Spectroscopy General

Spectroscopy Systemsand

Spectroscopy Applications

Atomska fizika i spektroskopija Predavanje 5

Sadrzaj

Reference Ciljevi Spektroskopija

Sto je spektroskopija ? Osnove: opci principi i pojmovi

Energija molekule Procesi

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Kratak pregled nekih vrsta (ne svih) spektroskopija Apsorpcijska spektroskopija Fluorescencijska spektroskopija Raman spektroskopija

Sadrzaj nast.

Spektroskopska oprema Komponente

Izvori Laseri Lampe (“broad band”)

Spektrografi i resetke Vezanje Fizika opticke resetke

difrakcija redovi ucinkovitost disperzija i razlucivost

Detektori “Array detection” i CCD-ovi

Reference

Spektroskopijahttp://www.chem.vt.edu/chem-ed/spec/spectros.html

Internet Journal of Vibrational Spectroscopyhttp://www.ijvs.com/archive.html

The Optics of Spectroscopyhttp://www.jyinc.com/systems/theory/oos/oos.htm

Oriel: TUTORIAL (pdf) http://www.oriel.com/tech/tutori.htm

Resetkehttp://cord.org/cm/leot/course06_mod09/mod06_09.htm

Ostali izvori http://www.spectroscopymag.com/ http://directory.google.com/Top/Science/Chemistry/

Analytical/Instruments/

Primjeri biomedicinske spektroskopije

Ne-invazivno promatranje glukoze Near-Infrared Absorption Spectroscopy

http://www.rgmt.com/

Fluorescence Spectroscopy http://www.argose.com/

Raman Spectroscopy http://www.lightouchmedical.com/

Pre-Cancer/Cancer detection Fluorescence Spectroscopy

http://www.spectrx.com/ http://www.medispectra.com/ http://www.lifespex.com/

Ciljevi

Uvod u spektroskopiju Sto je to?

Energijski nivoi Osnovni procesi Vrste spektroskopija

Pregled primjena

Uvod u spektroskopsku opremu Koje su glavne komponente i koja je njihova

uloga ? Osnove fizike/optike u pozadini Osnovna razmatranja o sastavljanju opreme

Spectroscopy

Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanjes tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su “probe” za dobivanje informacija o uzorcima

Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)

Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy

Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari

putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim

zracenjem. Valna duljina (energija) odreduju

medudjelovanje s tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su “probe”za dobivanje informacija o uzorcima


Dinamicke promjene u sastavu(kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy








Spectroscopy








Spectroscopy








Energija molekule

Emolecule =Eelectronic + Evibrational + Erotational + Espin + Etranslational

Nas zanimaju: Eelectronic

Evibrational

Erotational

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)

Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol → UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm

Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 – 2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm

Erotational→ 10 kJ/mol → mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m

Espin→ 10-3 J/mole → radiovaloviEtranslational→ kontinuirani spektar

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol →

UV-VisUV-Vis podrucje: 200 – 700 nm

Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 –2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm

Erotational→ 10 kJ/mol →mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m



UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm





UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm




Energija molekule (Jablonski diagram)

Procesi(sto nam govori prethodna slika?)

Apsorpcija: iz osnovnog u pobudeno stanje (10-15 s)

Relaksacija: iz pobudenog u osnovno stanje Unutarnja konverzija (IC)

relaksacija vibracijskih stanja bez zracenja (10-12 - 10-14

s) Emisija

fluorescencija (spontana emisija: 10-10 - 10-8 s) fosforescencija (10-3 - 10-0 s)

zahtjeva intersystem crossing (promjena elektronskogspina) osnovno stanje – singlet pobudeno stanje – singlet promjena spina – triplet intersystem crossing potrebna jos jedna promjena spina kako bi prijelaz u

singletno osnovno stanje bilo moguce

Fluorescencija, fosforescencija i“intersystem crossing”

Opcenito, elektroni u molekulama su spareni –po dva u svaki orbital

Osnovno stanje vecine molekula je singletno rezultat dozvoljenih apsorpcija je, takoder,

singletno stanje, jer je promjena spina elektrona, tehnicki, “zabranjen” proces

“zabranjen” treba shvatiti u smislu vjerojatnosti, a ne apsolutno

fotoni ne nose spin

Pobudenjem elektron prelazi u prazni orbital, cime se oslobada nuznosti sparenih spinova

Fluorescencija, fosforescencija i“intersystem crossing”

Struktura se moze relaksirati direktno u osnovno stanje fluorescencija

Moguc je, medutim, ISC, koji dopusta pobudenom singletnom stanju da prijede u odgovarajuce pobudeno tripletno stanje pobudeno elektronsko stanje moze biti ili singletno (svi

spinovi spareni) ili tripletno (dva spina nesparena)

IC se dogada bez zracenja (sudari, toplina)

jednom u tripletnom stanju, vracanje u osnovno singletno stanje je “zabranjeno” (opet u smislu vjerojatnosti) zbog toga, molekula ostaje u tripletnom stanju zantno

duze nego inace. Kada se emisija konacno dogodi, naziva se fosforescencija

Apsorpcijska spektroskopija

Ako se mjeri u UV-Vis (optickom) dijelu emgspektra Apsorpcija: prijelaz iz

nizeg u vise stanje s prijenosom energije od polja zracenja k apsorberu (molekuli)

ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih stanja

spektar atoma ili molekule ovisi o strukturi energijskih nivoa, sto apsorpcijske spektre cinikorisnima za identifikaciju sastava

Mjerenje koncentracije apsorbera u uzorku se postize primjenom Beer-Lambertovog zakona

Credit: NASA, Bernard Schmitt, and UKIRT.

Apsorpcija

Ground state

Excited state

Absorption

Loss of energy as

radiation, heat, etc ...

Apsorpcija duzzrake zracenja

Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)

Empirijska relacija izmedu intenziteta transmitiranog zracenja i broja apsorbera – A. Beer, 1852. Vidite → H. G. Pfeiffer and H. A. Liebhafsky, J. Chem. Ed. 1951, 28, 123-125, “The origins of Beer’s law.”• upadno zracenje je monokromatsko• jedinice apsorbera (atomi, molekule, ioni) djeluju medusobno nezavisno• apsorpcija je ogranicena na volumen uniformnog presjeka

0

Absorbing medium

abc

TA

e

I

IT

eI

eI

eII

bx

kIdx

dI

abc

bck

bn

bck

kb

=−===

=

==

=

−=

−

−

−

−

−

log

10

to0 from over gIntegratin

'

0

0

'0

0

σ

k = absorption coefficient, cm-1

b = path length, cm c = concentration, g L-1, moles L-1

a = absorptivity, cm-1 (concn.)-1

= absorption cross section, cm2

n = absorbers cm-3

b

• Nota: apsorpcija= Opticka gustoca

II0dx

x transmisija

apsorpcija

Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)

Za odstupanja vidite:http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/spec/beerslaw.html

Eksponencijalno smanjenje intenziteta s koncentracijom debljinom uzorka (duljina optickog puta)

Pretpostavke u uzorku nema rasprsenja

utjecaj rasprsenja: stvara gubitke na stranama uzorka

prividna apsorpcija tada veca od stvarne

opticki put nije vise samo debljina kuvete (fantomi nasumicnohodaju kroz uzorak

stvara zahtjev za teorijom sirenja svjetlosti (teorija difuzije, itd.)

Beerov zakon – primjer

Path length / cm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

%T 100 50 25 12.5 6.25 3.125

Absorbance 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

Apsorpcijska spektroskopija

Shema UV-Vis spektrofotometra s dvostrukom zrakom

Apsorpcijski spektar: hemoglobin

•Hemoglobin (lysed blood)

0

5

10

15

20

25

300 350 400 450 500 550 600 650

Wavelength (nm)

ua(c

m-1

)

Hemoglobin (lysed blood)

Spektroskopija

NIR apsorpcijska spektroskopija gleda vibracijske prijelaze unutar jednog elektronskog

stanja valne duljine: 800 nm - 2.5 µm

obicno se koristi skala valnih brojeva :12,500 - 4000 valni broj je broj valova po jednom centimetru

• valni broj (cm-1): ν' = 1 / λ

• ne zaboravite konverziju λ (nm) → λ (cm)

• npr. 800 nm = 12,500 cm-1

zasto? valni broj se povecava kako se povecava energija

Emisija

Pobudenje(apsorpcija)

Emisija

Pobudenostanje

Osnovno stanje

Emitirano zracenje→ izotropno

Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa

Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (“Stokesov pomak”). Zasto?

Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa

Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (“Stokesov pomak”). Zasto?

Ef = Eaps – Evib.relax. – Esolv.relax.↓ ↓

visak energije – disipacija(~10-12 s)

↓

Kashaino pravilo (Vavilov1926.): fluorescencijski spektar ne ovisi o valnoj

duljini pobudenja

Fluorescencijska spektroskopija

Vrsta UV-Vis (opticke) spektroskopije Fluorescencija: molekule koje su pobudene u visa

stanja mogu pasti na niza stanja emisijom

zracenja ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih nivoa

Intenzitet emitiranog zracenja je linearno srazmjerno koncentraciji analiziranog uzorka (pri niskim koncentracijama)

Molekularna fluorescencija je korisna za odredivanje kolicine tvari koja emitira


EEMDil ij -→ fluorescencija (intenzitet) EEM razrjedene otopine i oznacava valnu duljinu pobudenja j oznacava valnu duljinu pobudenja

N = broj fluorofora (k = 1 do N) detektirani dio ukupnog intenziteta fluorescencije, STotal(λi, λj) (Ω/4π) intezitet pobudenja, I(λi), debljina uzorka, Ldil svaki fluorofor se moze okarakterizirati s:

koncentracijom, Ck koef. molarne apsorpcije, εk(λi) fluorescencijski kvantni doprinos, φk(λj)

“…a measure of the efficiency with which absorbed light produces some effect and the quantum yield can bedefined by the equation:

Here, quantum yield is essentially the emission efficiency of a given fluorochrome.”

=Ω4π

µak λ i( )

k=1

N∑ φk λ j( )

(1) EEM Dil ij=

Ω4π

STotal λ i,λ j( )I λ i( )Ldil

=Ω4π

2.3Ck εk λ i( )

k =1

N

∑ φ k λ j( )

fotonaih apsorbiran broj

fotona emitiranih broj=φ

Fluorescencijska spektroskopija*

UV-Vis (opticka) spektroskopija (neki, ne svi) dijelovi fluorescencijske spektroskopije

spektar pobudenja fiksirana λ emisije, snimano pobudenje daje podatke o strukturi apsorpcije

dobivamo koef. molarne apsorpcije, εk(λi)

spektar emisije fiksirana λ pobudenja, snimana emisija

dobivamo fluorescencijski kvantni doprinos, φk(λj)

zajedno: matrica pobudenja – emisije vrijeme zivota fluorescencije

kako se pobudena stanja depopuliraju vremenom karakterizira molekule dobivamo molekularnu dinamiku i okolinu

*Dobra referenca: J. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, 2nd edition (July 1999)


Problemi u fluorescencijskoj spektroskopiji relativno sirok spektar bez jasnih vrpci - otezana

interpretacija (npr. mjesavine fluorofora) potrebno razviti i primijeniti modele sirenja svjetlosti

kako bi dobili kvantitativne informacije zamucenihuzoraka (tj. uzoraka koji rasprsuju i apsorbiraju; npr. tkiva)

mora se minimizirati vjerojatnost promjena uzorka zbog procesa mjerenja (npr. preveliki intenzitet svjetlosti →“photobleaching”)

komponente instrumentarija ne smiju oneciscavatiuzorak (npr. kod fluorescencije stakala)

zracenje pobudenja se mora u potpunosti izbaciti iz detekcije minimizacija “zalutalog” zracenja ili ce preplaviti signal koji nas

zanima

Fluorescencijski spektrometar

1 Lamp housing 2 IR filter 3 Adjustable slits 4 Sample compartment 5 Baffle 6 Filter holders 7 Excitation/emission optics 8 Cuvette holder 9 Emission port shutter 10 PMT detector

In-vivo Fluorescencijski sustavNitrogen Laser

Polychromator

ControllerGatePulser

Computer

IntensifiedDiodeArray

Probe

coupling lenses

excitation fiber(s)

collection fibers

coupling lens

quartz shield

Pumped DyeLaser

emission collection fiberexcitation fiber

Spektar pobudenja: koza

0

10

20

30

40

50

60

240 260 280 300 320 340

Data 1

NormalTumor

Wavelength (nm)

Em

@ 3

45 n

m

----- Normal----- Tumor

Spektar emisije: koza

0

0.5

1

1.5

2

2.5

400 450 500 550 600 650

NormalTumor

Wavelength (nm)

Ex

@ 3

80 n

m

----- Normal----- Tumor


Koje tvari fluoresciraju*? Endogeni fluorofori

amino kiseline strukturni proteini enzimi i ko-emzimi vitamini lipidi porfirini

Egzogeni Fluorofori fotosensitizeri

opcenito, tvari koje fluoresciraju… aromatske, organske

molekule mnostvo dvostrukih veza

*http://www.engr.wisc.edu/bme/faculty/ramanujam_nimmi/0102-_a.pdf

Rasprsenje

Promjena smjera, obicno bez promjene frekvencije zracenja

Ovisnost o λ i prostornoj raspodjeli rasprsenja ovisi o: velicini cestice prema λ zracenja

razlici indeksa loma izmedu tvari koja rasprsuje i okruzujuceg medija

Elasticno rasprsenje (nema promjene frekvencije rasprsenogzracenja) Rayleighevo rasprsenje; cestice puno manje od λ zracenja. Intenzitet

rasprsenja pada kao 1/λ4 (zato je nebo plavo)

Mieovo rasprsenje: cestice usporedljive velicine s λ zracenja

Neelasticno rasprsenje (male promjene frekvencije) Ramanovo rasprsenje: frekvencija zracenja je pomaknuta u odnosu na

frekvenciju pobudenja, no iznos pomaka ne ovisi o frekvenciji pobudenja.Ovaj "Ramanov pomak" je, stoga, intrinzisno svojstvo uzorka

Rasprsenje

Raman spektroskopija

Looks at vibrational transitions within a single electronic state, but by scattering light of the molecule and looking at how the wavelength of the scattered light is changed (shift in energy). Stokes shift:

small loss in photon energy corresponding to energy lost to vibrational state

shift to longer λ

Anti-stokes shift: small gain in photon energy corresponding to energy gained

by photon from vibrational energy

shift to shorter λ


Basis of interaction with light is molecular polarizability Probes the polarizability of a molecule

polarizability is the ease with which the electron cloud around a molecule can be distorted (induced dipole)

Raman requires high purity monochromatic source (laser)

Raman requires gratings with large angular dispersion (to resolve small shifts in wavelength)

Intensity ~ concentration (so you can use Raman as a quantification tool under certain circumstances)

Can produce very “information rich” spectra Wavelength range: UV to Infrared

Raman Spektrometar

789nm25 mW

Resolution: 11 cm-1

Range: 500-2000 cm-1

Integration: 15 min

LASER BPFILTER

HN FILTER

SPECTROGRAPH

LN-CCD

CONTROLLER

COMPUTER

CUVETTE


Raman spectrum of natural diamond (type IIa), showing the main Raman active mode at ~1332 cm-1 (Taken using 514.5 nm laser excitation wavelength). The Raman signal intensity is in arbitrary units (a.u.).


The trouble(s) with Raman “information rich” spectra can sometimes be difficult to

interpret Raman scattering is a very inefficient process

Only 1 in 108 to 10 10 scattered photons is a Raman scattered photon Often requires long integration times (seconds to minutes) and

high powers... Make sure that you don’t damage your sample

scattering efficiency decreases with increasing wavelength ~ 1/λ4

Tradeoffs try in increase efficiency by going to shorter

wavelengths signal of interest is tiny, sometimes riding on large

fluroescence background can stimulate Raman signal in optical fibers that

interferes with signal of interest



Typical Raman spectrum obtained from a CVD diamond film, deposited using MWCVD from a 0.5% CH4/H2 gas mixture, 1000 W microwave power, 700°C substrate temperature for 6 hours. Raman spectrum taken using 514 nm laser excitation.


Note: Raman and NIR spectroscopy are complementary techniques (often people will ask which is “better”).

NIR requires broadband sources measure of change in dipole moment

Raman requires high purity monochromatic source (laser) to

minimize broadening of features Probes the polarizability if a molecule particularly good for samples containing lots of water

Water absorption can swamp NIR absorption signal of interest

Water Raman is weak: opportunity to see components dissolved in water matix

Literatura

Anthony (Tony) J. Durkin, “Spectroscopy Systems andSpectroscopy Applications”

www.google.com

Documents

Spectroscopy General