Embed Size (px)
Citation preview
Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných
kalibrátorů
Absolventská práce
Michal Kučera
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo
nábřeží 6
Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant
Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková
Datum odevzdání práce:
Datum obhajoby:
Praha 2013
Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval samostatně a všechny
použité prameny jsem uvedl podle platného autorského zákona v seznamu
použité literatury a zdrojů informací.
Praha 2013
Podpis
Děkuji Mgr. Ivaně Malíkové za odborné vedení absolventské práce. Mé
poděkování patří i všem zaměstnancům CHL a TC a mojí rodině, která mě po
celou dobu studia podporovala.
Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší
odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo
nábřeží 6.
Podpis
ABSTRAKT
Kučera Michal
Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková
Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 57 stran
Stanovení hladiny nízkomolekulárního heparinu je důležité vyšetření při monitorování
léčby nízkomolekulárním heparinem. Sledování léčby LMWH pomocí stanovení jednotek
inhibice FXa je vhodné zejména u obézních, v graviditě, nebo u osob s renálním selháním.
Cílem naší práce bylo zavedení nové metodiky pro stanovení aktivity anti Xa, výběr
a příprava tří rozdílných kalibračních materiálů, porovnání měření při použití rozdílných
kalibračních křivek, zhodnocení metody a jejího využití pro diagnostiku. Metodika: Aktivita
anti Xa byla stanovena pomocí kitu COAMATIC Heparin, Chromogenix, Biophen Heparin 3
a Biophen Heparin (LRT), Hyphen BioMed, Francie, optický analyzátor BCS XP, Siemens,
SRN. Byly použity firemní kalibrátory pro stanovení aktivity anti Xa Hyphen BioMed
a připravené kalibrátory z nízkomolekulárních heparinů enoxaparinu (Clexane) a dalteparinu
(Fragmin). Výsledky: Provedli jsme 130 stanovení aktivity anti Xa všemi metodami za
použití všech kalibrátorů. Zároveň jsme vyhodnotili výsledky kontroly kvality a variační
koeficienty referenční metody při mezilaboratorním porovnání. Z naměřených dat jsme
zjistili, že optimální je využití kitu s reagenciemi připravenými za standardních podmínek
firmou a při použití univerzálního firemního kalibrátoru. Při použití připravovaných
kalibrátorů je nutné použít jako diluční médium poolovanou plasmu dárců, aby byla zajištěna
dostatečná hladina antitrombinu v reakční směsi. Při stanovení jednotek inhibice anti Xa bylo
dosaženo hodnot, které spolu dobře korelují. Závěr: Hladinu nízkomolekulárního heparinu
lze spolehlivě stanovit pomocí všech porovnávaných kitů za předpokladu, že je použit vhodný
kalibrátor, ev kalibrátor s vhodným dilučním médiem pro danou metodu.
Klíčová slova: Nízkomolekulární hepariny, inhibice F Xa, aktivita anti Xa, analyzátor BCS
XP, kalibrátory, faktor, inhibitor, aktivátor, kontrola kvality
ABSTRAKT
Kučera Michal
Stanovení aktivity anti Xa při použití rozdílných kalibrátorů
Anti Xa activity determination using different calibrators
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: Mgr. Ivana Malíková
Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 57 stran
In meiner Abschlussarbeit „Die Feststellung der Aktivität Anti Xa mit der
Anwendung verschiedener Kalibratoren“ konzetriere ich mich auf mein Ziel, den Spiegel des
niedermolekularen Heparins festzustellen. Für dieses Ziel war wichtig die Untersuchung beim
Monitorring der Behandlung mit niedermolekularem Heparin. Die Verfolgung der
Behandlung LMWH mit Hilfe von Inhibitionseinheiten F Xa eignen sich vor allem bei den
Personen mit Übergewicht, Gravidität oder bei den Menschen mit Nierenversagen. Das Ziel
meiner Abschlussarbeit war die Einführung der neuen Methodik für die Aktivität Anti Xa, die
Auswahl und die Vorbereitung drei verschiedener kalibrierten Materialien, den Vergleich der
Messungen mit verschiedener Kurven, die Auswertung dieser Methode und ihre Ausnutzung
für die Diagnostik. Die Ergebnisse: Ich stelle 130 Mal Aktivität Anti Xa mit Hilfe allen
Methoden mit Kalibratoren fest. Ich werte die Ergebnisse der Qualität und verschiedenen
Koeffizienten aus. Ich vergleiche die Methoden unter Laboratorien. Aus den erworbenen
Daten stelle ich fest, dass die Ausnutzung des Kits mit Reagenzien, die unter
Standartbedingungen von einem universellen Firmenkalibratoren vorbereitet werden, optimal
ist. Zum Schluss betone ich, dass der Spiegel des niedermolekularen Heparins zuverlässig mit
Hilfe allen verglichenen Kits mit geeigneten Kalibratoren, eventuell mit Kalibratoren mit
geeignetem Dilutionsmedium für diese Methode feststellen kann.
Schlüssel Wörte: Niedermolekularen Heparins, Inhibition F Xa, Aktivität Anti Xa,
Kalibratoren, Faktor, Ergebnisse der Qualität
Obsah
Úvod ........................................................................................................................................................ 9
1 Fyziologie hemostázy .................................................................................................................... 10
1.1 Hemostáza (srážení krve) ...................................................................................................... 10
1.1.1 Hemostáza od narození do dospělosti ........................................................................... 10
1.1.2 Složky podílející se na hemostáze ................................................................................. 11
1.1.3 Mechanismy hemostatických procesů ........................................................................... 11
1.2 Tvorba primární hemostatické zátky ..................................................................................... 11
1.3 Plazmatický koagulační systém............................................................................................. 12
1.4 Koagulační faktory ................................................................................................................ 12
1.4.1 Popis a funkce plazmatických koagulačních faktorů .................................................... 12
1.5 Vlastní proces koagulace ....................................................................................................... 15
1.6 Fibrinolytický systém ............................................................................................................ 16
1.7 Inhibitory koagulace a fibrinolýzy ........................................................................................ 17
1.7.1 Inhibitory plazmatického koagulačního systému .......................................................... 17
1.7.2 Inhibitory fibrinolýzy .................................................................................................... 19
1.8 Inhibitory s nespecifickými vazbami .................................................................................... 20
1.9 Antikoagulační léčba ............................................................................................................. 21
1.10 Nepřímé inhibitory trombinu ................................................................................................ 21
1.11 Heparin .................................................................................................................................. 21
1.12 Nízkomolekulární hepariny-přípravky .................................................................................. 23
1.13 Sledování aktivity LMWH .................................................................................................... 26
2 Praktická část ................................................................................................................................ 27
2.1 Odběr vzorku ......................................................................................................................... 27
2.2 Metody pro sledování anti Xa aktivity .................................................................................. 27
2.3 Analyzátor BCS XP .............................................................................................................. 29
2.4 Nastavení nové metody ......................................................................................................... 29
2.5 Provedení kalibrace ............................................................................................................... 29
2.6 Kontrola kvality..................................................................................................................... 31
2.6.1 Interní kontrola kvality .................................................................................................. 31
2.6.2 Mezilaboratorní porovnání ............................................................................................ 32
2.6.3 Externí kontrola kvality ................................................................................................. 33
2.6.4 Nejistota měření ............................................................................................................ 33
2.7 Kontrolní soubor ................................................................................................................... 33
3 Zpracování naměřených dat .......................................................................................................... 34
3.1 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody
Biophen kalibrované na Clexane (HypClex)..................................................................................... 34
3.2 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody
Biophen kalibrované na Fragmin (HypFrag) .................................................................................... 35
3.3 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT) (HypLMWH) a metody
Coamatic heparin (ChrLMWH) ........................................................................................................ 36
3.4 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Clexane ................................................. 37
3.5 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Fragmin ................................................. 38
Diskuze .................................................................................................................................................. 39
Závěr ..................................................................................................................................................... 41
Seznam použité literatury ...................................................................................................................... 42
Seznam zkratek ..................................................................................................................................... 43
Seznam obrázků .................................................................................................................................... 45
Seznam tabulek ..................................................................................................................................... 46
Seznam grafů ......................................................................................................................................... 47
Přílohy ................................................................................................................................................... 48
9
Úvod
Proces krevního srážení probíhá v organismu fyziologicky při porušení cévní stěny.
Jde o systém koagulačních plazmatických, cévních i buněčných faktorů, které musí být
v rovnováze, jinak by mohlo docházet ke stavům se sklonem ke krvácení nebo naopak
k nadměrnému srážení krve. Oba tyto stavy jsou život ohrožující, proto je hlavním úkolem
hematologické laboratoře tyto stavy odhalovat a následně kontrolovat jejich léčbu.
Mezi rutinně prováděná vyšetření v rámci poruch hemostázy patří stanovení KO
a zejména počtu krevních destiček, protože je důležitý pro vstupní data při vyšetření primární
hemostázy. Z koagulačních vyšetření se nejčastěji provádí PT, APTT, TT, AT, D-Dimery. Ke
speciálním vyšetřením patří např. stanovení PC, koagulačních faktorů a testy pro hodnocení
účinnosti antikoagulační léčby.
Léčba jak krvácivých, tak trombotických stavů musí být kontrolována, aby nedošlo
k závažným komplikacím, které by nemocného mohli poškodit. Stanovení hladiny
nízkomolekulárního heparinu je důležité vyšetření při monitorování léčby nízkomolekulárním
heparinem. Sledování léčby LMWH pomocí stanovení jednotek inhibice FXa je vhodné
zejména u obézních, v graviditě, nebo u osob s renálním selháním.
10
1 Fyziologie hemostázy
1.1 Hemostáza (srážení krve)
Hemostáza je schopnost organismu zastavit krvácení. Jedná se o proces, na kterém se
podílí řada mechanismů s odlišnými vstupy a účinky. Hemostáza je složitý mechanismus
spojený s celou řadou pozitivních a negativních zpětných vazeb.(1)
U zdravého člověka by se krev za normálních okolností srážet neměla. Proces
hemostázy nastává nejčastěji při poranění nebo porušení cévní stěny, kdy krev vytéká na
povrch kůže nebo sliznice. Organismus ihned začíná krvácení zastavovat a obnovuje průchod
poraněnou cévou.(2)
Srážení krve může nastat za určitých okolností i bez narušení celistvosti cévní stěny, to
vede k různým komplikacím. Tato porucha krevního srážení může nastat v souvislosti s jinou
chorobou, nepříznivým stavem nebo vrozenými defekty. Procesy krevního srážení se liší
podle toho, zda hemostatické mechanismy probíhají v arteriální nebo venózní části cévního
řečiště. V artériích se uplatňují při vzniku trombu především ateromatózní změny stěny cévní.
Dochází k poruše funkce a poškození endotelu a následně dochází ke zvýšené vazokonstrikci
cév, k tvorbě destičkové krevní sraženiny a k proniknutí zánětlivých buněk do cévní stěny.
V žílách mají svou důležitou úlohu inhibitory plazmatických koagulačních faktorů, které
brání nárůstu krevní sraženiny.(1)
1.1.1 Hemostáza od narození do dospělosti
Vývoj hemostázy v organismu prochází různými stádii.
Fetální a neonatální hemostáza
Vyznačuje se nevyzrálostí s velmi malou rezervní kapacitou při odpovědi na různé
podněty. Koagulační proteiny placentární bariérou neprochází. Tvorba koagulačních proteinů
začíná v plodu okolo 10. týdne, koncentrace stoupá s pokračujícím těhotenstvím. „U zralého
novorozence jsou hodnoty faktorů K – dependentních a faktorů kontaktu na 1/3 až 1/2 oproti
hodnotám dospělých.“ Po 6 měsících od narození se začínají hodnoty ustalovat a jsou téměř
totožné s hodnotami dospělých. Koncentrace fibrinogenu odpovídá hladině dospělých, má
však sníženou schopnost polymerace.
11
Hemostáza dětského věku
V dětském věku jsou hodnoty K – dependentních faktorů a faktorů kontaktu přibližně
o 20% nižší. Koncentrace faktorů V, VIII, XIII a vWF se téměř neliší od hodnot dospělých.
Rozdíl mezi hemostázou v dětském věku a hemostázou dospělých je v rovnováze, která je
velmi křehká a mírné rozkolísání může vést k závažným komplikacím. Rozkolísání
rovnováhy vede spíše ke krvácivým komplikacím než k trombózám.
Hemostáza pozdního věku
Nad 50 let a více se viditelně zvyšuje koncentrace některých faktorů (fibrinogen, F VIII,
F VIIa). Naopak u některých faktorů koncentrace klesá (protrombin, F X, antitrombin).
K významnému zvýšení u starších lidí dochází u molekulárních markerů aktivace koagulace
a fibrinolýzy (F IX, X, I, II, D – dimery).(1)
1.1.2 Složky podílející se na hemostáze
Cévní stěna
Krevní destičky
Plazmatické koagulační faktory (aktivátory, inhibitory, složky fibrinolýzy)
Pro bezproblémové srážení krve je důležitá optimální funkce všech těchto složek. Na
odbourávání přebytečné krevní sraženiny se podílí fibrinolytický systém.
1.1.3 Mechanismy hemostatických procesů
K zástavě krvácení dochází vazokonstrikcí a dalšími na sebe navazujícími pochody.
Začíná se tvořit primární hemostatická zátka, která se aktivací dalších procesů zpevní.
1.2 Tvorba primární hemostatické zátky
Neaktivní krevní destičky mají v krevním řečišti oválný diskoidní tvar. Na normální
nepoškozenou cévní stěnu trombocyty nereagují.(1)
Tvorba primární hemostatické zátky začíná adhezí destiček, kdy destičky přilnou
k poškozenému místu pomocí přichycení jejich receptorů glykoproteinové povahy ke
kolagenovým vláknům. Trombocyty se zvětší a změní tvar, dochází k aktivaci destiček.
Z plazmatických látek se podílí vWF., který tvoří můstek mezi destičkovou membránou
a subendotelovými strukturami. Důležitou součástí adheze je též fibrinogen a Ca2+
. Dalším
procesem tvorby zátky je agregace trombocytů, kdy se destičky začínají shlukovat. Zde se
12
uplatňují faktory trombin, tromboxan a faktor aktivující destičky (PAF). V této fázi je
primární cévní zátka velice křehká a reverzibilní a to k zastavení krvácení nestačí.
Kompletní hemostatická zátka (sekundární nebo fibrinová) vznikne až po zpevnění
fibrinovými vlákny, tato reakce je nevratná. Vznik fibrinu je dán vzájemným působením
plazmatických faktorů. Poslední fází aktivace je retrakce koagula, kdy dochází ke smrštění
fibrinových vláken pomocí kontraktilního systému trombocytu. Proces tvorby cévní zátky je
tím ukončen a průchodnost poškozené cévy je obnovena.(2)
1.3 Plazmatický koagulační systém
Cílem tohoto systému je vznik nerozpustného fibrinu. Nejdříve dochází k přeměně
fibrinogenu na fibrin, dále na fibrinové monomery, které polymerují. Aktivací F XIII
(F XIIIa) se polymery fibrinu propojují kovalentními vazbami a tím vznikne nerozpustný
fibrin. Tvoří vláknitou síť, která zachycuje krevní buňky.(1)
1.4 Koagulační faktory
Většina faktorů se tvoří v játrech a některé potřebují k syntéze vitamín K. Většina
faktorů se v plazmě vyskytuje v nízkých koncentracích, s výjimkou F I a F II. Faktory jsou
především glykoproteiny v podobě proenzymů a kofaktorů. Mezi serinové proteázy se řadí
F II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein. Po rozštěpení se projevují enzymatickou aktivitou.
Faktory V a VIII se po rozštěpení chovají jako kofaktory. Fibrinogen tvoří substrát pro
trombin, který jej štěpí.(1)
1.4.1 Popis a funkce plazmatických koagulačních faktorů
Fibrinogen (F I)
Fibrinogen je glykoprotein, nachází se v plazmě a v granulích krevních destiček. Vzniká
v játrech. Molekula fibrinogenu tvoří dimer, který je složen ze 3 párů polypeptidových řetězců
α, β a γ. Vzájemně se vážou disulfidickými můstky. Fibrinogen je substrátem pro trombin, ale
i pro plazmin. Podporuje agregaci krevních destiček pomocí interakce s destičkovými
receptory. Fibrinogen se řadí mezi proteiny akutní fáze.
Protrombin (F II)
Protrombin se skládá z 532 aminokyselin a syntetizuje se v játrech za přítomnosti
vitamínu K. V důsledku protrombinázy se přeměňuje na trombin (F IIa). Funkcí trombinu je
13
přeměna fibrinogenu na fibrin, aktivace F IX a F XIII, krevních destiček, napomáhá tvorbě
a sekreci t-PA. Trombin má dále uplatnění v procesech zánětu a hojení.
Tkáňový faktor (TF, F III)
TF se označuje jako membránový protein, který je prezentován na povrchu řady buněk. Je
obsažen v membránách endoplazmatického retikula. „Extrahuje se z tkáně s největší aktivitou
v mozku, v plicích, placentě, ale i v jiných orgánech.“ „Za zdroj TF v cirkulující krvi jsou
považovány monocyty.“ TF se nevyznačuje enzymatickou aktivitou a při kontaktu s krví
slouží jako vysoce příbuzný receptor pro F VIIa a s pomocí vápenatých iontů tvoří komplex
[TF . VIIa]. Tento komplex dále vyvolává přeměnu F X na F Xa. Klinický význam TF je
významný u hyperkoagulačních stavů a u trombotických nemocí.
Kalcium (F IV)
Ionty vápníku jsou důležité pro většinu reakcí v hemostáze. Nejmenší koncentrace
potřebná pro hemokoagulaci je 0,5 mmol/l.
Faktor V (PROAKCELERIN)
F V je glykoprotein, který se syntetizuje v játrech a megakaryocytech. Je obsažen
v plazmě a v α-granulích krevních destiček. Složením je podobný F VIII.
Faktor VI
F VI je součástí membránových fosfolipidů krevní destičky. Dříve se označoval jako
destičkový faktor 3.
Faktor VII (PROKONVERTIN)
Jedná se o glykoprotein složený z 406 aminokyselin. F VII se řadí mezi serinové proteázy.
Proteolyticky se štěpí na F VIIa. K aktivaci dochází za přítomnosti určitých faktorů, např.
trombinu, F IXa, Xa, XIa. F VIIa má velmi slabý účinek. Enzymatický potenciál F VIIa se
projeví až v komplexu s TF.
Faktor VIII (ANTIHEMOFILICKÝ FAKTOR A)
F VIII je glykoprotein (β globin) složený z 2332 aminokyselin. V plazmě je vázán
do komplexu s vWF. Aktivní F VIII funguje jako bílkovinný kofaktor ve vnitřní cestě
14
aktivace protrombinu, při tvorbě komplexu tenázy, potřebné k ativaci F X. Nefunkčnost nebo
nedostatek F VIII může vést ke krvácivým defektům, které jsou příznačné pro hemofilii A.
Faktor IX (CHRISTMAS FAKTOR)
Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, tvoří se v játrech za pomoci vitamínu K.
Aktivovaný F IX vytváří komplex vnitřní cesty aktivace přeměny protrombinu na trombin a ta
aktivuje F X na F Xa. Nefunkčnost nebo nedostatek F IX může vést ke krvácivým defektům,
které jsou příznačné pro hemofílii B.
Faktor X (FAKTOR STUARTA-PROWEROVÉ)
Je to dvouřetězcový glykoprotein, který se syntetizuje v játrech za účasti vitaminu K.
Aktivace F X se uskutečňuje za pomoci komplexu tenázy nebo za účasti komplexu
[VIIa . TF . PL . Ca2+
]. Aktivovaný F X je obsažen v enzymatickém koagulačně aktivním
komplexu protrombinázy a ta má schopnost přeměnit protrombin na trombin.
Faktor XI (ROSENTHALŮV FAKTOR)
Je to glykoprotein, který je přítomen v krvi ve formě zymogenu serinové proteázy. Jeho
aktivace probíhá při tzv. kontaktní fázi plazmatického koagulačního procesu. F XI má
vysokou přilnavost k aniontovým povrchům (sklo, celit, kaolin) a je vyvazován na povrch
krevní destičky.
Faktor XII (HAGEMANŮV FAKTOR)
Jde o glykoprotein tvořící se v játrech a řadící se mezi serinové proteázy. Vyskytuje se
v plazmě i v séru. Aktivuje se při porušení cévní stěny, aktivačním povrchem může být např.
sklo, kaolin, celit, dextran, kůže, kloubní chrupavka a jiné. Faktor XII zasahuje vedle
koagulace především do systému imunologických.
Faktor XIII (FAKTOR STABILIZUJÍCÍ FIBRIN)
Je obsažen v plazmě, ale i v buňkách (trombocyty, megakaryocyty, monocyty), placentě
nebo játrech. 50% celkové aktivity F XIIIa je obsaženo v krevních destičkách. Syntéza
probíhá v podobě tetrameru nebo dimeru podle místa výskytu. Aktivace faktoru XIII je
výsledkem hydrolýzy vyvolané trombinem. Důležitou funkcí F XIIIa je stabilizace fibrinové
sraženiny.(1)
15
1.5 Vlastní proces koagulace
Cílem koagulace je zástava krvácení, spočívá v generaci trombinu a vytvoření pevného
fibrinového vlákna. Dosáhne se toho postupnou regulovanou kaskádovitou enzymatickou
reakcí.
Vnější cesta
K aktivaci zevního systému je potřeba tkáňový faktor (TF), který se uvolňuje např.
v případě poranění. K aktivaci koagulace dochází poté, co se F VII dostane do kontaktu s TF.
Komplex TF/F VII přímo aktivuje F X na F Xa za přítomnosti vápenatých iontů. Komplex
TF/ F VIIa dále aktivuje F IX a zasahuje tak i do vnitřní cesty.(3)
Vnitřní cesta
K aktivaci vnitřní cesty dochází kontaktem F XII a F XI s aktivním povrchem. Podle
novějších poznatků mají větší význam faktory kontaktu v aktivaci systému kalikreinu, kininu
a komplementu a koagulační komplexy se tvoří pouze na površích buněk.(3)
Společná cesta
F Xa společně s F V, Ca2+
a fosfolipidy destiček vytváří protrombin nebo protrombinový
komplex a ten vyvolá přeměnu protrombinu na trombin. Vzniklý trombin katalyzuje přeměnu
fibrinogenu na fibrin a dochází též k aktivaci F V, F VIII, F XIII a trombocytů. Vznikají
monomery fibrinu, které postupně polymerizují a spojením řetězců vzniká fibrinová síť.
Působením F XIIIa se fibrin stabilizuje a vzniká nerozpustný fibrin.(2)
16
Obrázek 1: Schéma koagulační kaskády
Zdroj : (M. Pecka, Fyziologie a patofyziologie hemostázy, 2004, strana 66)
1.6 Fibrinolytický systém
Funkcí fibrinolytického systému je odstranění krevní sraženiny a obnovení průtoku krve.
Fibrinolytický systém představuje složitou síť aktivátorů a inhibitorů propojenou množstvím
vazeb, které zajišťují regulaci rovnováhy v systému. Zvýšení fibrinolytických vlastností může
vést ke krvácení, naopak snížení může vyvolat trombotické stavy. Důležitou jednotkou
fibrinolytického systému je plazmin, který vzniká aktivací plazminogenu a jeho funkcí je
rozpuštění krevní sraženiny. Na aktivaci plazminogenu na plazmin se podílejí aktivovaná
forma F XII, t-PA a u-PA. Fibrinolýzu kontrolují a regulují inhibitory a to jsou PAI
a α2-antiplazmin.(2)
Plazminogen
Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, který se tvoří v játrech ve formách Glu- a Lyz-
plazminogen. Vyskytuje se i v eozinofilech a ledvinách. Lyz- plazminogen vytváří menší
molekulu než Glu- plazminogen a má také kratší biologický čas. Plazminogen je prekurzorem
plazminu, který jako serinová proteáza aktivuje lýzu fibrinové složky krevní sraženiny.
17
Plazmin
Plazmin je serinová proteáza, která štěpí některé proteiny koagulačního systému
(fibrinogen, fibrin ve všech podobách, F II, V, VIII a další). Schopností plazminu je aktivace
F VII a XII, stimulace agregace krevních destiček a aktivace mediátorů v systému
komplementu. Hlavní funkcí plazminu je rozpouštění fibrinového koagula.(1)
Obrázek 2: Schéma fibrinolytického systému
Zdroj : (wiki.lfp-studium.cz, staženo 28.3.2013)
1.7 Inhibitory koagulace a fibrinolýzy
1.7.1 Inhibitory plazmatického koagulačního systému
Trombin je proteolytický enzym, který se po dobu srážení krve vytváří v nadbytku. To
znamená, že po vytvoření krevního koagula musí být tvorba trombinu inhibována, aby srážení
krve nepokračovalo. Inhibici nepodléhá jen trombin, ale i ostatní složky podílející se na
krevním srážení. Inhibitory tohoto systému jsou v klidovém stavu obsaženy v plazmě
v malém množství.
V plazmatickém koagulačním systému jsou nejdůležitější 2 inhibitory a to
Antitrombin (AT) a α2 – makroglobulin. V plazmě se vyskytují ve velmi vysokých
koncentracích. AT s pomocí kofaktoru heparinu II odpovídá za 80% koagulační aktivity.
Antitrombin (AT)
Jedná se o jednořetězcový α-2-glykoprotein. Skládá se z 424 aminokyselin a syntetizuje se
v játrech. Rovněž byl objeven v endotelových buňkách. AT je nejvýznamnějším inhibitorem
18
serinových proteáz. Hlavní funkcí je inhibice trombinu a plazmatických enzymů, kdy vznikne
komplex, který je vylučován v MFS. Vznik komplexu může být urychlen za pomoci navázání
heparinu nebo proteoglykanů z endotelových buněk.
Reakce s trombinem v přítomnosti heparinu
Hepariny se vyskytují na povrchu endotelových buněk a může nastat jejich uvolnění ze
žírných buněk. Vazba heparinu s AT je vratná, heparin, který se uvolní z komplexu je
schopný vytvořit komplex s další látkou. Hepariny jsou mukopolysacharidy a mají různě
vzájemný vztah k AT. Heparin, který má sekvenci pentasacharidu je schopen vytvářet
komplex s AT, jiné formy tuto schopnost nemají. Následuje konformační změna AT, která
vede až k tisícinásobnému zvětšení jeho antiproteázového účinku.
Heparinový kofaktor II (HC II)
HC II je glykoprotein, který se řadí mezi inhibitory serinových proteáz. Je lokalizován
na cévním endotelu, tvoří se v játrech. Skládá se z 480 aminokyselin. Na rozdíl od AT je
aktivita HC II namířena výhradně proti trombinu. HC II se uplatňuje v inhibici trombinu až
při poklesu hladiny AT pod 30%.
Systém proteinu C
Tento systém je tvořen proteinem C, proteinem S a trombomodulinem. Společně s AT
a TFPI se řadí mezi nejúčinnější inhibiční systém hemostázy. Systém proteinu C má
schopnost inaktivovat různé faktory (F VIIIa a Va), díky tomu reguluje tvorbu trombinu.
Protein C (PC)
Jedná se o jednořetězcový glykoprotein, který se syntetizuje v játrech za pomoci vitamínu
K. V menší míře vzniká i v endotelu. Skládá se z 461 aminokyselin. Po následném rozštěpení
je molekula PC složena ze 2 polypeptidových řetězců, z těžkého a lehkého. Dohromady jsou
propojeny disulfidickými můstky. Lehký řetězec je důležitý pro napojení se na fosfolipidový
povrch a pro připojení proteinu S. Na těžkém řetězci je umístěno katalytické místo. Přibližně
10% PC zůstává v plazmě ve formě jednořetězcové. PC se aktivuje nejlépe na povrchu
cévních endotelií, kde je navázán trombomodulin. Aktivovaná forma PC má důležitou funkci,
s pomocí fosfolipidů a Ca2+
štěpí a inaktivuje faktory neenzymového charakteru navázané na
membráně (F Va a VIIIa).
19
Protein S (PS)
PS je jednořetězcový glykoprotein, který se tvoří v játrech. Při jeho tvorbě je důležitý
vitamín K. Tvoří se i v endoteliálních buňkách a megakaryocytech. PS se vyskytuje buď
vázaný na specifický receptor nebo ve dvou dalších formách a to vázaný nebo volný. Jedná-li
se o vázanou formu, nedochází k navázání na APC a inhibuje F Xa. U volné formy dochází
k navázání na APC. Důležitou vlastností PS je jeho afinita k fosfolipidovým povrchům
v přítomnosti Ca2+
. PS jako kofaktor APC usnadňuje vazbu APC k fosfolipidovým povrchům
trombocytů a endotelií.
Trombomodulin
Trombomodulin je transmembránový glykoprotein, který se vyskytuje na cévním endotelu
se schopností vázat trombin. Vyvázaný trombin přichází o svůj koagulační účinek a následně
dochází k aktivaci PC. Slouží jako kofaktor pro aktivaci PC trombinem.
1.7.2 Inhibitory fibrinolýzy
Uplatňují se při lokalizaci a inhibici fibrinolytických dějů.
Alfa2-Antiplazmin
Je obsažený v plazmě v nadbytku a váže volný nadbytečný plazmin. Jedná se
o glykoprotein, který vzniká v játrech. Řadí se mezi proteinázy serinového typu. Je vysoce
afinitní k vazebnému místu pro lysin na plazminu. Tlumí navázání plazminogenu na fibrin,
může inaktivovat F XIIa, XIa, Xa, trombin, u-PA nebo t-PA.
Inhibitory aktivátorů plazminogenu (PAI)
Existují prozatím tři typy přirozených inhibitorů tkáňového aktivátoru plazminogenu. Jsou
to PAI-1, PAI-2, PAI-3.
PAI-1
Lidská forma patří mezi serinové proteázy. Vzniká v megakaryocytech, hepatocytech
a endoteliálních buňkách. Strukturou se řadí mezi glykoproteiny. Funkcí PAI-1 je inhibice
obou aktivátorů plazminogenu (t-PA, u-PA). Při vazbě na fibrin je proces inhibice urychlen.
PAI-1 se řadí také mezi tzv. proteiny akutní fáze.
20
PAI-2
Funkcí PAI-2 je pouze inhibice u-PA. Jeho koncentrace je zvýšená v průběhu těhotenství.
PAI 3
Je přítomen i v řadě tělních tekutin. Po vazbě na heparin inhibuje řadu proteáz (APC,
F IIa, IIa v komplexu s TM, u-PA, t-PA).
Trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy (TAFI)
TAFI se řadí mezi tzv. metalokarboxypeptidázy. Jsou to enzymy, které mají za úkol
hydrolýzu C- koncového řetězce peptidu. Obsahují atom zinku, který je důležitý pro jejich
správnou funkci. TAFI se řadí mezi glykoproteiny, tvoří se v játrech a skládá se z 401
aminokyselin. TAFI se aktivuje trombinem, plazminem nebo trypsinem. „TAFI hraje
klíčovou úlohu v interakci mezi prokoagulačními, antikoagulačními a fibrinolytickými
systémy.“
1.8 Inhibitory s nespecifickými vazbami
Do této skupiny se řadí: alfa2-makroglobulin, alfa1-antitrypsin a C1-inhibitor.
Alfa2-makroglobulin
Vzniká v játrech, kde ho vytváří hepatocyty. Je tvořen též makrofágy.
Alfa2-makroglobulin je obsažen v plazmě, ale i mimo cévní systém. Uplatní se tehdy, jsou-li
zásoby ostatních inhibitorů zcela vyčerpány.
Alfa1-antitrypsin
Jedná se o glykoprotein, který vzniká v játrech. Jeho funkce spočívá v inhibici F Xa
a APC. Hlavní funkcí je tlumení proteáz slinivky břišní a leukocytů.
C-1 inhibitor
Syntéza probíhá v játrech. Je to glykoprotein přítomný v α granulích krevních destiček
a uvolňuje se v průběhu aktivace trombocytů. Vyznačuje se inhibicí F XIIa, XIa, kalikreinu,
plazminu a zasahuje též do systému komplementu. V přítomnosti heparinu je účinek
silnější.(1)
21
1.9 Antikoagulační léčba
Cílem antikoagulační léčby je zabránění vzniku sraženiny tím, že brání vzniku trombinu
a následující přeměně fibrinogenu na fibrin. Při antikoagulační léčbě nedochází k aktivaci
koagulačních faktorů, tím že zabraňuje vzniku plnohodnotných faktorů. Může dojít též
k zesílení účinku AT k nepřímému vyvázání trombinu nebo F Xa. „Hlavním záměrem
antikoagulační léčby je co nejrychlejší dosažení stabilní účinné léčebné dávky, udržení této
dávky v terapeutických mezích a vyloučení významnějšího předávkování antikoagulačním
působkem.“(1)
1.10 Nepřímé inhibitory trombinu
Při antikoagulační léčbě napomáhají i tzv. nepřímé inhibitory trombinu. Tyto inhibitory
potřebují látku, která jim umožní se připojit k molekule trombinu. Mezi složky, které toto
připojení umožní, se řadí heparin. Heparin za pomoci pentasacharidové sekvence zesiluje
účinek vazby na trombin.(4)
1.11 Heparin
Heparin je antikoagulační látka živočišného původu. Objeven byl v roce 1916
McLeanem, který ho izoloval z jater. V organismu je obsažen ve většině tkání, nejvíce
v játrech, plicích a kůži. Tvoří se v žírných buňkách a endoteliích. Koncentrace v plazmě se
vymezuje pod 0,15 µg/ml plazmy. Heparin je vylučován játry. Patří do skupiny látek zvané
glykozaminoglykany, do této skupiny se řadí i heparan sulfát aj. Heparin působí proti
skrytému srážení krve a má vliv na metabolismus kostí, lipidový metabolismus, účastní se
různých imunologických reakcí (protialergický, protizánětlivý účinek), disponuje ochranou
funkcí při popáleninách či intoxikaci. Hlavním úkolem heparinu je jeho antikoagulační
činnost, kdy jeho hlavní funkcí je inhibice trombinu a F Xa. Jeho působení proti F IIa a F Xa
je závislé na ATIII. Heparin má také vliv na primární hemostázu, fibrinolytický systém
a systém plazmatických inhibitorů. V lékařské praxi se využívají dvě formy heparinu. Jedná
se o formu nefrakciovanou (UFH) a frakciovanou (LMWH).(5)
22
Obrázek 3: Injekční forma heparinu
Zdroj: http://www.maafirm.com/library/dallas-fort-worth-personal-injury-attorney-heparin-harmful-drug.cfm,
(staženo 21.3.2013)
Nefrakciovaný heparin (UFH – Unfrakcioned heparin)
UFH je heterogenní směs polysacharidových řetězců o různé molekulové hmotnosti.
Hodnoty se pohybují v rozmezí od 3000 do 40 000 daltonů. Přibližně jedna třetina řetězců
UFH obsahuje pentasacharidovou sekvenci, která se váže na AT. Dlouhé molekuly řetězců
UFH se vážou na různé bílkoviny v plazmě, také na trombocyty, endotelové buňky
a makrofágy. To značně ovlivňuje specifitu protisrážlivého účinku. Při podávání UFH je
potřeba hladinu častěji monitorovat a podle toho aktuálně měnit dávkování UFH. Nevýhodou
UFH je neschopnost inaktivovat trombin vázaný na fibrin.(1)
Nízké léčebné dávky UFH: monitorují se pomocí APTT a TT. U dávek se předpokládá, že
čas koagulačního testu je přímo úměrný koncentraci heparinu v plazmě nemocného. Vysoké
léčebné dávky UFH: využívají se při heparinizaci krve u mimotělních oběhů, které nelze
měřit pomocí APTT. V těchto situacích sledujeme léčbu heparinem aktivovaným
koagulačním testem (ACT).(4)
Nízkomolekulární heparin (LMWH – Low molecular weight heparin)
Vzniká enzymatickým štěpením z UFH. Molekulová hmotnost je přibližně 4 500-6000
Daltonů. U LMWH je stejně jako u UFH protisrážlivý účinek způsoben potlačením tvorby
trombinu. V přítomnosti AT dochází k zesílení účinku LMWH pro inhibici F Xa. „Kratší
heparinové řetězce, které obsahují méně než 18 monosacharidových jednotek, kterých je ve
směsi 50-75%, nejsou schopné vázat AT i trombin současně a proto trombin neinhibují.“ To
vede k tomu, že inaktivace trombinu je menší než inaktivace F Xa.(1)
23
LMWH nemá téměř žádný vliv na globální testy. Výhodou je menší vazba na plazmatické
bílkoviny, bílkoviny uvolňované aktivovanými trombocyty a endotelovými buňkami a menší
vazba na makrofágy. Léčba nízkomolekulárními hepariny se sleduje pomocí aktivity
anti Xa.(6)
Obrázek 4: Rozdíl mezi UFH (a) a LMWH (b)
Zdroj: (www.sciencedirect.com, staženo 28.3.2013)
1.12 Nízkomolekulární hepariny-přípravky
Vyrábí se celá řada nízkomolekulárních heparinů s různým počtem sacharidových
jednotek. K nejznámějším patří Clexane, Fraxiparin, Fragmin nebo Zibor.
Clexane
Clexane se vyrábí ve formě injekčního roztoku. Obsahuje enoxaparin sodný, který patří
do skupiny nízkomolekulárních heparinů. Hlavní funkcí Clexanu je zabránit tvorbě krevních
sraženin v krvi a neumožnit zvětšování krevních sraženin, které již vznikly. Clexane se užívá
24
v následujících situacích (k zabránění tvorby krevní sraženiny) např.
u nestabilní anginy pectoris, kdy srdce nedostává potřebné množství krve, dále u pacientů,
kteří prodělali velkou operaci nebo jsou připoutáni na lůžko z důvodu nemoci, po prodělání
srdečního záchvatu, k zabránění vzniku sraženiny v hadičkách dialyzační aparatury (u lidí
s poruchou ledvin). Clexane je určen k léčbě mladistvých a dospělých pacientů.
Clexane se neužívá u pacientů, kteří mají alergii na nějakou jeho složku nebo na heparin
či jeho některé frakce, dále u pacientů, kterým se snadno tvoří modřiny, mají střevní nebo
žaludeční vředy nebo po prodělání cévní mozkové příhody z důvodu krvácení do mozku.
Clexane se nesmí užívat společně s UF heparinem. Při užívání léků jako warfarin, aspirin,
clopidogrel, prednisolon aj. je nutné tuto skutečnost oznámit lékaři, před zahájením léčby
Clexanem. Před zahájením léčby by se lékař měl také dozvědět, jestli je žena těhotná. Při
kojení by se Clexane neměl užívat. Clexane obsahuje enoxaparinum natricum
o koncentraci 10 000 anti Xa-IU v 1 ml injekčního roztoku.(7)
Obrázek 5: Clexane
Zdroj: (http://www.okazii.ro/sanatate-altele/clexane-0-4-ui-anti-xa-0-4ml-a60518986#, staženo 21.3.2013)
Fraxiparine
Vyrábí se ve formě injekčního roztoku. Obsahuje Nadroparinum calcicum. Koncentrace je
9500 IU anti Xa v 1 ml roztoku. Fraxiparine se řadí mezi nízkomolekulární hepariny s MW
4 300 daltonů. Fraxiparine se nasazuje při léčbě pacientů s tromboembolickými poruchami,
dále jako prevence krevního srážení při hemodialýze, u léčby nestabilní anginy pectoris. Lék
mohou užívat mladiství nad 14 let a dospělí lidé.
Přípravek se nesmí užívat: u alergie na nadroparin, při trombocytopeniích po nadroparinu,
u aktivního krvácení, střevní a žaludeční vředy, mozkové příhody s krvácením do mozku,
endokarditidy, těžké poškození ledvin. Nedoporučuje se užívat společně s Fraxiparinem
25
kyselinu acetylsalicylovou. Způsob podání je podobný jako u Clexanu, u hemodialýzy je
způsob aplikace odlišný. Lék se nesmí podávat intramuskulárně.(8)
Obrázek 6: Fraxiparine
Zdroj: (http://www.docsimon.cz/zbozi/fraxiparine-inj-10x-0-3ml, staženo 21.3.2013)
Fragmin
Fragmin je další z řady nízkomolekulárních heparinů. Přípravek obsahuje dalteparin
sodný. Vyrábí se depolymerizací heparinu sodného kyselinou dusičnou ze sliznice prasečích
střev. MW je přibližně 5000 daltonů. Dalteparin sodný účinně potencuje inhibici faktoru Xa.
Má menší účinek na funkci trombocytů než heparin a má malý účinek na primární hemostázu.
Fragmin se využívá na léčbu akutní trombózy hlubokých žil a plicní embolie. Slouží
k prevenci při srážení krve v mimotělním systému při hemodialýze. Využívá se i k léčbě
nestabilní anginy pectoris a non-Q infarktu myokardu. Fragmin se nepodává pacientům
s alergiemi na hepariny, s akutními žaludečními vředy, krvácením do mozku, endokarditidou
a poruchou CNS. U dětí se léčba musí sledovat, monitoruje se hladina anti Xa a správný
způsob dávkování. Fragmin nepodáváme intramuskulárně. Přípravek není prokazatelně
škodlivý pro těhotné ženy a nemá tak negativní účinek na zdraví plodu ani novorozence.(9)
26
Obrázek 7: Fragmin
Zdroj: (http://www.pfizerinjectables.ca/en/product/15/37/fragmin/2-500-iu-2-ml-syringe/0/1, staženo 21.3.2013)
1.13 Sledování aktivity LMWH
Aktivitu všech výše uvedených nízkomolekulárních heparinů je možné sledovat pomocí
dvou základních principů.
Chromogenní princip
Chromogenní princip využívají metody Coamatic® Heparin, Biophen heparin (LRT)
a Biophen heparin 3. Principem stanovení aktivity anti-Xa je působení AT III-heparinového
komplexu na nadbytek čištěného F Xa, který je do reakce přidáván ve standardním množství
a následné měření zbytkového F Xa. U fotometrických metod se stanovuje amidolytická
aktivita F Xa za pomoci specifického chromogenního substrátu. Výsledek stanovení se
vyjadřuje v jednotkách IU/ml, který se získá odečtením hodnot z kalibrační křivky.(5)
Koagulační princip
Tento princip využívá koagulační metoda Pefakit® PiCT
®. U koagulačních metod se po
přidání plazmy a Ca2+
za přítomnosti substrátové plazmy měří koagulační aktivita zbytkového
F Xa. Pefakit PiCT, nebo-li protrombinázou indukovaný koagulační čas je funkční test pro
kvantitativní stanovení antikoagulační aktivity LMWH a pentasacharidu v plazmě. Princip
této metody spočívá ve smíchání reagentu, který obsahuje dané množství F Xa, fosfolipidů
a enzym hadího jedu specificky aktivující F V (RVV-V) se vzorkem plazmy. V následné
inkubaci (180 sekund) dochází k inhibici F Xa komplexem AT*heparin, který je přítomný ve
vzorku. Následně nastává proces rekalcifikace, při kterém dochází ke vzniku
protrombinázového komplexu a sleduje se doba do vytvoření koagula.
27
2 Praktická část
2.1 Odběr vzorku
Odběr a příprava vzorků pro stanovení LMWH
Provádíme do plastových nebo silikonovaných skleněných zkumavek s 1 dílem citrátu
sodného a 9 díly čerstvě odebrané venózní krve. Zkumavku poté pečlivě a pomalu
promícháme. Následně centrifugujeme 10 min při 3000 ot/min při 15-25°C. Pro stanovení
LMWH je nutné léčeným pacientům odebírat vzorek po 3 až 4 hodinách po aplikaci LMWH
s.c.. Plazma se musí zpracovat do 2 hodin od separace.
2.2 Metody pro sledování anti Xa aktivity
COAMATIC® Heparin
Principem tohoto testu je stanovení aktivity anti-Xa pomocí komplexu AT*heparin, který
je tvořen v plazmě. První reakcí je tvorba komplexu AT*heparin, kdy je následně k tomuto
komplexu přidáván F Xa v nadbytku. Tvoří se nový komplex F Xa*AT*heparin a zbytkový
F Xa, který štěpí substrát za uvolnění pNA. Uvolněný pNA je nepřímo úměrný hladině
heparinu ve vzorku, při 405 nm. Substrát se skládá z chromogenní směsi (Suc-Ile-Glu γpip –
Gly-Arg-pNA), detergentu a manitolu. F Xa je vyroben z hovězí směsi, Tris pufru, EDTA,
NaCl a dextran sulfátu. Při této metodě se musí vzorky ředit 1:3 fyziologickým roztokem.
Ředí se kontroly, standardy a plazma. Analyzátor ředění provádí automaticky. Naředěné
vzorky se v analyzátoru inkubují 120 sekund při 37°C, posléze se přidá substrát a probíhá
další inkubace 120 sekund při 37°C. Po změření získáme absorbanci a výsledek z kalibrační
křivky. Kalibrační křivka je sestavena za pomoci standardu, plazmy s heparinem o známé
koncentraci a normální plazmy. Optimální rozsah měření je v rozmezí od 0,00-1,00 IU/ml.
Hodnoty neléčených pacientů se pohybují od 0-0,02 IU/ml. Hodnoty přesahující 1,0 IU/ml je
doporučeno naředit 1:2 poolovanou plazmou a znovu proměřit. Podle kritických mezí
stanovených v SOP je potřeba všechny hodnoty nad 1,0 IU/ml hlásit na oddělení.(10)
BIOPHEN HEPARIN (LRT)
Jedná se o chromogenní test, který slouží k monitorování antikoagulační léčby LMWH.
Metoda se může provádět za pomoci analyzátoru, ale i manuálně. Reagencie obsažené
v soupravě jsou v tekutém stavu. Principem metody je vytvoření komplexu AT*heparin, kdy
tento komplex disponuje silnou inhibiční aktivitou pro F IXa, Xa a trombin. Biophen Heparin
28
(LRT) je kinetická metoda založená na tlumení specifického množství F Xa testovaným
heparinem v přítomnosti endogenního AT a hydrolýzou F Xa specifického substrátu zbylým
F Xa. Tím dojde k inaktivaci ze substrátu pNA. Uvolněné pNA je přímo úměrné zbytkovému
F Xa. Mezi koncentrací heparinu a vzniklým zbarvením, stanovovaným při 405 nm je
nepřímá úměra.
V soupravě jsou obsažené 2 reagencie. První reagencií je chromogenní substrát (SXa-11),
4 lahvičky po 7,5 ml. Druhou reagencií je hovězí F Xa, 4 lahvičky po 7,5 ml. Reagencie se
skladují při teplotě 2-8°C. Výsledné koncentrace LMWH se odvozují z kalibrační křivky. Pro
LMWH je test lineární do 2 IU/ml anti Xa. Před zavedením metody je důležitá kalibrace
a kontrola kvality. Každému prvnímu měření musí předcházet analýza kontrolních vzorků.
K soupravě Biophen heparin (LRT) je i sada kalibrátorů. V této sadě je pět hladin LMWH.
Hladiny koncentrací jsou: 0, 0,4, 0,8, 1,2 a 1,6 IU/ml LMWH. Výsledná kalibrační křivka se
tudíž pohybuje v rozmezí od 0 do 1,6 IU/ml. Před použitím musíme každý kalibrátor naředit
destilovanou vodou (1 ml) a pečlivě promíchat. Variabilitou šarží se přesné koncentrace
kalibrátorů mohou nepatrně měnit. Poslední částí sady Biophen je set kontrol (Biophen
control low kit a Biophen control kit). Kontroly obsahují lidskou plazmu o různých
koncentrací LMWH a slouží ke kontrole kvality. Hladiny kontrol jsou 0,25, 0,50, 0,80 a 1,20
IU/ml. Stejně jako kalibrátory i kontroly ředíme 1 ml destilované vody a důkladně
promícháme.(11)
BIOPHEN HEPARIN 3
Biophen heparin 3 je chromogenní metoda, založená na stejném principu jako metoda
Biophen heparin (LRT). Liší se v přípravě reagencií. Sada obsahuje 3 lahvičky specifického
substrátu F Xa a 3 lahvičky hovězího F Xa. Obě reagencie jsou lyofilizované. Musíme je
proto rekonstituovat 3 ml destilované vody a následně důkladně promíchat. Reagencie
specifického substrátu F Xa obsahuje manitol.
Kalibrátory nízkomolekulárních heparinů jsou důležité pro zavedení nové metody
a kontroly pro ověření správnosti a přesnosti. Před každou analýzou se musí nejprve provést
měření kontrolních vzorků. Analyzátor si pipetuje vzorky automaticky. Rozmezí hodnot
u léčených pacientů se pohybuje od 0-1,5 IU/ml. Při používání stejných reagencií, ale
odlišných šarží, může docházet k mírným odchylkám a výkyvům. Z tohoto důvodu je nutné
pro každou novou šarži vytvořit novou kalibrační křivku.(12)
29
2.3 Analyzátor BCS XP
Všechna měření, která jsem prováděl a použil jsem je v této práci, byla provedena na
analyzátoru BCS XP firmy Siemens. BCS XP je vysokokapacitní, automatický analyzátor,
pomocí kterého měříme kvantitativní testy specifických parametrů v plazmě. BCS XP pracuje
na principu měření rozptylu světla (turbidimetrie). Slouží ke stanovení imunologických,
aglutinačních a chromogenních testů. Analyzátor si měřené zkumavky nebo reagencie
identifikuje podle příslušného čarového kódu, který je zkumavce nebo lahvičce s reagencií
přidělen. Díky tomu je zajištěna ochrana proti záměně vzorků nebo reagencií. Analyzátor
obsahuje dva pipetory, které zajišťují pipetování všech vzorků a reagencií, chladící boxy pro
reagencie vyžadující chlazení a prostory pro rotorové kyvety, kde probíhá pipetování,
inkubace a vlastní měření. Analyzátor automaticky vyhodnocuje měřené výsledky a odesílá je
do laboratorního informačního systému (LIS). Funkcí je i správa referenčních křivek a šarží
pro jednotlivé reagencie.
2.4 Nastavení nové metody
Pro přípravu nové metody za použití připravovaného kalibrátoru jsme museli vytvořit
nový pracovní protokol pro analyzátor BCS XP, kde jsme museli nastavit pro každý typ
kalibrátoru všechny parametry pro reagencie, pipetování jednotlivých objemů vzorků
a reagencií, optimální podmínky měření, vyhodnocení a odečtení výsledků z kalibrační
křivky. Sestavené pracovní protokoly metod (MKBiophenClex a MKBiophenFrag) jsou
uvedeny v příloze č. 1, 2.
2.5 Provedení kalibrace
Kalibrace je nutná pro kvantitativní vyhodnocení měření, je důležité mít kalibrační křivku
pro každý test, kde se vyhodnocuje aktivita nebo koncentrace. Kalibrační křivka se dá vytvořit
za pomoci připravené kalibrační plazmy, standardní plazmy nebo pomocí kalibračního setu.
Po nastavení vstupních parametrů jsme vložili do analyzátoru všechny potřebné reagencie
a standardy. Kalibrace byla provedena automaticky a po vytvoření nové křivky jsme
zkontrolovali měření pomocí kontrol.
Provedení kalibrace pomocí firemních kalibrátorů
Použili jsme sadu kalibrátorů soupravy Biophen heparin calibrator, které se dají použít pro
metody Biophen heparin (LRT), Biophen heparin 3 nebo Coamatic heparin. Kalibrátory jsou
30
již připravené lyofilizované s danou koncentrací a před použitím je potřeba je naředit 1 ml
destilované vody. Následně se musí důkladně promíchat a poté inkubovat 30 min. při
pokojové teplotě za občasného promíchání. V soupravě jsou kalibrátory o pěti různých
koncentracích. Sestrojená křivka je uvedena v příloze č. 3.
Tabulka 1: Firemní kalibrátory
Firemní kalibrátor Koncentrace LMWH (IU/ml)
CAL 1 (0 IU/ml) 0
CAL 2 (0,4 IU/ml) 0,38
CAL 3 (0,8 IU/ml) 0,77
CAL 4 (1,2 IU/ml) 1,14
CAL 5 (1,6 IU/ml) 1,50
Provedení kalibrace (Clexane)
Clexane o koncentraci 10 000 IU/ml jsme naředili na 10 IU/ml. Smíchali jsme 10 µl
koncentrovaného Clexanu s 10 ml destilované vody. Z naředěného Clexanu jsme si připravili
kalibrační řadu o různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky. Předpokládali jsme
lineární závislost křivky. Společně s přípravou kalibrátorů jsme si připravili i kontroly (50 µl
+ 950 µl plazmy dárců). Popis přípravy kalibrátorů z Clexanu je zaznamenán do tabulky.
Kalibrační křivka je uvedena v příloze č. 4.
Tabulka 2: Kalibrace Clexanu
Normální plazma Clexane 10 IU/ml Koncentrace heparinu
U/ml
500 µl (neředěné) 0 µl 0
980 µl (50x ředěné) 20 µl 0,2
960 µl (25x ředěné) 40 µl 0,4
940 µl (16,5x ředěné) 60 µl 0,6
920 µl (12,5x ředěné) 80 µl 0,8
900 µl (10x ředěné) 100 µl 1,0
880 µl (8x ředěné) 120 µl 1,2
840 µl (6,3x ředěné) 160 µl 1,6
31
Provedení kalibrace (Fragmin)
Fragmin jsme připravili naředěním 25 000 IU/ml na 25 IU/ml. K 10 µl koncentrovaného
Fragminu jsme přidali 10 ml destilované vody. Z tohoto připraveného roztoku jsme vytvořili
kalibrační řadu. Po analýze jsme získáli kalibrační křivku Fragminu. Kalibrační křivka je
uvedena v příloze č. 5.
Tabulka 3: Kalibrace Fragminu
Normální plazma Fragmin 25 IU/ml Koncentrace heparinu
U/ml
500 µl (neředěné) 0 µl 0
980 µl (50x ředěné) 20 µl 0,5
960 µl (25x ředěné) 40 µl 1,0
940 µl (16,5x ředěné) 60 µl 1,5
920 µl (12,5x ředěné) 80 µl 2,0
900 µl (10x ředěné) 100 µl 2,5
880 µl (8x ředěné) 120 µl 3,0
840 µl (6,3x ředěné) 160 µl 4,0
2.6 Kontrola kvality
Je založena na analytických metodách s přesně dokumentovanou správností, nízkou
citlivostí na rušivé vlivy a přesností. Dodatečná kontrolní měření je možné vkládat mezi
jednotlivými měřeními. Tato měření mohou být prováděna kdykoliv.
2.6.1 Interní kontrola kvality
Firemní kontroly
Použili jsme sadu kontrolních plazem o přesných koncentracích pro metody Biophen
heparin (LRT) a Biophen heparin 3. Sady Biophen LMWH control low a Biophen LMWH
control plazma zahrnují 4 různé koncentrace (0,25, 0,50, 0,80 a 1,20 IU/ml). Firemní kontroly
jsou přímo navrženy pro kontrolu kalibračních křivek, které byly vytvořeny pro stanovení
nízkomolekulárních heparinů v lidské plazmě. Nejsou-li výsledky kontrol v optimálním
rozmezí, výsledky měřené série mohou být chybné a stanovení se musí opakovat.
32
Tabulka 4: Přehled firemních kontrol v soupravě
Biophen LMWH kontroly LMWH koncentrace
(IU/ml)-příklad
Přijatelné rozmezí (IU/ml)
C1 0,25 0,17-0,33
C2 0,50 0,40-0,60
C3 0,79 0,69-0,89
C4 1,25 1,10-1,40
Připravované kontroly
Pro vlastní vytvořené metody s připravenými kalibrátory (Clexane, Fragmin) jsem si
musel připravit kontroly, které sloužily pro kontrolu získané kalibrační křivky. Pro Clexane
jsem zhotovil dvě kontroly (0,2 a 0,6 U/ml) pro fragmin (0,5 a 1,0 U/ml).
2.6.2 Mezilaboratorní porovnání
Pokud laboratoř provádí stejné měření na více analyzátorech, je vhodné tyto přístroje
porovnat mezi sebou v určitých časových intervalech. Jeden z analyzátorů je určen jako
referenční a k němu jsou následně vztahovány výsledky ostatních měření.
Toto mezilaboratorní porovnání jsme provedli na třech přístrojích BCS XP umístěných
na různých úsekách koagulační laboratoře. Vybrali jsme 5 pacientských vzorků o různých
koncentracích LMWH změřených na referenčním analyzátoru a následně jsme vzorky
proměřili na ostatních analyzátorech a porovnali. Výsledkem jsou variační koeficienty, které
jsem zpracoval do tabulky. Celkové výsledky jsou uvedeny v příloze č. 6.
Tabulka 5: Rozmezí variačních koeficientů
Rozmezí hodnot Rozmezí variačních koeficientů
0-0,29 13,34-23,52
0,30-0,45 2,64-15,93
0,46-0,60 4,41-11,69
0,61-1,0 8,49-8,49
33
2.6.3 Externí kontrola kvality
INSTAND
Externí kontrola kvality je organizována institucí INSTAND – Společnost pro podporu
kvality v lékařské laboratoři. Kontrolu kvality stanovení aktivity anti Xa laboratoř zajišťuje
dvěma cykly kontrol za rok (Haemostasis 281 – LMWH). V každém cyklu jsou vyšetřeny dva
dodané vzorky plazmy a na základě dodání správných výsledků je vystaven certifikát
s platností 12 měsíců. Vzorky je možno analyzovat více metodikami.(13)
Referenční metoda (HypLMWH), ke které jsem vztahoval výsledky svých měření, byla
ověřena touto externí kontrolou kvality s 98% úspěšností za poslední dva roky.
2.6.4 Nejistota měření
Nejistota je definovaná jako údaj, který charakterizuje rozsah, v němž se výsledek
měření odůvodněně nachází. „Pro kontrolní materiály používané na koagulačních
analyzátorech nejsou definovány nejistoty cílové hodnoty. Nejistotu měření tedy vyjadřujeme
jako koeficient variace mezilehlé preciznosti zjištěný laboratoří.“(13, 14)
2.7 Kontrolní soubor
Soubor byl tvořen 30 jedinci (15 mužů a 15 žen), kterým byl s.c. aplikován
nízkomolekulární heparin, v 80% to byl přípravek Clexane. Normální hodnoty anti Xa nejsou
definovány rozdílně pro muže a ženy, proto jsou všechny výsledky uváděny společně.
34
3 Zpracování naměřených dat
Naměřená data byla zpracována v aplikaci Microsoft Office Excel 2010.
3.1 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT)
(HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Clexane (HypClex)
Tabulka 6: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na
Clexane
Referenční metoda (IU/ml) Kalibrace Clexane (IU/ml)
PRŮMĚR 0,33 0,34
MEDIÁN 0,28 0,26
MIN 0,00 0,00
MAX 1,10 1,18
KORELACE 0,994
Graf 1: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Clexane
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
akti
vita
an
ti X
a IU
/ml
číslo vzorku
Hyphen vs. Clexane
Hyp.LMWH
Clexane
Lineární (Clexane)
35
3.2 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT)
(HypLMWH) a metody Biophen kalibrované na Fragmin (HypFrag)
Tabulka 7: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na
Fragmin
Referenční metoda (IU/ml) Kalibrace Fragmin (IU/ml)
PRŮMĚR 0,33 0,42
MEDIÁN 0,28 0,33
MIN 0,00 0,00
MAX 1,10 1,43
KORELACE 0,993
Graf 2: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na Fragmin
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
akti
vita
an
ti X
a IU
/ml
číslo vzorku
Hyphen vs. Fragmin
Hyp.LMWH
Fragmin
Lineární (Hyp.LMWH)
36
3.3 Soubor porovnání referenční metody Biophen heparin (LRT)
(HypLMWH) a metody Coamatic heparin (ChrLMWH)
Tabulka 8: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic heparin
Referenční metoda (IU/ml) Coamatic heparin (IU/ml)
PRŮMĚR 0,33 0,40
MEDIÁN 0,28 0,37
MIN 0,00 0,00
MAX 1,10 1,22
KORELACE 0,980
Graf 3: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic heparin
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
akti
vita
an
ti X
a IU
/ml
číslo vzorku
Hyphen vs. Coamatic heparin
Hyp.LMWH
Coamatic
Lineární (Hyp.LMWH)
37
3.4 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Clexane
Tabulka 9: Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Clexane
Připravená kontrola
HypLMWH HypClexane HypFragmin
Clexane 0,8 0,83 0,74 0,95
Clexane 0,6 0,62 0,55 0,74
Clexane 0,4 0,4 0,36 0,45
Graf 4: Data výsledků kontrol připravených pomocí injekčního preparátu Clexane
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 2 3
Akt
ivit
a A
nti
Xa
IU/m
l
Připravené kontroly (Clexane)
Přehled kontrol-Clexane
HypLMWH
HypClexane
HypFragmin
38
3.5 Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Fragmin
Tabulka 10: Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Fragmin
Připravená kontrola
HypLMWH HypClexane HypFragmin
Fragmin 0,88 0,79 0,69 0,88
Fragmin 0,75 0,65 0,52 0,72
Fragmin 0,5 0,47 0,41 0,54
Graf 5: Data výsledků kontrol připravených pomocí injekčního preparátu Fragmin
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 2 3
Akt
ivit
a A
nti
Xa
IU/m
l
Připravené kontroly (Fragmin)
Přehled kontrol-Fragmin
HypLMWH
HypClexane
HypFragmin
39
Diskuze
V praktické části jsme se věnovali dvěma úkolům. Nejprve jsme vytvořili nové metody
s použitím kalibrátorů připravených z injekčních preparátů nízkomolekulárního heparinu
Clexane a Fragmin. Dále jsme tyto metody použili pro porovnání hodnot stanovení anti Xa
u pacientů, kterým byl podáván některý z těchto preparátů a jsou v běžné laboratorní praxi
sledovány metodou, která využívá firemní kalibrátor bez specifikace LMWH.
Pro přípravu kalibrátorů jsme měli k dispozici preparát Clexane a Fragmin a poolovanou
plasmu získanou od dárců TO. Při prvním experimentu jsme v nastavení metody zadali jako
diluční médium fyziologický roztok, který se běžně používá pro ředění vzorků při
koagulačním vyšetření. V metodě stanovení anti Xa je však zapotřebí dostatečné množství
antitrombinu pro reakci, proto se při vyšších ředěních kalibrátoru antitrombinu nedostávalo
a kalibrační křivka nebyla korektní. Odpovídajícího zakřivení kalibrační křivky jsme dosáhli
jen u vyšších hladin kalibrátoru, který nebyl roztokem naředěný a hladina antitrombinu byla
pro reakci dostatečná. Ve druhém experimentu už jsme chybu opravili a jako diluční médium
jsme zadali poolovanou plasmu. Při kalibraci nové metody už jsme následně dosáhli korektní
křivky. Tuto kalibraci jsme použili pro další porovnávání výsledků.
V časovém období prosinec 2012 – únor 2013 jsme provedli sběr vzorků u pacientů
trombotického centra, kterým byly podávány s.c. injekční přípravky LMWH. Výběr jsme
prováděli tak, aby bylo zastoupeno více preparátů a různě silné dávky heparinu. Odběr žilní
krve byl převážně prováděn v odběrovém centru nemocnice s dodržením času 3 – 4 hodiny po
aplikaci LMWH. Referenční hodnotu anti Xa jsme získali metodou, která je běžně
v laboratorní praxi používána, ale není specifická pro konkrétní přípravek LMWH. U všech
metod jsme při porovnání dosáhli vysokého korelačního koeficientu 0,98 – 0,99 ve vztahu
k referenční metodě. Vzhledem k tomu, že 80% pacientů užívalo preparát Clexane, jsou
u metody kalibrované na Clexane nejmenší rozdíly hodnot (Graf 1). U metody kalibrované na
Fragmin jsou rozdíly vyšší (Graf 2). U metody Coamatic heparin je nižší rozptyl hodnot (Graf
3).
U souboru kontrol je patrné, že lepších výsledků kontrol dosáhneme u odpovídajících
kalibračních křivek pro daný preparát (Tab. 9, 10 a Graf 4,5)
Do našich porovnávání jsme zahrnuli i mezilaboratorní porovnání, které se běžně provádí
se třemi vzorky. Abychom získali lepší statistické údaje, provedli jsme porovnání deseti
40
vzorků na třech analyzátorech. Nejnižší variační koeficienty jsme získali u vyšších hodnot
anti Xa > 0,45 IU/ml. U nižších hodnot anti Xa < 0,2 jsou variační koeficienty vyšší.
Kompletní výsledky jsou hodnoceny statisticky ve formě tabulek, kompletní primární
data jsou doložena v přílohách.
41
Závěr
Hladinu podávaného nízkomolekulárního heparinu je možné poměrně snadno
a spolehlivě monitorovat. Při monitorování LMWH bez uvedení preparátu se jeví jako
spolehlivější použít firemní sadu kalibrátorů.
Pokud známe podávaný preparát, je vhodnější jeho aktivitu sledovat pomocí metody,
která je nakalibrována přímo na tento preparát. Tuto metodu by bylo možné použít
i v rutinních laboratořích v menších zdravotnických zařízeních.
42
Seznam použité literatury
1. PECKA, M., Laboratorní hematologie v přehledu, Fyziologie a patofyziologie
hemostázy, Český Těšín, FINIDR, 2004, s. 237, ISBN 80-86682-03-X
2. SEDLÁČKOVÁ, M., Stručné texty z hematologie, b. m., b. n., b. r.
3. PENKA, M., TESAŘOVÁ, E., a kolektiv, Hematologie a transfuzní lékařství I, Praha
7, Grada Publishing, 2011, s. 424+64, ISBN 978-80-247-3459-0
4. PECKA, M., a kolektiv, Praktická hematologie, Laboratorní metody, Český Těšín,
FINIDR, 2010, s. 343, ISBN 978-80-903871-9-5
5. MATÝŠKOVÁ, M., ZAVŘELOVÁ, J., HRACHOVINOVÁ, I., Hematologie pro
zdravotní laboranty, 2. díl Krevní srážení, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve
zdravotnictví v Brně, 1999, s. 203, ISBN 80-7013-278-7
6. VOJÁČEK, J., MALÝ, M., a kolektiv, Arteriální a žilní trombóza v klinické praxi,
Praha 7, Grada Publishing, 2004, s. 276, ISBN 80-247-0501-X
7. Clexane FORTE injekční roztok-Příbalový leták [online], 2012-09-10, [cit. 2013-03-
21], URL: <http://pribalove-letaky.cz/clexane-forte-injekcni-roztok>
8. Příbalový leták FRAXIPARINE [online], [cit. 2013-03-21], URL:
<http://farmaceutika.info/fraxiparine>
9. Příbalový leták FRAGMIN 10000 M.J.(ANTI-XA)/1ML [online], 2007-07-11, [cit.
2013-03-21], URL: <http://farmaceutika.info/fragmin-10000-m-j-anti-xa-1ml>
10. CHROMOGENIX, COAMATIC®
Heparin 82 3393 63, 2002-11, [cit. 2013-03-26]
11. HYPHEN BioMed, BIOPHEN HEPARIN (LRT) Ref 221011 (4 x 7.5ml), 2010-07-16,
[cit. 2013-03-26]
12. HYPHEN BioMed, BIOPHEN HEPARIN 3 Ref 221003, 2007-02-27, [cit. 2013-03-
26]
13. KITCHEN, S., OLSON, J. D., and PRESTON, F. E., Quality in Laboratory
Hemostasis and Thrombosis, Wiley-Blackwell Publishing, 2009, s. 215, ISBN 978-1-
4051-9424-2
14. DRÁBKOVÁ, D., Bakalářská práce, Význam stanovení APTT a porovnání citlivosti
parciálních tromboplastinů k lupus antikoagulans, deficitu koagulačních faktorů a
heparinu, Praha, 2011, s. 44
43
Seznam zkratek
Použité zkratky:
ACT = aktivovaný koagulační test
APC = aktivovaný protein C
APTT = aktivovaný parciální tromboplastinový test
AT = antitrombin
AT III = antitrombin III
BCS = Behring coagulation systém
Ca2+
= vápenaté ionty
FDP = fibrin degradation products
HC II = heparinový kofaktor II
CHL = centrální hematologické laboratoře
KO = krevní obraz
LIS = laboratorní informační systém
LMWH = nízkomolekulární heparin
MFS = monocytomakrofágový systém
MKBiophenClex = Michal Kučera Biophen Clexane
MKBiophenFrag = Michal Kučera Biophen Fragmin
MW = molekulová hmotnost
PAI = inhibitor tkáňového aktivátoru plazminogenu
PF4 = platelet factor 4
pNA = p-Nitroanilin
PT = protrombinový čas
S.C. = subcutánně
SOP = standartní operační postupy
TAFI = trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy
TC = trombotické centrum
44
TF = tkáňový faktor
TFPI = inhibitor tkáňového faktoru
TO = transfúzní oddělení
t-PA = tkáňový aktivátor plazminogenu
TT = trombinový čas
UFH = nefrakciovaný heparin
UI = mezinárodní jednotky
u-PA = urokináza
vWf = von Wilebrandův faktor
45
Seznam obrázků
Obrázek 1: Schéma koagulační kaskády 16
Obrázek 2: Schéma fibrinolytického systému 17
Obrázek 3: Injekční forma heparinu 22
Obrázek 4: Rozdíl mezi UFH (a) a LMWH (b) 23
Obrázek 5: Clexane 24
Obrázek 6: Fraxiparine 25
Obrázek 7: Fragmin 26
46
Seznam tabulek
Tabulka 1: Firemní kalibrátory 30
Tabulka 2: Kalibrace Clexanu 30
Tabulka 3: Kalibrace Fragminu 31
Tabulka 4: Přehled firemních kontrol v soupravě 32
Tabulka 5: Rozmezí variačních koeficientů 32
Tabulka 6: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen
kalibrované na Clexane 34
Tabulka 7: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen
kalibrované na Fragmin 35
Tabulka 8: Porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic
heparin 36
Tabulka 9: Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Clexane 37
Tabulka 10: Výsledky kontrol připravených pomocí přípravku Fragmin 38
47
Seznam grafů
Graf 1: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na
Clexane 34
Graf 2: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Biophen kalibrované na
Fragmin 35
Graf 3: Korelace referenční metody Biophen heparin (LRT) a metody Coamatic heparin 36
Graf 4: Data výsledků kontrol připravených pomocí injekčního preparátu Clexane 37
Graf 5: Data výsledků kontrol připravených pomocí injekčního preparátu Fragmin 38
48
Přílohy
Seznam příloh:
Příloha 1: Pracovní protokol MK Biophen Clexane s. 49
Příloha 2: Pracovní protokol MK Biophen Fragmin s. 50
Příloha 3: Kalibrační křivka HypLMWH (Biophen heparin LRT, firemní kalibrátory) s. 51
Příloha 4: Kalibrační křivka HypLMWH Clexane (Biophen heparin LRT, připravený
kalibrátor Clexane) s. 52
Příloha 5: Kalibrační křivka HypLMWH Fragmin (Biophen heparin LRT, připravený
kalibrátor Fragmin) s. 53
Příloha 6: Tabulka výsledků mezilaboratorního porovnání s. 54
Příloha 7: Tabulka výsledků porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT)
a metody Biophen kalibrované na Clexane s. 55
Příloha 8: Tabulka výsledků porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT)
a metody Biophen kalibrované na Fragmin s. 56
Příloha 9: Tabulka výsledků porovnání hodnot referenční metody Biophen heparin (LRT)
a metody Coamatic heparin s. 57
49
