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Profa. Renata Faier Calegario
Técnicas Moleculares:
PCR, Sequenciamento e Southern Blot
Técnicas Sorológicas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 073- Biotecnologia Vegetal
ANÁLISE DA PCR
Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007
Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco
Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as
extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum
RepCP
1200pb
- Apresenta alguns falsos positivos
- Importante controles +/-
- Sensível (fentograma: 10-18)
- Rápido
- Grande n° amostras
Vantagens:
Desvantagens:
PCR
Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
Branco = sem DNA
Controle negativo = planta sadia
PCR
- Detecção de genes em DNA genômico
- Clonagem de DNA
- Sequenciamento
- Evolução molecular
- Análise de estrutura genômica
- Identificação de mutações
- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas
- Análise de plantas transgênicas
APLICAÇÕES
.....
VIDEO SEQUENCIAMENTO
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização
Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex
Teste de complementaridade
DNA
Southern Blot Northern Blot
RNA
Sonda: sequência complementar ao DNA alvo
SOUTHERN BLOT
Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico
COMO?
Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA
Sondas Radioativas = nt 32P
Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica
ou quimioluminescente)
SONDA: sequência complemetar ao DNA
Sequência de interesse DNA genômico
Sequência de complementarao DNA genômico
TTCCAGAA* *******
Sonda com nucleotídeos marcados
SOUTHERN BLOT
DNA genômico
DNA genômico cortado
SOUTHERN BLOT
1° Passo: Digerir DNA genômico
2° Passo: Gel Agarose do DNA genômico cortado
SOUTHERN BLOT
3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose
SOUTHERN BLOT
Gel Agarose comDNA genômico
Membrana Nitrocelulose
SOUTHERN BLOT
3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose
Gel Agarose comDNA genômico
SOUTHERN BLOT
TRANSFERÊNCIA
SOUTHERN BLOT
4° Passo: Hibridização da Sonda
Sonda
DNA (-) imobilizadoSonda
Nucleotídeos marcados P32
Membrana (+)
O QUE ACONTECE NA MEMBRANA
Revelação Raio X
5° Passo: Revelação
SOUTHERN BLOT
Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos
SOUTERN BLOT
VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja
Gel - 3hs
Hibridização
18hs
α32P: d-CTP3 3
4
1 11
4 4 6 66 6
4
Cópias do transgene
DNA total Hind III
Separou o gene
PCR
Souther
Blot
SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Batata
DNA total digerido Eco RI
1 e 5: Marcador Peso Molecular2 e 4: DNA total batata transgênicadigerido co Eco RI3: DNA total batata Não-transgênicadigerido co Eco RI
Southern Blot do gel
Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perda
das mesmas ou ao silenciamento
Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da
planta, pelo efeito posicional das inserções
Alto número de inserções do transgene:
SOUTERN BLOT
Importante para a expressão estável
Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da
real interação entre as moléculas
Poucas cópias:
Sensibilidade (fentograma)
Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma
Envio de membranas para outro laboratório
Demorado
Caro
Perigoso (sondas radioativas)
SOUTHERN BLOT
Vantagens:
Desvantagens:
- Importante experimentos de Transformação => Prova
molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal
- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de
alterações no material genético
- Detecta fragmento específico em meio a milhões de
fragmentos
- Usado para distinguir estirpes de um organismo
SOUTHERN BLOT
APLICAÇÕES
Baseado na reação antígeno – anticorpo de animais de sangue quente
Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos
(linfócitos B)
Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal
Substância formada em reação ao vírus: anticorpo
Antígeno: substâncias estranhas ao organismo
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Propriedade proteica
Anticorpo reconhece a CP
Portanto:
O antígeno é a proteína viral = Capa Proteica
Separação dos glóbulos vermelhos
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Glóbulos Brancos - soro
- IgG
Região
Invariável
Sítio de reconhecimento da proteína viral
Região variável
Anticorpo
Sítio de reconhecimento da proteína viral
Epitopo Epitopo
ELISA
Western Blot
Tissue Blot
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Detecta Proteína Antissoro
Y-E
O anticorpo 2° ligado
a enzima reconhece Ac 1°
O substrato é adicionadoY
Anticorpo 1°
imobilizado pelo vírus
Vírus adsorvido
Y
Y
Y-E
IndiretoAdaptado de Zerbini, 2002
Reação
Colorimétrica
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
Extrato Vegetal
infectado
Resultado
+
-
Absorbância Concentração viral
Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm)
Cor Amarela
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
ELISA: CiLV-C / AS = CP
Sensível (1 ng/ml)
Rápido
Baixo custo
Seguro
Várias amostras
Quantitativo
Útil para testes de rotina
Vantagens
Desvantagens
Não mede infectividade e reação inespecífica
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
Eletrophoretic protein separation
4.2 WESTERN BLOT
Extrato vegetal
infectado
- Enzima: fosfatase alcalina
- Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star
- Colorimétrico: NBT/BCIP
4.2 WESTERN BLOT
Vírus
Calegario et al., 2013
4.2 WESTERN BLOT
1- Proteína Pura2- Lesões novas3 e 4 - Lesões mais velhas5 - Planta Sadia
Western Blot: antissoro contra a CP do CLV-C (1:1000)
Não mede a infectividade do vírus
Apresenta alguns falsos positivos
Membranas podem ser transportadas
Pode ser iniciada em campo pelo agricultor
Custo moderado
Várias amostras analisadas concomitantemente
WESTERN BLOT
Vantagens
Desvantagens