SUPPLEMENTAL DATA 

AphA and LuxR/HapR Reciprocally Control Quorum Sensing in Vibrios 

 

Steven T. Rutherford, Julia C. van Kessel, Yi Shao, Bonnie L. Bassler 

 

Additional Materials and Methods 

Supplemental Tables S1‐S4 

Supplemental Figures S1‐S5  

Supplemental References 

 

 

MATERIALS AND METHODS 

Mapping Tn5 insertions 

The  locations  of  the  Tn5  insertions  in  16 mutants were mapped.  To  do  this,  total DNA was 

prepared from cells harboring Tn5 insertions, DNA was digested with KpnI, ligated and transformed into 

E. coli S17λpir. The  transposon contains an R6K ori allowing  it  to  replicate  in  the pir+ E. coli. Plasmids 

were  isolated  from  kanamycin‐resistant  transformants  and  the  DNA  flanking  the  transposon  was 

sequenced with primers VC029 and VC030 (Supplemental Table S4). Sequences were analyzed by BLAST 

against  the  V.  harveyi  genome  (BAA‐1116)  to  determine  the  locations  of  the  insertions.  Of  the  16 

insertions  that were mapped,  six exhibited high GFP production  in  the  screen and of  those  six,  three 

mapped to VIBHAR_00046, aphA.   

 

RNA isolation 

For  the  Trizol  approach,  cell  pellets  (3 ml) were  resuspended  in  1 ml  Trizol  (Invitrogen)  and 

incubated  for 5 min at  room  temperature. 200 μl  chloroform was added,  the preparation was mixed 

vigorously, and incubated for 5 min at room temperature. Following centrifugation for 15 min at 4°C at 

12,000 RPM,  the aqueous phase containing nucleic acids was  removed  to a clean  tube and  incubated 

with  500  μl  isopropanol  for  10 min. Nucleic  acids were  pelleted  at  12,000  RPM  at  4°C  for  15 min, 

washed with 750 μl 75% ethanol, pelleted again for 5 min, and the ethanol was removed. Dried pellets 

were  resuspended  in DEPC‐treated dH2O, and  treated with DNase using DNA‐free  (Ambion). RNA was 

further purified over a Qiagen RNeasy column and eluted  in dH2O. For the Qiagen RNeasy Minikit with 

RNAprotect, 500 μl of cells were added to 1 ml of RNAprotect and pelleted. RNA was prepared from the 

pellet using the RNeasy Minikit protocol. The final elution was treated with RNase‐free DNaseI (Ambion) 

2  

which was  inactivated with  the Ambion DNaseI  inactivation  resin.  The  cleaned DNase‐free  RNA was 

quantified by spectrophotometry. 

 

AphA purification 

Plasmid pSTR0606  encoding  a  6‐His‐tag,  a  thrombin  cleavage  sequence,  and V.  harveyi  aphA 

under  the  T7  promoter was  transformed  into  BL21  (DE3)  cells  and  grown  overnight  in  LB medium 

containing kanamycin. The overnight culture was diluted 1/100  into 1 L of fresh medium and grown to 

an OD600 of ~0.5. The culture was shifted to 18°C for 1 h and then induced with 1 mM IPTG for 18 h. Cells 

were collected by centrifugation and  frozen at  ‐80°C. The pellet was  resuspended  in 20 ml of 20 mM 

sodium  phosphate  buffer,  pH  7.4,  500 mM NaCl,  5 mM  imidazole.  Cells were  disrupted  using  a  cell 

cracker  at  >1000  psi  and  the  insoluble material was  pelleted  by  centrifugation  at  15,000  rpm.  The 

clarified supernatant was applied to a 5 ml nickel‐chelating column using the AKTA purification system 

(GE  Biosciences), washed with  5  column  volumes  of  buffer,  and  eluted with  an  imidazole  gradient. 

Fractions from a homogenous peak were pooled, the thrombin site was cleaved and cleaned (Novagen), 

and  the  final preparation was dialyzed against 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 

mM DTT, and 20% glycerol. Aliquots were stored at ‐80°C.  

 

Fluorescence Anisotropy 

DNA  binding was  assessed  by  fluorescence  anisotropy. Oligonucleotides  (Supplemental  Table 

S4) were purchased from IDT to be used as substrates for fluorescence anisotropy. One oligonucleotide 

of  a  complementary  pair was  ordered  containing  a  5’  fluoroscein  tag.  Substrates were  annealed  in 

annealing buffer (50 mM Tris‐HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) at 95°C for 1 min, followed by cooling 1°C per 

min for 70 minutes. AphA protein was incubated with 1 nM annealed substrate and 10 μg/ml poly dIdC 

3  

in assay buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM DTT, 200 μM EDTA, and 100 μg/ml BSA) for 

30 min at 30°C in triplicate for each concentration of AphA. Fluorescence anisotropy was performed as 

described  (Pompeani  et  al.  2008)  except  that  reactions were  incubated  for  30 min  at  30°C,  and  the 

concentrations of AphA protein added are  indicated  in each graph. One‐site specific non‐linear binding 

curves were fit to the data using GraphPad Software and the Kd were interpolated from the plots. Three 

samples were averaged to obtain each point and the Kd and SD for the fit line are shown. 

 

Microarray analysis 

Microarrays were designed using Agilent software in a 4 x 44 grid format. Each array contained 

three 60‐mer probes per open reading frame in the V. harveyi genome (Genbank strain BAA‐1116), each 

spotted  in  duplicate,  for  a  total  of  six  probes  per  gene  (Agilent  custom  array  2521087).  cDNA was 

synthesized from 10‐15 μg RNA and labeled with either Cyanine 3‐dUTP or Cyanine 5‐dUTP (de Lorenzo 

and Timmis) at a final concentration of 100 μM using Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) in 

a 30 μl  reaction at 46°C  for 3 h. RNA was degraded with 15 μl 0.1 M NaOH at 70°C  for 30 min and 

neutralized with 15 μl 0.1 M HCl. The labeled cDNA was purified over a Qiagen QIAquick column, eluted 

in  30  μl  DEPC‐treated  dH2O,  and  quantified  spectrophotometrically  using  a  Nanodrop.  Agilent  gene 

expression  hybridization  kits were  used  for  hybridization.  Approximately  30  pmol  of  Cy3‐  and  Cy5‐

labeled cDNA were combined in equal concentrations (up to 1000 ng per cDNA) with 11 μl 10X blocking 

agent in a volume of 55 μl, incubated 5 min at 95°C, and 5 min at room temperature. Agilent 2X Hi‐RPM 

hybridization buffer (55 μl) was added to each reaction, and 100 μl was hybridized to each array for 17 h 

at 65°C, rotating at 10 RPM. Slides were washed for 1 min  in Agilent wash buffer 1 twice, for 1 min  in 

Agilent wash  buffer  2,  and  then  for  30  seconds  in  acetonitrile.  Arrays were  scanned  on  an  Agilent 

scanner  using  the  extended  dynamic  range  (PMT  5%  and  100%)  in  the  red  and  green  channels  at  a 

4  

resolution of 5 microns, single pass scanning mode. Data were extracted with Agilent Feature Extractor 

and analyzed on the Princeton University Microarray Database (PUMAdb; http://puma.princeton.edu/) 

based on (Gollub et al. 2003). Data were retrieved for probes that were above background (p < 0.0001), 

and  differed more  than  2‐fold.    Probes were  averaged  for  each  gene.  Four  arrays were  performed 

comparing three  independent cultures of each strain as well as a dye‐swap comparison  for one set of 

strains. Data are available on the PUMAdb website (http://puma.princeton.edu/) 

 

 

SUPPLEMENTAL TABLES 

 

Supplemental Table S1. List of AphA‐regulated genes that displayed greater than two‐fold changes as determined by microarray analysis.   

Function                    Fold change SD Type III secretion apparatus   VIBHAR_01697 || hypothetical protein  ‐2.3  0.3 VIBHAR_01698 || hypothetical protein  ‐4.6  0.9 VIBHAR_01699 || hypothetical protein  ‐6.4  1.1 VIBHAR_01700 || hypothetical protein  ‐6.0  1.3 VIBHAR_01701 || hypothetical protein  ‐5.4  1.0 VIBHAR_01702 || hypothetical protein  ‐6.1  0.9 VIBHAR_01703 || hypothetical protein  ‐6.3  1.0 VIBHAR_01704 || hypothetical protein  ‐5.1  0.8 VIBHAR_01705 || hypothetical protein  ‐4.7  0.9 VIBHAR_01706 || hypothetical protein  ‐4.6  0.7 VIBHAR_01707 || hypothetical protein  ‐7.3  1.1 VIBHAR_01708 || hypothetical protein  ‐7.0  1.3 VIBHAR_01709 || type III secretion system protein  ‐7.5  1.3 VIBHAR_01710 || hypothetical protein  ‐6.1  0.5 VIBHAR_01711 || hypothetical protein  ‐3.9  0.5 VIBHAR_01712 || hypothetical protein  ‐6.5  0.6 VIBHAR_01713 || hypothetical protein  ‐5.6  1.1 VIBHAR_01722 || transcriptional regulator  2.1  0.1 VIBHAR_01723 || Type III secretory pathway, component EscU  ‐3.5  0.4 VIBHAR_01724 || Type III secretory pathway, component EscT  ‐3.2  0.4 VIBHAR_01725 || Type III secretory pathway, component EscS  ‐4.1  0.7 

5  

VIBHAR_01726 || type III secretion system protein  ‐4.3  0.6 VIBHAR_01727 || type III secretion system protein  ‐4.0  0.6 VIBHAR_01728 || hypothetical protein  ‐4.9  0.7 VIBHAR_01729 || hypothetical protein  ‐3.8  0.6 VIBHAR_01730 || type III secretion system ATPase  ‐4.4  0.7 VIBHAR_01731 || hypothetical protein  ‐4.7  0.8 VIBHAR_01732 || hypothetical protein  ‐4.5  0.7 VIBHAR_01733 || hypothetical protein  ‐4.7  0.7 VIBHAR_01734 || hypothetical protein  ‐3.8  0.6 VIBHAR_01735 || hypothetical protein  ‐4.7  1.0 VIBHAR_01736 || Type III secretory pathway, component EscV  ‐4.1  0.6 VIBHAR_01737 || hypothetical protein  ‐3.9  0.6 VIBHAR_01738 || hypothetical protein  ‐4.7  0.9 VIBHAR_01739 || hypothetical protein  ‐4.3  0.4 VIBHAR_01740 || hypothetical protein  ‐3.7  0.6 VIBHAR_01741 || hypothetical protein  ‐4.5  0.6 VIBHAR_01742 || hypothetical protein  ‐5.0  0.6  Metabolism VIBHAR_00205 || lysine decarboxylase  38.7  7.6 VIBHAR_00210 || bifunctionalphosphoribosylamino‐                           imidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase || purH  2.4  0.5 VIBHAR_00597 || phosphoenolpyruvate carboxykinase  2.2  0.3 VIBHAR_00767 || sulfate adenylyltransferase subunit 1 || cysN  2.2  0.0 VIBHAR_00829 || pyruvate kinase  ‐2.1  0.1 VIBHAR_00912 || carbamoyl phosphate synthase small subunit  2.3  0.2 VIBHAR_00926 || glutamate synthase subunit alpha || gltB  2.1  0.1 VIBHAR_00928 || glutamate synthase, large subunit  2.1  0.0 VIBHAR_01077 || bifunctional GMP synthase/glutamine amidotransferase || guaA  2.5  0.3 VIBHAR_01205 || trehalose(maltose)‐specific PTS system components IIBC  2.2  0.3 VIBHAR_01246 || ribose‐phosphate pyrophosphokinase  2.2  0.1 VIBHAR_01843 || thymidine kinase  2.4  0.5 VIBHAR_02039 || phosphoribosylaminoimidazole‐succinocarboxamidesynthase  2.7  0.9 VIBHAR_02116 || cytidine deaminase  ‐2.0  0.1 VIBHAR_02503 || ferredoxin  3.2  0.3 VIBHAR_02721 || protein disulfide‐isomerase  2.3  0.3 VIBHAR_03200 || phosphoribosylaminoimidazole synthetase  2.5  0.6 VIBHAR_03225 || UDP‐N‐acetylglucosamine acyltransferase  ‐2.1  0.2 VIBHAR_03313 || glycerol kinase || glpK  2.1  0.2 VIBHAR_03331 || UDP‐glucose 4‐epimerase  2.2  0.1 VIBHAR_03430 || beta‐N‐hexosaminidase  4.1  1.4 VIBHAR_03432 || phosphoglucomutase/phosphomannomutase  2.9  0.8 VIBHAR_03463 || dihydrolipoamide acetyltransferase || aceF  ‐2.3  0.3 VIBHAR_03491 || pyruvate carboxylase subunit B  2.2  0.1 VIBHAR_03645 || ornithine carbamoyltransferase  2.2  0.2 VIBHAR_04752 || putative aldolase  ‐3.9  0.6 VIBHAR_04753 || hydroxypyruvate isomerase  ‐3.8  0.5 VIBHAR_04849 || maltodextrin phosphorylase  2.3  0.2 VIBHAR_05183 || mannose‐6‐phosphate isomerase  2.3  0.4 VIBHAR_05184 || PTS system fructose‐specific IIABC component  2.6  0.2 

6  

VIBHAR_05207 || undecaprenyl‐phosphategalactosephosphotransferase  2.1  0.1 VIBHAR_05227 || dihydroorotase  2.2  0.3 VIBHAR_05311 || 3,4‐dihydroxy‐2‐butanone 4‐phosphate synthase || ribB  ‐2.2  0.2 VIBHAR_05495 || protoheme IX farnesyltransferase  ‐2.2  0.2 VIBHAR_05734 || pyridine nucleotide transhydrogenase || pntB  2.2  0.3 VIBHAR_06065 || diaminopimelate decarboxylase  2.1  0.1 VIBHAR_06845 || phosphatidylglycerophosphatase B  ‐2.6  0.4 VIBHAR_06938 || beta‐glucosidase  2.8  0.3  Oxidoreductases VIBHAR_00037 || dihydrolipoamide dehydrogenase  2.4  0.3 VIBHAR_00460 || multifunctional fatty acid oxidation complex subunit alpha || fadB  2.3  0.1 VIBHAR_00929 || Fe‐S oxidoreductase  ‐2.6  0.1 VIBHAR_01076 || inositol‐5‐monophosphate dehydrogenase  3.0  0.8 VIBHAR_02280 || formate dehydrogenase, cytochrome b556 subunit  ‐2.9  0.2 VIBHAR_02342 || glutamate dehydrogenase  ‐2.0  0.1 VIBHAR_02638 || acyl‐CoA dehydrogenase  2.7  0.5 VIBHAR_02782 || coenzyme A disulfide reductase  3.1  0.4 VIBHAR_03270 || Na(+)‐translocating NADH‐quinone reductase subunit F  ‐2.5  0.3 VIBHAR_03271 || Na(+)‐translocating NADH‐quinone reductase subunit E  ‐2.4  0.3 VIBHAR_03273 || Na(+)‐translocating NADH‐quinone reductase subunit C  ‐2.1  0.2 VIBHAR_03462 || dihydrolipoamide dehydrogenase  ‐2.4  0.3 VIBHAR_04750 || 3‐hydroxyisobutyrate dehydrogenase  ‐3.7  0.4 VIBHAR_04751 || 4‐hydroxythreonine‐4‐phosphate dehydrogenase  ‐3.1  0.1 VIBHAR_05341 || glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase  2.1  0.1 VIBHAR_06179 || choline dehydrogenase  2.4  0.2  Flagellar apparatus VIBHAR_01286 || flagellar basal body rod protein FlgB || flgB  ‐2.1  0.1 VIBHAR_01287 || flagellar basal body rod protein FlgC || flgC  ‐2.2  0.2 VIBHAR_01288 || flagellar basal body rod modification protein || flgD  ‐2.2  0.2 VIBHAR_01289 || flagellar hook protein FlgE || flgE  ‐2.7  0.3 VIBHAR_01291 || flagellar basal body rod protein FlgF || flgF  ‐4.6  0.7 VIBHAR_01292 || flagellar basal body rod protein FlgG || flgG  ‐4.2  0.7 VIBHAR_01293 || flagellar basal body L‐ring protein || flgH  ‐3.8  0.6 VIBHAR_01294 || flagellar basal body P‐ring protein || flgI  ‐3.9  0.7 VIBHAR_01297 || flagellar hook‐associated protein FlgK || flgK  ‐4.3  0.6 VIBHAR_01298 || flagellar hook‐associated protein FlgL || flgL  ‐4.1  0.6 VIBHAR_01300 || flagellin  ‐4.4  0.3 VIBHAR_01301 || flagellin  ‐2.9  0.5 VIBHAR_03155 || flagellar basal body‐associated protein FliL || fliL  ‐2.2  0.1 VIBHAR_03173 || flagellin  ‐3.1  0.9  Membrane associated VIBHAR_00206 || lysine/cadaverine antiporter || cadB  11.4  2.8 VIBHAR_00416 || inner membrane transport protein YdhC  ‐3.9  1.7 VIBHAR_01268 || cation transport ATPase  4.5  0.5 VIBHAR_03084 || aquaporin Z  ‐2.3  0.3 VIBHAR_04754 || H+/gluconate symporter  ‐2.7  0.3 VIBHAR_05361 || preprotein translocase subunit SecD || secD  6.3  1.0 

7  

VIBHAR_05362 || preprotein translocase subunit SecF || secF  3.4  0.7 VIBHAR_05387 || histidine kinase  ‐2.3  0.3 VIBHAR_06564 || glycine betaine ABC transporter ATP‐binding protein  2.6  0.2 VIBHAR_06904 || outer membrane protein W  ‐8.5  2.6 VIBHAR_06937 || sugar ABC transportor ATP‐binding protein  2.2  0.1  Stress related VIBHAR_00085 || ribonuclease R  2.3  0.2 VIBHAR_00522 || cold shock protein  ‐3.2  0.8 VIBHAR_00624 || prolyl oligopeptidase  ‐2.4  0.7 VIBHAR_02509 || protease  ‐4.8  0.3 VIBHAR_05034 || DnaK suppressor protein  ‐3.6  0.2 VIBHAR_05096 || ATP‐dependent protease  2.3  0.2 VIBHAR_05656 || chitinase  ‐2.3  0.2 VIBHAR_01627 || integrase  2.0  0.1 VIBHAR_01295 || peptidoglycan hydrolase || flgJ  ‐3.3  0.7    Gene Expression VIBHAR_00046 || transcriptional regulator AphA  18.3  6.1 VIBHAR_00224 || DNA‐directed RNA polymerase subunit beta'  ‐2.7  0.7 VIBHAR_00737 || 50S ribosomal protein L16 || rplP  ‐2.2  0.3 VIBHAR_00823 || leucine transcriptional activator || leuO  2.1  0.2 VIBHAR_01182 || GcvB RNA  ‐2.5  0.6 VIBHAR_02633 || DNA‐binding transcriptional regulator HexR  ‐2.8  0.3 VIBHAR_02639 || transcriptional regulator  2.4  0.4 VIBHAR_02927 || methionyl‐tRNA synthetase || metG  2.2  0.1  Quorum sensing VIBHAR_04846 || small RNA qrr2  ‐2.8  0.7 VIBHAR_05322 || small RNA qrr3  ‐2.8  0.5 VIBHAR_06697 || small RNA qrr4  ‐3.1  0.4  Pilus  VIBHAR_04793 || P pilus assembly protein  ‐2.1  0.1 VIBHAR_06198 || prepilin peptidase CpaA  ‐2.4  0.3 VIBHAR_06199 || Flp pilus assembly protein  ‐3.5  0.9  Hypothetical VIBHAR_00076 || hypothetical protein  2.1  0.1 VIBHAR_00140 || hypothetical protein  ‐2.1  0.2 VIBHAR_00454 || hypothetical protein  2.0  0.2 VIBHAR_00496 || hypothetical protein  ‐2.7  0.5 VIBHAR_00521 || hypothetical protein  ‐2.7  1.2 VIBHAR_00890 || hypothetical protein  2.2  0.1 VIBHAR_01084 || hypothetical protein  2.1  0.0 VIBHAR_01206 || hypothetical protein  2.6  0.3 VIBHAR_01267 || hypothetical protein  3.0  0.8 VIBHAR_01269 || hypothetical protein  2.6  0.3 VIBHAR_01272 || hypothetical protein  ‐4.1  1.2 VIBHAR_01273 || hypothetical protein  ‐5.4  2.8 

8  

VIBHAR_01276 || hypothetical protein  ‐4.0  0.4 VIBHAR_01277 || hypothetical protein  ‐3.5  0.5 VIBHAR_01278 || hypothetical protein  ‐3.9  0.6 VIBHAR_01326 || hypothetical protein  ‐2.4  0.3 VIBHAR_01372 || hypothetical protein  ‐2.5  0.2 VIBHAR_01409 || hypothetical protein  ‐2.5  0.6 VIBHAR_01539 || hypothetical protein  2.4  0.3 VIBHAR_01540 || hypothetical protein  2.3  0.2 VIBHAR_01547 || hypothetical protein  ‐3.8  0.3 VIBHAR_01548 || hypothetical protein  ‐3.3  0.4 VIBHAR_01558 || hypothetical protein  ‐5.7  1.5 VIBHAR_01680 || hypothetical protein  ‐2.3  0.3 VIBHAR_01691 || hypothetical protein  2.0  0.1 VIBHAR_01692 || hypothetical protein  ‐3.9  0.4 VIBHAR_01693 || hypothetical protein  ‐3.3  0.3 VIBHAR_01694 || hypothetical protein  ‐2.5  0.4 VIBHAR_01857 || hypothetical protein  2.1  0.1 VIBHAR_01952 || hypothetical protein  ‐2.1  0.0 VIBHAR_02153 || hypothetical protein  ‐12.4  1.8 VIBHAR_02154 || hypothetical protein  ‐7.6  1.3 VIBHAR_02190 || hypothetical protein  ‐3.3  0.4 VIBHAR_02220 || hypothetical protein  ‐2.8  0.3 VIBHAR_02260 || hypothetical protein  2.0  0.0 VIBHAR_02276 || hypothetical protein  ‐2.2  0.3 VIBHAR_02279 || hypothetical protein  ‐2.4  0.2 VIBHAR_02281 || hypothetical protein  ‐3.3  0.4 VIBHAR_02308 || hypothetical protein  ‐3.0  0.3 VIBHAR_02309 || hypothetical protein  ‐2.0  0.6 VIBHAR_02310 || hypothetical protein  ‐2.5  0.1 VIBHAR_02311 || hypothetical protein  ‐2.3  0.3 VIBHAR_02312 || hypothetical protein  ‐2.1  0.2 VIBHAR_02313 || hypothetical protein  ‐2.2  0.1 VIBHAR_02368 || hypothetical protein  ‐2.1  0.2 VIBHAR_02500 || hypothetical protein  ‐2.6  0.3 VIBHAR_02504 || hypothetical protein  2.7  0.0 VIBHAR_02505 || hypothetical protein  2.5  0.1 VIBHAR_02506 || hypothetical protein  2.7  0.2 VIBHAR_02507 || hypothetical protein  2.0  0.1 VIBHAR_02562 || hypothetical protein  2.1  0.2 VIBHAR_02584 || hypothetical protein  2.8  0.3 VIBHAR_02720 || hypothetical protein  2.3  0.2 VIBHAR_02739 || hypothetical protein  ‐2.3  0.2 VIBHAR_02783 || hypothetical protein  2.3  0.4 VIBHAR_02785 || hypothetical protein  2.2  0.1 VIBHAR_02790 || hypothetical protein  ‐2.2  0.1 VIBHAR_02791 || hypothetical protein  ‐2.4  0.2 VIBHAR_02831 || hypothetical protein  ‐5.0  0.7 VIBHAR_02832 || hypothetical protein  ‐5.3  0.7 VIBHAR_02833 || hypothetical protein  ‐5.5  0.7 VIBHAR_02956 || hypothetical protein  2.1  0.2 

9  

VIBHAR_02990 || hypothetical protein  ‐4.2  0.5 VIBHAR_03015 || hypothetical protein  ‐2.2  0.3 VIBHAR_03055 || hypothetical protein  ‐2.3  0.1 VIBHAR_03156 || hypothetical protein  ‐3.0  0.3 VIBHAR_03269 || hypothetical protein  ‐2.4  0.3 VIBHAR_03287 || hypothetical protein  ‐2.4  0.5 VIBHAR_03408 || hypothetical protein  ‐3.8  0.8 VIBHAR_03423 || hypothetical protein  7.2  2.1 VIBHAR_03424 || hypothetical protein  9.5  2.7 VIBHAR_03425 || hypothetical protein  11.8  3.0 VIBHAR_03426 || hypothetical protein  8.1  2.4 VIBHAR_03427 || hypothetical protein  6.9  2.1 VIBHAR_03428 || hypothetical protein  4.8  1.1 VIBHAR_03429 || hypothetical protein  4.6  1.0 VIBHAR_03431 || hypothetical protein  4.1  1.3 VIBHAR_03437 || hypothetical protein  ‐3.3  0.6 VIBHAR_03693 || hypothetical protein  ‐1.8  0.6 VIBHAR_03694 || hypothetical protein  ‐2.6  0.3 VIBHAR_03696 || hypothetical protein  ‐2.3  0.3 VIBHAR_04769 || hypothetical protein  ‐2.2  0.1 VIBHAR_04844 || hypothetical protein  ‐2.5  0.4 VIBHAR_04892 || hypothetical protein  ‐2.1  0.2 VIBHAR_05010 || hypothetical protein  ‐2.9  0.1 VIBHAR_05012 || hypothetical protein  ‐2.9  0.4 VIBHAR_05013 || hypothetical protein  ‐2.5  0.2 VIBHAR_05014 || hypothetical protein  ‐2.5  0.2 VIBHAR_05015 || hypothetical protein  ‐2.2  0.2 VIBHAR_05017 || hypothetical protein  ‐2.1  0.1 VIBHAR_05026 || hypothetical protein  ‐2.8  0.4 VIBHAR_05027 || hypothetical protein  ‐2.9  0.2 VIBHAR_05028 || hypothetical protein  ‐2.8  0.2 VIBHAR_05029 || hypothetical protein  ‐2.7  0.1 VIBHAR_05030 || hypothetical protein  ‐2.9  0.3 VIBHAR_05031 || hypothetical protein  ‐2.6  0.2 VIBHAR_05032 || hypothetical protein  ‐2.7  0.2 VIBHAR_05033 || hypothetical protein  ‐3.5  0.2 VIBHAR_05035 || hypothetical protein  ‐3.4  0.2 VIBHAR_05036 || hypothetical protein  ‐3.1  0.2 VIBHAR_05037 || hypothetical protein  ‐2.9  0.1 VIBHAR_05038 || hypothetical protein  ‐3.2  0.3 VIBHAR_05039 || hypothetical protein  ‐2.4  0.1 VIBHAR_05040 || hypothetical protein  ‐2.6  0.1 VIBHAR_05041 || hypothetical protein  ‐2.6  0.2 VIBHAR_05042 || hypothetical protein  ‐2.7  0.2 VIBHAR_05043 || hypothetical protein  ‐2.4  0.1 VIBHAR_05044 || hypothetical protein  ‐2.3  0.4 VIBHAR_05061 || hypothetical protein  2.3  0.4 VIBHAR_05068 || hypothetical protein  2.1  0.2 VIBHAR_05070 || hypothetical protein  2.1  0.1 VIBHAR_05115 || hypothetical protein  2.2  0.2 

10  

VIBHAR_05162 || hypothetical protein  ‐1.8  0.6 VIBHAR_05185 || hypothetical protein  2.3  0.1 VIBHAR_05206 || hypothetical protein  2.0  0.1 VIBHAR_05355 || hypothetical protein  ‐2.4  0.1 VIBHAR_05392 || hypothetical protein  ‐4.3  0.5 VIBHAR_05607 || hypothetical protein  ‐2.3  0.4 VIBHAR_05673 || hypothetical protein  ‐4.6  0.4 VIBHAR_05674 || hypothetical protein  ‐4.5  0.8 VIBHAR_05722 || hypothetical protein  ‐4.6  0.8 VIBHAR_05738 || hypothetical protein  ‐2.1  0.3 VIBHAR_05763 || hypothetical protein  ‐5.3  0.8 VIBHAR_05777 || hypothetical protein  ‐2.2  0.1 VIBHAR_05778 || hypothetical protein  ‐2.2  0.1 VIBHAR_05779 || hypothetical protein  ‐2.2  0.9 VIBHAR_05780 || hypothetical protein  ‐2.1  0.7 VIBHAR_05871 || hypothetical protein  ‐4.4  0.3 VIBHAR_05906 || hypothetical protein  2.1  0.2 VIBHAR_05912 || hypothetical protein  2.3  0.3 VIBHAR_06091 || hypothetical protein  2.1  0.2 VIBHAR_06124 || hypothetical protein  ‐2.7  0.6 VIBHAR_06125 || hypothetical protein  ‐2.2  0.2 VIBHAR_06130 || hypothetical protein  ‐2.2  0.3 VIBHAR_06194 || hypothetical protein  ‐1.8  0.6 VIBHAR_06197 || hypothetical protein  ‐2.4  0.5 VIBHAR_06262 || hypothetical protein  ‐2.8  0.6 VIBHAR_06321 || hypothetical protein  ‐2.9  0.1 VIBHAR_06327 || hypothetical protein  2.5  0.2 VIBHAR_06364 || hypothetical protein  2.9  1.7 VIBHAR_06365 || hypothetical protein  3.6  0.8 VIBHAR_06366 || hypothetical protein  3.5  0.6 VIBHAR_06410 || hypothetical protein  ‐2.1  0.2 VIBHAR_06418 || hypothetical protein  ‐2.2  0.4 VIBHAR_06567 || hypothetical protein  2.9  0.4 VIBHAR_06628 || hypothetical protein  ‐2.3  0.2 VIBHAR_06684 || hypothetical protein  ‐4.3  0.4 VIBHAR_06685 || hypothetical protein  ‐6.0  1.1 VIBHAR_06741 || hypothetical protein  ‐5.4  2.0 VIBHAR_06846 || hypothetical protein  2.4  0.3 VIBHAR_06939 || hypothetical protein  2.5  0.2 VIBHAR_06940 || hypothetical protein  2.2  0.1 VIBHAR_06942 || hypothetical protein  2.5  0.3 VIBHAR_06943 || hypothetical protein  2.2  0.2 VIBHAR_07080 || hypothetical protein  ‐2.2  0.3 VIBHAR_07099 || hypothetical protein  ‐2.6  0.2       

11  

    Supplemental Table S2. Strains used in this study.     Strain   Relevant genotype      Figure    Source E. coli strains    MC4100  wild‐type        2,5    (Casadaban 1976)    STR0018  MC4100 with luxO D47E at λatt site  2    this study    S17λpir  wild‐type             (de Lorenzo and Timmis 1994)  V. harveyi strains    BB120  wild‐type BAA‐1116      s2,s5    (Bassler et al. 1997)    JAF78   BB120 ΔluxO::cm      5,s6    (Freeman and Bassler 1999)    JAF548  BB120 luxO D47E::kan      6,s1,s5,s6   (Freeman and Bassler 1999)    JV48    BB120 ΔaphA::cm      s5    this study    JV50    JAF548 ΔaphA::cm      6,s1,s5,s6   this study    JV55    KM810 ΔaphA::cm      2,6    this study    JS202    KT282 ΔluxR        5    J. Schaffer, unpublished    KM83   BB120 luxO D47E::cm      5     (Tu and Bassler 2007)    KM806  JAF78, ΔluxR          5    K. Mok, unpublished    KM810  JAF548, ΔluxR         2,6    K. Mok, unpublished    KM812  KM83, ΔluxR         4, 5    K. Mok, unpublished    KT282   BB120 Δqrr1‐5        4,s2    (Tu and Bassler 2007)    STRVh0095  TL45::Tn5         2    this study    TL45      ΔluxM, ΔluxS, ΔcqsS, ΔluxR, Δqrr4::gfp  2    (Long et al. 2009)    V. cholerae strains    C6706str2  El tor wild‐type            (Thelin and Taylor 1996)    JC1796  C6706str2 luxO D47E, ΔhapR    7    W. Ng, unpublished    WN863  CW2035 (C6706str2 luxO D47E)   s4    (Waters et al. 2008)    WN865  CW2037 (C6706str2 ΔluxO)    7    (Waters et al. 2008)    WN868  C6706str2 ΔluxO, ΔhapR    7    W. Ng, unpublished    STRVc0044  JC1796 ΔaphA        7    this study   

12  

 

Supplemental Table S3. Plasmids used in this study.   Plasmid name  Description            Source pASK75   empty vector             (Skerra 1994) pDL1711   pBBR11MCS with vpsT‐lux        D. Lenz, unpublished pET28    empty vector            EMD Biosciences pEVS143  empty vector            (Dunn et al. 2006) pJV17    empty vector             this study pJV137     pLAFR2 ΔaphA::cm          this study pKT1111  empty vector             (Tu and Bassler 2007)   pKT1136  pKT1111 with qrr4‐gfp           (Tu and Bassler 2007) pLAFR2   empty vector            (Friedman et al. 1982) pRHA109   empty vector             (Giacalone et al. 2006) pRL27    R6K origin, Tn5 mutagenesis plasmid      (Larsen et al. 2002) pSTR0227  pRHA109 with qrr4          this study pSTR0502   pKT1111 with aphA (‐315 to +603)(StuI and BamH1)  this study pSTR0504   pEVS143 with aphA (‐22 to +606) (StuI and BamH1)  this study pSTR0538  pASK75 with aphA (‐315 to +603) (StuI and BamH1)  this study pSTR0606  pET28 with aphA between NdeI and XhoI    this study pSTR0612      pEVS143 with V. cholerae aphA (StuI and BamH1)  this study pSTR0615   pSTR0504 with aphA K63E mutant       this study pTL18    IPTG inducible FLP recombinase       (Long et al. 2009) pYS069   pEVS143 with aphA‐gfp (AvrII and KpnI)     this study pYS100   pEVS143 with mutant aphA‐gfp (deletion in Figure 5C)  this study pZD46    pKAS‐ΔaphA            Z. Donnell, unpublished  

13  

 

Supplemental Table S4. Primers used in this study. 

Primer name  Sequence            Use JV034    GGAGATATACATATGGCTAGCAAAGGA       pJV17 (insert) JV035    GGCTGCCTGACTCTAGAAGCATTGGT       PJV17 (insert) JV036    ACGTTCTAGAGAGCTGTTGACAATTAATCATC     pJV17 (vector) JV037    TAAAATATCGAGGCTAGCCATCTTGTTGTTACCTTA   pJV17 (vector) JV345   AAAGTGTAGATAGCTTGTTTACAAGTTTATTGACCATTTG  

GATTGAAGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGT  pJV137 JV346  AAAAGGCTTGCCCAACGGCAAGCCTTTTTCGTTTTATTTA  

AAGTGACGAAATGGGAATTAGCCATGGTCCATATGAAT  pJV137 STR0067  CAGACGGTACCATATGCGGTGTG       pSTR0227 (vector) STR0068  GTATCGTATACGACCAGTCTAAAAAGCG       pSTR0227 (vector) STR0075   AGACCCTTATTAAGCCGAGGGTCAC       pSTR0227 (insert) STR0076   CAGTGGTACCGCTCTAGAAAGAAAAAACGCCAATC 

ACAATAAAGTTG           pSTR0227 (insert) STR0210   GTGTAGGCCTCAACCACTTCTACTATTTGGAC    pSTR0502 STR0211   GTGTAGGCCTCACATTAAAAAACTTAAGCGTCATG   pSTR0504/0538 STR0213   GTGTGGATCCTTAGCCGATCACTTCAAGTT     pSTR0502 STR0213   GTGTGGATCCTTAGCCGATCACTTCAAGTT    pSTR0502/0504/0538 STR0244   CTATCTCGAGATTAGCCGATCACTTCA      pSTR0606 STR0245   CTGTCATATGTCATTACCACACGTAATTC      pSTR0606 STR0255  GTGTAGGCCTACTTAATTTTTGGATTGAAGACATGTCA   pSTR0612 STR0256  GTGTGGATCCTTATGCCATCGCGTTCAATTC     pSTR0612 STR0261   CCTCAAGAAGGCGAGCCAGACCGTAAGGT    QuickChange for pSTR0615 STR0262   ACCTTACGGTCTGGCTCGCCTTCTTGAGG      QuickChange for pSTR0615 VC029    CAGCAACACCTTCTTCACGA        sequencing Tn5 insertion VC030    AACAAGCCAGGGATGTAACG        sequencing Tn5 insertion YS086    GCGCCTAGGCCTGCTGGAAGCTCACAAAT     pYS069 (insert) YS099    GCGGGTACCTACAGTTAGAATTACGTGTGGTAA     pYS069 (insert) YS100    GCGGGTACCGCTAGCAAAGGAGAAGAACTC     pYS069/100 (vector) YS101    GCGCCTAGGGTCGAGCTGTTTCCTGTGT       pYS069/100 (vector) YS163    GATAAACGGCTTTAAGGTGACTATCTACACATTAAAAAAC  pYS100 (insert) YS164    GTTTTTTAATGTGTAGATAGTCACCTTAAAGCCGTTTATC  pYS100 (insert)   Anisotropy probes qrr4 probe 4 

STR0342  TTTGCATCATTTTGCATTTTGCAAATGCGATTTGCAAAATGCGTGCTCAAA STR0343  TTGAGCACGCATTTTGCAAATCGCATTTGCAAAATGCAAAATGATGCAAA 

luxR probe 1 JV436    TTAAGCAACTATTAAAATAATCAATTAGGGGA   JV437    TCCCCTAATTGATTATTTTAATAGTTGCTTAA 

aphA probe 2 STR0348  CTATTCCACTTCCACTTCATGCTTATTATTTATATACTACTTCCCTGCTGGAAGCT STR0349  AGCTTCCAGCAGGGAAGTAGTATATAAATAATAAGCATGAAGTGGAATAG 

14  

  qRT‐PCR primers VIBHAR_06904  

STR0269   ACAATCAGCAGTTTAGCAGTGGTT STR0270   GTCGTTTGGTACAACCGATGC 

VIBHAR_01726  STR0279   TGATGAACTGAACCTCATCGTTACA STR0280   AGAGAAAACCACGGCCAGTTTA 

VIBHAR_05035  STR0332   GGAACGCTCTTTATCGAGCATG STR0331   CGTCAAGGCACCGGATTCAT 

aphA    STR0381  ATCCATCAACTCTAGGTGATAAACG   STR0382  CGTCGCGAGTGCTAAGTACA luxR    STR0383  ACATCAACTCAAATGGCAAGG   STR0384  GCAAACACTTCAAGAGCGATTT qrr1    STR0129  CTCGGGTCACCTATCCAACTGA   STR0130  TCGGATCTATTGGCTCGTTCTG qrr2    STR0131  CTTAAGCCGAGGGTCACCTAGC   STR0132  CAATTAGGGCGATTGGCTTATGT qrr3  

STR0036  CTTAAGCCGAGGGTCACCTAGC STR0037  ACAAATTCGAGTCCACTAACAACGT 

qrr4  STR0038   CCTTATTAAGCCGAGGGTCAC STR0039   GTTGATTGGCGGTATATACTTGTG 

qrr5    STR0133  GACGTTGTTAGTGAACCCAATTGTT   STR0134  CACAAGGTTTGTGATTGGCTGTATA hfq    STR0040  CGTGAGCGTATCCCGGTATCTAT   STR0041  TTGCAGTTTGATACCGTTCACAAG qrr2(Vc)   STR0385  TGACCCTTGTTAAGCCGA   STR0372  CCGCGATTGGCTTATATATG qrr3(Vc)   STR0386  TGACCCTTAATTAAGCCGAGG   STR0374  GGTGATTGGCTGATAAAACAA qrr4(Vc)   STR0387  TGACCCTTCTAAGCCGAG   STR0376  AGTGTGATTGGCCGTCTATAAG hfq(Vc) 

15  

  STR0382  CTAAGGGGCAATCTCTACAAG   STR0383  AATTGATCAAATGATTCGATCTGA 

 SUPPLEMENTAL FIGURES 

 

LCDLCD, ΔaphA

relative

 qrr

tran

script level

qrr1      qrr2     qrr3     qrr4      qrr5 

Supplemental  Figure  S1. Qrr  sRNA  levels were measured  by  qRT‐PCR  in  locked  LCD  V.  harveyi with (JAF548:  luxO D47E) and without  (JV50:  JAF548, ΔaphA) aphA. This experiment  is  identical  to  the one shown  in Figure 2B except  that  LuxR  is present  in  the  strains  shown here. Means and SEMs  for RNA collected from three independent cultures are shown.  

16  

A

Δqrr1‐5

relative

 aph

Atranscript level

B

vector

relative

 luxR

transcript level

paphA

wild‐type

 

Supplemental Figure S2. AphA represses luxR and aphA. (A) luxR expression was monitored by qRT‐PCR in wild‐type V. harveyi (BB120) carrying an empty vector (pJV17) or a vector expressing V. harveyi aphA driven by an  IPTG‐inducible pTac promoter (paphA; pSTR0504). This experiment  is  identical to the one shown  in Figure 4A except that the Qrr sRNAs are present  in the strains shown here. Means and SEMs for  RNA  from  three  cultures  are  shown.  (B)  Expression  of  chromosomal  aphA  was  monitored  as described in Figure 4B except, that in the strain shown here the qrr genes have been deleted (Δqrr1‐5; KT282: Δqrr1‐5), which results in reduced aphA expression. The strain carried an empty vector (pJV17), or a vector expressing aphA (paphA; pSTR0504) or an aphA mutant defective for DNA binding (paphA*; pSTR0615). Means and SEMs for RNA isolated from three independent cultures are shown. 

 

 

 

17  

 

Supplemental  Figure  S3.  AphA  DNA  binding  curves  for  the  qrr4,  luxR,  and  aphA  promoters.  Three replicates  of  fluorescence  anisotropy  binding  curves  for  each  promoter  fragment  exhibiting  AphA binding are shown. Method and Kds are described and shown in Figure 3 and the Figure 3 legend.  

18  

 

 

relative

 qrr4 

tran

script level

BB120

ΔaphA

LCD

ΔaphAaphAwtaphAwt 

Supplemental  Figure  S4.  qrr4  expression  is  regulated  by  AphA  only  at  LCD.  qrr4  expression  was measured in wild‐type V. harveyi containing (BB120) or lacking aphA (JV48: ΔaphA) and in LCD‐locked V. harveyi containing (JAF548: luxO D47E) or lacking aphA (JV50: JAF548, ΔaphA). Cultures were grown as described in (Kovacikova et al. 2005). Briefly, overnight cultures were diluted, grown to an OD600 of 0.5, diluted back to OD600 of 0.1 and then grown to an OD600 of 0.3 prior to RNA collection. RNA from three separate cultures was analyzed by qRT‐PCR and the means and SEMs are shown.  

19  

relative

 aph

Atranscript level

HCDA

B

relative

 aph

Atranscript level

 

Supplemental Figure S5. aphA over‐expression and deletion.  (A) aphA expression was measured  in a HCD‐locked strain (JAF78: ΔluxO) carrying an empty vector (pJV17), a vector expressing aphA driven by an  IPTG‐inducible pTac promoter  (paphA; pSTR0504), or  the  same vector expressing an aphA mutant defective  for DNA binding  (paphA*; pSTR0615)  following  induction with  IPTG. Measurements of aphA mRNA were made using  the QuantiGene Plex Reagent System with beads specific  to  the aphA coding region  in order to measure expression of both chromosomally‐ and plasmid‐encoded aphA expression. (B) aphA expression was measured  in a LCD‐locked strain (JAF548:  luxO D47E) and a LCD‐locked strain lacking aphA  (JV50:  JAF548, ΔaphA) using the QuantiGene Plex Reagent System with beads specific to the aphA coding region. RNA was measured  from  triplicate cultures and means and SEMS are shown. The level measured in the LCD, ΔaphA strain was the same as background. 

 

 

 SUPPLEMENTAL REFERENCES 

20  

 Bassler BL, Greenberg EP, Stevens AM. 1997. Cross‐species  induction of  luminescence  in  the quorum‐

sensing bacterium Vibrio harveyi. J Bacteriol 179: 4043‐4045.  Casadaban MJ. 1976. Transposition and fusion of the lac genes to selected promoters in Escherichia coli 

using bacteriophage lambda and Mu. J Mol Biol 104: 541‐555.  de  Lorenzo  V,  Timmis  KN.  1994.  Analysis  and  construction  of  stable  phenotypes  in  gram‐negative 

bacteria with Tn5‐ and Tn10‐derived minitransposons. Methods Enzymol 235: 386‐405.  Dunn  AK,  Millikan  DS,  Adin  DM,  Bose  JL,  Stabb  EV.  2006.  New  rfp‐  and  pES213‐derived  tools  for 

analyzing  symbiotic Vibrio  fischeri  reveal patterns of  infection and  lux expression  in  situ. Appl Environ Microbiol 72: 802‐810. 

 Freeman  JA, Bassler BL. 1999. A genetic analysis of  the  function of LuxO, a  two‐component  response 

regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi. Mol Microbiol 31: 665‐677.  Friedman AM, Long SR, Brown SE, Buikema WJ, Ausubel FM. 1982. Construction of a broad host range 

cosmid cloning vector and  its use  in the genetic analysis of Rhizobium mutants. Gene 18: 289‐296. 

 Giacalone MJ,  Gentile  AM,  Lovitt  BT,  Berkley  NL,  Gunderson  CW,  Surber MW.  2006.  Toxic  protein 

expression  in Escherichia coli using a  rhamnose‐based  tightly  regulated and  tunable promoter system. Biotechniques 40: 355‐364. 

 Gollub J, Ball CA, Binkley G, Demeter J, Finkelstein DB, Hebert JM, Hernandez‐Boussard T, Jin H, Kaloper 

M, Matese JC, Schroeder M, Brown PO, Botstein D, Sherlock G. 2003. The Stanford Microarray Database: data access and quality assessment tools. Nucleic Acids Res 31: 94‐96. 

 Kovacikova G, Lin W, Skorupski K. 2005. Dual regulation of genes  involved  in acetoin biosynthesis and 

motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate‐responsive LysR‐type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol Microbiol 57: 420‐433. 

 Larsen  RA, Wilson MM,  Guss  AM, Metcalf WW.  2002.  Genetic  analysis  of  pigment  biosynthesis  in 

Xanthobacter autotrophicus Py2 using a new, highly efficient  transposon mutagenesis  system that is functional in a wide variety of bacteria. Arch Microbiol 178: 193‐201. 

 Long T, Tu KC, Wang Y, Mehta P, Ong NP, Bassler BL, Wingreen NS. 2009. Quantifying the integration of 

quorum‐sensing signals with single‐cell resolution. PLoS Biol 7: e68.  Pompeani AJ, Irgon JJ, Berger MF, Bulyk ML, Wingreen NS, Bassler BL. 2008. The Vibrio harveyi master 

quorum‐sensing regulator, LuxR, a TetR‐type protein  is both an activator and a repressor: DNA recognition and binding specificity at target promoters. Mol Microbiol 70: 76‐88. 

 Skerra  A.  1994.  Use  of  the  tetracycline  promoter  for  the  tightly  regulated  production  of  a murine 

antibody fragment in Escherichia coli. Gene 151: 131‐135. 

21  

22  

Thelin  KH,  Taylor  RK.  1996.  Toxin‐coregulated  pilus,  but  not  mannose‐sensitive  hemagglutinin,  is required  for colonization by Vibrio cholerae O1 El Tor biotype and O139 strains.  Infect  Immun 64: 2853‐2856. 

 Tu KC, Bassler BL. 2007. Multiple small RNAs act additively to integrate sensory information and control 

quorum sensing in Vibrio harveyi. Genes Dev 21: 221‐233.  Waters CM, Lu W, Rabinowitz JD, Bassler, BL. 2008. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio 

cholerae  through modulation of  cyclic di‐GMP  levels  and  repression of  vpsT.  J Bacteriol  190: 2527‐2536.