Stimulacija limfocitov B z

oligodeoksinukleotidi in določanje

preureditev gena IGH pri kronični

limfatični levkemiji

Helena Podgornik, Jasmina Farič, Katarina

Zorko, Doplihar Kebe Ana

Vsebina

} Standardna citogenetska preiskava proganih kromosomov pri kronični limfatični levkemiji } Težave

} Zakaj sploh?

} Vpliv novega načina gojenja na izsledke citogenetskih preiskav

} Preureditve gena IGH

} Pomen

} Pojavnost

} Glede na imunološke značilnosti

} Glede na potek

Citogenetske preiskave pri KLL

} Zakaj?

} Napovedni pomen & izbira terapije

} Diferencialno diagnostično: limfom plaščnih celic (LPC)

} Kako?

} FISH

} ~80% bolnikov s preureditvami

} Standardna citogenetska preiskava

} Kdaj? Zakaj?

Težave standardne citogenetske preiskave

} Slaba proliferacija limfocitov B v gojišču

} Majhni mitotski indeksi

} Slaba zaznavnost preureditev } Le ~40% bolnikov

} Uporaba mitogenov: } klasičnih

} pokeweed mitogen (PWM),

} lipopolisaharid (LPS),

} protein A,

} 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetat (TPA)

} novih

} CpG-oligodeoksinukleotidi (CpG-ODN) v kombinaciji z interlevkinom 2 (IL-2)

CpG-oligodeoksinukleotidi (CpG-ODN)

} Kratke enoverižne DNA molekule, } 19 do 25 baznih parov } Z nemetiliranimi otočki CpG

} Značilnosti bakterijske DNA } Arhaični vzorci } Prepoznavanje imunskega sistema

} 20x pogostejši kot pri sesalcih

Uvajanje gojenja v rutinsko uporabo

} 24 vzorcev bolnikov s KLL: } 17 vzorcev kostnega mozga

} 7 vzorcev venske krvi

} Gojeni z dodatkom CpG-ODN + IL2

} Gojeni na standardnem gojišču

} Vrednotenje

} Primerjava mitotskih indeksov (‰)

} Primerjava izsledkov

} FISH

} Kariotipizacije

Mitotski indeksi

Vsi vzorci

Venska kri

Vpliv spremenjenega gojenja na izsledek

preiskave

} 110 vzorcev poslanih z napotno diagnozo KLL } 55 (l. 2012) gojenih 24 h brez dodatka CpG-ODN ter IL-2.

} FISH preiskava pri vseh

} Kariotipizacija: 36

} 55 (l. 2013) gojenih 24 – 72 h z dodatkom CpG-ODN ter IL-2. } FISH preiskava pri vseh

} Kariotipizacija: 36

FISH:

DELEŽ BOLNIKOV

Brez CpG-ODN

CpG-ODN

neuspešna kariotipizacija

22% 2,7%

normalni rezultat kariotipizacije, FISH analiza pozitivna

(del (11q), trisomija 12, IGH preureditve) 19,4% 3%

odkrite dodatne kromosomske preureditve, ki jih s FISH

analizo nismo odkrili 13,8% 33,3%

Vpliv gojenja na izsledke standardne

citogenetske preiskave

Bolniki s kompleksnim kariotipom

4/36 = 11%

KARIOTIP del(13q) +12 del(11q) del(17p) FISH

47,XX,t(2;18)(p11,q21),+12[6]

/47,idem,t(8;14)(q24;q11)[4]/47,idem,del(13)(q14)[2]/47

idem,-4,add(8)(q24), +mar[1]/

46,XX[2]

6 75 Vmesen

46,XY,del(13)(q12q14)[9]/46~47,XY,-3,t(4;11)(q25;p15),

add(4)(p16),+1~2mar[cp3]/46,XY[8] 37 Ugoden

45,XY,del(11)(q21),dup(11)(q21q23),der

(18;20)(q10;q10),der(22)add(22)(p13)ins(11;?)(q21q23;?)[5] 95 Ugoden

47,XY,+12[14]/47-48,idem,t(2;9)(q33;q22),t(2;10)(q21;q26),-

4,del(6)(q14),add(7)(q36),+10,der(12)add(12)(p13)+1-

3mar[cp3]/46,XY[4]

87 Vmesen

Zakaj IGH (14q32)?

Diferencialna diagnostika

Napovedni pomen

} Ponavljajoče

} Redke: < 5% bolnikov

} Neugoden napovedni pomen:

} Vmes med del(17p) ter trisomijo kromosoma 12

Naša raziskava

} Diferencialno diagnostični pomen

} Pojavnost

} Med vsemi bolniki s KLL

} Glede na imunofenotip

} Glede na potek bolezni

Diferencialno diagnostični pomen določanja

t(11;14)

} Bolniki, pri katerih so bile opravljene citogenetske preiskave

} Preverili imunofenotip

} Izločili vse bolnike, pri katerih nismo imeli podatka o imunofenotipu

} 157 bolnikov (januar 2013 – avgust 2014) in napotno diagnozo

} KLL,

} Maligni limfom (ML)

} Limfom plaščnih celic (LPC)

Diagnostična vloga preureditev IGH

t(11;14) kot pomoč pri ločevanju LPC od aKLL

Napotna diagnoza

Označevalci t(11;14)

KLL

N=137 KLL

KLL

N=114

ML

N=13

aKLL N=32

aKLL

LPC

N=7

LPC N=26

LPC

N=11

114 114

17

6 17

13

7

6+3+6=15

4 + 7=11

Preureditve gena IGH

} Preverili imunofenotip, če ustreza KLL } Izločili vse bolnike, pri katerih nismo imeli podatka o

imunofenotipu/diagnozi ali nismo določili značilnih kromosomskih sprememb (januar 2013 – december 2014)

} 162 bolnikov s KLL

} 146 bolnikov z znanim imunofenotipom } Značilna KLL: CD5+/CD19+/CD20š/CD23+/FMC7-

} Atipična KLL (aKLL): CD5-, CD20+m, CD23-, FMC7+, restrikcija lahkih verig

} Povezava preureditev IGH s potekom KLL } 22 bolnikov z neugodnim potekom bolezni

} Bolniki zdravljeni po letu 2006

} <2 leti do začetka zdravljenja

del (13) 46%

trisomija 12 17%

del(11q) 18%

del(17p) 15%

preureditve IGH 4%

vsi bolniki s KLL (N=162)

del (13) 58%

trisomija 12 13%

del(11q) 15%

del(17p) 12%

preureditve IGH 2%

značilna KLL (N=114)

del (13) 37%

trisomija 12 12% del(11q)

9%

del(17p) 36%

preureditve IGH 6%

aKLL (N=32)

del(13q) 35%

trisomija 12 20%

del(11q) 15%

del(17p) 20%

preureditev IGH 10%

neugodni potek (N=22)

ID diagnoza +12

(%)

del(13q)

(%)

del (11q)

(%)

del (17p)

(%)

kariotip

KD KLL - 39 98 32

46,XY,

t(2;14)(p23;q32),del(11)(q23)[11]/45,sl,add(9)(q3

4),-17[2]/44,sdl1,-8[2]/45,sdl2,+6[5]

SI KLL - 94 77 10

46,XY,del(6)(q13q23),t(8;14)(q24;q32),del(11)(q2

2),del(13)(q12q21)[5]/46,idem,der(2)dup(2)(p32p

36)[6]

FJ KLL 57 - - 51 46,XX,t(2;14)(p13;q32),der(17)t(12;17)(q10;p10)

del(12)(q13)[10]

ŠC aKLL 75 - - - 47,XX,+12,t(14;19)(q32;q13)[10]

CB aKLL 54 - - -

47,XX,t(2;14)(p13;q32),+12,

t(14;19)(q32;q13),t(18;22)

(q21;q11)[10]

GI aKLL 83 10 - - 47,XY,+12,t(14;18)(q32;q21)[10]

KJ KLL 41 - - - 47,XY,+12,t(14;18)(q32;q21)[10]

MJ KLL - - - - /

GI KLL - - - - /

Značilnosti KLL s preureditvijo gena IGH

} Nismo je našli pri napovedno ugodnih bolnikih

} izolirana del(13)

} Povezava s trisomijo 12

} 5/9 bolnikov (55,6%)

} statistično značilna razlika glede na druge skupine bolnikov s KLL (p=0,021)

} 6/9 bolnikov napovedno vmesnih – FISH

} 2: brez sprememb

} 4: trisomija 12

Zaključki } Gojenja z dodatkom CpG-ODN + IL2 selektivno stimulira maligne

limfocite B } Venska kri ustrezen vzorec } Analiza proganih kromosomov je tako uspešna kot preiskava FISH

} domala pri vseh bolnikih s KLL (>95%) uspešno izvedemo standardno citogenetsko preiskavo

} Kariotipizacija razkrije skoraj pri tretjini bolnikov dodatne preureditve } Ustreznejša opredelitev napovednega pomena pri ~10% bolnikov

} Vključitev sonde za gen IGH je nujna diferencialno diagnostično } >50% bolnikov, pri katerih so označevalci skladni z LPC izključujemo

t(11;14) } ~5% bolnikov s KLL ima preureditve gena IGH, ki so napovedno

pomembne; } Pogostejše pri bolnikih z aKLL oziroma neugodnim potekom bolezni

} Standardna citogenetika omogoča razreševanje preureditev gena IGH

Zahvala } Skupine bolnikov

} Matevž Škerget, dr.med.

} Imunofenotipizacija } Darja Žontar } Tadej Furlan } Ivana Nerad } Alenka Babnik

} Citogenetika } Elza Osterman } Lidija Pušnik } Hermina Čibej } Karmen Dežman } Špela Orešnik