32 | oktober 2011

T E M A M E S E C A ∑ N E S M R T N E C E L I C E

GEA 10_oktober 2011.indd 32 12.5.2011 12:59:19

GeA | 33

BIotehnološka

zdrav i la

Foto

graf

ija:

Dom

en G

rögl

Priprava vseh potrebnih sestavin za izdelavo (biotehnoloških) zdravil poteka pod strogo nadzorovanimi pogoji.

GEA 10_oktober 2011.indd 33 12.5.2011 12:59:23

34 | oktober 2011

Sprva so nesmrtne celične linije pridobivali samo iz vzorcev rakavih celic, ki so sposobne stalne in nenadzorovane delitve celic. Napre­dek znanosti pa je omogočil spremembo nava­dnih celic v nesmrtno celično linijo. Nastanek celične linije se začne z odvzemom vzorca ce­lic, ki mu sledi gojenje celic v umetnem oko­

lju zunaj telesa. Neprekinjeno delitev celic in tako njihovo nesmrtnost se doseže z vnosom »nesmrtnih« genov v celice, kjer se začnejo sintetizirati zaščitni proteini, ki preprečujejo smrt celic.

Prednosti uporabe nesmrtnih celičnih linij so številne. Za­radi njihove nesmrtnosti lahko celice razmeroma preprosto gojimo, bodisi kot pritrjene na podlago ali kot prosto plavajo­če v mediju. Medij, v katerem so celice, je kompleksno gojišče, v katerem se ob nenehnem dotoku hranil celice lahko delijo brez omejitev. Tako pripravljene celične linije nadomeščajo uporabo vedno novih celic, pridobljenih iz obolelih tkiv po­skusnih živali in pacientov z različnimi bolezni. Velika pred­nost celičnih linij – v primerjavi z vedno novimi vzorci celic – je v dostopnosti in njihovih lastnostih. Pri uporabi celičnih linij za testiranja zdravilnih učinkovin lahko namreč teste vedno znova ponavljamo na vedno istih celičnih linijah, saj so znotraj linije vse celice enake, z istimi lastnostmi, ki se ob delitvah celic tudi ohranjajo.

Zadnjih 30 let je možna uporaba živalskih celičnih linij tudi pri sintezi biotehnoloških zdravil, kjer se nesmrtne ži­valske celične linije uporabljajo kot »gostiteljski« organizmi. Biotehnološka zdravila spadajo v skupino bioloških zdravil, ki se sintetizirajo z uporabo tehnologije rekombinantne DNK; ta nastane ob kombiniranju posameznih genov enega organizma z drugimi. Pri tej tehnologiji se v »gostiteljske« celične linije vstavi gen za sintezo želenih učinkovin, ki se uporabljajo za zdravljenje različnih bolezni, kot so nekatere vrste raka in dia­betesa, ter v razvoju cepiv.

Prvo registrirano biotehnološko zdravilo je bilo namenjeno diabetikom Sodobna rekombinantna biološka zdravila imenujemo tudi biotehnološka zdravila, saj je postopek za njihovo izdelavo vezan na biotehnologijo. Izdelujejo jih s pomočjo živih orga­nizmov, kot so bakterije, rastline in glive, ter z uporabo ne­smrtnih živalskih ali človeških celičnih linij.

Sodobna biotehnološka zdravila so nastajala z vzporednim razvojem farmacevtske tehnologije, genetike, molekularne biologije ter biotehnoloških znanosti. Velik napredek na po­dročju genetike se je zgodil leta 1973 ob odkritju tehnologije rekombinantne DNK, ki omogoča vnos genov iz enega orga­nizma v drug, »gostiteljski« organizem, pri katerem vnešeni

BESEDILO: UrOš JamnIkar

Nesmrtne celične linije so imele zelo pomembno vlogo pri razvoju znanosti v zadnjih šestdesetih letih. Predvsem so omogočile razvoj celične, molekularne biologije, genetike in biotehnologije. v raziskavah so uporabljene večinoma nesmrtne živalske in humane celične linije, ki se uporabljajo kot modeli za proučevanje medceličnih povezav, znotrajceličnih funkcij in pri razvoju novih biotehnoloških zdra-vil. Prav pri razvoju biotehnoloških zdravil se uporabljajo predvsem nesmrtne živalske celične linije. Njihova poglavitna prednost pred humanimi celičnimi linijami je precejšnja nedovzetnost za okužbe s humanimi virusi, zaradi česar je razvoj biotehnoloških zdravil v nesmrtnih živalskih celičnih linijah varnejši za humano uporabo.

Uroš Jamnikar je univ. dipl. mikrobiolog. Diplomiral je s področja rotavirusov na Mikrobiološkem inštitutu v Ljubljani. V svoji doktorski nalogi preučuje genetsko stabilnost in ekspresijo rekombinantnih učinkovin v sesalskih celičnih linijah. V sklopu svojega dela se je izobraževal v Švici in v ZDA, zadnja leta pa kot raziskovalec v družbi LEK sodeluje pri razvoju rakombinantnih učinkovin in izdelavi biotehnoloških zdravil s pomočjo nesmrtnih živalskih celičnih linij.

GEA 10_oktober 2011.indd 34 12.5.2011 12:59:23

GeA | 35

geni naravno ne obstajajo. Vnešeni gen se vključi v dedni ma­terial (DNK) »gostiteljskega« organizma, ki nato sintetizira učinkovino, ki jo vstavljeni gen kodira. Ameriška agencija za hrano in zdravila (FDA) je leta 1982 izdala dovoljenje za re­gistracijo prvega biotehnološkega zdravila Humulin®, izdela­nega z uporabo tehnologije rekombinantne DNK. To zdravilo izdelujejo z vstavitvijo gena, ki v človeku nenevarnem sevu bakterije Escherichia coli, nosi zapis za humani inzulin. Sev te bakterije je gensko spremenjen tako, da sintetizira inzulin, ki je enak humanemu inzulinu.

Pred uporabo tehnologije rekombinantne DNK za izdela­vo somatrema, sintetičnega rastnega hormona, so človeški ra­stni hormon (somatotropin) lahko pridobili edino z izolacijo iz človeške hipofize, ki so jo odstranili posmrtno. Rekombi­nantni rastni hormon je cenejši in varnejši, njegovo prido­bivanje pa je omejeno samo s proizvodnimi zmogljivostmi proizvajalca.

Z registracijo prvih biotehnoloških zdravil v osemdesetih letih prejšnjega stoletja se je začelo obdobje uporabe bioteh­noloških zdravil v medicini. Trenutno je na trgu okoli 165 bi­

otehnoloških zdravil za humano uporabo, še veliko več pa jih je v različnih fazah kliničnih testiranj.

Celice in ≈gostiteljski« organizmi

Biotehnološka zdravila so spremenila moderno medicino, saj omogočajo zdravljenje številnih neozdravljivih bolezni. Ta zdravila so zelo kompleksne učinkovine, ki so po svoji se­stavi enake naravnim sestavinam, ki jih proizvaja naše telo (npr. hormoni, citokini, proteini, rastni faktorji, protitele­sa), in imajo zaradi svojih lastnosti malo stranskih učinkov. Mnoga izmed njih imajo zelo kompleksno strukturo, zato se pri njihovi proizvodnji uporabljajo živi organizmi, ki imajo sposobnost graditve kompleksnejših struktur, kot bi jih lahko pridobili s kemijsko sintezo. Za učinkovito delovanje bioteh­nološkega zdravila je namreč pomembna njegova pravilna oblika, to pa so sposobni razviti le celice sesalcev.

Biotehnološka zdravila so v veliki večini proteinske mo­lekule in nukleinske kisline, ki se po svoji naravi precej raz­likujejo od klasičnih zdravil. Razlika je predvsem v velikosti

Biotehnološko zdravilo za sladkorne bolnike izdelujejo z uporabo nenevarnega seva bakterije Escherichia coli.

Foto

graf

ija:

Reu

ters

GEA 10_oktober 2011.indd 35 12.5.2011 12:59:25

36 | oktober 2011

molekule in v zapleteni tridimenzionalni zgradbi. Običajno obstaja povezava med kompleksnostjo biotehnološke učinko­vine in »gostiteljskim« organizmom, v katerega vstavijo gen za izdelavo želene učinkovine. Preproste učinkovine, ki so zgrajene iz ene podenote, lahko npr. izdelujemo s pomočjo bakterij. Ker pa bakterije zaradi manjkajočih encimov niso sposobne izdelati kompleksnejših učinkovin v funkcionalni obliki, se za njihovo izdelavo uporabljajo nekatere vrste kva­sovk, rastlinske celice in sesalske celične linije. Slednje upo­rabljajo šele v zadnjih letih; med njimi uporabljajo predvsem sesalske ovarijske celice kitajskega hrčka (celice CHO), ledvič­ne celice hrčkovega mladiča (BHK) ter mišje mielomske celice NS0 in Sp2/0. Njihova prednost pred drugimi organizmi je zmožnost graditve najzahtevnejših in popolnoma funkcional­nih rekombinantnih zdravil; potreba po zahtevnejših bioteh­noloških učinkovinah je tako prevladala nad zahtevnejšo in dražjo gensko manipulacijo.

Med dobro poznanimi in opisanimi celicami so celice CHO, ki so jih že leta 1957 izolirali iz jajčnikov samice ki­tajskega hrčka in jih že vrsto let uporabljajo pri raziskavah. Prednost teh celic pred drugimi sesalskimi celičnimi linijami je njihovo razmeroma preprosto gojenje v laboratoriju in so­razmerno hitra delitev celic.

Prvo humano, rakavo celično linijo je znanstvenikom uspelo vzgojiti v laboratorijskem okolju šele leta 1951, ko so imeli znanstveniki prvič priložnost proučevati rakave ce­lice v nesmrtni celični liniji. Vzorec tkiva so odvzeli bolnici Henrietti Lacks, ki je obolela za redko in invazivno obliko

raka. Celično linijo so imenovali HeLa, poimenovano po darovalki celic, in prav ta celična linija je pomenila pomem­ben mejnik v raziskavah raka in veliko upanje pri odkrivanju

Zgodovina nastanka celic CHo

Celice CHO so bile izolirane iz kitajskega hrčka (Crice-tulus griseus), ki spada v družino glodavcev, v naravi pa živi v puščavah severne Kitajske in Mongolije. Že leta 1919 so ga uporabljali za proučevanje nekaterih nalezljivih bolezni, ki jih je prenašal. v dvajsetih letih prejšnjega stoletja si je pridobil sloves pomembnega orodja za epidemiološke študije, ker je bil prenašalec sm-rtonosnega parazita Leishmenia, ki povzroča bolezen, imenovano lišmanioza. leta 1948 sta dr. Hu in dr. Wat-son kitajske hrčke dobesedno pretihotapila iz Kitajske v zda. Kitajska se je v začetku hladne vojne bala, da bodo zda kitajske hrčke uporabile kot biološko orožje. domnevali so, da jih bodo zda okužile s prenašalci kolere in kuge in jih s padali odvrgle nad Kitajsko. Namesto tega so se kitajski hrčki v laboratorijih uvel-javili kot pomembno orodje za epidemiološke študije. leta 1957 so celice iz jajčnikov samice kitajskega hrčka izolirali in jih začeli gojiti v laboratorijskem okolju kot nesmrtne celične linije. Celična linija CHO se še zdaj uporablja za razvoj novih biotehnoloških zdravil.

Celično linijo vero so izolirali iz ledvične povrhnjice afriške zelene opice. Uporabljajo jo za namnoževanje virusov, kot sta virus polio in virus gripe, ter kot gostiteljsko celično linijo za parazite.

Foto

graf

ija:

Y T

ambe

GEA 10_oktober 2011.indd 36 12.5.2011 12:59:25

GeA | 37

vzrokov za nastanek rakavih obolenj. Celice HeLa še danes predstavljajo enega izmed pomembnejših modelnih siste­mov za proučevanje rakavih obolenj. Razen njih so v prete­klosti izolirali še mnogo nesmrtnih celičnih linij iz različnih oblik rakavih obolenj, uporaba nesmrtnih celičnih linij pa omogoča proučevanje razlik v biokemijskih poteh med zdra­vimi in rakavimi celicami.

Ena izmed prvih uporab celične linije HeLa v zdravstvu je bila bitka proti virusu polio, ki povzroča otroško parali­zo. Sprva so celice HeLa uporabljali le za preprosto testiranje prisotnosti virusa, pozneje pa so jih uporabili tudi v razvoju cepiva. Celice HeLa so v nadaljevanju spodbudile celo vrsto raziskav, ki pred njihovim obstojem niso bile mogoče Omo­gočile so temeljne raziskave za razvoj kemoterapije, zdravil proti raku (tamoxifen), zdravljenje levkemije, Parkinsonove bolezni in drugih kompleksnih bolezni. Tako se pri več kot 75 odstotkih raziskav pri rakavih obolenjih uporablja vsaj ena izmed 112 humanih celičnih linij, kolikor jih poznamo danes.

V osemdesetih letih prejšnjega stoletja so začeli uporabljati celično linijo Vero, ki izhaja iz zdravih ledvičnih celic afriške zelene opice. To celično linijo uporabljajo kot gostiteljsko lini­jo za namnoževanje virusov, kot sta virus polio in virus gripe, ter kot gostiteljsko celično linijo za parazite. Prednost celične linije Vero je v hitri delitvi celic in rasti do večjih celičnih gostot, kar pomeni več virusnega materiala za razvoj cepiv.

Med široko uporabljenimi celičnimi linijami je tudi celič­na linija PER.C6, ki so jo izolirali iz celic človeške mrežnice. Uporabljajo jo za razvoj poskusnih cepiv proti HIV­u, virusu Zahodnega Nila, gripi in SARS­u.

Z uporabo nesmrtnih celičnih linij lahko nove zdravilne učinkovine testirajo varneje in temeljiteje. Nove zdravilne učinkovine lahko vedno znova testirajo na isti celični liniji, saj so poskusi na njih precej lažje izvedljivi in etično manj sporni kot npr. poskusi na živalih. Testiranje zdravilnih učinkovin na celični ravni pa je še posebej pomembno na ravni živč­nih celic, kjer je treba zbrati čim več informacij o vplivu nove učinkovine na možgane. Z uporabo celičnih linij in modelov za določeno bolezensko stanje se izognemo etično spornemu in odvečnemu testiranju novih učinkovin na ljudeh in živalih. Celične linije tako predstavljajo modele za proučevanje naj­različnejših vplivov in interakcij novih zdravilnih učinkovin, prav tako pa jih uporabljamo kot gostiteljske celice za sintezo najsodobnejših biotehnoloških zdravil.

v taBLIčnI IzDaJI: Odlomek iz knjige Rebecce Skloot Nesmrtno življenje Henriette Lacks

Biotehnološka zdravila v EU in Sloveniji

Biotehnološka zdravila proizvajamo in uporabljamo tudi v Sloveniji. v nasprotju s sinteznimi zdravili so zaradi zahtevnejše izdelave od desetkrat do stokrat dražja. v Evropski uniji je bilo v zadnjih letih odobreno kar nekaj biotehnoloških zdravil, proizvedenih v bak-teriji Escherichia coli. leta 1995 so odobrili uporabo zdravila za multiplo sklerozo (Bseron®), leta 1997 za diabetes (Humalog®), leta 2000 za Hepatitis B in C ter različne vrste raka (atronol®), leta 2003 pa tudi zdravila za osteoporozo (Forsteo®). Fo

togr

afija

: iz

knj

ige

Nes

mrtn

o ži

vlje

nje

Hen

riette

La

cks

GEA 10_oktober 2011.indd 37 12.5.2011 12:59:27