Współczesne możliwości szybkiego

diagnozowania gruźlicy

Ewa Augustynowicz-Kopeć

Zakład Mikrobiologii

Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc

Warszawa

Czego oczekują klinicyści od laboratoriów prątka ?

1. potwierdzenia metodami mikrobiologicznymi podejrzenia klinicznego

2. wykonania badania w najkrótszym czasie

wstępną diagnostykę

należy zakończyć po 2 dniach (bakterioskopia i badanie genetyczne)

pełną diagnostykę

• 21 dni identyfikacja gatunkowa

• 30 dni test lekooporności

ROZPORZĄDZENIE

MINISTRA ZDROWIA 1)

z dnia 25 marca 2014 r. w sprawie biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu, wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich wyników badań w kierunku biologicznych

czynników chorobotwórczych oraz okoliczności dokonywania zgłoszeń

Zał. nr 1 Wykaz czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu

Różna specyficzność i czułość w wykrywaniu

prątkowania chorego

Bakterioskopia 10.000 komórek/ 1ml • Jakość próbki plwociny

• ilość prątków

• wykrywa około połowy wszystkich przypadków czynnej gruźlicy.

• mniej przydatny u zakażonych HIV i dzieci

Hodowla (L-J) > 1.000 komórek / 1ml

Nowoczesne systemy > 500 komórek / 1ml min 100 kom żywych

Długi czas oczekiwania na wynik

Czas generacji prątków 24 h

Metody genetyczne 50-100 komórek / 1ml w hodowli wykrycie obecność DNA

M. tbc lub innych gatunków prątków

= TB

Na podstawie wyniku bakterioskopii nie można ani

potwierdzić ani wykluczyć rozpoznania gruźlicy

w dodatnim rozmazie mogą być obecne prątki

środowiskowe.

przy dodatnim rozmazie należy wykonać badanie

genetyczne

czułość metody około 45% wg World Health Organization

(2012) Fact Sheet No. 104: Tuberculosis. Geneva: WHO

Rekomendacja 3

Pneumonol. Alergol.81,4 2013

Co oznacza wynik rozmazu?

• AFB (-) • prątki nie obecne w wystarczającej liczbie , aby być widoczne pod

mikroskopem

• silne podejrzeniu gruźlicy >niż trzy materiały zbierane i testowane w różnych dniach

• nie świadczy o braku prątkowania mała ilość bakterii potwierdzona hodowlą

• Chorzy HIV + postacie gruźlicy skąpopratkowe

• zakażenie spowodowane innym czynnikiem etiologicznym niż prątki

Behr MA, Warren SA, Salamon H, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-

fast bacilli. Lancet1999;353:

AFB + wynik 24 h

• Chory z aktywną postacią TB obficie prątkujący – zalecane wykonanie badania genetycznego

• pomocne w podejmowaniu decyzji o włączeniu leczenia choremu

Metody genetyczne:

Gen-Probe – RNA 4h +opracowanie materiału

ProbeTec DNA 6h +opracowanie materiału

GeneXpert- DNA 2h + R- RMP wstępny test

diagnostyczny TB MDR zalecenia WHO

PCR (home-made ) brakuje kalibracji

nie rekomendowany do gruźlicy wykrywanie obcego DNA

mogą znacznie przyspieszyć diagnostykę gruźlicy płuc i postaci

pozapłucnych

nie powinny nigdy zastępować innych metod powinny być ich

uzupełnieniem

należy wykonywać je wyłącznie w zamkniętych systemach,

wyposażonych w kontrolę procesów amplifikacji

Testy genetyczne

• Najnowsze testy molekularne są bardzo proste w wykonaniu

• nie wymagają spełniania kryteriów laboratorium molekularnego

• Czułość zależna o wyniku AFB i Hodowli

• Dodatni wynik 95-100% w przypadku pozytywnych AFB i hodowli

• 40-60% ww przypadku ujemnych wyników AFB i hodowli

• Khandekar P et al. (1994) Evaluation of PCR based test for the detection of Mycobacterium tuberculosis

in coded sputum specimens. Indian J Med Res 100 167–71

RMP- R jako marker MDR -TB

• wg WHO RMP- R jako marker MDRTB

• Ale wartość predykcyjna wyniku dodatniego testu przekracza 90% gdy

• częstość występowania RMP R przekracza 15% co jest rzadkością w skali globalnej

• wynik pozytywnym wymaga testu potwierdzającego

• mutacje rpoB Leu533Pro, Leu511Pro, Asp516Tyr i His526Leu -mniej popularne, ich częstość występowania może osiągnąć jednak 10 do 22%

• Oporność na RMP nie zawsze surogatem oporność MDR

• Potrzeba szybkich testów na INH • Kurbatova EV et all. Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis: susceptibility

to isoniazid and other anti-tuberculosis drugs. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2012 16:355–357

m2000 RealTime System

testów w kierunku HIV-1

i MTB na tej samej platformie

Abbott Introduces New Molecular Test to Aid in the Diagnosis of Tuberculosis -

October 08, 2014

Czy wykonując badania molekularnego nadal musimy używać tradycyjnych metod?

• bezpośrednio w materiałach wykrywanie obecność M. tuberculosis i

markerów genetycznych lekooporności – RMP

• Potwierdzenie AFB + –chory poddany leczeniu

ALE

• hodowla i/lub AFB -MOTT -test genetyczny ujemny

• hodowla - identyfikacja M.tbc, test lekooporności

• hodowla -epidemiologiczne dochodzenia molekularne, śledzenie

transmisji , badanie kontaktów

Jakie są korzyści z badań molekularnych?

• Szybkość uzyskania wyniku - bezpośrednio z materiału od chorego ,

szybka identyfikacją szczepu prątków

• włączenie natychmiastowego leczenia przeciwprątkowego , izolację chorych ,zapobieganie transmisji, badanie kontaktów

• Informacja w postaciach skąpoprątkowych ( gruźlica pozapłucna , u dzieci ) w

sytuacji kiedy konwencjonalne testy są ujemne –np.z AFB (-) i hodowlą

• Umożliwiają diagnostykę chorego z podejrzeniem TB w sytuacji ,

materiał został wysłany tylko na badanie hist pat

RAPORT WHO GRUŹLICA OPORNA NA LEKI 2013

Globalnie, 3,6% chorych TB nowowykrytych i 20,2% wcześniej leczonych ma status MDR-TB

Na podstawie danych z 92 krajów zakłada się, że 9,6% przypadków MDR-TB ma postać XDR-TB.

Gruźlica lekooporna MDR i XDR na świecie

MDR-TB XDR-TB

Peru

Płd. Afryka

Indie

Chiny

Federacja Rosyjska

~480.000 nowych przypadków MDR TB (3.6%)

45 000 XDR TB – 9.6 % wśród MDR TB

Raporty z XDR TB 58 krajów (2009r), 77 krajów (2011r) ,92 krajów w 2013

TDR TB – Iran – 15 chorych (2009 r), Indie-4 chorych (2012 r) Indie Hospital in Andheri

Dziecko z TDR (2013)

TDR TB

Koszt leczenia TB

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

17000

134000

330000

126000

124000 zmniejszenie wydajności wtrakcie leczenia

bezpośrednie koszty leczenia zuwzględnieniem

$

Leczenie i diagnostyka Zarządzanie i opieka Opieka domowa Hospitalizacja

http://www.cdc.gov/nchhstp/newsroom 2015

554 000 $

260 000 $

17 000 $

DS-TB MDR-TB XDR-TB leczenie 6-9 m-cy leczenie20-26 m-cy leczenie 32 m-ce

U chorych po raz pierwszy diagnozowanych w kierunku gruźlicy

należy wykonać badanie bakterioskopowe , molekularne, posiew na

pożywkach płynnych i stałych, identyfikację oraz test lekooporności

U chorych ze wznową gruźlicy należy uwzględnić możliwość

wystąpienia lekooporności prątków i poza badaniami wymienionymi

wykonać molekularny test w kierunku lekooporności

Rekomendacja 8

Pneumonol. Alergol.81,4 2013

Testy lekooporności

MDR, XDR

• Testy lekooporności wykonywane na pożywkach płynnych 5 – 18 dni (mediana 6,8) L-J 28 - 54 (mediana 29,1)

• Szczepy prątków gruźlicy zdiagnozowane w laboratoriach regionalnych muszą być weryfikowane w Krajowym Referencyjnym Laboratorium

GenoType

Zestawy do oznaczania lekooporności

Lekooporności Mycobacterium tuberculosis complex z uzyskanej hodowli lub próbki klinicznej AFB (+)

GenoType MTBDRplus (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na

RMP i INH) Czas badania – 5 godzin

GenoType MTBDRsl (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na

fluorochinolony, aminoglikozydy i etambutol) Czas badania – 5 godzin

Wyniki badań molekularnych lekooporności potwierdzone konwencjonalnymi metodami

Dlaczego??

fenotyp lekooporności niewykrywany przez testy molekularne

• nie wszystkie mutacje powodujące oporność wykrywane w testach

• mutacja na zewnątrz regionu badanego inne nieznane mechanizmy oporności

• niektóre mutacje powodują tzw niskie miano oporności np. chinolony lek może być stosowany w wyższych dawkach

• Sekwencjonowanie całego genomu -porównanie genomu szczepów lekoopornych i wrażliwych wykrycie nowych mutacji

Zastosowanie testów molekularnych w diagnostyce TB

Wykrywanie

Wykrycie obecności prątków gruźlicy w badanym materiale

Celem jest wykrycie sekwencji specyficznych dla

M. tuberculosis complex

Pozytywny wynik testu świadczy o obecności prątków M. tuberculosis

complex w materiale klinicznym

Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli

Lekooporność

Wykrycie oporności na leki przeciwprątkowe, np. INH, RMP

Celem jest wykrycie mutacji odpowiedzialnej za oporność na

lek, np. mutacje w rpoB oporność na RMP

Wykrycie mutacji w danym genie świadczy o oporności prątków na

badany lek

Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli

Identyfikacja

Identyfikacja gatunkowa prątków

Amplifikacja specyficznych sekwencji dla danego gatunku

prątków

Identyfikacja do gatunku prątków MOTT oraz w obrębie

M. tuberculosis complex

Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli

National Institute for Materials Science. "A rapid, paper-based diagnostic test for tuberculosis." ScienceDaily. ScienceDaily, 3 October 2013

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■

■■□■■■■■□■■■■■■□■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

Spoligotypowanie = metoda przesiewowa

1 2 3 4

1 2 3 4

SZCZEPY RÓŻNE SZCZEPY IDENTYCZNE

Zastosowanie metody bardziej różnicującej

Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

Wzór molekularny Beiging

leczenie gruźlicy mniej skuteczne wobec szczepów

genotypu Beinging nie związane z lekooporności.

J Infect Dis. (2010) 201 (4): 553-557.

W Europie >80% MDR

Konferencja TB PAN-NET Mediolan czerwiec 2014

Dlaczego świat boi się prątków Beijing?

Szybko nabywają oporności na leki

Większa patogenność

Łatwo transmitowane

Oporne na działanie mechanizmów obronnych człowieka

Namnażają się w makrofagach i monocytach

Nieprzewidywalna odpowiedź na leczenie

Analiza 106 szczepów Beijing

wyizolowanych od chorych w Polsce

w latach 2000-2014 Liczba szczepów

Obcokrajowcy

(%)

Polacy

(%)

Ogółem

(%)

42 (40) 64 (60) 106 (100)

Płeć Mężczyźni 31 (29) 55 (53) 86 (82)

Kobiety 11 (10) 9 (8) 20 (18)

Wiek Dorośli 38 (36) 62 (58) 100 (94)

Dzieci (0-14) (troje 0-3 lat) 4 (4) 2 (2) 6 (6)

Szczepy lekowrażliwe 11(10) 11(10) 22 (20)

Szczepy lekooporne 30 (28) 54 (52) 84 (80)

Liczba szczepów MDR

Wśród MDR

pre-XDR

XDR

18 (17)

4 (4)

2 (2)

53 (50)

14 (13)

6 (6)

71 (67)

18 (20)

8 (8)

W Polsce w populacji chorych na gruźlicę typu Beijing dominuje postać oporna na leki p/prątkowe (80%)

MDR-TB – 42% Pre-XDR-TB - 20%

XDR-TB – 8%

Wszystkie szczepy lekooporne

izolowane od chorych na gruźlicę w Polsce

należy weryfikować metodami genotypowania

w celu określenia ich przynależności do rodziny molekularnej Beijing.

Hist - Pat

Ziarniniaki nie są strukturą swoistą dla gruźlicy i mogą

występować w innych chorobach jak:

• mykobakterioza

• sarkoidoza,

• chłoniaki

• bruceloza

• choroba kociego pazura

• grzybice

• ziarniniakowatości Wegenera

• odczyny na ciało obce

Znalezienie ziarniniaków nawet z martwicą nie upoważnia do his-pat

rozpoznania tbc

Diagnostyka TB

Płyn mózgowo-rdzeniowy

Płyn z opłucnej

Płyn z otrzewnej

Płyn z osierdzia

Węzły chłonne

Tkanki

Biopsje

Mocz

Plwocina

Wydzielina oskrzelowa

Popłuczyny oskrzelowe

BAL

Popłuczyny żołądkowe

Badania genetyczne

Hodowla

Materiały pozapłucne Materiały płucne

Materiały

histopatologiczne

76 materiałów utrwalonych w

parafinie badanych metodą genetyczną

51,3% (39) mat.

(+) bad. gen.

48,7% (37) mat.

(-) bad. Gen.

Wyniki badań 37 mat. hist.-pat. z barwieniem

Z-N

37 mat.

23 mat.

Z-N (-)

5 (22%) mat.

Bad. gen.(+)

18 (78%) mat.

Bad.gen. (-)

14 mat.

Z-N (+)

10 (72%) mat.

bad.gen. (+)

4 (28%) mat.t

bad.gen. (-)

Testy IGRA (Interferon-Gamma Release Assay)

Quanti FERON-TB GOLD (Cellestis, Carnegie, Australia)

T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Abingdon, Wielka Brytania)

Zasada działania testów IGRA

ocena produkcji interferonu γ wydzielanego przez limfocyty T krwi obwodowej po

stymulacji swoistymi antygenami ESAT-6 (early secretory antigen target 6) i CFP

10 (culture filtrate protein 10) kodowanymi w regionie RD1 (Region of Difference 1)

genomu M.tuberculosis

brak go w genomie prątków BCG i w większości prątków środowiskowych z

wyjątkiem: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum

Możliwość zastosowania testu IGRA T-SPOT.TB do identyfikacji aktywnej postaci gruźlicy

• z materiałów klinicznych:

• BALf do diagnostyki gruźlicy płuc

• płyn z opłucnej postaci pozapłucnej

•

W literaturze ukazały się publikacje dotyczące wykorzystania testu IGRA z płynów do diagnostyki gruźlicy

Jafari C. i wsp. (BALf)/ 3 rozmazy plwociny

negatywne

Losi M. i wsp. (pł.z opłucnej)/czułość 95% i

swoistość 76%

Trajman i wsp. czułość 89% i swoistość 97%

T-SPOT.TB w diagnostyce gruźlicy płuc i postaci pozapłucnej

Test IGRA T-SPOT.TB

71 chorych w IGiChP w latach 2012–13

71 chorych z krwi obwodowej wykrycie LTBI

• BALf (55) , płynów z opłucnej (16) aktywnej gruźlicy

• Ilość limfocytów T wydzielających interferon gamma w płynie opłucnowym i BALf oznaczano metodą ELISpot (T-SPOT.TB).

• Równolegle mat. poddano rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej

• Podstawę rozpoznania TB stanowiły wynik hodowli

płynu z opłucnej lub BALf.

71

(71 krwi, 55 BALf i 16 płynów z

opłucnej)

10

+ T-SPOT.TB z krwi

10

+ T-SPOT.TB z płynów

ustrojowych

1

+ T-SPOT.TB z pł. z opłucnej

1 potwierdzony mikrobiologicznie

wyhodowano szczep M. tbc

9

+ T-SPOT.TB z BALf

4 potwierdzone mikrobiologicznie

wyhodowano szczep M. tbc

LTBI

Aktywna TB

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■

■■□■■■■■□■■■■■■□■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■

Spoligotypowanie = metoda przesiewowa

1 2 3 4

1 2 3 4

SZCZEPY RÓŻNE SZCZEPY IDENTYCZNE

Zastosowanie metody bardziej różnicującej

Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

Kontaminacja bronchoskopu –

PACJENTKA 1 PACJENTKA 2

Obraz kliniczny Zmiany wskazujące na

proces gruźliczy Brak zmian

Data bronchoskopii 13.05.08 15.05.08

AFB +++ -

Sonda genetyczna + +

Hodowla + +

Lekooporność INHRSMR INHRSMR

Analiza molekularna wykazała identyczne wzory molekularne

szczepów od obu pacjentek

Zakażenia krzyżowe w laboratorium

Nr próbki/

pacjenta

Wyniki genotypowania szczepów

Spoligotyping

MIRU-VNTR

A 3774 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■□□■■■■■■■■□□□□■□□■■■■ T4_CEU1 39 352633232433335

3776 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■□□■■■■■■■■□□□□■□□■■■■ T4_CEU1 39 352633232433335

B

4892* ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■ H1 47 323634233232425

4893* ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■ H1 47 323634233232425

4894 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■ H1 47 323634233232425

C 7511 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■ T2 52 353625232433538

7512 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■ T2 52 353625232433538

D

562B ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■ T1 53 333634242232125

571 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■ T1 53 333634242232125

573 ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■ T1 53 333634242232125

Częstość występowania kontaminacji krzyżowych

w Laboratorium Prątka

w latach 2011 - czerwiec 2014

Liczba materiałów klinicznych od chorych z podejrzeniem gruźlicy

28.308

Liczba wyhodowanych szczepów / liczba chorych z potwierdzeniem TB

598 szczepów / 408 chorych

Liczba przypadków podejrzanych o zakażenie krzyżowe / liczba szczepów

12 przypadków / 26 szczepów

Liczba przypadków potwierdzonych / liczba szczepów fałszywych

4 przypadki potwierdzonej kontaminacji / 5 szczepów

0.8%

Przypadek Nr badania Data

posiewu AFB

Obfitość/czas

wzrostu na

pożywce stałej

Czas wzrostu

na pożywce

płynnej

Wzór DNA

szczepu Wynik analizy

A

3774

plwocina 27.05.2011

+++ +++/15 dni NW 352633232433335 Źródło kontaminacji

3776

p.oskrzelowe - +/13dni NW 352633232433335

Materiał

skontaminowany

B

4892

plwocina

02.08.2012

++ ++/18dni +/7dni 323634233232425 Źródło kontaminacji

4894

Plwocina

- +/79dni NW 323634233232425 Materiał

skontaminowany

C

7511

p.oskrzelowe

15.11.2013

- +/18dni +/12dni 353625232433538 Źródło kontaminacji

7512

p.oskrzelowe

- +/46dni +/19dni 353625232433538 Materiał

skontaminowany

D

562B

Plwocina

23.01.2014

+++ +/18 dni +18dni 333634242232125 Źródło kontaminacji

571

p.oskrzelowe

- Brak wzrostu +/19dni 333634242232125 Materiał

skontaminowany

573

p.oskrzelowe

- Brak wzrostu +/26dni 333634242232125 Materiał

skontaminowany

4 przypadki potwierdzonej kontaminacji krzyżowej

Podsumowanie

Znalezienie czynnika sprawczego gruźlicy i procesem trudnym i

wymaga ścisłej współpracy mikrobiologów z klinicystami

Wiarygodność mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy wymaga

zastosowania najnowszych metod diagnostycznych i powinna

być wykonywana w laboratoriach prątka o najwyższym

poziomie referencyjności

czas wykonania badania !!!!!!

Podsumowanie

• W ostatniej dekadzie metody szybkiej diagnostyki TB w tym testy oporności umożliwiły wczesne wykrycie chorego z TB i identyfikację lekoopornej gruźlicy

• Problemem pozostaje czułość wykrywania gruźlicy u dzieci, zakażonych HIV i postaci pozapłucnych