Spektrofotometri UV-VIS 

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.

Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.

Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai

sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator, untuk sistem

spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan

metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.

Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis)

melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya

dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR))

kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan

kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi

elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan

transisi dari ground state ke eksited state. 

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu : 

  a.       Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.

b.        Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks

c.        Penyerapan oleh  perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb : 

E = hv

Dimana , E = energy (joule/second)

h = tetapan plank

v = frekuensi foton

                Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor

(gugus  dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi

yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron.

Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap

sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai

dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron

bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor

akan  

mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar

(bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik). 

Kegunaan spektroskopi UV-VIS 

UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan dari

logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik.  

a. Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya) karena elektron dalam

atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik lainnya. Warna larutan ion logam sangat

dipengaruhi oleh kehadiran spesies lain, seperti anion tertentu atau ligan. Sebagai contoh, warna

larutan encer tembaga sulfat adalah biru yang sangat terang; menambahkan amonia meningkat

dan perubahan warna panjang gelombang serapan maksimum (λ m a x).  

b. Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat tinggi konjugasi, juga menyerap cahaya

pada daerah UV atau terlihat dari spektrum elektromagnetik. Pelarut untuk penentuan ini sering

air untuk senyawa larut dalam air, atau etanol untuk senyawa organik yang larut. (Pelarut organik

mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang signifikan; tidak semua pelarut yang cocok untuk

digunakan dalam spektroskopi UV. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang

gelombang.).Polaritas pelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan spektrum senyawa

organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan maksimum dan koefisien molar kepunahan

ketika pH meningkat 6-13 atau ketika polaritas pelarut berkurang.  

c. Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna sering terlalu kuat untuk

digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa absorbansi

larutan berbanding lurus dengan konsentrasi spesies menyerap dalam larutan dan panjang jalan.

Jadi, untuk tetap jalan panjang, UV / VIS spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan

konsentrasi dalam larutan penyerap. Perlu untuk mengetahui seberapa cepat perubahan

absorbansi dengan konsentrasi. Ini dapat diambil   dari referensi (tabel koefisien molar

kepunahan), atau lebih tepatnya, ditentukan dari kurva kalibrasi.

Instrumentasi UV-Vis

Spektroskofi UV-VIS memiliki instrumentasi yang terdiri dari lima komponen utama,

yaitu ;

1. Sumber radiasi

sumber energy cahaya yang biasa untuk daerah tampak dari spectrum itu maupun daerah

ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat ranbut terbuat

dari wolfram. Pada kondisi operasi biasa, keluaran lampu wolfram ini memadai dari sekitar 235

atau 350 nm ke sekitar 3 µm. energy yang dipancarkan olah kawat yang dipanaskan itu beraneka

ragam menurut panjang gelombangnya. Panas dari lampu wolfram dapat merepotkan; sringkali

rumah lampu itu diselubungi air atau didinginkan dengan suatu penghembus angin untuk

mencegah agar sampel ataupun komponen lain dari instrument itu menjadi hangat.

2.  Wadah sampel

kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan dan karenanyan kebanyakan wadah

sampel adalah sel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Sel itu

haruslah meneruskan energy cahaya dalam daerah spektral yang diminati: jadi sel kaca melayani

daerah tampak, sel kuarsa atau kaca silica tinggi istimewa untuk daerah ultraviolet. Dalam

instrument, tabung reaksi silindris kadang-kadang diginakan sebagai wadah sampel. Penting

bahwa tabung-tabung semacam itu diletakkan secara reprodusibel dengan membubuhkan tanda

pada salah satu sisi tabunga dan tanda itu selalu tetaparahnya tiap kali ditaruh dalam instrument.

Sel-sel lebih baik bila permukaan optisnya datar. Sel-sel harus diisi sedemikian rupa sehingga

berkas cahaya menembus larutan, dengan meniscus terletak seluruhnya diatas berkas. Umumnya

sel-sel ditahan pada posisinya dengan desain kinematik dari pemegangnya atau dengan jepitan

berpegas yang memastikan bahwa posisi tabung dalam ruang sel (dari) instrument itu

reprodusibel.

3. Monokromator

Monokromator ini adalah piranti optis untuk memencilkan suatu berkas radiasi dari

sumber berkesinambungan, berkas mana mempunyai kemurnian spectral yang tinggi dengan

panjang gelombang yang diinginkan. Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian

disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh ke unsure

pendispersi, yang berupa prisma atau suatu kisi difraksi. Dengan memutar prisma atau kisi itu

secara mekanis, aneka porsi spectrum yang dihasilkan oleh insur disperse dipusatkan pada celah

keluar, dari situ, lewat jalan optis lebih jauh, porsi-porsi itu menjumpai sampel.

4. Detektor

Detector dapat memberikan respons terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang

mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-

senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan

sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang

berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati

melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak

mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan

menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya,

metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah

190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya

menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan

yang salah dari pelarut.

5. Rekorder

Dan di dalam rekorder signal tersebut direkam sebagai spektrum yang berbentuk puncak-puncak.

Spektrum absorpsi merupakan plot antara absorbans sebagai ordinat dan panjang gelombang

sebagai absis.

Prinsip Kerja UV-Vis

Pada prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang

mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya.Cahaya yang digunakan

merupakan foton yang bergetar dan menjalar secara lurus dan merupakan tenaga listrik dan

magnet yang keduanya saling tagak lurus. Tenaga foton bila mmepengaruhi senyawa kimia,

maka akan menimbulkan tanggapan (respon), sedangkan respon yang timbul untuk senyawa

organik ini hanya respon fisika atau Physical event. Tetapi bila sampai menguraikan senyawa

kimia maka dapat terjadi peruraian senyawa tersebut menjadi molekul yang lebih kecil atau

hanya menjadi radikal yang dinamakan peristiwa kimia atau Chemical event.

Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna. Sehingga sampel yang akan

diidentifikasi harus diubah dalam senyawa kompleks. Analisis unsur berasal dari jaringan

tanaman, hewan, manusia harus diubah dalam bentuk larutan, misalnya destruksi campuran asam

(H2SO4+ HNO3 + HClO4) pada suhu tinggi. Larutan sample diperoleh dilakukan preparasi

tahap berikutnya dengan pereaksi tertentu untuk memisahkan unsur satu dengan lainya, misal

analisis Pb dengan ekstraksi dithizon pada pH tertentu. Sampel Pb direaksikan dengan amonium

sitrat dan natriun fosfit, pH disesuaikan dengan penambahan amonium hidroksida kemudian

ditambah KCN dan NH2OH.HCl dan ekstraksi dengan dithizon.

Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan

menuju monokromator, Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan

sebuah cermin berotasi, Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara

berulang – ulang, Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya,

perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram.