Současné problémy trichomonózy v ČR

RNDr. Erich Pazdziora, CSc.

Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě Národní referenční laboratoř

pro urogenitální trichomonózu

Trichomonóza

• Sexuálně přenosné onemocnění vyvolané

prvokem Trichomonas vaginalis s nejvyšší

prevalencí na světě.

• Trichomonóza nepodléhá povinnému

hlášení

• není sledována v databázi přenosných

nemocí (EPIDAT)

• neexistují doporučení, která by určovala,

kdo a jak by měl testování provádět

• většina těchto infekcí je diagnostikována

přímo v ordinaci lékaře

• mnohé infekce jsou asymptomatické

• infekce T. vaginalis je příznakem vysoce

rizikového sexuálního chování (ve světě

koincidence s HIV a HPV)

Několik poznámek k výskytu a epidemiologii

• inkubační doba je 4 – 28 dní

• za 48 hodin po vniknutí trichomonád do těla hostitele

vzniká infekce u 85 % žen a 70 % mužů

• již po dvou týdnech poklesne počet nakažených mužů

na 33 %

• u mužů trichomonády perzistují méně než 10 dní a infekce může spontánně vymizet

• přítomnost zinku v prostatické tekutině – při vysokých hladinách Zn trichomonády hynou, kmeny rezistentní k zinku - těžké průběhy infekcí

• infekce přetrvává u žen asymptomaticky i několik

let

• u téže ženy jsme prokázali v průběhu fertilního věku

výskyt 17 x

• ve vzorcích moči jsou trichomonády životaschopné

30 minut

• trichomonády jsou schopné přežít kryokonzervaci

spermatu - infekce přes inseminaci jsou možné

• trichomonády mohou přežívat krátkou dobu ve

vlhkém prostředí v tělesných sekretech a

v teplé bazénové vodě

Výskyt trichomonózy v naší populaci

• Výskytu trichomonózy, zejména v populaci žen, se u nás v věnovala náležitá pozornost od šedesátých let minulého století

• diagnostikovala se z Giemsou barvených mikrobních obrazů poševních

• z kultivací pomocí v té době nové polotuhé Szenesovy transportní půdy

Trichomonas vaginalis byla do konce 80. let prokazována až ve 20 % zaslaných vzorků vaginálního sekretu

Specifická nemocnost žen se pohybovala v počtu 878 až 1385 na 100 000 žen ve věku 15+

Výskyt trichomonózy v naší populaci

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Ne

mo

cn

ost

že

n 1

5+

/100 0

00

1970 1972 1974 1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006

ROKY

Graf 2: Trichomonóza v modelovém okrese Nový Jičín v létech 1970 - 2006

(specifická nemocnost žen 15+/100 tisíc žen)

specifická nemocnost

Výskyt trichomonózy v populaci

• Od 90. let došlo k výraznému poklesu výskytu trichomonózy v populaci

• V posledních 25 letech se záchytnost Trichomonas vaginalis v poševních sekretech pohybuje do 3 % z počtu vyšetřovaných

• Specifická nemocnost je mezi 63 až 81 případů

na 100 tisíc žen 15+

Pokles výskytu trichomonózy v populaci v 90. letech – možné příčiny

• Široké používání Metronidazolu

• Změny ve způsobu diagnostiky a evidence – vznik soukromých laboratoří a pracovišť

• Zavedení komerčně připravovaných půd

• Příprava destilované vody pro kultivační půdy cestou reverzní osmózy

• Změny biologických vlastností – pokles manifestních forem

• Za tohoto stavu výskytu nákazy v populaci a podílu inaparentních forem musí být kladeny vysoké nároky na laboratorní diagnostiku

Srovnání diagnostických testů u žen (podle Lawinga et al., JCM, 38(10):3585,2000

Diagnostická metoda Senzitivita

%

Specificita

%

Nativní prep. (vagina) 58,9 100

Kultivace (vagina) 94,3 100

PCR (vagina) 88,9 97,1

Nativní prep. (moč) 58,5 100

Kultivace (moč) 60,4 100

PCR (moč) 64,2 96.6

Srovnání dostupných diagnostických testů

Diagnostický test Doba vyšetření Senzitivita Specificita

Nativní preparát minuty 51 – 65 % až 100 %

Kultivace 24 – 120 h 75 – 96 % až 100 %

Imunochromato-

grafický test

10 min 82 – 95 % 97 – 100 %

Nucleic acid 45 min 63 % 99,9 %

APTIMA TV Assay hodiny 95 – 100 % 95 – 100 %

DNA amplifikace hodiny Není schváleno FDA

PCR hodiny Není schváleno FDA

Mikroskopická diagnostika v ordinaci

• nativní preparát – tvar a pohyb prvoků, senzitivita 59 % • mikroskopická diagnostika v zástinu • barvení fixovaných preparátů: Giemsa - Romanowski, akridinová oranž, diferenciace podle Schiffa a Fontana, Papanicolau - vysoká chybovost 48 %

Barvení fixovaných preparátů Giemsou

TestLine Clinical Diagnostics s.r.o.:

• Roztok Giemsy v hotovém pracovním ředění

Informace o výrobku:

• Roztok GIEMSA-ready slouží k barvení krevních nátěrů a je obzvlášť vhodný pro vizualizaci krevních parazitů a protozoí

Určen pro: Krevní parazity: jádra jasně červená

V textu nejsou uvedeny trichomonády – barví se

nedostatečně

Pro barvení trichomonád roztok Giemsy v

koncentrovaném stavu (10 x) – ředí se fosfátovým

pufrem 1: 10

EHK – cesta ke zkvalitnění diagnostiky v laboratořích

• Externí hodnocení kvality mikroskopické diagnostiky trichomonád bylo zavedeno v roce 1996

• Vzorky k vyhodnocení jsou laboratořím zasílány 2 x ročně

• Do konce minulého roku proběhlo 40 kol

Výsledky ovlivňují počty trichomonád přítomných v preparátu na 100 zorných polí mikroskopu

Většina laboratoří chybuje, obsahuje-li vzorek méně než 13 – 17 prvoků na 100 zorných polí při zvětšení 1000 x

Bezchybné odečítání bylo při počtu 132 a 193 trichomonád na 100 zorných polí

Poznámky k výsledkům barvených preparátů

Chybná diagnostika trichomonád v laboratořích

Roky

Procento laboratoří, které trichomonády v pozitivních vzorcích nenašly

Průměrné počty TV na 100 zorných polí v pozitivních vzorcích

2004 - 2007 7,9 111,3

2008 - 2011 16,3 76,0

2012 - 2014 9,5 93,0

Průměr 11,2 93,4

EHK – kolik laboratoří se zúčastňuje?

• V posledních 22 kolech průměrně

75 laboratoří

• Limit nesplnilo 5,9 % laboratoří

• 8,54 % laboratoří „diagnostikovalo“ trichomonády i ve vzorcích, v nichž prokazatelně nebyly

Zhodnocení 22 kol EHK v letech 2004 – 2014:

• Laboratoře při diagnostice negativních preparátů tápou a za trichomonády označují

• leukocyty

• poškozené epiteliální buňky nebo jejich jádra

• artefakty způsobené barvením

• Nejčastější příčinou chyb je nedostatečné barvení

• „Nález“ trichomonád v negativním vzorku je neshoda

• Odečítání a hodnocení vzorků by měl provádět pouze zkušený odborník

• U morfologické mikroskopické diagnostiky budou hrát vždy rozhodující roli znalosti a zkušenosti diagnostikujícího odborníka

• Trvalým cílem externího hodnocení kvality je dosahovat srovnatelné diagnostické úrovně laboratoří

• Pravidelná účast v EHK má předcházet vzniku odchylek a neshod

• Gynekologové, kteří využívají diagnostiky v laboratořích, by se měli přesvědčit,

zda se laboratoř zúčastňuje Externího hodnocení kvality organizovaného SZÚ Praha

• NRL nabízí ověření růstu v půdách připravovaných ve varnách diagnostických laboratoří

Kontrola kvality půd

Standardizace odběrových, transportních a kultivačních půd:

• Řešením by byly půdy vyráběné komerčně, s nutným požadavkem dlouhodobou exspiraci

• Jsou však sterilizovány gama zářením

Standardizace odběrových, transportních a kultivačních půd:

• Prokázali jsme, že v takto sterilizovaných půdách vznikají rozkladem kyseliny L - askorbové produkty toxické pro trichomonády

• Potvrdilo se, že i naše připravené půdy podrobené radiační sterilizaci 25 kGy ztrácejí své původní vlastnosti a neumožňují růst kultury trichomonád

Laboratorní diagnostika

• Nejvyšší senzitivitu i specificitu má

z dostupných metod kultivace trichomonád

v dostatečně výživném médiu

• Osvědčilo se médium fy Oxoid, Trichosel, Diamondovo médium TYM

• Všechna s inaktivovaným koňským, případně beraním sérem

• Nejvýživnější je bovinní prekolostrální sérum

Laboratorní diagnostika

• K úspěšnému zahájení kultivace je třeba

• 1 500 trichomonád v 5 mikrolitrech suspenze

• V poševním sekretu odebraném tamponem nemusí být uvedený počet prvoků přítomen, takže ani odběr do kvalitní půdy nemusí vést k úspěšné kultivaci

• Nutná je pravidelná kontrola kvality přípravy půd

• Využívání nabídky NRL na ověření připravovaných půd - jedna z cest ke zvyšování kvality laboratorní diagnostiky

• Dobře připravené půdy poskytují příznivé podmínky k růstu populace prvoků

• Exponenciální fáze růstu vrcholí u půd připravených ze základu Trichosel nejčastěji po 72 hodinách inkubace,

• v půdě Oxoid po 72 až 96 hodinách

• Úspěšná kultivace je závislá na inokulační dávce

• Posuzujeme kvalitu diagnostických půd:

Diagnostika z kultivačních půd

TESTOVÁNÍ PŮD – inokulační dávka 5 mikrolitrů (6 013 trichomonád)

počet prvoků při kultivaci v 1 mikrolitru půdy

Kultivace

v hodinách

Půda B 1

Trichosel 5 µl

Půda B 2

Bio 5 µl

Půda Ostrava

Trichosel 5 µl

Půda Ostrava

Oxoid 5 µl

24 0 7 155 26

48 8 0 635 403

72 0 0 4395 2290

96 0 0 2225 5055

120 0 0 1890 1425

144 0 0 885 530

168 0 0 90 358

192 0 0 8,5 80

216 0 0 0 0

240 0 0 0 0

TESTOVÁNÍ PŮD – inokulační dávka 10 mikrolitrů (12 025 trichomonád) počet prvoků při kultivaci v 1 mikrolitru půdy

Kultivace

v hodinách

Půda B 1

Trichosel 10 µl

Půda B 2

Bio 10 µl

Půda Ostrava

Trichosel 10 µl

Půda Ostrava

Oxoid 10 µl

24 17 14 80 26

48 2 905 370 560

72 0 4205 3525 3850

96 0 2015 2475 2765

120 0 870 530 535

144 0 486 50 210

168 0 480 14 57

192 0 126 3,3 0

216 0 35 0 0

240 0 15 0 0

TESTOVÁNÍ PŮD – inokulační dávka 15 mikrolitrů (18 038 trichomonád) počet prvoků při kultivaci v 1 mikrolitru půdy

Kultivace

v hodinách

Půda B 1

Trichosel 15 µl

Půda B 2

Bio 15 µl

Půda Ostrava

Trichosel 15 µl

Půda Ostrava

Oxoid 15 µl

24 49 12 43 59

48 115 1980 615 1450

72 99 4210 3480 4315

96 69 1660 855 5055

120 360 865 45 2035

144 389 610 8,5 435

168 735 729 0 40

192 833 753 0 0

216 482 692 0 0

240 337 701 0 0

• Imunochromatografické testy neboli LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay) se staly fenoménem poslední doby pro detekci rozličných analytů

• TRICHOMONAS CARD (Swab Specimen) Inter Medical, s. r. l., Italy • C-95 One Step Trichomonas Test Device –

Imunochromatografické stanovení přítomnosti antigenu trichomonád

Přímý průkaz antigenu Trichomonas vaginalis Imunochromatografické testy

• Antigen přítomný ve vzorku reaguje s konjugátem za

vzniku komplexu antigen-konjugát

• ten migruje směrem ke specifickému proteinu

umístěnému na porézní membráně z nitrocelulózy

• Je-li ve vzorku přítomen antigen, vznikne v místě

navázání komplexu antigen-konjugát na imobilizovaný protein specifický band signalizující pozitivní výsledek

Imunochromatografický test

TRICHOMONAS CARD (Swab Specimen) Inter Medical, s. r. l., Italy

Poševní sekret do extrakčního pufru

Senzitivita imunochromatografického testu

Trichomonády

v neředěné kultuře počet v 1 µl

Trichomonády v ředěné kultuře

Počet trichomonád v 1 µl ředěné kultury

Průkaz antigenu Trichomonas vaginalis

4325 1:2 1900 pozitivní

1:4 750 pozitivní

2245 1:3 748 pozitivní

1:10 363 negativní

2155 1:5 149 negativní

1565 1:5 450 pozitivní

4770

1:10 805 pozitivní

1:20 208 negativní

1:30 23 negativní

4870 1:10 1295 pozitivní

4780 1:10 807 pozitivní

• Problémy s barvením trichomonád limitují kvalitu mikroskopické diagnostiky v ordinacích i v našich laboratořích

• Nedostatky v přípravě kultivačních půd v řadě laboratoří významně snižují záchytnost trichomonád

• Průkaz antigenu imunochromatografickou metodou může mít zásadní přínos v dostupnosti

diagnostiky, v jejím zjednodušení a ve zvýšení spolehlivosti používaných diagnostických metod v gynekologických ordinacích

Závěr

Děkuji za pozornost