Standar Mikrobiologi dan Uji Mikrobiologi untuk Bahan 

dan Produk Farmasi

Marlia Singgih Wibowo

Bahan Farmasi

• Bahan baku• Air murni (Purified Water)• Produk Farmasi Steril (Sterile 

Pharmaceuticals)• Produk Farmasi Non‐Steril (Non‐Sterile 

Pharmaceuticals)• Produk kosmetik, alat kesehatan, PKRT, 

suplemen makanan

Mengapa diperlukan kualitas mikrobiologi dalam produk farmasi?

• Produk harus bermanfaat dan aman• Mikroorganisme patogen → Bagaimana

mikroorganisme patogen dapat mengkontaminasi produk

• Bagaimana mendeteksi mikroorganisme patogen dan bagaimana menghitung jumlahnya

• Analisis kualitatif dan kuantitatif

BAHAN BAKU FARMASI

• Bahan baku untuk produk farmasi dapat berupa bahan kimia atau bahan yang berasal dari alam

• Bahan yang berasal dari alam lebih cenderung terkontaminasi mikroorganisme lebih berat dibandingkan bahan sintetik kimia

Kategori Bahan Baku Alam (Grigo, 1976)

1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak bahan alam yang sudah dimurnikan (rata‐rata 10 cfu/g atau mL)

2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan alam (rata‐rata 102 cfu/g atau mL)

3. Ekstrak tanaman (rata‐rata 103 cfu/g atau mL)4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit 

mengalami proses (rata‐rata 104 cfu/g atau mL)5. Produk hewan atau tanaman yang tidak mengalami 

proses (rata‐rata 105 cfu/g atau mL)

Mikroorganisme kontaminan yang sering dijumpai dalam bahan baku alam

• Bacillus • Enterobacteriaceae• Staphylococcus• Aspergillus• Penicillium • Mucor• Rhizopus

E.coli

Salmonella

AIR

• Air minum (potable water) : tidak boleh ada Coliform bacilli per 100 ml

• Air untuk injeksi : – < 0,25 endotoksin unit (EU) per ml.– Batas mikroba < 10 cfu per 100 ml– Tidak ada Pseudomonas

• Air untuk sediaan non‐steril : o Kisaran dari <10 sampai < 100 cfu per 100 mlo Tidak ada Pseudomonas

Produk Farmasi Steril• Untuk produk parenteral, sediaan obat mata, termasuk 

larutan lensa kontak , dan produk‐produk yang diberikan pada luka terbuka atau untuk proses irigasi rongga tubuh.

• Uji sterilitas perlu dilakukan • Syarat Steril : Sterility Assurance Level dengan 

probabilitas sama atau lebih baik dari 10 ‐6, artinya dalam satu juta sediaan steril hanya boleh maksimum 1 yang tidak steril.

• Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya pertumbuhan mikroba pada media Fluid Thioglycollate(FTM) dan Soyabean Casein Digest (SCD)pada 30‐35°C (bakteri) dan 20‐25°C (fungi) selama 7 dan 14 hari.

Produk Farmasi Non‐Steril

• Tidak ada aturan tunggal yang mengatur, tergantung pada farmakope negara masing‐masing

• Tidak mengandung mikroba yang dapat menyebabkan infeksi akibat penggunaan obat tersebut (medication‐borne infection)

• TVC (Total Viable Count) dalam jumlah tertentu dan tidak adanya patogen enterik dalam bahan baku nya.

Persyaratan Kualitas Mikrobiologi Sediaan Farmasi versi FIP (1976)

Gol. Jenis Sediaan Persyaratan

1a1b

InjeksiObat mata, sed.utk bgn tubuh yg bebas mikroba, sed.utk luka bakar, tukak berat

Steril – FarmakopeBebas mikroba yang memp.daya hidup/g atau mL

2 Sed. topikal pada lesi kulit, hidung, tenggorokan (resiko tinggi)

Mikroba yg memp.daya hidup maks 102 /g atau mL, dan tidak mengandung Enterobacteriaceae, P.aeruginosa, S.aureus

3 Sediaan lain Mikroba yg memp.daya hidup maks 103 – 104

bakteri anaerob, 102 ragi dan kapang /g atau mL, Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak mengandung Salmonella, P.aeruginosa, S.aureus, Enterobacteriaceae lain maks. 102 /g atau mL

Batas kontaminan mikroba pada bahan dan sediaan obat asal tanaman (versi UNIDO,1990)

Bahan/Sediaan

Bakteri Ragi dan kapang

Baketri coliform

Salmonella Staphylococcus

Sediaan obat asal tanaman

< 104 /g < 102 /g - - -

Bahan obat asal tanaman

< 107 /g < 104 /g - - -

Ket.: (-) tidak boleh ada

UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)

Uji Mikrobiologi yang Tercantum pada Farmakope Indonesia edisi IV

• Uji secara Mikrobiologi<51> Uji Batas Mikroba<61> Uji Efektivitas Pengawet<71> Uji Sterilitas

• Uji dan Penetapan secara Biologi<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara 

Mikrobiologi

<51> Uji Batas Mikroba• Dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob 

viabel di dalam semua jenia perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku hinga sediaan jadi

• Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu

• Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik• Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah 

menempatkan wadah di dalam ruang terkendali secara termostatik pada suhu antara 30 – 35°C selama 24 – 48 jam

• Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan adanya perkembangan mikroba viabel

<61> Uji Efektivitas Pengawet

• Pengertian Pengawet Antimikroba : zat yang ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi sediaan terhadap kontaminasi mikroba.

• Pengawet terutama digunakan pada wadah dosis ganda• Pengawet tidak boleh digunakan semata‐mata untuk 

menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai pengganti cara produksi yang tidak baik

• Kadar yang digunakan harus serendah mungkin• Pengujian dalam farmakope dimaksudkan untuk menguji 

efektivitas pengawet yang ditambahkan pada sediaan dosis ganda yang dibuat dengan dasar atau bahan pembawa cairan

• Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada produk di dalam wadah asli yang belum dibuka , yang didistribusikan oleh produsen

<71> Uji Sterilitas

• Digunakan untuk menetapkan apakah bahan atau produk farmasi yang harus steril memenuhi syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing‐masing monografi bahan atau produk

• Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai bagian dari pengawasan mutu di industri, tertera pada <1371> Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia

• Mengingat kemungkinan hasil positif dapat disebabkan oleh pengerjaan yang salah atau kontaminasi lingkungan, diberlakukan pengujian 2 tahap seperti yang tertera pada bagian : Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

• Prosedur alternatif dapat digunakan asal hasil yang diperoleh sekurang‐kurangnya setara keandalannya →Lihat Prosedur pada Uji dan Penetapan dalam Ketentuan Umum

• Jika timbul perbedaan, dan adanya kontaminasi terdapat pada hasil dari prosedur Farmakope, maka hasil harus dinyatakan sebagai tidak memenuhi syarat. 

<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12

• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus leichmanii dengan metode turbidimetri

• Pembanding larutan baku Sianokobalamin BPFIberkisar antara 0,01 – 0,04 ng per mL. Blanko menggunakan air.

• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang 530 nm.

• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus plantarum dengan metode turbidimetri

• Pembanding larutan baku Kalsium pantotenat BPFIberkisar antara 0,01 – 0,04 µg per mL. Blanko menggunakan air.

• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang 660 nm.

• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

<131> Penetapan Potensi Antibiotik secaraMikrobiologi

• Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi sesuai dengan efek daya hambatnya terhadap mikroba uji

• Perbedaan kadar dan potensi• Dua metode umum : cara lempeng dan cara tabung• Cara lempeng : menggunakan kertas cakram atau selinder baja, efek difusi antibiotik pada medium agar.

• Cara tabung : turbidimetri, efek larutan antibiotik terhadap turbiditas mikroba

Tahapan analisis mikrobiologiPenyiapan metode, alat dan bahan pereaksi

↓Identifikasi sampel

↓Sampling

↓Analisis kualitatif

↓Analisis kuantitatif

↓Kesimpulan

Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi pada Produk Farmasi dan Makanan

Jenis Uji Mikrobiologi

• Uji langsung• Teknik kultur• Metode Enumerasi • Metode Alternatif• Metode Cepat

Uji Langsung• Pengamatan langsung

dengan mata (makroskopik)

• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik)

• Metode pewarnaan• DEFT (Direct

Epifluorescent Filter Technique)

• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) : morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk koloni

• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua jenis mikroskop : optik dan fase kontras

• Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel

disaring dengan filter, bakteri diwarnai dengan zat warna tertentu lalu dilihat di bawah mikroskop epifluoresens

Morfologi Aspergillus nigerdi bawah mikroskop

DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)• Filter membran polikarbonat• Zat warna senyawa fluorokromatis yang

berfluoresensi setelah berikatan• Acridine orange :

Ikatan denan dsDNA : hijauIkatan dengan ssRNA : oranyeIkatan dengan sel hidup : kuningIkatan dengan sel mati : hijau terang

Teknik Kultur

Walaupun berbagai metode analisis cepat dan sensitif telah dikembangkan untuk identifikasi dan karakterisasi mikroba patogen, teknik pembiakan mikroba di dalam medium mikrobiologi masih diperlukan terutama untuk konfirmasi identitas. Media mikrobiologi yang sering digunakan umumnya adalah medium padat atau cair. Medium padat umumnya mengandung agar.

Kultur pada media agar• Tujuan Isolasi• Tujuan Determinasi• Tujuan Penyimpanan• Tujuan Pertumbuhan• Tujuan Produksi• Tujuan Analisis

Metode Enumerasi

• Plate Count : metode perhitungan mikroba yang ditumbuhkan di atas cawan petri

• MPN Count (Most probable Number) : metode perhitungan relatif berdasarkan fenomena kekeruhan

• Analisis Fisikokimia : metode perhitungan mikroba berdasarkan komponen sel atau metabolit yang dihasilkan

Metode Alternatif

• Uji Biokimia• Dye-reduction Test• Electrical Methods• ATP Determination

Biochemical Methods: Enzymes

M. Ryan

Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase, trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase, glucuronidase, proteases, fucosidase.

An APIZYM strip

Biochemical Methods: Metabolites

Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites

(Example of Patulin production by Penicillium spp.)

Dye-reduction Test• Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna (dye)• Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem biologi

yang aktif dan akan menghasilkan perubahan warna• Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarna dan bentuk

tereduksi tidak berwarna• Contoh dye yang sering digunakan : metilen blue,

resazurin, trifeniltetrazolium klorida

Electrical Methods

• Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan menyebabkan perubahan komposisi medium dan oleh karenanya akan merubah sifat elektriknya.

• Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi, kapasitans, dan impedansi

Penetapan ATP

• ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidup yang melakukan metabolisme

• Diukur melalui aktivitas enzim luciferase dan substrat luciferin menghasilkan pendaran cahaya (chemiluminesence)

ATP assay

Luciferin + Luciferace + ATP

Luciferin-Luciferace-AMP + PP + O2

Oxyluciferin-Luciferase-AMP + H2O

Oxyluciferin + Luciferase + AMP + hµ (560 nm)

Metode cepat

• Metode Imunokimia• Metode Biologi molekuler

Metode Imunokimia• Prinsip analisis : berdasarkan reaksi Antigen-

Antibodi• Komponen sel atau metabolit sel mikroba

bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan pereaksi (suatu Ab yang spesifik) menghasilkan kompleks Ag-Ab

• Kompleks Ag-Ab divisualisasi dengan berbagai cara yang dapat diukur (spektrofotometri, spektofluorometri, dll.)

Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Antigen

Antibodi

Kompleks Ag-Ab

Konjugat enzim pada Ag-Ab

Substrat

Produk berwarna

Reaksi enzimatik

Jenis Metode Imunokimia

• EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)• RIA (Radio Immuno Assay)• IFA (Immuno Fluoresence Assay)• LIA (Luminescence Immuno Assay)

Metode Molekuler

• Cara Hibridisasi• Cara Amplifikasi

Teknik hibridisasi

• Proses denaturasi dsDNA menjadi ssDNA menggunakan pemanasan

• Kombinasi ssDNA tersebut dengan suatu segmen ssDNA lain yang telah di beri probe (label)

• Hibrid DNA yang telah mengandung label dapat dideteksi dengan berbagai

Teknik amplifikasi• PCR (polymerase chain reaction) : reaksi polimerisasi

berantai• DNA target didenaturasi menggunakan panas• Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek) yang

komplemen dengan salah satu ujung ssDNA• Sintesis DNA yang diawali dari primer• Proses pengulangan 20 – 50 x

Proses PCR

3’ 5’3’5’

Denaturasi pada 94 °C

3’5’

3’ 5’

3’ 5’

3’5’

Annealing primer pd 72°C

3’ 5’

3’5’Polimerisasi pada 72 °C

3’5’

3’ 5’ dsDNA baru

dsDNA baru

Proses berulang

Denaturasi

Annealing

Polimerisasi

Proses setelah PCR

• Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat di deteksi

• Produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis DNA

• Pita-pita DNA dibandingkan dengan marker DNA

Elektroforesis DNA

DNA marker Produk PCR

PCR Fingerprints of Replicates of an isolate of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of

Preservation with Mr Primer

L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in water , 12-16 cryopreserved, 17 control

M. Ryan