Teknikat bioteknologjike klasike

• Teknikat mё tё pёrdorura nё etapёn e parё tё zhvillimit tё BT janё:

Hibridizimi Mutacioni dhe pёrzgjedhja Krijimi dhe shkrirja e protoplasteve Fiksimi i enzimave dhe qelizave

hibridizimi

• Hybridization—the production of offspring from two animals or plants of different breeds, varieties, or species

• Nenkupton hibridizim midis llojeve ose shtameve tw ndryshme• pёrdoren pikёrisht ciklet jetёsore tё majave nga shtame

haploide me veti gjenetike tё njohura, pwr tw dhwnw forma tё reja me karakteristika tё dёshiruara

• Shembull: kryqёzimi i njё shtami joflokulent ( pa shkumё), qё si burim karboni pёrdor maltozёn, me njё maja tjetёr qё nuk e ka vetinё flokuluese, dhe qё nuk e pёrdor maltozёn burim karboni, mund tё pёrzgjidhet njё shtam diplod qё zotёron tё dy vetite e dёshiruara (joflokulent, pa maltozwn)

Shfrytёzimi i cikleve jetёsore pёr prodhimin e shtameve diploide

1. hibridizimi

• Megjithatё, problemet janё tё ngjashme me ato tё kryqёzimeve nga gjenetika klasike,

• Si rrjedhojё sot pёrdoren metodat gjenetike tё modifikimit molekular tё ADN-sё

• Kjo metodё ka ndihmuar nё njohjen gjenetike tё majave dhe nё pёrpilimin e hartave gjenetike tё kromozomeve tё tyre (diplode 32 kromosome)

• Pikёrisht njё numёr i madh gjenesh sic ёshtё ai pёrgjegjёs pёr flokulimin ёshtё hartuar me rrugёn e hibridizimit

2. Mutacioni dhe pёrzgjedhja (seleksionimi)

• Nё bioteknologji pёrdoren mikroorganizma tё pёrzgjedhura (pra ku shtami mё i mirё ёshte ai i cili ka veti mё tё mira prodhuese), me anё tё mutacionit apo seleksionimit

• Si rezultat i hartimit tё programeve tё mutacionit e tё seleksionit, shumё organizma qё prodhonin lёndё nё sasi tё vogla lёndё me interes pёr njeriun, (antibiotikё, vitamia, aminoacide etj.), janё shndёrruar na shtame mё aftёsi tё lartё prodhuese, qё ende pёrdoren me sukses nё industrinё e sotme fermentuese.

2. Selection and Mutation

• Selection: Culture a naturally occurring microbe that produces desired product

• Mutation: Mutagens cause mutations that might result in a microbe with a desirable trait

• Site-directed mutagenesis: Change a specific DNA code to change a protein

• Select and culture microbe with the desired mutation

Pёrparёsitё:

• Me anё tё mutacionit janё pёrftuar m.o tё aftё pёr pёrdorimin e lёndёve tё para mё pak tё kushtueshme, qё rriten nё temp. tё ndryshme, apo kultura qё vetinё shkumёzuese e kanё nё nivele minimale

• Poashtu me anё tё mutacionit mund tё ndёrpritet njё zinxhir metabolik nё nivele tё ndryshme, gjё qё bёn tё mundur grumbullimin e produktit tё ndёrmjetёm metabolik, pra nё disa raste janё lёndё me rendёsi tё lartё industriale

Si induktohet njё mutacion artificialisht ??!

• Qelizat i nёnshtrohen njё lёndё mutagjene fizike (temperatura, uv ndricim, rrezatim), kimike (ᾳ benzopireni, produktet policiklike PAH), izolohen mё pas qelizat qё kanё mbijetuar dhe vlerёsohen vetitё e tyre tё fituara. (SHBA, Skoci)

• Ku eshte shfrytezuar????• Qёllimi ishte rritja e rendimentit tё penicilinёs, e dobishme jo

vetёm pёr penicilinёn por edhe pёr antibiotikё tё tjerё• Shembujt e mёposhtёm:• Penicillium notatum VS P. chrysogenum

Prodhimi i penicilinёs G dhe i L-lizinёs

• Shtami i egёr i Penicillium notatum, i zbuluar nga Fleming dhe qё jepte 0,6-1,2 mg penicilinё/liter terreni u zёvendёsua (pwrzgjodh) nga P. crysogenum, i izoluar ne SHBA

• Me anё tё mutacionit e pёrzgjedhjes u pёrftua njё shtam mutant, i aftё pёr tё prodhuar rreth 120 mg pen/Litёr terreni, mё pas me anё tё teknikave pёrzgjedhёse tё njёpasnjёshme, u arrit nё shtamet e sotme tё prodhojnё deri nё 10 g pen/lit.

• Lizina Lysine is an essential amino acid, which means that the human body cannot synthesize it. Its codons are AAA and AAG fitohet me rrugё fermentative nga shtame mutante Corynebacterium glutamicum qё prodhojnё mbi 40 g lizinё/lit terren kulturё. (mutantё, me crregullim mekanizmi i kontrollit tё sasisё sё prodhimit tё lizinёs., mutacion nё gjenet rregullatore)

Penicillium notatum VS P. chrysogenum

Kufizimet e mutacionit dhe perzgjedhjes !!

• Mutacione janё tё rastёsishem dhe jogjithmonё fitohet mutanti nё zonёn e ADN-sё dёshiruar

• Rrallё herё ndodhё qё tё fitohen mutacione tё njefishta; • Frekuenca e mutacionit tё dёshiruar ёshtё shumё e ulёt,

procedura e pёrzgjedhjes ёshtё shumё e ulёt• Qendrueshmёria e shtameve tё ndryshuar ёshtё mё e ulёt se

e atyre natyralё, sepse nuk ёshtё e mundur tё identifikohen tё gjitha mutacionet e ndodhura edhe pse tё padukshme

3. Protoplastet dhe shkrirja e tyreProtoplastet?? A protoplast is a plant, bacterial or fungal cell that had its cell wall completely or partially removed using either mechanical or enzymatic means. Enzimat: lizoxima (bakteret), zimoliaza (majatё), celulazat (bimёt)

Figure 9.5a

Process of Protoplast Fusion

Protoplastet

• Rrugё tjetёr e pёrmirёsimt tё shtameve mikrobike: SHKRIRJA E PROTOPLASTEVE??

• Rikombinimi i gjeneve me anё tё shkrirjes sё qelizve vegjetative

• Formohen qeliza heterokariote, qё mund tё bashkojnё bёrthamat e tyre, tё rikombinojnё gjenet, segregohen mё pas rikombinantёt

• Protoplastet bashkohen nёn veprimin e njё solucioni polietilenglikol (PEG), dhe formojna qeliza hibride ku nё tё njёjtёn citoplazmё gjenden kromozomet nga dy qeliza gjenetiksht tё ndryshme.

protoplastet

Pwrdorimi i protoplasteve

• Metoda e shkririjes sё protoplasteve ashtu si ajo e mutagjenezёs ёshtё pёrdorur gjёrёsisht pёr prodhimin e antibiotikёve dhe lёndёve tё tjera

• Kjo metodё ka dhёnё rezultate tё dukshme nё prodhimin e antibiotikёve nga bakteret Streptomyces, tё cilё janё prodhuesit e rreth 60 % tё antiobiotikёve tё njohur dhe tё disa prej enzimave mё tё rёndёsishme si p.sh glukozё – izomeraza

• Pёrmirёsimi i shtameve tё ndryshme tё Streptomyces ka ndikuar nё rendimentin e prodhimit tё rreth 70 antibiotikёve dhe enzimave

Pwrdorimi i protoplasteve

• Kjo metodё ёshtё pёrdorur edhe nё shtamet fermentuese tё majave, kёshtu p.sh njё shtam i Saccharomyces cerevisiae u shkri me njё tё Saccharomyces uvarum; - veti gjenetike tё dёshiruara tё dy shtameve

• Njёri nga shtamet ishte flokulent por auksotrof??pёr njё sёrё lёndёsh, shtami tjetёr ishte joflokulent por i aftё tё prodhontё lёndёt e sipёrpёrmendura, pra nuk kёrkonte lёndё tё shumta pёr tё u shumuar

• Shtami hibrid FLOKULENT- JOAUKSOTROF• Nё fushёn e mykeve ёshtё realizuar p.sh skrirja midis dy

specieve gjinive tё Aspergillus dhe Penicillium

protoplastet

vazhdim

• vazhdim

4. Fiksmi i enzimave

• Si burime industriale tё enzimave ekonomikisht tё levёrdishme shfrytёzohen vetёm disa inde shtazore e bimore

• Shumica e enzimave qё pёrdoren sot janё me orgjinё mikrobikea) japin njё sasi tё konsiderueshme tё enzimave, b) nga i njejti mikrob mund tё nxiren disa enzima

Fiksimi i enzimave

Enzimat qw prodhohen: amilaza, pektinazat, celulazat, invertazat, laktazat, lipazat, aminoacilaza, penicilinaza, katalazat etj.

• Nё shkallё industriale enzimat pёrdoren nё formё tё tretshme, pra nё tё njёjtёn formё nё tё cilёn ndodhen edhe substratet mbi tё cilat ato veprojnё

• Pra reaksioni enzimatik ndodh nё fazё tё lёngёt homogjene, dhe pas transformimit tё plotё tё substratit, pёrzierja qё pёrmban produktin pёrdoret si e tillё ose trajtohet mё tej pёr izolimin apo pastrimin e kёtij tё fundit,

Fiksimi i enzimave

• Por nё tё dyja rastet enzima inaktivizohet sepse rikuperimi I saj eventual do tё ishte I vёshtirё dhe I kushtueshёm po tё kemi parasysh pёrqёndrimin e saj tё ulёt nё pёrzierjen e e reaksionit.

• Si rrjedhojё u zhvillua metoda e fiksimit tё enzimave• ёshtё njё metodё me anё tё sё cilёs enzima detyrohet tё

zhvillojё aktivitetin e saj katalitik nё njё hapёsirё tё kufizuar por tё ekzpozuar mirё ndaj substratit dhe produktit tё reaksionit.

Metodat e fiksimitfizike dhe kimike

• Metodat fizike – metoda e thjeshtё dhe mё ekonomike bazohet nё a) adsorbimin : molekulat enzimatike fiksohen nё partikula tё ngurta me natyrё tё ndryshme (qelq poroz, argjilё, lёndё plastike) por qё mund tё shkёputen nё kushte tё caktuara

• Metoda tjetёr fizike konsisiton nё b) “gёlltitjen” e enzimёs me njё polimer natyral ose sintetik

• Pasi nxitet polimerizimi nё prani tё enzimёs, molekulat e kёtij tё fundit mbeten “tё burgosura” nё rrjetёn tridimensionale tё formuar nga molekulat e gjat polimerike.

Metodat e fiksimit

• Njё tjetёr metodё fizike ёshtё ajo e c) mikrokapsulimit qё konsiston nё mbёshtjelljen e enzimёs nё shumё sferula me pёrmasa tё vogla (diametёr 10- 100μm) paretet e tё cilave janё shumё tё holla (najlon, kolodium) janё tё pёrshkueshёm nga ana e molekulave tё substartit dhe tё produkteve tё reaksionit).

Lёndёt qё pёrdoren mё sё shumti pёr fiksim

Polimeret që shfrytëzohen: • Alginati• Agari dhe agaroza• Karagenan• Poliakrilamidi• Poliuretani• membrana

Metoda fizike dhe kimike e fiksimit tw enzimave

Metodat kimike

• Fiksimi me rrrugё kimike arrihet me anё tё formimit tё lidhjeve kovalente midis molekulave tё enzimёs dhe tё njё suporti tё ngurtё zakonisht tё patretshёm nё ujё, p.sh nga celuloza, kolagjeni, najloni, polesteri etj.

• Meqenёse si grupet funksionale tё enzimave ashtu edhe ato tё suportit kanё reaktivitet tё ulёt , ёshtё I domosdoshёm “aktivizimi i tyre

• Veprohet mbi ato tё suportit duke I bёrё tё afta pёr t’u lidhur me enzimёn nё mёnyrё t qёndrueshme (skema)

Pёrdorimet e enzimave

Pёr analizat kimo-klinike Terapeutike Diagnostifikuese Kёrkimore

Pёrdorimi i enzimave

• Pёrdorimi nё analizat kimike bazohet na specifitetin e enzimave,

• Analizat me bazё enzimatike mund tё kryhen nё vёllime shumё tё vogla

• Pёr pёrcaktimin e uresё nё gjak (azotemia) pёrdoret enzima ureaza, e cila shpёrbёn uren nё CO2 dhe nё amoniak (NH3), nga amoniaku mund tё llogaritet sasia e uresё qё e ka dhёnё atё

Pёrdorimi I enzimave

• Pёrcaktimi I glicemisё nё gjakё, bazohet nё veprimin e dy enzimave a) glukozё-oksidaza dhe b) peroksidaza• E para oksidon glukozёn dhe formon peroksidin e hidrogjenit (H2O2),

e dyta (peroksidaza) pёrdor peroksidin e hidrogjenit nga reaksioni I parё pёr tё oksiduar njё lёndё pa ngjyrё indikatore e cila ngjyroset kur kalon nё gjendje tё oksiduar. Intensiteti I ngjyrimit ёshtё nё pёrpjestim tё drejtё me sasinё e pranishme tё glukozёs nё gjakё.

• Vlerat normale tё glicemisё me metoda klasike 80-120 mg/100 ml gjak, ndёrsa vlerat me metoda enzimatike 70-105 mg/100 ml gjak, pra kjo e fundit ёshtё vlera realisht qё I takon vetёm konc. tё glukozёs

Perdorimi i enzimave

• Me metoda enzimatike mund tё maten edhe metabolitet e tjerё tё rёndёsishёm si kolesteroli, trigliceridet, acidi urik, etj.

• Proteazat, pёr qёllime terapeutike• Enzimё me orgjinё humane qё pёrdoret me sukses nё rastet e

flebiteve , tromboflebiteve ёshtё urokinaza (plasminogen factor), as an enzyme, it catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin, the major enzyme responsible for clot breakdown.

• Streptokinaza , e ngjashme me urokinazёn, mё pak specifike, me orgjinё mikrobike dhe fitohet nga Streptococcus haemoliticus

Enzimat, pwrdorimi

• Tripsina- ёshtё pёrdorur nё raste analoge, pёr veteitё e saja antimpiksёse, dhe pёr forcimin e veprimit tё antibiotikёve dhe tё antikuagullantёve

• Penicilinaza – enzimё e izoluar nga Bacillus licheniformis, qё aktivizon nё mёnyrё tё shpejtё penicilinёn

• Enzimat proteolitike, amilaza, hemicelulaza e celulaza, janё pёrodur pёr kurim tё shqetёsimeve tё traktit digjestiv , pankreatiteve,

• Kimotripsina – efekt terapeutik injektohet nё sy pёr tё menjanuar atё qё njihet si perde e syve (katarakt)

• Hialuronidaza- hidrolizon acidin hialuronik, lehtёson difuzinin e medikamenteve

• Proteinaza K, -hidrolizin membarnat qelizore, izolimi I AND-sё• Polimerazat – PCR etj etj etj

Fund