sano di un soggetto affetto sia portatore del gene mutato ad una determinata età.

L’espressivita’ e’ il grado di gravita’con cui fra gli individui che presentano il fenotipo questo si esprime: puo’ costituire un sottoinsieme degli individui “penetranti”

La penetranza ridotta non e’ da confondere con l’espressivita’ variabile

Es. Neurofibromatosi: presenza di tumori lungo i nervi periferici e regioni di pigmentazione scura (“macchie di caffelatte”)Tutti i portatori presentano almeno uno dei segni, ma la gravita’ puo’ essere diversa anche all’interno della stessa famiglia: un genitore con macchie e piccoli tumori cutanei benigni puo’ avere un figlio che presenta tumori estesi e maligni. (questa differenza non e’ prevedibile si puo’ solo quantizzare il rischio di ereditare l’allele non il fenotipo)

Penetranza ed espressivita’

ipotesi sul rischio di ricorrenza

1. La malattia non è genetica

2. La malattia è dovuta a nuova mutazione dominante: rischi di ricorrenza trascurabili nella prole della coppia

3. La trasmissione è autosomica recessiva: rischio di ricorrenza di 1 su 4 per la futura prole indipendentemente dal sesso

4. La malattia è legata all’X recessiva e la madre può essere o meno portatrice: rischio di ricorrenza di 1 su 2 maschi se la madre è portatrice

5. La malattia è poligenica o cromosomica: rischio di ricorrenza ben definito dipendente dal tipo di malattia

mappaggio genico

serve ad identificare la posizione cromosomica di un locus genico

possono essere “mappati”:

– marcatori genetici anonimi, quali brevi sequenze di DNA (dette STS), DNA microsatelliti, ecc.

– geni

– loci associati a malattie con trasmissione mendeliana

– loci associati a predisposizione a malattie con trasmissione nonmendeliana

a cosa serve il mappaggio in genetica medica?

– per identificare la localizzazione dei geni malattia

– per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la mutazione responsabile di una malattia genetica mendeliana non è stata ancora identificata

– per identificare i geni responsabili della suscettibilità a malattie non mendeliane

per localizzare e identificare geni malattia

Linkage mapping

per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la mutazione responsabile di una malattia genetica

mendeliana non è stata ancora identificata

per identificare i geni associati

ad una suscettibilità a

malattie non mendeliane

Segregazione e crossing-over

un figlio riceve un cromosoma da ciascun genitore che è il prodotto finale della ricombinazione meiotica

Non è possibile ricevere un cromosoma che non abbia effettuato crossing-over

principi generali del mappaggio

• si segue la segregazione della

patologia nei pedigrees

utilizzando marcatori genetici

a posizione nota• si correla la segregazione

della patologia e dei marcatori

in più famiglie• quanto più spesso la patologia

e un marcatore co-segregano

tanto più sono vicini

*

*

* * **

c’è bisogno di famiglie abbastanza grandi in cui si osserva la trasmissione della patologia

i membri della famiglia devono essere genotipizzati usando marcatori polimorfici

marcatori polimorfici sono noti per ogni cromosoma e di ciascuno si conosce esattamente la posizione cromosomica

i marcatori più informativi sono quelli che presentano un elevato grado di eterozigosità, perché questo consente di distinguere l’allele paterno dall’allele materno

La nomenclatura D20S906 indica che un marcatore di DNA è singolo nel genoma ed è localizzato sul cromosoma 20; purtroppo il numero 906 non ha alcun rapporto con la posizione

Marcatori polimorfici

A partire dagli anni ‘80

RFLP: restriction fragment length polymorphisms

Nella accezione attuale, il DNA purificato è amplificato con la PCR.

Il prodotto della PCR è quindi tagliato in frammenti di restrizione mediante enzimi di restrizione detti endonucleasi, che attuano il taglio unicamente in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, specifiche per ogni enzima.

I frammenti di restrizione sono separati per lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio

RFLPl’enzima di restrizione SmaI taglia l’esanucleotide CCCGGG. La sequenza CCGGGG rende non digeribile il DNA in quella posizione

CCCGGG

GGGCCC

a

b

CCGGGG

GGCCCC

c

a

b

c

Allele 1 Allele 2

STR

• A partire dal 1990STR: short-tandem repeats or microsatellites

–e.g. (CAn)–gttatcttagggctcagtcacacacacacacacacacacatccaggtattggatcaac

Quello che varia tra gli alleli è il numero di ripetizioni dell’elemento. E’ molto più frequente riscontrare individui eterozigoti, con un numero di ripetizioni differente nei due alleli

SNPssingle nucleotide polymorphisms

• Variazioni puntiformi della sequenza Variazioni puntiformi della sequenza tra due copie del genomatra due copie del genoma

• Per un SNP un individuo può essere Per un SNP un individuo può essere

– Omozigote Omozigote TT//TT o C/C o C/C– Eterozigote Eterozigote TT/C/C

ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA

Variazioni della sequenza del DNA

SNPs nel genoma umanoSNPs nel genoma umano

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/DB SNP built 128 (23 Oct 2007)

Totale 11.751.216 11.751.216

Totale codificanti 111.003Codificanti sinonimi 46.621Codificanti nonsinonimi 64.382

Aploblocchi sul sito http://www.hapmap.orgAploblocchi sul sito http://www.hapmap.org

Diploid gamete precursor cell

(♂) (♁)

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

(♂)

(♁)

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - GHaploid

gamete precursors Hap. gametes

NR

NR

R

R

♁

A -

B -

- A

- B

A -

B -

- A

- B

A -

B -

- A

- B

A -

B -

- A

- B

♂ ♁C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

A -

B -

A -

B -

- A

- B

- A

- B

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

C - GA - TA - TT - AG - CC - GT - AT - AT - AA - TA - TG - CC - GG - CA - TT - AG - CT - AA - TC - G

DNA

recombination

Meiosis

2 (22 + 1)

2 (22 + 1)

22 + 1

22 + 1

chr1 chr1 chr1 chr1

chr1

chr1

chr1

chr1

chr1

chr1

ricombinanti R e non ricombinanti NR

il 50% deve essere R e il 50% NR se i loci sono posti su cromosomi differenti, mentre i NR sono >50% se i

loci sono sintenici.

L’analisi della frazione di ricombinazione è alla base del

mappaggio

• la frazione di ricombinazione tra due loci, , è compresa tra 0 e 0.5

• Il valore di non può mai essere maggiore di 0.5, il che indica che i loci sono posizionati molto lontani o su cromosomi differenti

• se è significativamente minore di 0.5 i loci sono “linked”

• più piccolo è più vicini sono i loci

l’unità di misura della distanza genetica è il centiMorgan cM

La distanza genetica tra due loci è il numero atteso di crossovers per meiosi

l le distanze piccole sono accurate mentre le grandi sono sottostimate perché un doppio crossover può far pensare a un non ricombinante

l per valutare distanze grandi occorre sommare distanze piccole

l per q <10% la correlazione tra q e cM è 1:1l mediamente 1 cM corrisponde a circa 850.000 bp,

ma tale valore è inversamente proporzionale alla frequenza di ricombinazione

Le meiosi si visualizzano con MLH1 che è parte del macchinario di ricombinazione

Nella meiosi maschile che avviene nei testicoli ci sono circa 51 chiasmi e quindi considerando 50cM per chiasma, il genoma è di 2550 cM

Nella meiosi femminile che è più difficile da studiare perché avviene a 16-24 settimane di vita fetale ci sono almeno 70 chiasmi (3500 cM), ma si stimano 4280cM

Dal momento che la frequenza di ricombinazione è differente si usa un valore medio tra i due sessi

Il mappaggio per linkage è basato sull’analisi della ricombinazione

d d D d

D d

D d D d D d D d

d d

d dd d

2 5 1 1

1 2 3 4

1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3

= affetto

= non affetto

D = allele patologico

d = allele wild-type

Locus malattiaMarker

d d D d

D d

D d D d D d D d

d d

d dd d

2 5 1 1

1 2 3 4

1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3

Doppio eterozigote

1° obiettivo - stabilire la fase

d d D d

D d

D d D d D d D d

d d

d dd d

2 5 1 1

1 2 3 4

1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3

NR NR NR NR NR Rrecombinanti = 1/5

2° obiettivo – contare i ricombinanti

lod-score

• Il lod-score misura le probabilità a favore del linkage

• Compara la probabilità ad un certo valore di e la probabilità nel caso non vi sia alcun linkage e quindi che sia uguale a 0.5

LOD = log of the odds Z() = log10 [L()/L(0.5)]

d d D d

D d

D d D d D d D d

d d

d dd d

2 5 1 1

1 2 3 4

1 3 1 3 2 4 1 4 2 4 2 3NR NR NR NR NR R

Z = log10 R ( 1- ) NR 0.5 (R+NR)

LOD SCORE (LOD)

= log10 ( 1- ) 5 0.5 6

3° obiettivo – calcolare il LOD score

Il metodo

• La probabilità L() è calcolata per i differenti valori di

tra 0 e 0.5

• Un rapporto tra le probabilità è calcolato LR() =

L()/L(0.50)

• Il lod-score è il logaritmo in base 10 (log10) del

rapporto tra le probabilità

Z() = log10[L()/L(0.50)]

• La migliore stima della frazione di ricombinazione è il

valore di a cui Z() è massimo (MLS)

Per le patologie a trasmissione mendeliana

Z() >> 3 si accetta il linkage per un

carattere autosomico

Z() >>2 si accetta il linkage per un

carattere X-linked

Z() < -2 si respinge definitivamente l’ipotesi

di linkage per un particolare valore di Z() > -2 ma < 3 occorrono ulteriori studi

linked, no recombination

Link utile

http://linkage.rockefeller.edu