Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn1 Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 1

Jan-Philipp Stier

Marc Matuszewska

Wendelin Wolf

Lars Lüdicke

Thomas Horn

Molekulare BiotechnologieRuprecht-Karls-Universität Heidelberg


GliederungI. Begriff und Geschichte der PCR

II. Ablauf der PCR allgemein

III. Mathematische Beschreibung der PCR

IV. mathematische Problemstellungen der

PCR

V. Quantitative PCR

VI. RT-PCR

VII. Real Time PCR

VIII. Beispiele


I. Begriff und Geschichte

PCR (Polymerase Chain Reaction)„Polymerase-Kettenreaktion“ zur

Vervielfältigung von Nukleinsäuren

Erfinder: Kary Mullis (1985)

PCR eröffnet in fast allen Bereichen der

Naturwissenschaft zahlreiche neue

Möglichkeiten

Nobelpreis für Mullis 1993


II. Ablauf der PCR allgemein I

Benötigte Reagenzien (Master Mix)Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP

Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA

Enzym-Cofaktor: Mg2+

Enzym, welches Kontaminationen abbaut

Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration

spezifische Primer (20-30 Basen: sense-,

antisense)

zu amplifizierende DNA


II. Ablauf der PCR allgemein IIPCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus)

1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle

2. Annealing (Anlagerung: 40°C<T<65°C): Bindung spezifischer Primer an Zielsequenz

3. Extension (Verlängerung: T≈72°C): Synthese (5‘-3‘) zwei ssDNA zu zwei dsDNA

6

zu vermehrenderDNA-Abschnitt

5’3’5’

3’

5’

3’5’

3’

Denaturierung (T>90°C)

5’

5’ 5’

3’5’

3’

3’

3’

Annealing (40 – 65 °C)

3’

5’3’

5’ 5’

3’5’

3’

DNA-Synthese (72 °C)

7

Schutzhaube

Heizblöcke

Steuerungseinheit

PCR-Gerät

8

III. Mathematische Beschreibung der PCR IZyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4

1Denaturierung

2Annealing

3Extension

N = N0 * 2n

N = Zahl der amplifizierten Moleküle

N0 = Zahl der Startmoleküle

n = Zahl der Zyklen n

N

N0

N

N0


III. Mathematische Beschreibung der PCR II

Plateau-Phase

Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung

theoretisch:

20 Zyklen: 1,048,576

30 Zyklen: 1,073,741,824

n

N

N0

N

N0


III. Mathematische Beschreibung der PCR IIIEffizienz E der PCR:

Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird ≠ 100%

E meist um die 85%

geringe Veränderungen E große Veränderungen N

Beispiel: E=0.85; n=30 => N=10.4*107N0

E=0.80; n=30 => N= 4.6*107N0

E = Amplifikationseffizienz

N = N0 * (1+E)n


IV. Mathematische Problemstellungen IPrimer Schmelztemperatur

Einfaches Modell

Primer kürzer als 14 Nukleotide:

TM=2*(A+T)+4*(G+C)

Primer länger als 14 Nukleotide:

TM=64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G)

entscheidend ist der GC Gehalt (3 H-

Bindungen), beeinflusst TM maßgeblich


IV. Mathematische Problemstellungen IIKompliziertes Modell

R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol)

… dimensionslose molare Primerkonzentration

T0=-273.15°C

t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C

S… Entropie des Primers in cal/(K*mol)

H… Enthalpie des Primers in kcal/mol


IV. Mathematische Problemstellungen IIIBerechnung Enthalpie, Entropie:

H(p)=i=1n-1H(pi,pi+1); S äquivalent

Beispiel:

p=GGAT

H(GGAT)=H(GG)

+H(GA)+H(AT)

(pi;pi+1) H(pi;pi+1) S(pi;pi+1)

AA oder TT 9.1 24.0

AT 8.6. 23.9

TA 6.0 16.9

CA oder TG 5.8 12.9

GT oder AC 6.5 17.3

CT oder AG 7.8 20.8

GA oder TC 5.6 13.5

CG 11.9 27.8

GC 11.1 26.7

GG o. CC 11.0 26.6


V. Quantitative PCR I

Frage: Wie groß ist N0?

Methode 1: Titrationsanalyse

Verwendung externen Standards mit bekanntem N0

Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe

Amplifikation in n Zyklen Berechnung N0 Probe über Steigung


Auswertung:der Unterschied von N0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden

man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil)

Abtragung der dazu gehörigen y-Werte

Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N0 von Probe und Standard

so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede

bestimmbar

V. Quantitative PCR II

Probe

Standard

Lo

g N

Log N0


einfaches Beispiel:N0S=100 (log N0S=2), n=20, E=0.85 => NS=100*(1+0.85)20

NS=2.21*107 => log NS=7.344

NP bei N0=100 => log NP=7.568

log N0S + 0.224 ergibt log N0P

log N0P=2.224

N0P=168

V. Quantitative PCR III

Probe

StandardLo

g N

Log N0 2

7.568

7.344


Methode 2: lineare Analyse N = N0 * (1+E)n

(nach: Y = a * X + b)

Log N = [Log (1+E)]*n + Log N0

n0

Log N 0

Lo

g N Log (1+E)

V. Quantitative PCR III


VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR

Ausgangsmaterial: m-RNA ds-cDNA

Enzym: Reverse Transcriptase Retroviren

Tth-Polymerase Reverse TranscriptaseMangan-Ionen

19

3’5’ mRNA3’ 5’Primer 1

Primer 25’ 3’

5’3’einzelsträngigecDNA

doppelsträngige3’5’5’ cDNA3’

Reverse Transkription

Amplifikation

3’5’

5’3’

Primer 25’ 3’

Primer 13’ 5’

Synthese des komplementärencDNA Stranges


VII. Real Time PCR

Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert

In diesem Zustand Detektion möglich

früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera

heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme

Echtzeitmessung mit jedem Zyklus


Zyklenzahl

Flu

ore

sze

nz


VIII. Messung von Metallothionein-I mRNAAuswertung

Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA)

y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0)


VIII. Gen-Expression durch RT-PCRCT-Wert

-Patientenabhängig

-Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz)

1. Normierung des CT-Wertes des Target-Gens

2. Eichung des CT(Target)-Wertes zu Bezugsexpressionsgröße

2 -∆∆CT relative

Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%)


Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit

Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure AufmerksamkeitVielen Dank für eure Aufmerksamkeit

Documents

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn1 Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität