Sluttrapport

Strategisk instituttprogram 130195/140 1999-2003

Nutrition in larvae and juveniles of the Atlantic

halibut (Hippoglossus hippoglossus L.)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

MH

(mm

)

Stage 9

Stage 8

Stage 7

Stage 6

Stage 5

Innhold Faglige mål Deltagere Sammendrag av oppnådde faglige resultater Vitenskapelig publisering Faktaark

0. Vitale mål hos kveitelarver 1. Ernæringsstatus og metamorfose hos kveitelarver fôret med Artemia

eller zooplankton 2. Forskjell i jod- og tyroidhormon nivå i kveitelarver fôret med Artemia

eller copepoder 3. Organstørrelse hos kveitelarver påvirkes av diett 4. Artemia anriket med jod fôret til kveitelarver 5. Stadieinndeling hos kveite fra startforing til bunnslåing, uavhengig av

øyenvandring 6. Forbeining og øyenvandring hos kveitelarver påvirkes av diett 7. Vitamin A i kveitelarver og –yngel (Hippoglossus hippoglossus L.) – kan

Artemia dekke behovet for retinoider? 8. Innhold av vitamin A i Artemia og copepoder 9. Innhold av vitamin A i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder 10. Vitamin A behov i kveiteyngel 11. Proteinfordøyelse og aminosyreutnyttelse i marine fiskelarver. 12. Radioaktiv merking av modellprotein til bruk i studier av proteinfordøyelse

og –utnyttelse i marine fiskelarver 13. Pre-hydrolyse bedrer absorpsjon og utnyttelse av diettprotein i

kveitelarver 14. En metode for syntese av proteiner egnet til metabolismestudier av

fiskelarver 15. Proteinmetabolisme i kveitelarver; effekt av proteinstørrelse 16. Vitamin C behov hos kveiteyngel – Effekt av vitamin E

1

Sluttrapport

Strategisk instituttprogram 130195/140. 1999-2003

Nutrition in larvae and juveniles of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.)

Faglige mål Å frembringe grunnleggende kunnskap om effekt av utvalgte næringsstoffer på næringsopptak, proteinomsetning, vekst og normal utvikling av kveitelarver

1. Å studere sammenhengen mellom larvens utviklingsstadium, aktivitet av fordøyelsesenzymer og opptak av næringsstoffer.

2. Å studere effekter av protein gitt i intakt og hydrolysert form på proteinomsetning og vekst

3. Å studere effekt av utvalgte næringsstoffer på tyroidhormon metabolisme og normal utvikling gjennom metamorfose

4. Å bestemme behov for mikronæringsstoffer hos kveiteyngel ved hjelp av multivariat tilnærming

Deltakere Nasjonalt Institutt for Ernærings- og Sjømatforskning (NIFES) Dr. scient Kristin Hamre (Prosjektleder) Stipendiat Sigurd Tonheim Stipendiat Mari Moren Havforskningsinstituttet, Austevoll Forsker Ingegjerd Opstad Stipendiat Stine C. Hovde Universitetet i Bergen Dr. scient Karin Pittman (Intitutt for fiskeri og marinbiologi, IFM) Professor Ivar Rønnestad (Zoologisk institutt) Professor Arnt Johann Raae (Molekylærbiologisk institutt)

Stipendiat Jostein Solbakken (IFM) Hovedfagsstudent Øystein Sæle (IFM) Hovedfagsstudent Børre Erstad (IFM) Hovedfagsstudent P.G.Espedal (IFM) Hovedfagsstudent E.Grotan (IFM)

Programmet ble startet opp 01.01.99 og avsluttet 31.12.03 Sammendrag av oppnådde faglige resultater Programmet har to hovedretninger. Den ene går på fordøyelse, absorpsjon og omsetning av protein (Delmål 1 og 2), der målet er å oppnå en best mulig proteinutnyttelse og dermed vekst. Marine fiskelarver har et lite differensiert fordøyelsesapparat, men utvikler dette gjennom metamorfosen. Bl.a. mangler magen, som denaturerer proteinet ved hjelp av syre og skiller ut fordøyelsesenzymet pepsin. I tillegg er aktiviteten av andre proteaser lav ved startfôring, men økende utover på larvestadiet og gjennom metamorfose. Man har derfor en

2

hypotese om at marine fiskelarver før metamorfose har begrenset evne til å fordøye protein (Ark 11). I levende fôr er en stor andel av proteinet vannløselig og antagelig relativt lett fordøyelig. I formulerte fôr og protein-anrikningsfôr for levende fôrorganismer brukes for en stor del fiskemel, der en stor andel av proteinet er tungt løselig. En utfordring er valg og eventuell prosessering av protein som gjør det tilgjengelig for larvene uten at det lekker ut av det mikropartikulære fôret. Det viser seg at kontrollerte fôringsforsøk med marine fiskelarver der man ser på effekt av frie aminosyrer og hydrolysert protein, som begge er små og sterkt vannløselige molekyler, vanskeliggjøres av høy lekkasje fra de mikropartikulære fôrene. Både delmål 1 og 2 er derfor løst ved hjelp av sondefôringsteknikk, der det er mulig å tvangsfôre enkeltlarver med et radioaktivt merket protein. Fordøyelse, absorpsjon, deponering av protein og forbrenning kan registreres ved å følge og kvantifisere radioaktivteten . Det er utviklet metoder for å produsere 3 ulike radioaktivt merkede proteinpreparater. To er produsert ved hjelp av PCR-teknikk og deretter oppformert ved innsetting av gensekvensen i bakterier (Ark 14). Det tredje er isolert fra lakseserum etter at laksen var fôret med en blanding av radioktivt merkede aminosyrer (Ark 12). Preparatene er brukt til å undersøke ontogenien i larvenes evne til opptak av protein og hvordan proteinstørrelse og hydrolyse av protein til peptider påvirker proteinopptak og omsetning i larven (Ark 13 og 15). Det ble bl.a. vist at andel av proteinet som ble absorbert var lavt på larvestadiet, at opptak av protein ble mer effektivt med økende alder på larvene og at opptak av små protein og hydrolysat var mer effektivt enn opptak av hhv. store protein og intakt protein. Det er viktig at proteinet fordøyes og absorberes raskt, fordi høy tarmtømmingsrate gjør at ”langsomme” proteiner i stor grad blir utskilt som fekalier (Ark 13). Den andre hovedretningen var å undersøke hva som kan være årsaken(e) til feilutvikling hos kveitelarver i intensiv kultur, et trekk som i hovedsak er ernæringsbetinget siden zooplanktonfôrede larver i liten grad blir feilutviklede (Delmål 3). Hypotesen var i utgangspunktet at langkjedete fettsyrer (n-3 og n-6), vitamin A og tyroidhormon er med på å styre metamorfosen og at mangel eller overskudd av disse næringsstoffene eller av næringsstoffer som er nødvendig for syntese av tyroidhormon kunne være årsaken til feilutvikling. Bakgrunnen for hypotesen var at alle tre har vist seg å påvirke pigmentering og til en viss grad øyevandring i flatfisk. I tillegg er de ligander til kjernereseptorer som styrer avlesning av gener som igjen styrer embryonalutvikling og antagelig også metamorfose. Det er dessuten interaksjoner mellom kjernereseptorer som binder vitamin A og hhv. fettsyrer og tyroidhormon. Det ble kjørt et forsøk der kveitelarver ble fôret med Artemia eller zooplankton, der larvene ble undersøkt for utviklingsfeil og der fôr og larver ble screenet for en rekke næringsstoffer (Ark 1, 2 og 9). Mer enn 90% av larvene fôret med Artemia var feilpigmentert og hadde manglende øyevandring, mens for larver fôret med zooplankton var tallene hhv. 32 og 12%. Det var stor forskjell i fettsyresammensetning mellom Artemia og zooplankton, med markert høyere DHA og EPA og lavere arachidonsyre i zooplankton enn i Artemia. Fettsyresammensetningen i fôret ble gjenspeilet i larvene. Larver fôret med zooplankton hadde noe høyere innhold av vitamin A enn larver fôret med Artemia. Jodnivået i zooplankton var dessuten 700 ganger høyere enn i Artemia. Jod er nødvendig for dannelse av tyroidhormon og tyroidhormon nivået i larver fôret med zooplankton var høyere enn i larver fôret med Artemia i det kritiske vinduet for metamorfose (14-25 dager etter startfôring). Det så ut til å være tilstrekkelig av de andre næringsstoffene som inngår i tyroidhormon syntesen i Artemia. Siden det er gjort mye forskning på fettsyrebehov hos marine fiskelarver valgte vi å gå videre med vitamin A og jod.

3

Undersøkelser av vitamin A innhold i zooplankton, Artemia (Ark 8) og larver (Ark 9), av kveiteyngelens evne til å omdanne karotenoider til vitamin A og av vitamin A behovet hos kveiteyngel (Ark 10) ledet til konklusjonen at Artemia ikke inneholder vitamin A, men antagelig nok karotenoider til å forsyne kveitelarver med tilstrekkelig vitamin A (Ark 7). Når det gjelder jod, ble det kjørt et fôringsforsøk der Artemia ble anriket med jod og der man så et økt opptak av jod i Artemia og larver (Ark 4). Det var også en tendens til økt syntese av tyroidhormon, men dette var ikke signifikant. Det må gjøres mer arbeid for å undersøke hvilken effekt anrikning med jod eventuelt har på utviklingsfeil. Forsøket med fôring av Artemia og zooplankton til kveitelarver var også utgangspunkt for stadieinndeling av kveitelarver fra startfôring til metamorfose, basert på beindannelse (Ark 5). Det er utarbeidet beskrivelser og tegninger av stadium 5 (ved startfôring) til 9 (etter metamorfose), korrelert med myotomhøyde, standard lengde og antall dager etter startfôring. Det er videre vist at larver fôret med zooplankton har større beinmasse enn larver fôret med Artemia (Ark 6) og at hypofysen og tyroidea er større (Ark 3). Det siste tyder på at zooplankton stimulerer tyroidhormon produksjonen. Det er gjort en studie av effekten av vitamin E på vitamin C behov (Ark 16, Delmål 3). Behovet for vitamin C ble funnet å ligge på 30 mg kg-1. Det ble bare funnet små effekter av vitamin E på vitamin C behovet. 24.02.04 Kristin Hamre Vitenskapelige utgivelser og annen publisering Avhandlinger Tonheim S. (2004) Protein digestion and amino acid utilisation in marine fish larvae. Dr.

scient thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway.

Moren M. (2004) Vitamin A in juvenile and larval Atlantic halibut (Hippoglossus

hippoglossus L.) – does Artemia cover the retinoid requirement? Dr. scient thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway.

Solbakken JS. (2003) Plasticity of metamorphosis in Atlantic halibut (Hippoglossus

hippoglossus): responses to internal and external cues. Dr. scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway.

Sæle Ø (2002) Ossification as staging criterion in Atlantic halibut (Hippoglossus

hippoglossus) Larvae and the effects of diet. Cand. scient. thesis in aquaculture. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway

Erstad B. (in prep.) Responses of halibut larvae to startfeeding diets: the effects on thyroid

hormones levels and growth of the pituitary and thyroid glands. Cand. Scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway

4

Grøtan E. (in prep.) Responses of cod larvae to first feeding diets and temperature: the effects on thyroid hormones levels and growth of the pituitary and thyroid glands. Cand scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway

Espedal P.G. (in prep). Development of protocol to determine IgM in Atlantic halibut using in

situ hybridization. Cand scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway

Artikler i internasjonale tidsskrift med referee Conceição, L. E. C., Rønnestad, I. & Tonheim, S. K. (2002) Metabolic budgets for lysine and

glutamate in unfed herring (Clupea harengus) larvae. Aquaculture 206, 305-312 Hamre, K., Opstad, I., Espe, M., Solbakken, J., Hemre, G.-I. & Pittman, K. (2002) Nutrient

composition and metamorphosis success of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus, L.) larvae fed natural zooplankton or Artemia. Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Moren, M. Opstad, I. & Hamre, K (Accepted) A comparison of retinol, retinal and retinyl ester concentrations in larvae of Atlantic halibut (Hippolglossus hippoglossus L.) fed Artemia or zooplankton. Aquaculture Nutrition.

Moren, M., Næss, T. & Hamre, K. (In press) Conversion of β-carotene, canthaxanthin and astaxanthin to vitamin A in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. Fish Physiology and Biochemistry.

Moren, M., Opstad, I., Berntssen, M.H.G., Zambonino Infante, J-L. & Hamre, K. (Accepted) An Optimum level of vitamin A supplements for Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. Aquaculture.

Rønnestad, I., Rojas-García, C. R., Tonheim, S. K. & Conceição, L. E. C. (2001) In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae. Aquaculture 201, 161-175.

Rønnestad, I., S. K. Tonheim, H. J. Fyhn, C. R. Rojas-García, Y. Kamisaka, W. Koven, R. N. Finn, B. F. Terjesen, Y. Barr & L. E. C. Conceição (2003) The supply of amino acids during early feeding stages of marine fish larvae: a review of recent findings. Aquaculture 227, 147-164.

Sæle, Ø., Solbakken, J., Watanabe, K., Hamre, K., Power, D. & Pittman, K. (submitted) Stages of Atlantic halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.) from first feeding through metamorphosis with emphasis on cranial ossification independent of eye migration. Aquaculture

Sæle, Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K., & Pittman, K. (2003) The effect of diet on ossification and eye migration in Atlantic halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture 220, 683-696.

Solbakken J. & Pittman K. (In press) Photoperiodic modulation of metamorphosis in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture

Solbakken, J.S., Norberg, B. & Pittman, K. (Accepted). Sensitivity of metamorphosis to exogenous thyroxine during larval development in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.): consequences for eye migration and asymmetrical pigmentation post-metamorphosis. Journal of Fish Biology

Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2003) Differential iodine and thyroid hormone levels between Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exogenous feeding until post metamorphosis. J. Fish. Biol., 61, 1345-1362.

5

Tonheim, S.K., Espe, M., Raae, A.J., Darias, M.J. & Rønnestad, I. (in press) In vivo incorporation of [U]14C-amino acids: an alternative protein labelling procedure for use in examining larval digestive physiology. Aquaculture.

Bokkapitler Kjørsvik E., Pavlov, D. & Pittman, K. (2003). From fertilization to metamorphosis -

functional development. In: Mokness, E., Kjørsvik, E. & Olsen, Y. (eds.) Cultivation of Coldwater Marine Fish, Blackwell Science, Oxford, UK pp 204-278

Pittman, K., (2003) Flatfish Nutrition. In: (Lall, S. et al. eds.) Encyclopedia of Farm Animal Nutrition, Prentice & Hall

Stoss, J., Hamre, K. & Otterå, H. (2003) Weaning and nursary. In: Moksness, E., Kjørsvik, E. & Olsen, Y. Culture of cold-water marine fish. Blackwell Science Ltd, Oxford, UK.

Foredrag Erstad, B., Brown, J. & Pittman, K. (2002) Thyroid hormone development in Atlantic halibut

larvae fed rotifers and Artemia. Proceedings of the World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27,

Grøtan, E., Pittman, K. & Otterlei, E. (2002) Whole body levels of thyroid hormones in early life stages of cod (Gadus morhua) with focus on metamorphosis. Proceedings of the World Aquaculture Society Meeting, Beijing China Apr 24-27,

Hamre, K., Opstad, I., Solbakken, J. & Pittman, K. (2000) Artemia eller zooplankton som fôr til kveitelarver – larveutvikling, nivå av tyroid hormon og ernæring. Det 11. Norske Fiskeernæringsseminar, Norheimsund, 8-10. mai.

Moren, M., Næss, T.H. & Hamre, K (2000) Omdanning av karotenoider til vitamin A hos yngel av kveite. Det 11. Norske Fiskeernæringsseminar, Norheimsund, 8-10. mai.

Moren, M., Opstad, I., Zambonino Infante, J.L., Berntssen, M. & Hamre, K (2002) Behov for vitamin A i larve og yngelfasen hos kveite. Programkonferansen ”Havbruk og villaks”. Tromsø 16-18 september.

Moren, M., Opstad, I., Zambonino Infante, J.L., Berntssen, M. and Hamre,K. (2002) Possible roles of vitamin A in the metamorphosis of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae. 10th International Symposium on Nutrition & Feeding in Fish, Rodos 2-7. juni 2002.

Pittman, K. (2001). Farming flatfish. Marine and Coastal Management, Cape Town South Africa, 30 November

Pittman, K. (2001) Halibut Production in Norway: New Biology meets New Business. Ocean Science Center, Memorial University of Newfoundland, 3. May

Pittman, K. (2001) Rearing Halibut in Norway: Current Practice and Challenges, 12 April, Harbour Branch Oceanographic Inst, Fort Pierce, Florida

Pittman, K. (2002) Overview of marine fish culture in Norway. Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa

Pittman, K. (2002) Salmon, cod and halibut farming in Norway. Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa

Pittman. K. (2002) Trends and constraints in global finfish aquaculture. Keynote speech at Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa

Pittman, K. (2004) What makes a flatfish flat? Canada-Norway halibut workshop. January 19-24, National Research Council, Halifax, Canada

Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish with examples from Atlantic halibut. 26th Annual Larval Fish Conference 22-26 July, Bergen, Norway

6

Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish. World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27

Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish with examples from Atlantic halibut. Larval Fish Society Conference Bergen July 24-27

Pittman, K.(2003) Kveiteoppdrett – den vanskelige veien til en flatfisk middag. AquaNor Trondheim Aug 11-14

Pittman, K., J. Solbakken, & K. Hamre (2001) Control of metamorphosis in flatfish. Oral contribution and extended abstract to Larvi’ 2001, Ghent Belgium

Sæle, Ø., Solbakken, J., Hamre, K. & Pittman, K. (2002) Early development of bony structures in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus). Proceedings of the World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27,

Tonheim, S. K., Darias, M. J., Espe, M. & Rønnestad, I. (2002) Merking av lakseserumprotein med 14C for bruk i metabolske studier av marine fiskelarver. Programkonferansen ”Havbruk og villaks”. Tromsø 16-18 september.

Postere Moren, M. & Hamre, K. (2003) Retinoids in Artemia and copepods. Aquaculture Europe,

Trondheim 9.-12.aug. European Aquaculture Society. Moren, M., Opstad, I., Pittman, K., & Hamre, K. (2001) A comparison of retinol, retinal and

retinyl ester concentrations in larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) fed Artemia or zooplankton. Larvi ’01, Ghent, Belgium 3.-6. september.

Rojas-García, C.R., Tonheim, S.K. & Rønnestad, I. (2002). Post-prandial changes of pH in the gut of developing Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) studied by in vivo tube feeding. Aquaculture Europe 2002, Trieste, Italy, 16.-19.okt. European Aquaculture Society.

Solbakken, J.S., Hamre, K., Berntssen, M., Opstad, I, Norberg, B. & Pittman, K. (2000) Nutritional effects on whole body thyroid hormone levels, larval development and juvenile quality in Atlantic halibut. New Species in Mariculture, August, Faro, Portugal.

Tonheim, S., Hamre, K., Espe, M. Aursland, K. & Rønnestad, I. (2001) A study of the protein digestion and amino acid uptake and metabolism in fish larvae. Larvi’01, 3.-6. Sept., Ghent, Belgium.

Vitale mål hos kveitelarver Sammenheng mellom alder (dager etter startfôring), standard lengde, myotom høyde og vekt hos kveitelarver fôret med copepoder i 60 dager.

Dag

Standard lengde

(mm)

Myotom høyde

(mm)

Tørrvekt

(mg)

0 13,2±0,4 1,9 1,0

15 15,4± 0,8 2,2±0,1 2,5±0,7

25 16,7± 0,0 3,1±0,1 4,9±0,3

29 18,0± 0,3 3,5±0,3 6,5±1,2

34 19,8± 1,0 4,6±0,5 10,4±2,6

46 23,5± 0,9 5,8±0,2 22,5±1,2

55 25,9± 0,3 6,8±0,1 36,4±0,7

60 28,1± 0,3 7,4±0,1 47,7±3,0

Ark 1

Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Ernæringsstatus og metamorfose hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton

Kristin Hamre, Ingegjerd Opstad, Marit Espe og Karin Pittman

Kveitelarver fôret med Artemia blir ofte feilpigmenterte og får ufullstendig øyevandring. Larver fôret med copepoder, som er larvenes naturlige føde, vil derimot som oftest utvikle seg normalt. Feilutvikling av kveitelarver synes derfor å være ernæringsbetinget. I dette forsøket ble kveitelarver fôret med de to typene fôrorganismer under ellers like forhold for 1) å kartlegge vekst og utvikling og 2) å kartlegge næringsinnhold i fôrorganismer og ernæringsstatus i larver, for derigjennom å identifisere næringsstoffer som kan gi opphav til feilutikling. Introduksjon Fettsyresammensetning og vitamin A er de næringsstoffene som har vist størst effekt på pigmentering hos flatfisk. Når det gjelder fettsyresammensetningen, har særlig nivå av DHA og DHA/EPA ratio fått stor oppmerksomhet. Det er vist at total mangel på n-3 fettsyrer gir feilpigmentering og at god anrikning med DHA gir bedret pigmentering, men hvilket nivå som skal til for å få normal pigmentering (behovet) er ikke kjent. I den senere tid er det også kommet publikasjoner som viser at høyt nivå av arachidonsyre (ARA), og dermed lav EPA/ARA ratio gir dramatisk økt feilpigmentering. Derimot hadde DHA/EPA-ratio liten effekt på pigmentering. Anriking av Artemia med vitamin A ga bedret pigmentering hos japansk flyndre, men dette var ledsaget av skjelettdeformiteter. Bad av larver i retinsyre, den aktive metabolitten av vitamin A, stimulerte også dannelsen av pigmentceller hos japansk flyndre. I tillegg til vitamin A og fettsyrer, er tyroid hormon vist å stimulere til normal utvikling hos flatfisk. Næringsstoffer som er nødvendige for dannelse av tyroid hormon er bl. a. jod, selen og aminosyrene fenylalanin og tyrosin. Manglende øyevandring er et mye større problem hos kveitelarver enn hos andre flatfisk, og det er ikke gjort mye arbeid på dette feltet. Det har vært foreslått at god øyevandring henger sammen med god vekst. Fôring med Artemia anriket med planteolje (mangel på langkjedete n-3 fettsyrer) ga dessuten dårlig øyevandring hos piggvarlarver. Dette faktaarket tar for seg hovednæringsstoffene, fettsyrer og aminosyrer. For vitamin A og næringsstoffer som er nødvendige for tyroid hormon syntese, se andre ark i denne rapporten. Materialer og metoder Egg fra en hunnfisk ble befruktet med sperm fra en hann og inkubert på egg- og larvestadiet i henhold til standard prosedyrer ved Austevoll Havbruksstasjon. De ble så flyttet til 4 1500 L kar, 5000 larver per kar, som ble driftet i henhold til

standard prosedyrer. Larvene ble fôret i duplikat i 60 dager med Artemia (RH-type, INVE) anriket med DHA-Selco og vitaminer eller med zooplankton filtrert fra poll (Svartatjønn). Zooplanktonet bestod i hovedsak av de calanoide copepodene Eurytemora affinis og Centrophages hamatus. Analyse av næringsstoffer er utført i henhold til akkrediterte metoder ved NIFES. Resultater Det var ikke signifikante forskjeller i dødelighet mellom de to larvegruppene (Fig.1), selv om dødeligheten i det ene karet fôret med Artemia var noe høyere enn i de andre 3 karene. Dette førte til at det ble mangel på materiale i dette karet på slutten a)

b)

Dager etter startfôring

mg

tørrv

ekt

0 10 20 30 40 50 60 70-5

5

15

25

35

45

55

65

Dager etter startfôring

Cum

luat

ive

mor

talit

y (n

o. o

f lar

vae)

Zooplankton Artemia0 10 20 30 40 50 60 70

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Figur 1. Vekst a) og dødelighet b) hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager fra startfôring.

Ark 1

Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Tabell 1. Pigmentering og øyevandring hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager fra startfôring Artemia Zooplankton Feilpigmentert 93 32 Manglende øyevandring 90 12 Fri dorsalfinne 82 33 av forsøket, og at vi derfor bare har en parallell for vekst ved siste uttak. Veksten i de to larvegruppene var lik til og med dag 45. Deretter ser copepode fôrete larver ut til å vokse bedre enn Artemia forede larver. Det var stor forskjell i pigmentering og øyevandring i de to larvegruppene (Tabell 1). Feilpigmenterte larver i Artemia-gruppen var depigmenterte, mens de i zooplanktongruppen var pigmentert på begge sider. Næringsinnhold i fôrorganismene Artemia og zooplankton hadde noenlunde samme tørrstoff- og proteininnhold, mens nivå av fett og glykogen var høyere i Artemia enn i zooplankton (Tabell 2). Fettsyresammensetningen (Tabell 3) i zooplankton var karakterisert ved høyt nivå av DHA, EPA og totale n-3 fettsyrer. Artemia hadde lavt innhold av DHA, EPA og n-3 fettsyrer og høyere innhold av monoener, n-6 fettsyrer og ARA enn zooplankton. DHA/EPA-ratio var ikke signifikant forskjellig mellom de to. Tabell 2 Tørrvekt og innhold av hovednæringsstoffer i fôrorganismene Artemia Zooplankton Tørrvekt (mg g-1 våtvekt) 110±10 110±20 Protein (mg g-1 tørrvekt) 620±40 720±80 Fett (mg g-1 tørrvekt) 266±5a 156±31b Glykogen (mg g-1 tørrvekt) 74±6a 5±2b Tabell 3 Fettsyresammensetning (% fordeling) i fôrorganismene Artemia Zooplankton ARA (20:4 n-6) 2.1±0.1a 0.7±0.2b EPA (20:5 n-3) 4.9±0.3a 18.6±3.2b DHA (22:6 n-3) 6.3±0.9a 28.5±4.8b Σ Mettede 21.3±1.2 22.5±1.0 Σ Monoener 27.3±0.2a 10.4±4.0b Σ n-3 34.5±0.4a 55.9±4.8b Σ n-6 8.1±0.4 4.3±3.3 DHA/EPA 1.3±0.1 1.6±0.4 EPA/ARA 2.3±0.0a 29±10 b

Tabell 4. Nivå av frie og totale aminosyrer (mg g-1 protein) i fôrorganismene. Essensielle aminosyrer er merket med asterix. Frie aminosyrer Totale aminosyrer Artemia Zooplankton Artemia ZooplanktonAsp 2.6±0.4a 3.9±1.3b 76±3 77±13 Glu 13±2 12±6 113±4 109±21 OH-Pro 0.2±0.0a 0.1±0.1b - -

Ser 10±2 9±3 42±1 42±7 Gly 6.5±1.3a 22±8b 42±2a 60±12b Gln 12±2a 6.1±2.7b - -

His* 4.1±0.7 4.1±1.6 16±1 17±5 Tau 14±2a 9±3b 17±1a 12±4b Arg* 18±3a 25±8b 60±3 60±13 Thr* 6.2±1.1 7.3±2.6 40±1 39±7 Ala 21±4 17±7 55±2 56±10 Pro 13±3 15±6 42±2 42±7 Tyr 8.0±1.7 7.5±3.0 37±1 37±6 Val* 8.6±1.6 10±4 44±2 42±8 Met* 4.7±0.9a 6.3±2.3b 17±1 19±4 Ile* 4.4±0.8a 6.5±2.9b 41±2 35±6 Leu* 12±2a 15±6b 66±3 60±11 Phe* 7.0±1.2 7.3±2.7 39±2 32±5 Trp* 1.8±0.3 2.1±0.8 - -

Lys* 17±3 17±6 68±3 59±12

ΣAA 183±33 248±24 818±30 797±148

fôrorganismene, mens EPA/ARA ratio var mer enn 10 ganger høyere i Artemia enn i zooplankton. Zooplankton hadde ca 35% høyere innhold av frie aminosyrer enn Artemia (Tabell 4), med høyere innhold av følgende essensielle aminosyrer: arginin, metionin, isoleucin og leucin. Den største forskjellen lå imidlertid i glycin, som er en ikke-essensiell aminosyre. Det var bare små forskjeller i innhold av totale aminosyrer mellom de to fôroganismene (Tabell 4). Ernæringsstatus i larver Tørrstoffinnholdet i larver økte gjennom startfôringsperioden fra ca 9 til ca. 18% av våtvekt, mens proteininnhold i % av tørrstof ble redusert fra 87 til ca 70. Det var bare små forskjeller i protein og tørrstoffinnhold mellom fôringsgruppene. Fettinnhold i larvene var målt som FAME, dvs. totale fettsyrer, som gir et noe lavere tall enn om man hadde målt totalt fett. Ved 15 og 29 dager hadde larver fôret med Artemia tilsynelatende lavere fettinnhold enn larver fôret med zooplankton, men dette var ikke signifikant. Fettinnholdet i larver fôret med Artemia økte mot slutten av forsøket, mens det i zooplanktonfôrede

Ark 1

Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Tabell 5. Utvikling av tørrstoff, protein, fett og glykogeninnhold i larver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager Tørrstoff

(mg g-1 våtvekt) Protein

(mg g-1 tørrvekt) FAME*)

(mg g-1 tørrvekt) Glykogen

(mg g-1 tørrvekt.) Dag Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton 0 94±1 94±1 870±50 870±50 70±4 70±4 5±1 5±1 15 113±12 123±3 770±90 760±20 77±4 88±8 11±2a 1±2b 29 124±15a 138±5 b 790±70 730±30 59±5 88±11 8±3 6±1 45 161±4 151±8 680±20 720±40 89±25 89±5 9±2 13±3 60 181±2 177±1 660±40 710±50 114±13a 76±4b 20±5a 9±2b

larver var en liten nedgang i fettinnhold. Signifikant forskjell i fettinnhold i larver finner man bare på dag 60. Glykogeninnholdet i larvene økte utover i startfôringsperioden og var høyere i Artemia fôrede enn i zooplankton forede larver på dag 15 og 60. Når det gjelder nivå av aminosyrer i larvene, var det høyere innhold av metionin på dag 15 og lavere innhold av taurin på dag 45 i larver foret med Artemia enn i larver fôret med zooplankton (Tabell 6). Tabell 6. Totale aminosyrer i kveitelarver fôret med Artemia i 15 og 45 dager. Essensielle aminosyrer er merket med astriks.

Dag 15 Dag 45 Artemia Zoopl. Artemia Zoopl.

Asp 83±1 83±1 86±1 85±3 Glu 122±2 121±1 124±0 125±1 Hyp 5±0 5±0 7±0 6±0 Ser 45±0 45±1 50±3 47±0 Gly 51±1 52±0 59±3 55±1 His* 16±0 16±0 20±1 19±0 Tau 25±0 24±1 27±1a 22±0 b Arg* 65±1 64±0 60±1 61±0 Thr* 45±1 44±0 43±0 44±1 Ala 51±1 50±0 58±1 56±1 Pro 36±0 37±0 39±0 38±0 Tyr 35±1 34±1 32±0 33±0 Val* 45±1 45±2 44±1 45±0 Met* 17±1 a 20±1 b 27±0 28±0 Ile* 38±1 38±2 39±1 39±0 Leu* 72±2 70±2 75±1 75±1 Phe* 37±1 38±3 38±0 38±0 Lys* 69±1 70±1 75±1 75±1 ΣEAA 403 403 420 424 ΣNEAA 453 451 482 468 ΣAA 857 854 902 891

Det var store forskjeller I fettsyresammensetning mellom larver fôret med de to fôrorganismene, med dramatisk høyere ARA, lavere EPA og DHA i larver fôret med Artemia i forhold til zoolpankton fôrede larver (Figur 2).

ArtemiaZooplankton

ARA

Days after firstfeeding

AA

(wt%

)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

0 15 30 45 60

a aa

b

c

d

e ee

ArtemiaZooplankton

EPA

Days after firstfeeding

EPA

(wt%

)

0

5

10

15

0 15 30 45 60

aa

bbcc

d d dd

Artemia

Zooplankton

DHA

Days after firstfeeding

DH

A (w

t%)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 15 30 45 60

a a

ab abb

c

dd

d

Figur 2. Essensielle fettsyrer i larver fôret med Artemia eller zooplankton.

Ark 1

Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Diskusjon Vekst frem til dag 45 og dødelighet var ikke signifikant forskjellig i de to gruppene. Tidligere studier har vist noe varierende resultater med hensyn til vekst av kveitelarver, men hovedinntrykket fra dette og tidligere studier er at Artemia har lignende potensial som copepoder til å fremme vekst hos kveitelarver i tidlige stadier. Lengre ute på larvestadiet er det mulig at Artemia blir for små, da det har vært beregnet at kveitelarver trenger opp til 2500 Artemia per dag på dette stadiet for å dekke sitt energibehov. En større andel av larvene fôret med copepoder var normalt utviklet, sammenlignet med larver fôret med Artemia. Dette bekrefter tidligere resultater der det også er funnet store forskjeller i pigmentering og øyevandring mellom larver fôret med de samme fôrorganismene. Det at larver fôret med zooplankton hadde såpass høyt innslag av feilutvikling var imidlertid uventet. Pigmentering på begge sider, funnet i en stor andel av denne yngelen, kan være et resultat av manglende øyevandring. Sammensetning av hovednæringsstoffene var innenfor optimalområdet definert for yngel, i copepoder, mens fett- og glycogeninnhold var litt i overkant av antatt øvre grense (hhv. 25 og 5%) i Artemia. Økt fett- og glycogeninnhold ved slutten av forsøket i larver fôret med Artemia reflekterer fôret og stemmer overens med resultater fra kveiteyngel. Tidligere på larvestadiet hadde forskjellene i hovednæringsstoff i fôrorganismene ingen klar effekt på sammensetningen av larvene. Tendensen til lavere fettinnhold i larver fôret med Artemia var, selv om den ikke var signifikant, i motstrid til resultater fra kveiteyngel, og kan ha sammenheng med lav tilgjengelighet av fett fra anrikningsemulsjonen. Dette fettet består av triacylglycerol, mens det er vist at fosfolipid er mer tilgjengelig for marine fiskelarver. Lavere tilgang på energi i larver fôret med Artemia i den perioden som er antatt å være kritisk for utvikling, kan muligens forklare forskjellen i øyevandring. Forskjellen i frie aminosyrer mellom Artemia og copepoder ser ikke ut til å ha hatt innvirkning på proteinsyntesen, siden verken vekst eller proteininnhold i larvene var forskjellig. Det er vist at Artemia har høyt innhold av vannløselig protein, som antagelig er godt tilgjengelig for larvene, selv om disse ikke har et fullt utviklet fordøyelsessystem. Totalinnholdet av aminosyrer var ganske likt de to fôrorganismene, bortsett fra at glycin var høyere i zooplankton enn i Artemia. Glycin er en ikke essensiell aminosyre og Artemia ser derfor ut til å være en like god proteinkilde for kveitelarver som copepoder, i alle fall med hensyn til aminosyresammensetning.

Aminosyresammensetningen i protein fra larver er genetisk bestemt og den frie aminosyre poolen er liten i forhold til totale aminosyrer. Det er derfor vanskelig å forklare at metionin er lavere i larver fôret med Artemia enn i zooplankton-fôrede larver. Dersom det hadde vært mangel på metionin ville proteinsynteseraten blitt lavere, noe som ville ha medført redusert vekst eller proteindeponering i larvene. Forskjellen i metionin i larver er liten og antagelig forårsaket av feil i analysene. Den største forskjellen i næringsinnhold mellom Artemia og copepoder fant man ikke uventet i fettsyresammensetningen. Lav DHA, høy ARA og lav EPA/ARA ratio i Artemia kan ha vært årsaken til feilpigmentering. Det var ikke forskjell i DHA/EPA forholdet i fôrorganismene. Hvilke mekanismer som styrer fettsyrenes effekt på pigmentering er ikke kjent, men EPA og ARA danner utgangspunkt for syntese av eicosanoider. Disse signalstoffene påvirker svært mange funksjoner i organismen. EPA og ARA konkurrerer om enzymene cyclo-oxigenase og lip-oxigenase som styrer dannelsen av eicosanoider, mens DHA binder seg til enzymene og blokkerer syntesen. N-3 og n-6 fettsyrer gir eicosanoider med forskjellig funksjon. Det er derfor viktig å ha riktig balanse mellom disse fettsyrene. Selv om man i den vitenskapelige litteraturen finner generelt lave nivå av DHA i Artemia (5-10%), er det mange kommersielle anlegg som oppnår langt høyere nivå. Det bør være mulig å anrike Artemia med opp til 20% DHA og få relativt høye nivå av EPA. ARA finner man imidlertid i selve Artemia og det kan være vanskelig å få redusert nivået. Siden det er balanse det dreier seg om, kan det vise seg å være tilstrekkelig å øke DHA og EPA i Artemia for å oppnå normal pigmentering hos kveitelarver. Balansert fettsyresammensetning kan også ha betydning for øyevandring. Konklusjoner

Artemia kan gi en stor andel feilpigmentering og manglende øyevandring hos kveitelarver, i motsetning til copepoder. Utviklingsfeilene er ernæringsbetinget.

Ubalansert fettsyresammensetning er en av flere mulige årsaker til feilpigmentering

Mangel på energi og ubalansert fettsyresammensetning er to av flere mulige årsaker til manglende øyevandring.

Artemia har antagelig omtrent samme potensialet som copepoder til å stimulere vekst hos tidlige stadier av kveitelarver.

Artemia er antagelig en god protein- og aminosyrekilde for marine larver.

Anriket Artemia inneholder litt for mye fett og glycogen i forhold til optimalområdet for kveiteyngel.

Ark 2

Forskjell i jod- og tyroid hormon nivå i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder

Hamre, K., Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B. & Pittman, K.

Tyroid hormon er en viktig faktor i styring av metamorfosen hos en rekke dyr, inkludert fisk. Aminosyrene fenylalanin og tyrosin, samt selen og jod er nødvendig for dannelse av tyroid hormon. Vi fant at jod-nivå i Artemia var ca 700 ganger lavere enn i copepoder og at det var forskjeller (2-3 ganger) også i larvene. Tyriod hormon var høyere på dag 15 og 25 etter startfôring i larver fôret med copepoder, noe som falt sammen med initiering av øyevandring i denne gruppen. Man kan stille spørsmål om Artemia som fôres til kveitelarverbør anrikes med jod. Introduksjon Tyroid hormon styrer metamorfosen i en rekke dyr, inkludert marine fiskelarver. Feilpigmentering og manglende øyevandring hos kveitelarver fôret med Artemia er i hovedsak ernæringsbetinget. Vi ville derfor undersøke om næringstoffer som er sentrale i syntesen av tyroid hormon var tilstede i forskjellig nivå i copepoder og Artemia og i larver fôret med de to organismene. I tillegg ville vi måle tyroid hormon i larvene for å se om dette var avhengig av fôrorganisme. Tyroid hormon dannes med utgangspunkt i aminosyren tyrosin som kan dannes fra aminosyren fenylalanin. I den videre prosessen bindes 4 jod til tyrosin (T4). Den aktive formen av hormonet dannes ved å spalte av ett jod til T3. Enzymet dejodinase som står for denne siste omdanningen er avhengig av selen for å fungere. Vi har derfor fokusert på næringsstoffene fenylalanin, tyrosin, jod og selen i larver fôret med Artemia eller copepoder fra startfôring og gjennom metamorfose. Materialer og metoder Egg fra en hunnfisk ble befruktet med sperm fra en hann og inkubert på egg- og larvestadiet i henhold til standard prosedyrer ved Austevoll Havbruksstasjon. De ble så flyttet til 4 1500 L kar, 5000 larver per kar, som ble driftet i henhold til standard prosedyrer. Larvene ble fôret i duplikat i Tabell 1. Innhold av selen, jod, tyrosin og fenylalanin i fôrorganismene (n=5). (µg g-1 tørrvekt) Artemia Zooplankton

Selen 2,2±0,2 2,0±0,4

Jod 0,51±0.05a 350±40b

Aminosyrer (mg g-1 protein)

Tyrosin 37±1 37±6

Fenylalanin 39±2 32±5

60 dager med Artemia (RH-type, INVE) anriket med DHA-Selco og vitaminer eller med zooplankton filtrert fra poll (Svartatjønn). Zooplanktonet bestod i hovedsak av de calanoide copepodene Eurytemora affinis og Centrophages hamatus.. Analyse av næringsstoffer er utført i henhold til akkrediterte metoder ved NIFES og analyse av øyevandring og T4 er gjennomført ved Austevoll Havbruksstasjon. Resultater Det var ingen forskjell i nivå av selen, tyrosin eller fenylalanin mellom Artemia og copepoder. Jod var

Jod i larver

Dager etter startfôring

Jod

(ug/

g tø

rrve

kt.)

ArtemiaZooplankton0 15 29 45 60

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Selen i larver

Dager etter startfôring

Sele

n (u

g g-

1 tø

rrvek

t)

ArtemiaZooplankton0 15 29 45 60

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

Figur 1. Jod og selen i larver fôret med zooplankton eller Artemia

Ark 2

Figur 2. Øyevandring (a) og tyroid hormon nivå (T4, b) i larver fôret med Artemia (åpne symboler) eller copepoder (lukkede symboler) fra startfôring (43 dager etter klekking) til etter metamorfose. ca 700 ganger høyere i copepoder enn i Artemia (Tabell 1). I larvene var det 2-3 ganger høyere nivå av jod hos dem som hadde fått copepoder, sammenlignet med dem som hadde fått Artemia (Figur 1a). Selen nivå i larver fôret med Artemia var høyere enn i larver fôret med copepoder (Figur 1b). Det var ingen forskjeller i fenylalanin- of tyrosin nivå i larvene. Det var stor forskjell i øyevandring mellom gruppene. Øyet begynte å vandre hos larver fôret med copepoder rundt 58 dager etter klekking som tilsvarer 15 dager etter startfôring (Figur 2a). Det var høyere nivå av tyroid hormon i larver fôret med copepoder i perioden rundt initiering av øyevandring (Figur 2b). Diskusjon Det at selen, fenylalanin og tyrosis ikke var lavere i Artemia enn i copepoder og heller ikke i larver fôret med Artemia enn i dem som hadde fått copepoder, kan sees som en indikasjon på at det er nok av disse næringsstoffene i Artemia. Det høye nivået av selen i Artemia-fôrede larver kan være et resultat av god tilgjengelighet av selen fra dette byttedyret. Selen foreligger i forskjellige former med forskjellig tilgjengelighet.

Det var ca 700 ganger mer jod i copepoder enn i Artemia, men bare 2-3 ganger så mye i larver fôret med copepoder, sammenlignet med Artemia-fôrede larver. Sjøvann er en viktig jod-kilde, og man antar at det er tilstrekkelig til å dekke jodbehov hos støøre fisk. Hos voksen fisk taes jod opp over gjellene. Larver på et tidlig stadium har ikke gjeller og hvordan jod eventuelt taes opp fra vannet på dette stadiet er ikke kjent. Man kan også spørre seg om fiskelarver er tilvendt til og avhengig av et fôr som inneholder mye jod. Larver fôret med copepoder hadde også høyere nivå av tyroid hormon i perioden der øyevandring ble initiert, noe som kan ha sammenheng med økt jod tilgang. Denne perioden sammenfaller med ”copepode-vinduet” der man ved å fôre copepoder i fra dag 18-25 etter startfôring, fikk en markant positiv effekt på pigmentering og øyevandring (Næss og Lie 1998). Det er imidlertid et åpent spørsmål om larver har behov for jod via fôret i de mengdene som man finner i copepoder. Konklusjoner

Av de næringsstoffene som er nødvendig for syntese av tyroid hormon, var bare jod lavere i Artemia enn i copepoder og i Artemia- sammenlignet med copepode-fôrede larver.

Lavt jod kan ha vært årsaken til lavere nivå av tyroid hormon og svakere øyevandring i larver fôret med Artemia.

Om jodanrikning av Artemia er nødvendig for å få normal utvikling av kveitelarver må undersøkes nærmere.

Referanse Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2003) Differential iodine and thyroid hormone levels between Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exogenous feeding until post metamorphosis. J. Fish. Biol., 61, 1345-1362.

******

** ******

***

0

1

2

3

40 50 60 70 80 90 100 110 120

Days post hatching

Eye

mig

ratio

n in

dex

*****

0

10

20

30

40

50

40 50 60 70 80 90 100 110 120

Days post hatching

T4 (n

g g-1

)

Ark 3

Organstørrelse hos kveitelarver påvirkes av diett

Espedal, P.G., Sæle, Ø., Erstad, B., Watanabe, K., Hamre, K. & Pittman, K. Dersom kveitelarvens diett påvirker skjelettdannelse og yngelens utseende, er det flere mekanismer som kan ligge bak. En fiskelarve har en hjernedel, hypofysen, som styrer hormonutskillelse, og en “kjertel”, tyroiden, som mottar signalene og skiller ut hormoner som styrer celle-endringer i resten av kroppen. Vi ville se om dietten påvirket så basale organer tidlig i kveitelarvens utvikling. Vi undersøkte organdannelse hos en utviklingsserie av 76 kveitelarver, fôret enten på anriket Artemia eller naturlig dyreplankton. Disse var seriesnittet medialt, farget og analysert stereologisk for volum av hypofyse, tyroidens epitel og colloid, og tarmepitel. Analyse av det siste er ikke ferdig. Resultatene viser at fôring med dyreplankton gir en signifikant større hypofysevolum fra startfôring og gjennom hele utvikling, og tyroidfolliklene er ikke-signifikant større gjennom hele utvikling enn de er hos larver fôret med Artemia. Det er en endring i trendene i alle data rundt 3-4 mm myotomhøyde, som er tilsvarende Stadiet 7. Da hypofyse og tyroid også påvirker tarmutvikling, kan det være en feedback loop der riktig mat bygger opp hjernen og tyroid som hjelper til å forbedre fordøyelse som fører til normal utvikling osv. Effekten av diett på hjerneoppbygging og dermed larvens evne til å styre egen utvikling er målbart kort etter startfôring. Introduksjon Utviklingsproblemer er ofte relatert til diett, men mekanismene bak er uklare. Etter plommesekkabsorpsjon, er det dietten som gir byggesteinene for all organdannelse, inkludert hjernen. Hos fisk er det en hjernedel, hypofysen, som utvikles under hoveddelen av hjernen. Hypofysen hos voksne beinfisk skiller ut bl.a. prolactin, veksthormon, melanoforstimulerende hormon (for pigmentering), ACTH (styrer cortisol) og tyroidstimulerende hormon. Det er altså hypofysen som styrer hormonutskillelse fra tre andre organer: interrenalen, gonadene og tyroiden. Av disse er det mest interessante på larvestadiet tyroiden. Tyroiden bygges opp rundt starforing og skiller ut tyroidhormoner som er nødvendig for å styre metamorfose, på lik linje som hos frosker. En effekt er på tarmen, der tyroidhormon øker volumet av epitel og absorbativt vev (egne data). Vi ville derfor undersøke kveitelarvens oppbygging av hypofyse, tyroid og tarm for å se når og hvor forskjeller oppstår som respons til diett. Dette var en del av en flerfaglig undersøkelse. Materialer og metoder (Se faktaark om Jod og tyroid for forsøksoppsettet.) En utviklingserie på tilsammen 76 kveitelarver, foret på enten zooplankton eller anriket Artemia ble samlet inn på regelmessig fra dag 5 til 46 etter startfôring. Disse ble bedøvd, målt for standard lengde, myotomhøyde, og øyenvandring, og fiksert før innstøping, snitting i 5 µ tykke snitt og farget. Programvaren CAST 2 (Olympus Danmark) ble brukt for stereologisk måling av areal som sammen med snitt-tykkelse ga volumet til hvert organ på hver larve. Tyroidfollikkelen ble delt opp i epitel og colloid.

Resultater Volumet av hypofysen øker med økende myotomhøyde hos larvene i begge grupper (Fig. 1) . Larver fôret med dyreplankton har samlet sett signifikant større hypofyse fra kort tid etter startfôring (covariansanalyse) og forskjellen øker med økende størrelse. Trenden ser ut til å endres rundt myotomhøyde 3-4 som tilsvarer Stadiet 7. Til tross for store individforskjeller er det signfikant større hypofyse hos kveitelarver som får dyreplankton.

Fig. 1 Volumet av hypofyse hos kveitelarver fôret med dyreplankton (røde firkanter) eller Artemia (blå sirkler). N=76. Regresjonslinjene er signfikant forskjellig (covariansanalyser). Stolpene indikerer området der Solbakken et al. (2003) målte økt tyroidnivå hos larver fra samme forsøk. Tyroidfollikkelvolum hos kveitelarvene gjenspeilet samme trend (figur 2). Hos begge gruppene økte tyroidfollikkelvolum med økende larvestørrelse, og igjen var det større tyroid hos de som fikk dyreplankton, selv om forskjellen ikke var signifikant. Igjen var det en endring da myotomhøyde var mellom 3-4 mm, og dette svarte til størrelsesområdet der Solbakken et al. (2003)

Myotomhøyde (mm)

Hyp

ofys

evol

um (m

m3 )

0 1 2 3 4 5 6 7 80,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

**

Ark 3

hadde målt økt tyroidnivå hos larver fra samme forsøk.

Fig. 2 Volumet av tyroidfolliklene hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). Stolpen er det intervallet myotomhøyde der økt tyroidnivå er blitt målt hos larver fra samme forsøk. Når man delte opp tyroid i epitelcellelaget (som opptar bl.a. tyrosin og jod og tillater hormonutslipp), og colloidlaget (som binder molekylene sammen for å lage tyroidhormonene) blir bildet av det som skjer i fisken mer nyansert (Fig. 3). Samlet sett er epitelcellelaget signifikant større hos dyreplankton-fôret larver etter ca 4 mm myotomhøyde, men det er stor individvariasjon. Trenden er også at epitelcellelaget er større hos mindre larver som har fått dyreplankton, men ikke signifikant.

Fig. 3 Volumet av epitelcellelaget (ytre del av tyroidfollikkelen) hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). * er signifikant større (covariansanalyse). Stolpen er det intervallet myotomhøyde der økt tyroidnivå er blitt målt hos larver fra samme forsøk.

Colloiden i tyroidfollikklene har en litt annen trend i utviklingen, og viser signifikant større volum tidlig i utviklingen, men ikke senere (Fig. 4). Igjen er det en økning hos begge gruppene i myotomhøydeintervall 3-4 mm. Det er stor individvariasjon hos større fisk.

Figur 4. Volumet av colloid (indre del av tyroidfollikklene) hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). * er signifikant større (covariansanalyse). Diskusjon Diett ga signifikante forskjeller i størrelse på hypofyse og tyroid fra kort tid etter startfôring. Volumet av colloiden, som lager hormonene, var signifikant større hos dyreplanktonfôret kveitelarver i perioden før det ble målt høyere tyroidnivå hos samme gruppen (Solbakken et al. 2003). Dette støtter hypotesen om at diett har en tidlig, direkte påvirkning på organsystemer som fisken bruker for å styre egen utvikling. Volumendringene følger samme mønsteret men forholdet mellom volum og funksjon av et organ er ikke kartlagt. Størrelsesforskjeller peker på muligheten til utvidet funskjonalitet, noe som må testes med andre metoder. Foreløpig støtter våre data hypotesen om at diett bygger hjernen og hjernens oppbygging er grunnlaget for resten av utviklingen hos kveite. Vi skal snart sette disse data sammen med målinger fra tarmsystemet. Kan diett bygge hjernen som i sin tur påvirker tarmen og hvordan blir dietten utnyttet? Konklusjoner

• Fra kort etter startfôring er det signifikant større hypofyse og tyroid hos kveitelarver som får dyreplankton.

• Oppbygging av colloid, som lager hormon, er signifikant større i størrelsesintervallet før det er målt økt tyroidnivå hos kveitelarver fra samme forsøk.

Myotomhøyde (mm)

Tyro

idfo

llikk

elvo

lum

(mm3 )

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

Myotomhøyde (mm)

Epite

lvol

um (m

m³)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

*

Myotomhøyde (mm)C

ollo

idvo

lum

(mm

3 )

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

*

Ark 4

Artemia anriket med jod fôret til kveitelarver

M. Moren, I. Opstad, K, Pittman og K. Hamre

Jod er nødvendig for dannelse av tyroidhormoner som igjen nødvendige for å initiere metamorfosen. Innholdet av jod i copepoder (zooplankton) er inntil 700 ganger høyere enn i Artemia. Larver som har blitt fôret med copepoder har høyere innhold av jod enn de som er fôret med Artemia. Vi anriket Artemia med jod slik at nivået var på høyde med copepoder. Videre ble dette fôret til kveitelarver i 53 dager. Resultatet ble en økning av jod i larvene og en indikasjon på økt innhold av tyroidhormon. Introduksjon Dersom man fôrer Artemia til kveitelarver, får man feilutvikling i høyere grad enn om man gir larvene copepoder. Tyroidhormon initierer metamorfosen og kan derfor spille en rolle for hvor vellykket den blir. Mikronæringsstoffet jod er nødvendig for å danne disse hormonene. Solbakken et al (2002) fant et jodnivå i copepoder som var 700 ganger høyere enn i Artemia. Videre hadde larver fôret med copepoder høyere innhold av jod og en tendens til høyere tyroidhormon-nivå enn de som var fôret med Artemia. Målet med dette studiet var å undersøke om det var mulig å øke innholdet av jod i larver ved å anrike Artemia til et nivå tilsvarende copepoder. Effekter på innhold av jod og tyroidhormoner ble målt. Innholdet av jod ble også målt i copepoder samlet gjennom en lengre periode av året for å få et sesonggjennomsnitt og for å se variasjonen. Materialer og metoder Copepoder ble samlet fra mai til november i Svartatjønn (van der Meeren, 2001) og fôringsforsøket inklusive anrikningen av Artemia med jod ble utført ved Austevoll Havbruksstasjon. Larver fra dag 8 etter startforing ble fordelt på 12 kar (1000 larver pr 1500 L tank). Artemia ble enten anriket med DC-DHA-Selco (kontroll-Artemia) eller med DC-DHA-Selco tilsatt jod (jodanriket Artemia). De to variantene av anriket Artemia ble fôret til larver i 6 kar i en periode på 53 dager. Prøver ble tatt av fôrorganismene hver 10. dag, mens larver ble tatt ut til analyse ved start og slutt av fôringsforsøket. Prøvene ble frosset ned på tørris og lagret på – 80 °C for analyse av tyroidhormon og på – 20 °C for jodanalysene. Jod ble gitt som en olje men den aktive formen er på sin side ikke fettløselig. Derfor spaltet vi larveprøvene i en fettfraksjon og en fraksjon uten fett og analyserte innholdet av jod i disse som en kontroll på hvorvidt larvene hadde nyttegjort seg jodet i oljen. Innholdet av jod ble analysert ved NIFES.

Tyroidhormoner ble analysert ved Institutt for Fiskeri- og Marinbiologi, UiB. Resultater Jodinnholdet i copepodene varierte fra 8.4 – 35.1 µg g-1 (våtvekt.) gjennom sesongen. Innholdet i jodanriket Artemia lå innenfor dette spekteret selv om det er signifikant lavere enn gjennomsnittet for copepoder (tabell 1). Kontroll-Artemia hadde klart lavere innhold av jod enn de to øvrige fôrgruppene. Tabell 1. Jodinnhold i Artemia anriket med DC-DHA-Selco (kontroll-Artemia) eller med jod i tillegg (jodanriket Artemia) og copepoder. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD, p<0,05)

Fôrtype Jodinnhold (µg I g-1 våtvekt)

Jodanriket Artemia (n=12) 9.4 ± 2.7 a

Kontroll-Artemia (n=12) 0.194 ± 0.084 b

Copepoder (n=14) 18.1 ± 7.3 c

Resultatene i tabell 2 viser at jodet har blitt igjen i larven. Andelen som var i fettfraksjonen var relativt stor, men det resterende, altså det som må anses som tilgjengelig for larver var signifikant høyere enn jod i larver fôret med kontrollArtemia (figur 1). Tabell 2. Konsentrasjoner i larver fôret jodanirket eller kontrollArtemia i 53 dager. . Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD, p<0,05). Larvegruppe Jodinnhold

(µg I g-1 våtvekt) Larver fôret med Jodanriket Artemia

21.63 ± 9.3 a

Larver fôret med Kontroll-Artemia

1.49 ± 1.2 b

Ark 4

Figur 1. Innold av jod i fettfri fraksjon fra larver fôret med (0) kontroll-Artemia eller jodanriket Artemia. (1) i 53 dager.

Figur 2. Innhold av tyroidhormonet triiodotyronin (T3) i larver fôret med med (0) kontroll-Artemia eller (1) jodanriket Artemia i 53 dager og (2) fra 1. dag i fôringsforsøket. Det var ikke signifikant forskjell i innhold av triiodotyronin (T3, den aktive formen av tyroidhormonene), men figur 2 viser en indikasjon på at jodanriket Artemia har gitt en økning av dette hormonet i larvene. Diskusjon Den store forskjellen i jodinnhold mellom Artemia og copepoder påvirker innholdet av jod i larven (Solbakken et al., 2002) og det kan være mulig at fôret er en viktig jodkilde for kveitelarver. Men jod finnes også tilgjengelig for fisk i sjøvannet. Det er vist at jod kan tas opp som jodid (I-) over gjeller (Hunn, 1966).

Larver har som kjent ikke gjeller og det er ikke sikkert at et lavt nivå av jod i fôr kan kompenseres med økt opptak fra vann. Det er uansett vist her at økt innhold av jod i fôr gir økt innhold i larvene og dermed kan ikke opptaket av jod fra fôr anses som en uvesentlig kilde. De høye nivåene i copepoder, det naturlige fôret for kveitelarver, gjør kanskje nettopp fôret til den beste jodkilden ute i naturen. Før vi kan si om jod i fôret er den viktigste kilden gjenstår det å undersøke effekten av jodopptak fra vann og den eventuelle påvirkingen økt jod i fôret har på pigmentering og øyevandring. Konklusjon Det er mulig å heve innholdet av jod i larver ved å fôre dem med Artemia som er anriket med jod i form av en jodetert olje. Effekten av dette på metamorfosen gjenstår ennå å se. Referanser Hunn, J.B.F., P.O. (1966) In vivo uptake of radioiodide by rainbow trout. J. Wat.Pollut. Control. Fed., 38, 1981-1985. Meeren, v.d. (2001) Biochemical compostition of Copepods: seasonal varation in lagoon-reared zooplankton In Larvi '01 - Fish and shellfish larviculture symposium (Hendry, C.I., Van Stappen, G., Wille, M. Sorgeloos, P. ed., Vol. Special publication no. 30, pp. 614-615. European Aquaculture Society, Ghent, Belgium. Solbakken, J.B., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2002) Different iodine and thyroid hormone levels between Atlantic hailbut larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exougenous feeding until post metamorphosis. Journal of Fish biology, 60, 1345-1362.

Ark 5

Stadieinndeling hos kveite fra startforing til bunnslåing, uavhengig av øyenvandring

Sæle, Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K., Power, D. & Pittman, K.,

Sammenligning av forsøk og resultater på kveitelarver er vanskelig på grunn av mangel på standardiserte målestokk. Inngående studier av kveitelarvens generell utvikling og forebeining av hodeskallet muliggjorde korrelasjoner med mål som bl.a. myotomehøyde og dannet grunnlaget for robuste definisjoner på stadier 5 til 10, fra startforet larve til bunnslått yngel. Uavhengig av øyenvandring, var korrelasjonen mellom stadie og myotomhøyde R2 0.086. Stadieinndelingen var videre validert på to grupper kommersielt produsert kveitelarver. Hvordan yngelen skal se ut etter bunnslåing ser ut til å være fastsatt innen Stadie 8. Siden metamorfose tar lang tid hos kveite, kan denne stadieinndelingen og særlig bruken av myotomhøyde hjelpe til å standardisere prøvetaking og analyse mellom forsøk og mellom produsenter. Introduksjon Sammenligning av forsøk og resultater på kveitelarver er vanskelig på grunn av mangel på standardiserte målestokk. Vår tidligere arbeid også viste at hverken antall dager fra f.eks. klekking, døgngrader, standard lengde, pigmentering eller øyenvandring ga en god nok indikasjon på hvor langt i utviklingen larvene var kommet. Derfor ble det prøvetatt en tidsserie med larver fra en eggbatch, fóret med zooplankton eller Artemia. Disse ble grundig undersøkt for forbeining på hode og generell utvikling. Utviklingsdivisjonene ble teste på to grupper kommersielt produsert kveitelarver. Studiet var en del av et større forsøk som så på diett, jod, tyroid, og skjelettutvikling hos kveite. Materialer og metoder (Se faktaark om jod og tyroid for detaljer om forsøksoppsett.) Fem larver fra hvert kar ble tatt på dag 0, 5, 10, 14, 21, 25, 28, 35, 40 og 46 etter startforing, tilsammen 180 larver. Disse ble anestisert, målt levende for standard lengde og myotomhøyde, og så fiksert i 10% bufret formalin. Larvene ble klarnet og farget for calsifisert vev og oppbevarte i 87% glycerol. Vi brukte hodet til en 28 dager gammel larve for å identifisere de enkelte bein, da de fleste var tilstede men ikke fusjonert på dette tidspunkt. Tabuleringen av hodebeinutvikling dannet grunnlaget for en mulig stadieinndeling. Etter å ha bestemt basale utviklingstrinn, ble larvene sortert i stadier og individets stadie sammenlignet med standard lengde, myotomehøyde og alder. Samme prosedyre ble utført på 23 larver produsert på det kommersielle kveiteoppdrettsanlegg på Island, Fiskey, og resultatene sammenlignet. For å sammenligne morfometriske endringer mellom satdiene, ble ytterlige 101 kveite fra Fiskey anestisert og fotografert digitalt.

Resultater Utvikling ble best korrelert med myotomhøyde (0.86) men det var også relativt godt korrelert med standardlengde (Fig. 1). Alder var minst korrelert med individets utvikling.

Figur 1. Korrelasjoner mellom stadie, dager etter startfôring, standard lengde og myotomhøyde hos 178 kveitelarver med forbeining. Det ble laget stadieinndelinger 5 (startforing, premetamorfose) til 10 (bunnslått yngel, postklimaks metamorfose) for å forstette arbeid fra Pittman et al. (1990). Øyenvandring er følgt av beinet som heter Frontale, som forbeines før den har fått sin ferdige form (Fig. 2).

5 6 7 8 9

Stage

1

2

3

4

5

6

7

8

MH

(mm

)

0

10

20

30

40

50D

PSF

14

16

18

20

22

24

26

28

30

SL (m

m)

Ark 5

Figur 2. Oversikt over utvikling og forbeining av hode hos kveitelarver. Det ble laget korte definisjoner på stadier 5-10 som gikk på faste trekk og nevnt mer fleksible trekk som øyenvandring og pigmentering (Fig. 3). Stadie 5 (pre-metamorfose): kveitelarven er symmetrisk, gjennomsiktig bortsett fra pigmenterte øyne, og har larvefinnebremm rundt hele kroppen. Tarmen er kveilet, og finnestråler kan sees der notokorden har bøyd seg oppover (flexion). Forbeining i hodet er begrenset til de rundt kjevene. Stadie 6 (pro-metamorfose): kveitelarven er fortsatt symmetrisk og generellt gjennomsiktig mens myotomhøyden øker bak urinblæren. Halefinnen vokser og bukfinnene kommer til syne foran anuset. Til tross for at gjellefilamenter kan sees, er det ingen røde blodlegemer. Kjevens forbeining blir mer fullstendig men resten av hode er generelt uten mer kalsifisering. Stadie 7 (pro-metamorfose): Larven er fortsatt symmetrisk mens kroppsdybden øker og bukfinnene vokser. Haleroten smalner inn og markerer overgangen fra larvefinnebremm til dorsal-, ventral- og halefinner. Dorsalfinnen vokser framover hodet. Det er fortsatt ingen røde blodlegemer i gjellene. Kjevene har en ferdig form, mens skallen begynner å utvikle bein spesielt en rekke bein inklusivt Frontale. Skallebeinene er fortsatt separate. Stadie 8 (pro-climax metamorfose): Larvene er store men fortsatt pelagiske. Dorsal- og ventralfinnene er breiest bakerst. Normalt rekker de fremste dorsalfinnestrålene halvveis nedover hodet.

Det er ingen røde blodlegemer. Skallebeinene vokser sammen. Dersom normalt, begynner larven å vise litt asymmetri, først i Frontalen som vil bøye seg mot den framtidige “oppside”. Stadie 9 (climax metamorfose): Larven jakter pelagisk men kan hvile på bunn. Røde blodlegemer kan være synlig. Dersom normalt, har både de fremste dorsalfinnestrålene og de underliggende bein vokst over hodet mot det vandrende øye, og et asymmetrisk pigmentmønster kan inkludere halen. Alle hodebein er tilstede og alle skallebein har vokst sammen. Normalt vil Frontale være sterk bøyd. Dersom normalt, kan den nederst øye har vandret så mye at linsen synes fra oppsiden. Stadie 10 (post-metamorfose): Kveiten er en bunnslått juvenil og vokser nå relativt mer i lengde enn i myotomhøyde. Kroppen inntar den kjente kveiteformen. Rødeblodlegemer er tilstede. Normalt vil den fremste dorsalfinnen har vokst under den vandrede øye, og begge øyne er på oppsiden, mens en asymmetrisk pigmentmønster

blir etablert. Figur 3. Oversikt over myotomhøyder for hver stadie hos kveitelarver. Avbildede kveite er tatt fra midt i størrelsesintervallet til hvert stadie. Skille på myotomhøyde mellom hvert stadie er basert på percentil koeffisientene, i tillegg til 95% konfidensintervallene. Diskusjon Grupperingen av forbeinede elementer i hode var konsekvent med utvikling, til tross for store variasjoner i øyevandring. Ved å bruke vår stadieinndeling, er abnormaliteter vanligvis helt åpenbare ved Stadie 9, mens årsakene er å finne

A

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5M

H (m

m)

Stage 9

Stage 8

Stage 7

Stage 6

Stage 5

Ark 5

tidligere. Vi foreslår at kveiteyngelens utseende er bestemt innen Stadie 8, og påvirkes helt fra stadie 5. Konklusjoner

• Stadieinndeling må basere seg på stabile karakterer, som for kveite har viste seg å være rekkefølgen av forbeining i hodet. Dette er godt korrelert med myotomhøyde.

• Variasjon i utvikling er synlig ved stadiene 7 og 8, noe som indikerer at yngelens utseende påvirkes tidligere enn dette.

• Bruken av myotomhøyde for å bestemme stadie tillater en standardisert måte å ta

prøver på og å sammenligne resultater mellom forsøk og mellom anlegg.

Referanse Sæle Ø, Solbakken JS, Watanabe K, Hamre K, Power D & Pittman K. Staging of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) from first feeding through metamorphosis, including cranial ossification independent of eye migration. Submitted to Aquaculture in 2003

Ark 6

Forbeining og øyenvandring hos kveitelarver påvirkes av diett

Sæle, Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K. & Pittman, K.

Larvens diett påvirker yngelens utseende hos kveite, samt hvordan skjeletten utvikler seg. Vi undersøkte beindannelse hos en utviklingsserie av 180 kveitelarver, der halvparten ble fôret på anriket Artemia og halvparten på naturlig dyreplankton. Disse var klarnet, farget og analysert stereologisk for areal av kropp og, beinvev. Fra 21 dager etter startfôring, var det mer beinvev i forhold til kroppstørrelse hos larver som fikk dyreplankton enn de som fikk Artemia. Forskjellen var signifkant fra dag 35 etter startforing (34% vs 29%). I forhold til hvert stadiet, hadde dyreplankton-fôret larver en høyere prosentandel beinvev ved stadiene 7, 8 og 9. Asymmetri av hode og dermed øyenvandring begynte tidligere (Stadiet 7 vs 9) og ble bedre hos dyreplankton-fôret larver. Vi spør om det er diettenes forskjellig innhold av Vitamin A, og fiskens tyroidhormon som agerer på beindannende og –omformerende celler som har forårsaket forskjellen i utvikling. Resultatene støtte hypotesen om et kritisk vindu for metamorfose hos kveite mellom 14-25 dager etter startforing. Introduksjon Utviklingsproblemer som har startet under larvefasen blir synlig bare under metamorfose. Ofte er årsaken relatert til diett. Hos kveite, som har acellulært bein, dannes beinvev fra osteoblaster. Både Vitamin A og tyroidhormon er nødvendig for normal skjelettdannelse hos pattedyr, og noe av det samme er vist hos beinfisk. Beindannelse og –metabolisme er også avhengig av retinsyre. Vi ville derfor undersøke kveitelarvens skjelettdannelse for å se når og hvor forskjeller og abnormaliteter oppstår som respons til diett. Dette var en del av et flerfaglig undersøkelse. Materialer og metoder (Se faktaark om Jod og tyroid for forsøksoppsettet.) Ti larver fra zooplanktonfôring og 10 fra Artemia fôring ble samlet inn på regelmessig fra dag 5 –46 etter startfôring, bedøvd, målt for standard lengde, myotomhøyde, øyenvandring, og fiskert før klarning og farging. Programvaren CAST 2 (Olympus Danmark) ble brukt for stereologisk måling av kroppsareal og areal av fargede elementer på aksial skjelett på hver larve. Resultater Øyevandring var signifikant bedre og tidligere hos zooplankton-fôret larver enn hos de som fikk Artemia (Stadie 7 for zooplankton fôret larver kontra stadie 9). Hodet ble fullt forbeinet ved stadie 9, selv om øye ikke var vandret (Fig. 1). Beinet som går mellom øynene, Frontale, skal normalt bøye seg mot “oppsiden” men dette er ikke nødvendig for forbeining. Dersom Frontale forble rett, forble også resten av beinene i hode symmetriske.

Fig. 1 Full forbeining av hode hos kveitelarver ved Stadie 9, med alle øyenvandringsgrader representert (tall til høyre). De to øverste er Artemiafôret kveite, resten er dyreplanktonfôret. Alle er 40 dager etter startfôring, unntatt den nederste som er 45 dager. Larvene hadde veldig lite bein de første 14 dagene etter startfôring. Etter dag 35 hadde zooplankton-fôret kveitelarver signifikant større areal bein (Fig. 2), til tross for ingen forskjell i kroppstørrelse mellom gruppene.

0

2

1

3

4

Ark 6

Fig. 2 Areal av bein (i % av kroppsareal) i forhold til alder hos kveitelarver fôret enten på Artemia (åpen firkant) eller zooplankton (svart firkant). * er signifikante forskjeller. Når man delte opp larvene etter stadie var det en signifikant økning i i forbeining mellom stadiene for hver gruppe. Fôring med zooplankton ga mer bein ved stadiene 7, 8 og 9 enn fôring med Artemia, men forskjellen var signifikant bare ved stadie 8 (Fig. 3). Uansett kroppsstørrelse ga fôring med zooplankton mer areal bein hos kveitelarver i utvikling. Figur 3. Prosentandel av kroppen som er beinvev i forhold til stadie hos kveitelarve fôret med zooplankton (svart firkant, n=88) eller Artemia (åpen firkant, n=90). * er signifikant forskjell.

Diskusjon Forskjellene i forbeining er et underestimat, da bare to dimensjoner ble målt mens bein vokser i tre dimensjoner. Dessuten ble ikke overlappende bein målt separat. Mer forbeining er målbare innen 21 dager etter startfôring hos zooplankton-fôret larver og er signifikant allerede ved dag 35. Dette indikerer en kumulativ effekt av ernæring på skjelettdannelse. Øyenvandring var bedre blant larver fôret med zooplankton. Øyenvandring var korrelert med bøyning av Frontale beinet, mellom øynene. Beinet er ikke forskjøvet av det vandrende øye hos kveite, da Frontalen blir undergår forbeining før øyevandring tar til. Det ser heller ut til at Frontalen bøyer seg først for å gi plass til det vandrende øyet, og korrelerer med resten av hodets asymmetri. Mønsteret i forbeining og variasjon i forbeining hos kveite tyder på at grunnlaget for skjelett er spesielt følsom for ernæring innen den først måned etter startfôring. Siden både Vitamin A og tyroidhormon kan påvirke beindannelse er det verd å nevne at det er omtrent 50% mer Vitamin A i zooplankton-fôret larver enn hos de som fikk Artemia. Kan ubalanse av bl.a. Vitamin A i en kritisk periode være årsaken til manglende øyenvandring? Konklusjoner

• Forbeining av kroppen, og av det asymmetriske hodet samt øyenvandring var signifikant bedre hos kveitelarver fôret med copepoder sammenlignet med Artemia-fôrede larver.

• Diett den første måneden etter startforing ser ut til å påvirke skjelettdannelse.

• Beinet mellom øyne, Frontale, begynner forbeining før den bøyer seg og før øyenvandring tar til.

Referanse Sæle Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K. & Pittman, K. (2003) The effect of diet on ossification and eye migration in Atlantic halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.) Aquaculture 220: 683-696

5 10 14 21 25 28 35 40 46

Days post start feed

0

5

10

15

20

25

30

35

40%

Bon

e

* **

5 6 7 8 9

Stage

0

5

10

15

20

25

30

35

40

% B

one

*

#

!

Ark 7

Vitamin A i kveitelarver og –yngel (Hippoglossus hippoglossus L.) – kan Aretemia dekke behovet for retinoider?

Kort sammendrag fra Dr. Scient avhandling med originaltittel: ”Vitamin A in larval and juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) – does Artemia cover the larval retinoid requirement)”

Mari Moren, 2004

Introduksjon Hovedmålet med dette doktorgradsarbeidet var å vurdere Artemia som kilde til vitamin A i kveitelarver fordi vitamin A er viktig i reguleringen av organutvikling. Dermed fantes det en potensiell mulighet for at feil vitamin A nivå var en av årsakene til at larver fôret med Artemia gir større andel med unormal pigmentering og ufullstendig øyevandring. Resultater fra fire arbeid ga grunnlaget for denne vurderingen. Under følger kort presentasjon av bakgrunnene for de fire arbeidene. Artikkel I) Bestemme innholdet av vitamin A i både Artemia og i copepoder. I litteraturen finnes det uoverensstemmelser i mengde vitamin A som finnes i Artemia. De analyserte nivåene varierer fra 0 – 250 µg vitamin A g-1 (tørr vekt). En vurdering av innholdet av vitamin A i Artemia og copepoder var nødvendig for å vite eventuelle forskjeller mellom disse og for å vite hvilket nivå av vitamin A som fantes i Artemia benyttet ved Austevoll forsøksstasjon der fôringsforsøket med larver ble utført. Artikkel II) Evaluere hvorvidt karotenoider kan omdannes til vitamin A i kveite. Både copepoder og Artemia inneholder store mengder oksygenerte karotenoider, henholdsvis astaxanthin og kantaxantin (Meeren, 2001, Krinsky, 1965, Rønnestad et al., 1998). Disse kan omdannes til vitamin A i flere fiskearter og kan dermed være en viktig vitamin A kilde. Det var uvisst om og i hvor stor grad kveite kunne utnytte astaxantin og kantaxantin som en kilde til vitamin A. Et ti-ukers fôringsforsøk ble satt opp som følger: 600 kveiteyngel med en vekt på 0,6 ± 0,2 gram ble distribuert til 15 kar. Fisk i 3 kar fikk kontrollfôret som ikke var tilsatt vitamin A eller karotenoider. Fôr som inneholdt 3 ulike nivåer av enten astaxantin, kantaxantin, ß-karoten eller retinylacetat ble gitt til fisk i ett og ett kar. Nivåene var ekvimolare med 5, 10 og 30 mg ß-karoten kg fôr (tørrvekt). Ingen forskjell i dødelighet ble observert. Sluttvekten var heller ikke forskjellig mellom gruppene, men de som hadde fått kontrollfôret viste tegn til vitamin A mangel i form av blødninger

langs finnebasis, på finnene og rundt øynene. Regresjonsanalyser basert på innhold av karotenoider i fôr og analyserte mengder vitamin A i fisken ble kalkulert. Stigningstallene ble brukt som indikasjon på hvilken grad de ulike karotenoidene ble omdannet til vitamin A i fisken. Artikkel III) Bestemme forholdet mellom lagret vitamin A (retinylestere) og fysiologisk aktivt vitamin A (retinol og retinal) i kveitelarver fôret med enten Artemia eller copepoder. (Rønnestad et al., 1998) fant et høyere nivå av total vitamin A i larver fôret med copepoder i forhold til larver fôret med Artemia. Nivåene av retinal, retinol og retinylestere kan gi større forståelse av vitamin A status i den undersøkte organismen. Dersom det foregår en økning i lagring, er det en indikasjon på tilstrekkelig tilgang til vitamin A. Artikkel IV) Bestemme hvilket nivå av vitamin A i fôret som er optimalt for kveiteyngel. 6 ulike nivåer av vitamin A (0, 0,25, 0,75, 2,5, 25 og 250 mg kg-1 fôr, tørr vekt) ble gitt til kveiteyngel i 13 uker. I tillegg til å benytte vekst, overlevelse og innhold av vitamin A ble biokjemiske og cellulære markører brukt for å beskrive vitamin A status. Hovedkonklusjoner Artikkel I) Det finnes lite (under 10 pg g-1) vitamin A i både Artemia og copepoder. To ulike analysemetoder ble benyttet for å bekrefte resultatet. Artikkel II) Både astaxantin og kantaxantin omdannes til vitamin A i kveiteyngel. De omdannes i lik grad, men både ß-karoten og retinylacetat ga høyere innhold av vitamin A i kveiteyngelen. Artikkel III) Kun innholdet av retinylestere var høyere i larver fôret med copepoder sammenliknet med larver fôret med Artemia. Innholdet av retinol og retinal var ikke signifikant forskjellig. I tillegg økte innholdet av retinylestere i løpet av de 60 dagene forsøket pågikk.

Ark 7

Artikkel IV) 2,5 mg vitamin A kg-1 fôr, tørr vekt viste seg å gi den mest optimale responsen i kveiteyngelen. Larver fôret med Artemia hadde et nivå av fritt retinol som liknet nivået i kveiteyngel fôret med det optimale nivået. Videre foregikk det en økning i lagret vitamin A, noe som tyder på at Artemia var tilstrekkelig til å dekke behovet for vitamin A. I og med at det ikke ble funnet vitamin A i Artemia men store mengder kantaxantin (Krinsky, 1965) som kveite kan omdanne til vitamin A, kan en anta at det er kantaxantin som er hovedkilden for kveitelarver når de får Artemia som fôr. Innholdet av kantaxantin og evt. andre karotenoider i Artemia bør kartlegges for å sikre at nivået er tilstrekkelig uavhengig av stamme og anrikningsmedium (minimum 150 µg kantaxantin g -1 Artemia). Artikkel I, III og IV og Dr.Scientgraden er utført med støtte fra NFR prosjekt # 130195/130.

Referanser Krinsky, N.I. (1965) The carotenoids of the brine shrimp, Artemia salina. Comparative Biochemistry and Physiology, 16, 181-187. Meeren, v.d. (2001) Biochemical compostition of Copepods: seasonal varation in lagoon-reared zooplankton In Larvi '01 - Fish and shellfish larviculture symposium (Hendry, C.I., Van Stappen, G., Wille, M. Sorgeloos, P. ed., Vol. Special publication no. 30, pp. 614-615. European Aquaculture Society, Ghent, Belgium. Moren, M., Gundersen, T.E. and Hamre, K. Quantitative and qualitative analysis of retinoids in Artemia and copepods by HPLC and diode array detection. Artikkel I Moren, M., Næss, T. and Hamre, K. Conversion of ß-carotene, canthaxanthin and astaxanthin to vitamin A in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. (accepted) Fish Physiology and Biochemistry. Artikkel II Moren, M., Opstad, I. and Hamre, K. A comparison of retinol, retinal and retinyl ester concentrations in larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) fed Artemia or zooplankton. (accepted) Aquaculture nutrition. Artikkel III Moren, M., Opstad, I., Berntssen, M.H.G., Zambonino Infante J.-L. and Hamre, K. An Optimum level of vitamin A supplements for Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. (accepted) Aquaculture. Artikkel IV Rønnestad, I., Helland, S. & Lie, O. (1998) Feeding Artemia to larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L) results in lower larval vitamin A content compared with feeding copepods. Aquaculture, 165, 159-164.

Ark 8

Innhold av vitamin A i Artemia og copepoder

Mari Moren, Thomas E. Gundersen og Kristin Hamre Kveitelarver har behov for vitamin A som må dekkes gjennom fôret. Tidligere arbeid har rapportert alt fra 0 – 250 µg vitamin A g -1 Artemia (tørrvekt), noe som strekker seg fra mangel- til toksiske nivåer. Artemia og copepoder fra Austevoll Havbruksstasjon ble analysert for innholdet av ulike former for vitamin A. Siden så ulike resultater var rapportert tidligere, ble analysene utført ved to laboratorier som har hver sin metode. Resultatet fra begge laboratoriene var at det ikke er detekterbare nivåer av vitamin A i verken Artemia eller copepoder. Larvene må derfor dekke sitt behov for vitamin A gjennom andre kilder. Introduksjon Vitamin A opptrer i ulike former. Retinol (ROH), retinal (RAL), retinylestere (RE) og retinsyre (RA) og isomerer av disse er de mest kjente formene og finnes normalt i alle vertebrater. Det kan ikke syntetiseres, og må derfor tilføres gjennom maten, enten som vitamin A eller som karotenoider. Det sistnevnte kan omdannes til vitamin A i kroppen. Vitamin A er kjent for å påvirke utvikling (Maden 1994) og har vist seg å ha en betydelig effekt på pigmentering og beinutvikling i marine flatfisk-arter (Dedi et al. 1995, Haga et al. 2002, Takeuchi, 1998). Det rapporterte innholdet i Artemia som ikke er anriket med vitamin A varierer fra 0-362 µg vitamin A g-1

(tørr vekt) (Rønnestad et al., 1998, Estevez and Kanazawa, 1995, Haga et al. 2002). På grunnlag av behovsforsøk må denne variasjonen anses å strekke seg inn i mangel- og toksiske nivåer (Dedi et al. 1995, Saleh et al. 1995, Mohamed et al. 2003). De svært varierende nivåene av vitamin A i Artemia gjorde det vanskelig å vurdere hva som egentlig ble fôret til larvene i våre forsøk. Egne erfaringer ved analyse av Artemia har vist at kromatogrammene fra HPLC analysene har gitt mange ukjente topper og at noen av disse kan ved uhell ble identifisert som vitamin A. Vi ønsket derfor å analysere Artemia og med to ulike metoder for bekreftelse av resultatene. Copepoder ble analysert for å ha et sammenlikningsgrunnlag siden det er ansett som det naturlige fôret for marine larver. Materialer og metoder Prøver av copepoder hentet fra Svartatjønn, Austevoll besto hovedsakelig av Eurytemora affinis, Acartia grani og Centropages hamutus. Artemia nauplii (RH-type, INVE Aquaculture NV, Belgia) ble andriket I 20 timer med 0,3 g L-1 DC-DHA Selco (INVE, Ghent, Belgium) + vitaminer (vitaminblanding er beskrevet i Hamre et al. 2002). Prøver ble så tatt for analyse av vitamin A med metode 1. Følgende stadier ble benyttet ved analyser med metode 2: etter klekking (0t), før anrikning (24t) etter anrikning (48t). Prøvene ble umiddelbart frosset ned vha tørris og holdt på – 80 °C til de ble analysert.

Metode 1, utviklet av Nöll (1996), ble utført i hehold til Moren et al. (akseptert, a) hvor den er tilpasset biologisk materiale. Metode 2 ble utført i henhold til (Sakhi et al. 1998) med det unntak at enkeltbølge UV og diode array detector ble brukt i tillegg til elektrokjemisk deteksjon. Diode array detektor, brukt i begge metodene, gjorde det mulig å undersøke om de ukjente toppene var former for vitamin A eller ikke.

Resultater Figurene under viser kromatogram fra begge metodene. Etter nøye gjennomgang av kromatogrammene fra begge metodene, kunne vi med sikkerhet si at det ikke var detekterbare nivåer av følgende former for vitamin A: all-trans-ROH, 9-cis-ROH eller all-trans-3,4-didehydro ROH. Videre ble følgende former testet med metode 2: cis og trans 3,4-didehydro-RA, cis og trans 3,4-didehydro-ROH, cis og trans 3,4-didehydro-RAL, cis og trans ROH og cis og trans-RA. Ingen av disse formene ble påvist.

Figur 1. Kromatogram av copepoder ( ), Artemia ( ) and all-trans-ROH ( . ) fra metod 1. Retensjonstider for 13-cis-ROH (1), 9-cis-ROH(2) and 3,4-didehydro-ROH(3) er indikert I krometogrammet.

Ark 8

Figur 2. Kromatogram ra metode 2. Artemia 48 ( ), Artemia 24 ( ) and Artemia 0 ( ). Retensjonstiden til følgende standarder er indikert med svart piler: (1) all-trans-3,4-didehydro-ROH (2) all-trans-ROH (3) 13-cis RA (4) all-trans-3,4-didehydro-RA (5) 9-cis RA (6) all-trans-RA. UVmaximum for toppene er vist for noen topper. Innrykket kromatogram viser forstørring av Artemia 48 med retensjonstidene for all-trans–ROH (1) all-trans-RA (6) indikert.

Figur 3. Kromatogram fra analysen av copepoder med metode 2. Uv maximum for de viktigste toppene er vist. Retensjonstider for vitamin A formene er som i figur 2. Diskusjon De aller høyeste nivåene av vitamin A som har vært rapportert tidligere kunne indikere at Artemia ga larvene et toksisk nivå av vitamin A (Haga et al., 2002), mens andre har vist at larver som får zooplankton har et høyere vitamin A innhold enn de som er fôret med Artemia og har dermed forelsått at vitamin A er i mangel når larver får Artemia (Rønnestad et al., 1998). Vi har ikke funnet vitamin A i fôrorganismene i slike mengder som ville resultere de nivåene av vitamin A som finnes i larver. Dermed er det sannsynlig verken Artemia eller copepoder kan gi toksiske nivåer av vitamin A. Karotenoider finnes i store mengder både i Artemia og copepoder (van der Meeren, 2001, Rønnestad et al. 1998). Dette er forløpere til vitamin A i kveiteyngel (Moren et al. in press). De mengder karotenoider som er funnet i Artemia kan etter all

sannsynlighet dekke vitamin A behovet i larven, gitt at larvens fordøyelse og utnyttelse av Artemia er som for copepoder. Konklusjoner ϕ Artemia inneholder ikke detekterbare nivåer av

vitamin A. ϕ Copepoder inneholder ikke detekterbare nivåer

av vitamin A. ϕ Larven må dekke sitt vitamin A behov

gjennom karotenoider som finnes i store mengder i begge formene for levende fôr.

Referanser Dedi, J., Takeuchi, T., Seikai, T. & Watanabe, T. (1995) Hypervitaminosis and safe levels of vitamin A for larval flounder (Paralichthys olivaceus) fed Artemia nauplii. Aquaculture, 133, 135-146. Estevez, A. & Kanazawa, A. (1995) Effect of (n-3) PUFA and vitamin A Artemia enrichment on pigmentation success of turbot, Scophthalmus maximus. Aquaculture Nutrition, 1, 159-168. Haga, Y., Takeuchi, T. & Seikai, T. (2002) Influence of all-trans retinoic acid on pigmentation and skeletal formation in larval Japanese flounder. Fisheries Science, 68, 560-570. Hamre, K., Opstad, I., Espe, M., Solbakken, J., Hemre, G.-I. & & Pittman, K. (2002) Nutrient composition and metamorphosis success of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed natural zooplankton or Artemia. Auqaculture Nutrition, 8, 139-148. Maden, M. (1994) Role of retinoids in embryonic development In Vitamin A in health and desease (Blomhoff, R. ed.), Vol. 1, pp. 677. Marcel Dekker, Inc., New York. Mohamed, J.S., Sivaram, V., Roy, T.S.C., Marian, M.P., Murugadass, S. & Hussain, M.R. (2003) Dietary vitamin A requirement of juvenile greasy grouper (Epinephelus tauvina). Aquaculture, 219, 693-701. Moren, M., Næss, T. and Hamre, K. Conversion of ß-carotene, canthaxanthin and astaxanthin to vitamin A in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. (in press) Fish Physiology and Biochemistry. Rønnestad, I., Helland, S. & Lie, Ø. (1998) Feeding Artemia to larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L) results in lower larval vitamin A content compared with feeding copepods. Aquaculture, 165, 159-164. Sakhi, A.K., Gundersen, T.E., Ulven, S.M., Blomhoff, R. & Lundanes, E. (1998) Quantitative determination of endogenous retinoids in mouse embryos by high-performance liquid chromatography with on-line solid-phase extraction, column switching and electrochemical detection. Journal of Chromatography A, 828, 451-460. Saleh, G., Eleraky, W. & Gropp, J.M. (1995) A short note on the effects of vitamin A hypervitaminosis and hypovitaminosis on health and growth of Tilapia nilotica (Oreochromis niloticus). Journal of Applied Ichthyology-Zeitschrift für Angewandte Ichthyologie, 11, 382-385. Takeuchi, T., Dedi, J., Haga, Y., Seikai, T. & Watanabe, T. (1998) Effect of vitamin a compounds on bone deformity in larval Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, 169, 155-165. van der Meeren, T. (2001) Biochemical compostition of Copepods: seasonal varation in lagoon-reared zooplankton In Larvi '01 - Fish and shellfish larviculture symposium (Hendry, C.I., Van Stappen, G., Wille, M. Sorgeloos, P. ed., Vol. Special publication no. 30, pp. 614-615. European Aquaculture Society, Ghent, Belgium.

Ark 9

Innhold av vitamin A i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder

M. Moren, I. Opstad, og K. Hamre

Vitamin A er viktig for rett transkripsjon av over 500 gener og styrer mange prosesser i organutviklingen. Kveitelarver som fôres med Artemia utvikler unormal pigmentering og øyevandringen blir ufullstendig, mens når de fôres med copepoder er disse deformitetene mindre vanlige. Videre er det vist at vitamin A innholdet i larver gitt Artemia er lavere enn i larver som er fôret med copepoder, og en mulig årsak til feilutviklingen sett i larver fôret med Artemia har blitt foreslått til å være vitamin A mangel. Vi har i dette arbeidet undersøkt dette nærmere ved å se på sammensetningen av lagringsform (retinyl estere) og to fysiologisk aktive former (retinal og retinol) av vitamin A i larver fôret med Artemia eller copepoder. Introduksjon Vitamin A er en av flere viktige komponenter i reguleringen av gener. Både mangel og overskudd gir alvorlige former for feilutviklinge under fosterutviklingen (Ross et al., 2000). Kveitelarver gjenomgår en metamorfose og i oppdrett oppstår det feil i pigmentering og øyevandring dersom larvene fôres med Artemia, men det skjer i liten grad dersom de gis copepoder (Hamre et al. 2002). Det har vært påvist av vitamin A kan påvirke pigmentering og beindannelse i flatfisk-larver (Takeuchi et al., 1995). Videre har det vært vist at Artemia som fôr gir lavere nivå av vitamin A enn copepoder, det naturlige fôret (Rønnestad et al., 1998). Materialer og metoder Fôringsforsøket ble utført ved Austevoll Havbruksstasjon, Storebø. DHA-Selco anriket Artemia eller copepoder, samlet fra Svartatjønn, ble gitt til kveitelarver fra startfôring og 60 dager framover. Det ble foretatt uttak på dag 0, 15, 29, 45 og 60. Prøvene ble umiddelbart frosset ned på tørris og lagret på – 80 °C inntil analyse. For flere detaljer om fôringsforsøket, se Hamre et al. (2002). En HPLC metode for analyse av retinylestere, retinal og retinol fra Bankson et al. (1986) ble modifisert og testet for bruk på fiskemateriale før prøvene fra forsøket ble analysert. Resultater Feilpigmentering og mangel på øyevandring ble registrert ved dag 60. Blant larvene fôret med Artemia var 7% rett pigmentert, mens andelen blant de fôret med copepoder var 68%. Andel med fullstendig øyevandring i gruppa fôret med Artemia var 10%, mens den var 88% blant larver fôret med copepoder. Innholdet av retinylestere var signifikant lavere i gruppa fôret med Artemia i forhold til de som fikk

copepoder, men innholdet av retinal og retinol var likt (se figur).

0 15 29 45 60days post first feeding

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

µg re

tinal

g -1

larv

ae (w

et w

t)

Diets Zooplankton Artemia

0 15 29 45 60days post first feeding

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

µg re

tinol

g -1

larv

ae (w

et w

t)

Diets: Zooplankton Artemia

0 15 29 45 60days post first feeding

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

µg re

tinyl

est

ers

g -1

larv

ae (w

et w

t)Diets:

Zooplankton Artemia

Figuren viser innhold av (fra øverst) retinylestere, retinol og retinal i larver fôret med Artemia ( ) eller copepoder ( ).

Ark 9

Diskusjon I metabolismen av vitamin A blir retinylestere omdannet til retinol som så blir transportert til målceller etter behov (Green et al., 1993). Der blir retinol omdannet til retinal som igjen blir omdannet til retinsyre (Perlmann, 2002). Dette er nøye regulert. Det er den siste komponenten som deltar i genregulering (Petkovich et al., 1987). Selv om vi ikke har målt denne vitamin A formen, er det stor sannsynlighet for at evnen til å danne retinsyre er lik i begge fôringsgruppene så lenge innholdet av retinal og retinol er like høyt i larver fôret med Artemia som med copepoder. En høyere andel retinylestere i larver fôret med copepoder tilsier at dette fôret gir en større tilgang til vitamin A, men i begge gruppene øker largingsandelen og det indikerer at også Artemia gir et visst overskudd som går til lagring. I Artemia og copepoder er det karotenoider som er kilden til vitamin A. Disse kan spaltes og danner da enten retinal eller retinsyre (Napoli, 1993, Lampert et al., 2003) som larven kan nyttegjøre seg. Fra resultatene i dette forsøket kan vi konkludere at begge formene for fôr ser ut til å gi tilstrekkelig med vitamin A. Likevel er det viktig å studere omdannelsen av karotenoider til vitamin A før man med sikkerhet kan si at Artemia er en tilfredsstillende kilde til vitamin A for kveitelarver.

Referanser Bankson, D.D., Russell, R.M. & Sadowski, J.A. (1986) Determination of retinyl esters and retinol in serum or plasma by normal phase liquid chromatography: method and applications. Clinical Chemistry, 32, 35-40. Gaemers, I.C., vanPelt, A.M.M., vanderSaag, P.T. & deRooij, D.G. (1996) All-trans-4-oxo-retinoic acid: A potent inducer of in vivo proliferation of growth-arrested A spermatogonia in the vitamin A-deficient mouse testis. Endocrinology, 137, 479-485. Green, M.H., Green, J.B., Berg, T., Norum, K.R. & Blomhoff, R. (1993) Vitamin A metabolism in rat-liver - a kinetic model. American Journal of Physiology, 264, G509-G521. Hamre, K., Opstad, I., Espe, M., Solbakken, J., Hemre, G.-I. & & Pittman, K. (2002) Nutrient composition and metamorphosis success of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed natural zooplankton or Artemia. Auqaculture Nutrition, 8, 139-148. Hanusch, M., Stahl, W., Schulz, W.A. & Sies, H. (1995) Induction of gap junctional communication by 4-oxoretinoic acid generated from Its precursor canthaxanthin. Archives of Biochemistry and Biophysics, 317, 423-428. Lampert, J.M., Holzschuh, J., Hessel, S., Driever, W., Vogt, K. & von Lintig, J. (2003) Provitamin A conversion to retinal via the beta,beta-carotene-15,15 '-oxygenase (bcox) is essential for pattern formation and differentiation during zebrafish embryogenesis. Development, 130, 2173-2186. Napoli, J.L. (1993) Retinoic acid synthesis from beta-carotene in vitro. Methods in Enzymology, 214, 193-202. Perlmann, T. (2002) Retinoid metabolism: a balancing act. Nature Genetics, 31, 7-8. Petkovich, M., Brand, N.J., Krust, A. & Chambon, P. (1987) A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors. Nature, 330, 444-450. Ross, S.A., McCaffery, P.J., Drager, U.C. & De Luca, L.M. (2000) Retinoids in embryonal development. Physiological Reviews, 80, 1021-1054. Rønnestad, I., Helland, S. & Lie, O. (1998) Feeding Artemia to larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L) results in lower larval vitamin A content compared with feeding copepods. Aquaculture, 165, 159-164. Takeuchi, T., Dedi, J., Ebisawa, C., Watanabe, T., Seikai, T., Hosoya, K. & Nakazoe, J.I. (1995) The effect of beta-carotene and vitamin-a enriched artemia nauplii on the malformation and color abnormality of larval Japanese flounder. Fisheries Science, 61, 141-148.

Ark 10

Vitamin A behov i kveiteyngel

M. Moren, I. Opstad, M.H.G. Berntssen, J.-L. Zambonino Infante og K. Hamre

Behovet for vitamin A i kveiteyngel og larver har ikke vært testet, men er nødvendig å kjenne dersom man skal kunne vurdere hvorvidt et fôr er tilfredsstillende. Kveiteyngel ble derfor fôret med 6 ulike nivåer av vitamin A i 13 uker. Analyser av vitamin A innhold i lever, tarm og helfisk og analyser i tarm av DNA, ensymaktivitet og proliferasjon ble gjennomført. En samlet vurdering av resultatene viste et optimalt nivå av vitamin A for kveiteyngel som lå nærmere 2,5 enn NRC anbefalingen på 0,75 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt). Introduksjon Behovet for vitamin A er ikke definert for kveite. Samtidig finnes det teorier om at enten vitamin A mangel eller overskudd gir feilutvikling i metamorfosen (Rønnestad, 1998, Dedi et al., 1995, Takeuchi, 1998). I japansk flyndre har overskudd av vitamin A påvirket pigmentering og beindannelse og dette indikerer viktigheten til vitamin A i utviklingen av larvene. Dersom det skal være mulig å vurdere tørrfôr og levende fôr som kilde til vitamin A for kveite, må man kjenne kveitens behov for dette vitaminet. NRC (1993) anbefaler bruk av yngel i fôringsstudier for å unngå problemer med levende fôr og samtidig kunne estimere hva behovet vil være på larvestadiet. Materialer og metoder Fôr med 6 nivåer av vitamin A (0, 0.25, 0.75, 2.5, 25 and 250 mg kg-1 fôr (tørr vekt)) ble gitt til kveiteyngel i triplikat i 13 uker ved Austevoll Havbruksstasjon. Prøver ble tatt etter 5 uker, fiksert i Bouin’s fixativ og siden lagret på 70% etanol for immunohistologiske analyser av prolifererende kjerner vha. PCNA (proliferating cell nuclear antigen, PC10, Chemicon, USA, dilution 1:250) en metode fra Ortego et al., (1994) som er modifisert av Berntssen et al., (2004). Metoden resulterer i at kjerner som er under deling vil farges svarte og gi en indikasjon på celledelingsgraden i vevet. Øvrige analyser ble utført på prøver som ble tatt etter 13 uker. Disse ble frosset ned på tørris og lagret v/ -80°C. Ensymanalysene ble utført i henhold til Zambonino Infante and Cahu (2001) og aktiviteten er uttrykt som mU mg-1 protein (protein analysert etter Bradford, (1976). Total DNA konsentrasjon ble analysert etter protokoll som fulgte med PicoGreen® kit’et. Resultater Analyser av fôret viste noe lavere innhold av vitamin A enn det som ble tilsatt, men nivåene økte eksponentielt slik det var planlagt (se tabell neste side).

Verken vekt eller mortalitet varierte mellom gruppene. Fisk fôret med 0 og 0,25 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt) hadde blødninger langs finnebasis og rundt øyne og var signifikant kortere enn de øvrige gruppene. Resultater fra vitamin A analysene viste en gjennomgående signifikant økning i fisk fôret med vitamin A nivå fra 0,75 til 250 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt) (figur 1). Analyser av DNA viste et signifikant høyere nivå i fisk fôret med 0, 0,25 og 250 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt) enn i de øvrige gruppene. Den spesifikke ensymaktiviteten til aminopeptidase og alkalase (børstesøm ensymer) var signifikant høyere i fisk fôret med 2,5 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt) enn i de øvrige gruppene (figur 3). Lavest andel PCNA-fargete kjerner ble observert i tarm prøver fra gruppene fôret med 2,5 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt). Eksempler fra fisk gitt 0, 2,5 og 250 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt) er vist i figur 2.

Figur 1. Innhold av ulike vitamin A former i lever etter 13 ukers fôring. X-aksen indikerer de 6 ulike nivåene av vitamin A i fôret. Y-aksen viser mengde målt av analytten i prøvene. Resultatene fra helfisk og tarm ga like trender, men i helfisk var nivået av dd-ROH og dd-ROHes for lave til å kunne måles. Det samme gjaldt for dd-ROHes i tarm. (at-ROH er all-trans-retinol, ROHes er retinyl estere, at-dd-ROH er all-trans-didehydro retinol og dd-ROHes er didehydro retinyl estere).

Ark 10

Tabell over tilsatt og analysert innhold av vitamin A i fôret. Teoretisk innhold (mg VA kg-1 fôr, tørrvekt)

0 0.25 0.75 (NRC)

2.5 25 250000

Analysert i prøver av fôret (n=3, snitt ± std)

0.007±0.001 i.a 0.77±0.02 1.9±0.5 16.1±0.2 209.89±0.05

i.a = ikka analysert

Figur 2. Analyse av PCNA i prøver av tarm tatt etter 5 ukers fôring (bildene ble tatt med et Olympus lysmikroskop (BX 51) og et digitalt kamera i 200 x forstørrelse.

Figur 3. Spesifikk aktivitet av 2 børstesøm-ensymer fra tarm tatt etter 5 ukers fôring. Høyest aktivitet indikerer størt grad av differensiering av enterocytter. Diskusjon Siden vitamin A regulerer differensiering og proliferasjon har det vist seg at PCNA og ensymaktivitet kan benyttes som statusmarkører for rotte og kylling (Reifen et al., 1998, Uni et al., 2000, Uni et al., 1998) og vi har nå vist at de også kan benyttes på kveiteyngel sammen med vitamin A målinger. Slike markører kan gi svar tidligere og dermed medføre kortere fôringsforsøk og mer presise resultater. Igjen gir det rimeligere forsøk og mindre påkjenning for forsøksdyrene. Nivået vi fant som optimum ligger over det som er den generelle anbefalingen fra NRC (1993). På den andre siden ligger ofte nivåene i kommersielle larve- og yngelfôr enda høyere, oppgitte nivåer ligger mellom 4-12 mg kg -1 fôr (tørr vekt). Små endringer i ensymaktivitet og økt ROHes ble funnet mellom gruppene gitt 2,5 og 25 mg vitamin A kg-1 fôr (tørr vekt). Dette kan tyde på at 25 mg er for høyt og muligvis kunne dette nivået gitt negative effekter over lengre tid enn de 13 ukene dette

forsøket varte. Nivået av vitamin A i fôr som skal benyttes over lengre perioder bør derfor være nær 2,5 mg kg-1 fôr (tørr vekt). Referanser Berntssen, M.H.G., Hylland, K., Julshamn, K., Lundebye, A.-K. & Waagboe, R. (2004) Maximum limits of inorganic mercury in fish feed, In press. Aquaculture Nutrition. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitiation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248-254. Dedi, J., Takeuchi, T., Seikai, T. & Watanabe, T. (1995) Hypervitaminosis and safe levels of vitamin A for larval flounder (Paralichthys olivaceus) fed Artemia nauplii. Aquaculture, 133, 135-146. Ortego, L.S., Hawkins, W.E., Walker, W.W., Krol, R.M. & Benson, W.H. (1994) Detection of proliferating cell nuclear antigen in tissues of 3 small fish species. Biotechnic & Histochemistry, 69, 317-323. Reifen, R., Zaiger, G. & Uni, Z. (1998) Effect of vitamin A on small intestinal brush border enzymes in a rat. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 68, 281-286. Rønnestad, I., Gemre, G.-I., Finn, R.N. & Lie, Ø. (1998) Alternate sources and dynamics of vitamin A and its corporation into the eyes during the early endotrophic and exotrphic larval stages of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.). Comp. Biochem. Physiol., 119A, 787-793. Takeuchi, T., Dedi, J., Haga, Y., Seikai, T. & Watanabe, T. (1998) Effect of vitamin a compounds on bone deformity in larval Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, 169, 155-165. Uni, Z., Zaiger, G., Gal-Garber, O., Pines, M., Rozenboim, I. & Reifen, R. (2000) Vitamin A deficiency interferes with proliferation and maturation of cells in the chicken small intestine. British Poultry Science, 41, 410-415. Uni, Z., Zaiger, G. & Reifen, R. (1998) Vitamin A deficiency induces morphometric changes and decreased functionality in chicken small intestine. British Journal of Nutrition, 80, 401-407. Zambonino Infante, J.L. & Cahu, C.L. (2001) Ontogeny of the gastrointestinal tract of marine fish larvae. Comparative Biochemistry and Physiology, 130C, 447-487.

Ark 11

Proteinfordøyelse og aminosyreutnyttelse i marine fiskelarver.

Sammendrag av Dr. Scient avhandling med original tittel: ”Protein digestion and amino

acid utilisation in marine fish larvae”

Sigurd K. Tonheim, 2004

Introduksjon Forutsigbar og kostnadseffektiv produksjon av yngel er en forutsetning for etablering av industriell produksjon av kveite i oppdrett. Intensiv produksjon av kveiteyngel, er som for andre marine arter i oppdrett, avhengig av at det benyttes levende fôr i startfôringsfasen. Dette representerer et ledd som både er kostnadsdrivende og skaper problemer på grunn av uheldige og uforutsigbare ernærings-messige forhold. Formulerte fôr er derfor ønskelig, men det har ennå ikke lyktes å utvikle fôr som aksepteres av larvene og tilfredstiller deres ernæringsbehov. Fiskelarver har et enormt vekstpotensial, og selv arter tilpasset temperaturen i våre områder er vist å kunne oppnå 25 % daglig tilvekst. Dette krever imidlertid at larvene forsynes med tilstrekkelige mengder vekst- og energisubstrat gjennom dietten. Vekstsubstrat er i all hovedsak aminosyrer (AA). I tillegg er AA vist å være det viktigste energisubstratet i mange marine fiskelarver, deriblant kveitelarver. Ut fra dette kan vi slå fast at larvene har et særlig stort behov for AA. AA-behovet dekkes først og fremst gjennom fordøyelse av diettprotein. Marine fiskelarver mangler imidlertid mage, som er viktig for protein-fordøyelsen, og dårlig fordøyelse av spesielt formulerte fôr, men også levende fôr, er rapportert fra fôringsforsøk med fiskelarver. Dette gjør det berettiget å studere marine fiskelarvers evne til å fordøye diettprotein, og om eventuelt enzymatisk nedbryting av diettprotein kan forbedre tilgangen til AA i dietten og dermed bidra til bedre utnyttelse av fiskelarvenes store vekstpotensial. Metodikk Å sammenligne absorpsjon og utnyttelse av intakt protein, hydrolysert protein og frie AA (FAA) i fiskelarver kompliseres av at små vannløselige molekyler i stor grad lekker ut av formulerte fôr på grunn av den korte diffusjonsavstanden i de små partiklene (0.2 – 0.6 mm). Et annet stort problem i ernæringsstudier av marine fiskelarver er at det er vanskelig å få disse til å akseptere formulerte fôr. Begge disse problemene kunne imidlertid omgås

ved å sondefôre radioaktivt merket protein, hydrolysat eller AA til larver, for deretter å følge den radioaktive isotopen gjennom larvenes stoffskifte. Ved å benytte 14C-isotop kunne dessuten oksidering av AA kvantifiseres gjennom å kvantifisere radio-aktiviteten i CO2 respirert fra larvene etter sonde-fôring. Protokoll og fysisk oppsett for sondefôring av kveitelarver med påfølgende innkubering og oppsamling av CO2 ble derfor utarbeidet (Fig 1, Artikkel I).

Fig 1. Oppsett for sondefôring og innkubering av fiskelarver. Enkeltlarver sondefôres med 14C-merkede næringsstoff og innkuberes i en gitt tid. Etter at larven er tatt ut og inkubasjonskammeret igjen er lukket, tilsettes HCl gjennom sprøyten slik at pH synker til under 2,0. Dette gjør at CO2 drives ut av vannet og blir transportert med luftstrømmen over til CO2-fellen hvor CO2 fanges på grunn av den høye pH verdien (11,5). Larvens tarm dissekeres for å skille radioaktivitet som er assimiler i larven fra radioaktivitet som fortsatt er i tarmen. Radioaktivitet i inkubasjonsvannet etter at CO2 er drevet ut representerer ufordøyd materiale tapt gjennom avføringen. En [U]14C-merket essensiell AA (lysine) og en ikke essensiell AA (glutamin) ble sondefôret til sildelarver i for å studere om fiskelarver i likhet med høyere vertebrater har ulik preferanse for essensielle og ikke essensielle AA for utnyttelse til henholdsvis forbrenning og proteinsyntese (Artikkel II).

Ark 11

En forutsetning for å kunne studere protein-fordøyelse og postprandial AA omsetning i larver var egnet radioaktivt merket AA og modellprotein. 14C-merkede AA produseres gjerne i alger dyrket med 14CO2 som karbonkilde. Dette gir uniformt (U) merkede AA, og med det menes at alle karbonatomer i AA er merket i like stor grad. Vanlig prosedyre for 14C merking av protein derimot, er basert på kjemisk modifisering (metylering) av intakt protein ved at dette behandles med 14C-formaldehyd. 14C overføres til lysin- og til en viss grad arginin-sidekjeder i proteinet med den følge at molekylvekt og ladning endres. Dette kan ha betydning for proteinets fysiologiske egenskaper, og det er vist at metylering av protein hemmer proteaser som katalyserer hydrolyse av peptidbindig inntill lysin- og arginin-sidekjeder. Men mer alvorlig er det, at merket lysin og arginin som eventuelt frigis under fordøyelsen vil være kovalent modifisert og dermed ulik lysin og arginin. Sannsynligheten for at metylert lysin og arginin blir diskriminert i stoffskiftet i forhold til umetylert lysin og arginin er stor. Protein radioaktivt merket med 14C-formaldehyd egner seg derfor ikke som modellprotein i fordøyelses og stoffskifte studier. Som et bedre alternativ, ble det derfor foretatt en innkorporering av [U]14C-merkede AA i serum-protein i levende laks ved at merkede AA ble gitt til laksen gjennom sondefôring. Etter to dager ble laksen tappet for blod og 14C-merket serumprotein renset og oppkonsentrert (Artikkel III). Isotopmerket serumprotein ble deretter sondefôret til kveite før og etter metamorfose enten som intakt protein eller pre-hydrolysert ved hjelp av proteaser, i en serie forsøk (Artikkel III og Artikkel IV). Resultater og diskusjon CO2 avgitt fra fiskelarver under innkubering etter sondefôring med 14C-merkede AA ble samlet 97 ± 2 % effektivt og ingen rester av CO2 var tilbake i inkubasjonsvannet etter at CO2 var fjernet. Av radioaktiviteten til stede i FAA og protein ble henholdsvis 17 % og 56 % gjenfunnet som CO2. De store andelene av radioaktivitet som ble gjenfunnet i CO2 viste tydelig at det var nødvendig å skille CO2 og avføring for å få et riktig bilde av absorpsjon og utnyttelse (Artikkel I). Forsøk med sondefôring av en essensiell AA (lysin) og en ikke-essensiell AA (glutamin) viste store forskjeller i hvordan disse ble utnyttet av larvene. Glutamin ble i stor grad oksidert (62 %) og kun i mindre grad assimilert i larvene (32 %), i motsetning til lysin som ble spart og assimilert (63 %), og kun i liten grad oksidert (22 %). Totalt sett ble 95 % av glutamin og 85 % av lysin absorbert av larvene. AA kan også tjene som substrat for syntese av lipider. Resultatene viste imidlertid at kun en ubetydeig andel av radioaktiviteten fra lysin (0,3 %)

og glutamin (1,3 %) ble gjenfunnet i larvenes lipidfraksjon. Dette indikerte at utnyttelsen av AA som substrat for produksjon av lipid er kvantitativt ubetydelig i sondefôringsforsøk med fiskelarver, og derfor ikke analysert i de etterfølgende eksperimentene (Artikkel II). Kveitelarver før utvikling av mage absorberte og utnyttet 25 ± 13 % og 36 ± 14 % (gjennomsnitt ± stdav) av det merkede modellproteinet i to uavhengige forsøk og viste dermed dårligere evne til fordøyelse og utnyttelse av diett protein enn kveite etter metamorfose, som absorberte 59 ± 13 % (gjennomsnitt ± stadv) av intakt protein gitt i en tilsvarende dose sett i forhold til kroppsvekt. Dette påviste at den proteolytiske kapasiteten til kveite øker etter som fordøyelsesapparatet modnes. Det ble også vist at et 14C-(metyl)-merket serum protein verken ble fordøyd eller assimilert i like stor grad som serumproteinet merket ved innkorporering av [U]14C-merkede AA i laks. Dette indikerte at metyleringsprosessen inhiberte både fordøyelse av proteinet og utnyttelse av det metylert lysinet i proteinsyntesen (Artikkel III). Enzymatisk hydrolyse av modellproteinet før sondefôring forbedret imidlertid proteinutnyttelsen i kveitelarver til samme nivå som utnyttelsen av intakt protein i kveite etter metamorfose (63 %), og utnyttelsen var konstant og uavhengig av dosens størrelse i det målte området (3,5 – 35 µg). Intakt protein ble utnyttet i mindre grad når gitt dose økte. Modellproteinet ble absorbert 2.2 ganger raskere av kveitelarver når det på forhånd var hydrolysert med pepsin, og 3 ganger raskere når det på forhånd var hydrolysert med trypsin og tre andre proteaser i tillegg til pepsin. Absorpsjonsraten av protein i kveitelarver økte således med hydrolysegrad og raskere absorpsjon gav utslag i høyere nivåer av radioaktivitet i larvenes FAA-pool. Fordelingen av absorberte AA som ble benyttet som henholdsvis energisubstrat og oksidert, eller benyttet i proteinsyntesen og assimilert, var imidlertid konstant, 42 ± 7 % og 49 ± 6 %, uavhengig av hydrolysegrad og hvor stor dose som ble gitt (3.5 - 35 · 10-6 g), og viste at raskere absorpsjon og høyere postprandial konsentrasjon av AA ikke nødvendigvis reduserer proteinretensjonen som følge av stimulert AA forbrenning. Allerede mellom 2 og 4 timer etter sondefôring ble 25 % av inntakt modellprotein skilt ut med larvenes avføring. I det samme tids-intervallet ble 15 % av radioaktiviteten absorbert, og indikerte dermed at rask tarmevakueringsrate er en medvirkende årsak til den dårlige utnyttelsen av intakt protein i tidlige stadier av kveite. Det fekale tapet fra larver fôret med hydrolysert protein var til sammenligning ca 5 % etter 4 timer og dermed betydelig mindre enn i larver fôret med inntakt protein. På dette tidspunkt var absorpsjonen i larver fôret med hydrolysert protein i all vesentlighet fullført og faren for at

Ark 11

disse diettene skulle tapes med avføringen dermed tilsvarende redusert (Artikkel IV). Innholdet av FAA og vannløselig protein i levende fôr kan utgjøre så mye som 50 % av totalt nitrogen. FAA kan absorberes direkte og er dermed lett tilgjengelig for larver, og løselige proteiner brytes raskere ned av proteaser enn vev og uløselig protein. Såfremt fôrtilgangen er god, kan det derfor være en bedre strategi for marine fiskelarver med tanke på å oppnå raskest mulig vekst, å ha høyt fôropptak, rask tarmevakueringsrate og eksklusivt utnytte lett tilgjengelig protein og AA, enn det vil være å optimalisere proteinutnyttelseseffektiviteten ved å redusere fôrinntaket og tarmpasserings-hastigheten. Utfordringen for produsenter av formulert fôr til marine fiskelarver vil være å oppnå fôr med høy proteintilgjengelighet, uten at det tilgjengelige proteinet tapes gjennom lekkasje før fôret spises av fiskelarvene. Konklusjoner

• Kveitelarver har begrenset kapasitet til å utnytte diettprotein sammenlignet med kveite etter at funksjonell mage er utviklet.

• Proteinutnyttelsen i kveitelarver reduseres når fôrinntaket økes.

• Dårlig proteinutnyttelse i kveitelarver kan kompenseres for ved hydrolyse av diettproteinet før inntak.

• Hydrolyse av diettprotein før inntak i kveitelarver kan øke absorpsjonsraten uten at dette gir negative konsekvenser for proteinutnyttelseseffektiviteten.

• Det er indikert at høy tarmtømmingsrate er en viktig begrensende faktor for utnyttelse av diettproteiner som fordøyes langsomt.

Artikkel III og Artikkel IV og Dr.Scient graden er utført med støtte fra NFR prosjekt #130195/130 Referanser 1. Rønnestad, I., Rojas-García, C. R., Tonheim, S.

K., Conceição, L. E. C. (2001). In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae. Aquaculture 201, 161-175 (Artikkel I)

2. Conceição, L. E. C., Rønnestad, I., Tonheim, S. K. (2002). Metabolic budgets for lysine and glutamate in unfed herring (Clupea harengus) larvae. Aquaculture 206, 305-312 (Artikkel II)

3. Tonheim, S.K., Espe, M., Raae, A.J., Darias, M.J., Rønnestad, I., 2004. In vivo incorporation of [U]14C-amino acids: an alternative protein labelling procedure for use in examining larval digestive physiology. Aquaculture, in press (Artikkel III)

4. Tonheim, S. K., Espe, M., Rønnestad, I. Pre-hydrolysis of protein improve utilisation of dietary protein in larval Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus). Subm. to J. Nutr. 2004 (Artikkel IV)

Ark 12

Radioaktiv merking av modellprotein til bruk i studier av proteinfordøyelse og –utnyttelse i marine

fiskelarver

S.K. Tonheim, M. Espe, A.J. Raae, M.J. Darias, I. Rønnestad Proteinfordøyelse i kveitelarver ble studert ved bruk av sondefôring. For å gjøre dette var det nødvendig å fremstille et hensiktsmessig 14C-merket modellprotein siden innmerkingsteknikken benyttet i kommersielt fremstilte 14C-merkede proteiner ble antatt å påvirke både fordøyelse og omsetning av disse proteinene. Det ble utført merking av protein i levende laks ved å gi [U]-14C-merkede aminosyrer oralt. Merket serumprotein ble høstet og renset, og radioaktiviteten i proteinet og de enkelte aminosyrene ble analysert. Det produserte modellproteinet (14C-SSP) ble sondefôret til kveite før og etter metamorfose og sammenlignet med et kommersielt fremstilt 14C-merket protein. 14C-SSP ble fordøyd og utnyttet i langt større grad i kveite etter metamorfose (59 ± 13 %) enn før metamorfose (24 ± 13 %). Dette styrket hypotesen om at kveitelarver før metamorfose har begrenset evne til å fordøye protein, og viste at 14C-SSP var egnet i komparative fordøyelsesstudier med fiskelarver. Det kommersielt fremstilte proteinet hadde lavere fordøyelighet og resultatene styrket påstanden om at proteiner merket på denne måten ikke er egnet i ernæringsstudier. Introduksjon Strenge krav til teknisk oppsett, dårlig fôraksept, problemer med å registrere fôrinntak og utstrakt lekkasje av små vannløselige fôrkomponenter før fôret spises av fiskelarvene, er alle faktorer som vanskeliggjør bruk av klassiske fôringsforsøk i behovsstudier hos marine fiskelarver. Sondefôring med radioaktivt merkede næringsstoffer har potensiale til å omgå de foran nevnte utfordringene, men begrenses av tilgang til egnede radioaktive modellnæringsstoffer. I studier av proteinutnyttelse i fiskelarver er det hensiktsmessig å benytte 14C-merking siden aminosyrer (AA) i stor grad benyttes som energisubstrat i fiskelarver. Den andelen som forbrennes vil dermed kunne bestemmes gjennom å analysere 14C i CO2 avgitt fra fisken. Merking av AA, fettsyrer og andre enkle næringsstoffer med 14C utføres kommersielt ofte ved å dyrke algekulturer i medium tilsatt uorganisk 14C. Uorganisk 14C fikseres og inkorporeres i sukker produsert under fotosyntesen. Det 14C-merkede sukkeret brukes deretter som substrat for produksjon av alle organiske forbindelser nødvendig for å ivareta algekulturens behov, deriblant de 20 AA som inngår i proteiner. Denne metoden resulterer i at alle karbonatomene i de produserte organiske molekylene (AA, fettsyre, etc.) er merket i like stor grad (uniform merking). Kjemiske eller biologiske egenskaper påvirkes ikke av denne måten å merke på. Fremstilling av 14C-merkete proteiner derimot, utføres vanligvis ved å la 14C-holdige reagenser reagere med et ferdig intakt protein. Den vanlige reaksjonen som benyttes er metylering av lysin (og til en viss grad arginin) ved å behandle proteinet med 14C-formaldehyd. Dette gir ikke uniform merking, siden 14C kun vil finnes i en spesifikk posisjon i proteinets lysin-sidegrupper, (og til en viss grad i arginin-sidegrupper). Denne type

merking er relativt skånsom for proteinet, men vil like fullt medføre endringer som gjør proteiner merket på denne måten lite egnet til ernærings-studier. Metylering av lysin og arginin vil hemme proteaser som katalyserer spalting av peptid-bindinger hvor disse aminosyresidegruppene inngår, deriblant trypsin, som er et viktig fordøyelsesenzym også for kveitelarver. Mer alvorlig er det imidlertid at dersom fordøyelse likevel skjer og de merkede lysinmolekylene frigjøres og absorberes, vil disse mest sannsynlig diskrimineres i stoffskiftet fordi molekylets størrelse, form og ladning vil være ulik umerket lysin. Merkingen i seg selv vil således kunne påvirke hvordan den merkede komponenten utnyttes i stoffskiftet, og dermed bryte forut-setningen for bruk av radioaktiv sporing. Produksjon av [U]14C-merket algeprotein ble forsøkt, men førte ikke frem fordi det ikke lot seg gjøre å separere 14C-merkede proteiner fra karbohydrater som også var merket. Det ble derfor utført et forsøk på å merke proteiner ved å gi [U]-14C-merkede AA til levende fisk. Merkede AA som tas opp av fisken vil blande seg med fiskens frie AA (FAA) og inkorporeres i proteiner etter som disse syntetiseres i fisken. En slik merking med [U]-14C-merkede AA vil ikke påvirke proteinets biologiske eller kjemiske egenskaper. Materialer og metoder En blanding av [U]-14C-merket L-alanin 8%, L-arginin 7%, L-aspartic acid 8%, L-glutamic acid 12,5%, glycine 4%, histidin 1,5%, L-isoleucin 5%, L-leucin 14%, L-lysin 6%, L-phenylalanin 8%, L-prolin 5%, L-serin 4%, L-threonin 5%, L-tyrosin 4%, L-valin 8%, til sammen 75 MBq, ble gitt med sondefôring til en laksesmolt på 150 g. Etter to dager ble smolten fanget inn, bedøvet og tappet for blod. Smolten ble deretter avlivet med en overdose

Ark 12

bedøvelse. Blodet ble separert og serumproteinene renset ut ved gelfiltrering og konsentrert ved sentrifugering gjennom membran (cut-off sentrifugering). Radioaktivitet og proteininnhold i det merkete serumproteinpreparatet (14C-SSP) ble analysert. Fordelingen av radioaktivitet i ulike proteinkomponenter ble studert ved gelfiltrering i kombinasjon med elektroforese, og spesifikk radioaktivitet i den enkelte aminosyre bestemt etter separasjon i HPLC. For å evaluere 14C-SSP med tanke på fordøyelighet og egnethet i ernæringsstudier ble 14C-SSP sondefôret til kveite før og etter metamorfose. De sondefôrede fiskene ble innkubert i kammer med mulighet for oppsamling av CO2. Etter 16 timer ble fiskene tatt ut, avlivet og tarmen dissekert. Tarm og kropp ble ekstrahert i TCA for å separere protein fra frie AA. Fordøyelighet og retensjonseffektivitet av 14C-SSP ble analysert ved å studere fordelingen av radioaktivitet i de ulike larvefraksjonene, samt i CO2 og i inkubasjonsvannet som inneholdt ikke absorbert protein skilt ut sammen med feces. For sammenligning ble også et metylert modellprotein (14C-metyl-BSA) sondefôret til kveite etter metamorfose. Resultater Det ble utvunnet 1,6 ml radioaktivt merket serum fra den ene smolten hvor innmerkingen foregikk. Gjennom preparativ gelfiltrering ble proteiner separert fra lavmolekylære forbindelser i serumet og oppkonsentrert gjennom cut-off sentrifugering. Det endelige merkede proteinpreparatet hadde en konsentrasjon lik 81 mg/ml og en spesifikk radioaktivitet lik 3,6 KBq/mg.

Fig. 1. Gelfiltrering og analyse av protein (OD280), radioaktivitet (Bq) og molekylvektstørrelser (SDS_PAGE) i de eluerte fraksjonene viste at tre proteiner på henholdsvis 120, 75 og 65 kD (A,B og C) både utgjorde majoriteten av proteinene / polypeptidene i 14C-SSP og inneholdt samtidig mesteparten av radioaktiviteten.

Analytisk gelfiltrering og analyse av radio-aktiviteten og elektroforese av de separerte fraksjonene avdekket at 14C-SSP var en kompleks blanding av mer enn 13 ulike polypeptider (proteiner), med varierende spesifikk aktivitet (Fig. 1). Tre polypeptider, med molelylvekt på henholdsvis 65, 75 og 120 (kD) var dominerende både hva angikk mengde og radioaktivitet. Den spesifikke radioaktiviteten av de enkelte aminosyrene etter separasjon med HPLC varierte betydelig (Tabell 1). Mest oppsiktsvekkende var den høye aktiviteten i tyrosin (2895 Bq / µmol) og phenylalanin (2250 Bq / µmol). Den spesifikke aktivitete i de øvrige AA varierte mellom 78 og 500 Bq / µmol. Tabell 1. Aminosyreprofil og aminosyre spesifikk radioaktivitet i 14C-merket lakseprotein (14C-SSP) etter hydrolyse 6N HCl og separasjon i HPLC.

Amounts (nmol)

Radioactivity (Bq)

Spec.act. (Bq · µmol-1)

Asp + Asn 47 5.3 113 Ser 9 1.1 122 Gly 45 5.6 124 Pro 32 7.6 238

Glu + Gln 38 3.5 92 Ala 67 5.2 78 Tyr 19 55 2895 Thr 24 5.2 217 Val 37 7.8 211 Met 14 2.3 164 Ile 19 5.1 268

Leu 43 8.7 202 Phe 16 36 2250 Lys 41 12 293 His 12 1.8 150 Arg 20 10 500

Verdiene er per µl 14C-SSP. Cys og Trp ble ikke analysert. 14C-SSP ble fordøyd og absorbert av kveitelarver, men en betydelig høyere andel ble absorbert og utnyttet etter metamorfose (59 ± 13 % mot 24 ± 13 %). Fordelingen av absorberte AA til henholdsvis forbrenning, assimilering i protein og akkumulering i larvens FAA var imidlertid tilnærmet identisk før og etter metamorfose (Fig. 2). 14C-(metyl)-BSA ble absorbert og utnyttet i langt dårligere grad enn 14C-SSP (44 ± 7 % mot 59 ± 13 %). Spesielt var forskjellen stor når det gjaldt assimilering i fiskens proteinfraksjon (12 ± 3 % mot 29 ± 8 %) (Fig. 2). Diskusjon Innkorporering av [U]14C-aminosyrer i serum-protein i laksesmolt var vellykket, og tilstrekkelig radioaktivitet ble oppnådd til at 14C-SSP var egnet for bruk til sondefôring av fiskelarver i ernærings-

Ark 12

studier. 14C-SSP var imidlertid ikke uniformt merket (den spesifikke aktiviteten av de enkelte AA varierte i stor grad). Dette må det tas høyde for i evaluering av ernæringsstudier hvor slike modellproteiner benyttes, siden det ikke uten videre kan settes likhetstegn mellom distribusjon av radioaktivitet og distribusjon av AA. For eksempel hadde aminosyrene alanin, asparginsyre, glutamat og glutaminsyre, som er de mest typiske AA som forbrennes i energistoffskiftet, en samlet spesifikk aktivitet på bare en femtedel av den gjennom-snittlige spesifikke aktiviteten av de øvrige AA. Dette kan ha bidratt til underestimering av AA forbrenningen.

Fig. 2. Absorpsjon og utnyttelse av radioaktivt merket lakseserumprotein (14C-SSP) i kveite før og etter metamorfose, 36 og 78 dager etter startfôring (dpsf). Til sammenligning vises absorpsjon og utnyttelse av 14C-(metyl)-BSA i kveite 78 dpsf. Den dårlige proteinutnyttelsen i larver før meta-morfose tilskrives mangelfullt utviklet fordøyelses-system, først og fremst fravær av en funksjonell mage. At det ble funnet såpass stor forskjell i utnyttelsen av 14C-SSP i kveite før og etter metamorfose viser at 14C-SSP er et egnet modellprotein til bruk i komparative protein-fordøyelsstudier. Større fekalt tap av 14C-(metyl)-BSA sondefôret til kveite, sammenlignet med 14C-SSP, styrker hypotesen om at metylering hemmer proteolyse. Den relativt lave andelen av 14C-(metyl)-BSA som assimileres i protein styrker også hypotesen om at metylert lysin diskrimineres i stoffskiftet, siden det tidligere er vist at lysin svært effektivt assimileres i fiskelarver.

Referanse Tonheim, S.K., Espe, M., Raae, A.J., Darias, M.J., Rønnestad, I. In vivo incorporation of [U]-14C-amino acids: an alternative protein labelling procedure for use in examining larval digestive physiology. Aquaculture 2004, in press.

Ark 13

Pre-hydrolyse bedrer absorpsjon og utnyttelse av diettprotein i kveitelarver

Sigurd K. Tonheim, Marit Espe, Ivar Rønnestad

Et radioaktivt merket modellprotein (14C-SSP) produsert gjennom innkorporering av [U]-14C-merkede aminosyrer (AA) i lakseserumprotein, ble hydrolysert i to nivåer og absorpsjon og utnyttelse av intakt protein (IntP) og hydrolysat ble sammenlignet i kveitelarver før metamorfose ved å benytte en etablert teknikk for sondefôring. Absorpsjon og utnyttelse av IntP avtok når dosen økte, og det ble funnet signifikant forskjell mellom larver med en aldersforskjell på 6 dager, mens tilsvarende verdier for hydrolysert protein var høyere (63 %) og uavhengig av dosens størrelse, proteinpreparatets hydrolysegrad og larvenes alder og størrelse. Absorpsjonsraten økte med hydrolysegrad og gav seg utslag i ulik akkumulering av frie AA (FAA). Økt absorpsjonsrate og akkumulering av FAA gav imidlertid ikke utslag i økt AA forbrenning, siden andelen av absorberte AA som var forbrent, 20 timer etter sondefôring, var konstant (42 %) og uavhengig av hydrolysegrad og dosestørrelse. Resultatene indikerte videre at rask tarmtømmingsrate bidrar til å redusere proteinutnyttelsen i mageløse fiskelarver, og at rask absorpsjon i seg selv derfor bidrar til forbedret proteinutnyttelse. Introduksjon Fiskelarver har et stort vekstpotensial, forutsatt at fôrtilgangen er tilstrekkelig. Stort fôropptak og rask vekst bidrar til å øke behovet for metabolsk energi. Fiskelarver har derfor et særlig stort proteinbehov siden aminosyrer (AA), i tillegg til å være nødvendig for vekst, i stor utstrekning forbrennes for å dekke energibehovet. Kveitelarver startfôres på et tidlig stadium, før mage og fordøyelses-systemet er ferdig utviklet. Dette gjør det relevant å anta at tilgang på AA kan være en begrensende faktor for vekst og at kveitelarver har spesielle krav til fôrets innhold av protein. Mer kunnskap på dette området synes å være nødvendig før det er realistisk å forvente at formulerte fôr, egnet til kveitelarver fra startfôring, skal kunne utvikles. For å forbedre tilgjengeligheten av protein i formulerte fôr er det gjort forsøk med innblanding av frie AA (FAA) og pre-hydrolyserte proteiner. Resultater fra fôringsforsøk viser imidlertid at både FAA og hydrolysert protein i formulerte fôr har negativ effekt på vekst hos fiskelarver dersom innblandingen overskrider visse grenser (25 – 30 %). Det er vist at diettproteiner som absorberes raskt stimulerer til AA forbrenning og gir redusert proteinutnyttelse. Det var derfor av interesse å utføre et detaljert studium på AA stoffskiftet i kveitelarver fôret med protein og hydrolysert protein med eksakt lik AA sammen-setning for å se om raskere absorpsjon i seg selv ville gi utslag i økt AA forbrenning og dermed redusert protein retensjon. Materialer og metoder På forhånd var et 14C-merket modellprotein fremstilt. Dette ble hydrolysert med pepsin (PHP) og videre med trypsin og tre endoproteinaser som spalter peptidbindinger mellom henholdsvis glutamin, proline og asparginsyre (HHP). PHP og HHP ble sondefôret direkte i midttarmen til

kveitelarver i perioden 24 til 32 dager etter startfôring (dpsf). Umiddelbart etter sondefôring ble kveitelarvene innkubert enkeltvis i forseglede kammer koblet til en CO2-felle for å kunne måle radioaktivitet i CO2 produsert under forbrenning av radioaktive AA i larvenes energistoffskifte. Ved endt inkubasjonstid ble kveitelarvene tatt ut av kammeret, veid og avlivet med et kutt i sentralnervesystemet. Larvene ble deretter dissekert for å skille radioaktivitet i tarmen fra radioaktivitet absorbert i kveitelarvenes kropp. Kropp og tarm ble deretter hver for seg ekstrahert med trikloreddiksyre (TCA) for a skille mellom radioaktivitet i FAA og radioaktivitet innkorporert i larvens protein. Radioaktivitet i feces ble analysert ved måling i inkubasjonsvannet etter at CO2 var fullstendig fjernet. To forsøk ble gjennomført parallelt, ett der larver ble sondefôret med ulik mengde protein eller hydrolysat (3.5 – 35 µg) og alle larver inkubert i 20 timer etter sondefôringen, og et annet der alle larvene ble gitt den samme mengde protein eller hydrolysat (10 -12 ug), men inkubasjonstiden ble varierte mellom og 0.5 og 20 timer. Resultater Hydrolysatene PHP og HHP var innbyrdes ulike med tanke på hydrolysegrad, og begge var ulike det intakte proteinet (IntP; Fig. 1.) På tross av ulik hydrolysegrad ble imidlertid begge hydrolysatene uthyttet like effektivt av kveitelarvene (63%) uavhengig av mengde hydrolysat som ble gitt, og uavhengig av alders- og størrelsesforskjell på larvene. IntP ble ved små inntak utnyttet i tilsvarende grad som hydrolysatene, men så snart mengde økte ble utnyttelsen av IntP betydelig redusert (Fig. 2). Det ble dessuten funnet signifikant dårligere utnyttelse av IntP i larver 25 dpsf sammenlignet med larver fra samme gruppe seks dager senere (Fig. 2.). Absorpsjonsraten økte

Ark 13

med hydrolysegrad (HHP > PHP > IntP, Fig. 3.) og det ble funnet forskjell i akkumulering av radio-aktivitet i kveitelarvenes FAA (Fig. 4).

Fig. 1. Elektroforese (SDS-PAGE) viste at den preparative hydrolysen av IntP resulterte i endret molekylvektdistribusjon på bekostning av de originale proteinene i preparatet. Videre hydrolyse av PHP til HHP gav et preparat bestående av små peptider og frie aminosyrer, hvor kun en liten andel hadde tilstrekkelig molekylvekt til å bli holdt tilbake i gelen under elektroforesen (> 10 kD).

Fig. 2. Regresjonsanalyse for absorpsjon av hydrolysert protein i kveitelarver viste at absorpsjonseffektiviteten var lik for de to hydroly-serte preparatene (HHP og PHP). Lineariteten var god (R2=0,98) og skjæringspunktet nær origo, og indikerte dermed en konstant (63%) absorpsjons-effektivitet av hydrolysert protein uavhengig av dosens størrele (mellom 3,5 til 35µg). Utnyttelseseffektiviteten av intakt protein (IntP) var signifikant forskjellig fra hydrolysatene (P < 0,05), hadde dårligere linearitet og betydelige konstantledd og indikerte dermed at utnyttelses- effektiviteten av intakt protein i motsetning til hydrolysatene avtok med økende dose. Det var i tillegg signifikant forskjell i utnyttelseseffektivitet (P < 0,05) mellom larver sondefôret intakt protein 25 dager etter startfôring ( 0,05 · sondefôret protein + 2,0; R2 = 0.16) og larver fra samme gruppe sondefôret intakt protein seks dager senere. (0,4 · sondefôret protein + 0,72; R2 = 0,87). Fordeling av absorberte AA til henholdsvis forbrenning og assimilering i protein og i FAA etter

20 timer var lik for alle larver, uavhengig av om protein eller hydrolysat ble gitt og hvilke mengder som ble gitt. Det fekale tapet av radioaktive AA i larver som ble gitt IntP i perioden 2 - 4 timer etter sondefôring var 24 ± 10% (gjennomsnitt ± SEM, n = 10), betydelig større enn det fekale tapet fra larver sondefôret med PHP og HHP (Fig. 5.). Det ble i tillegg funnet at det fekale tapet av intakt protein i denne perioden var signifikant (P < 0,05) større i de yngste larvene sammenlignet med larver fra samme gruppe seks dager sener.

Fig. 3. Absorpsjonsraten av HHP og PHP i kveitelarver var henholdsvis 3 og 2,2 ganger raskere enn absorpsjonsraten av intakt protein (IntP). Regnet om i mengde var absorpsjonsratene for HHP, PHP og IntP henholdsvis 2,61µg/time (R2=0,54), 1,92µg/time (R2=0,77) og 0,87µg/time (R2=0,36).

Fig. 4. Akkumulering av frie AA var raskest og nådde høyest nivå i kveitelarver fôret med HHP. To timer etter sondefôring var det signifikant forskjell (P < 0.05) mellom alle gruppene. Diskusjon Resultatene viste at hydrolyse av modellproteinet før fôring til kveitelarver forbedret absorpsjon og utnyttelse av proteinets AA, og at utnyttelsesgraden i forhold til intakt protein økte med økende inntak (Fig. 2.). Modellproteinet ble absorbert 2.2 ganger

1 2 3 4 5 6 7 8

IntP PHP HHP

75kD

25kD

10kD

Ark 13

raskere når det på forhånd ble hydrolysert med pepsin (PHP), og ytterligere hydrolyse med flere proteaser (HHP) økte absorpsjonsraten 3 ganger i forhold til inntakt protein (Fig. 3.). Forskjellen i absorpsjonsrate av de ulike preparatene var tilstrekkelig til å oppnå ulik akkumulering av FAA i kveitelarvene (Fig. 4.). Den oppnådde forskjellen i akkumulering av FAA bidrog imidlertid ikke til øket forbrenning av AA, siden fordelingen av absorberte AA var konstant med 42% forbrent, 49% assimilert i protein og 9% i FAA, uavhengig av hvilke preparat og hvor stor dose som ble gitt. Resultatene fra kveitelarver skiller seg således fra resultater funnet i mennesker som viser økende forbrenning og redusert utnyttelse av AA fra proteiner som absorberes hurtig sammenlignet med proteiner som absorberes mer langsomt.

Fig. 5. Det fekale tapet var størst fra kveitelarver sondefôret intakt protein (IntP). Særlig påfallende var det store tapet i perioden 2 – 4 timer etter sondefôring, før absorpsjonen avtok. Dette indikerte at tarmtømmingsraten kan være en kritisk faktor for proteinutnyttelse i kveitelarver. Kveitelarver 25 dpsf utnyttet intakt protein dårligere enn kveitelarver fra samme gruppe seks dager senere. Forskjellen kunne ikke tilskrives modning av magefunksjoner siden proteinløsningen ble injisert direkte til kveitelarvenes midttarm. Tilsvarende effekt av alder på utnyttelse av hydrolysert protein ble ikke funnet. Med første øyekast kunne dette derfor tolkes som om evnen til proteinfordøyelse i midttarmen var forbedret. Analyser av det fekale tapet av intakt protein ved henholdsvis 25 og 31 dpsf gav imidlertid grunnlag for en alternativ tolkning. I perioden 2 til 4 timer etter sondefôring var det fekale tapet i de yngste larvene i gjennomsnitt på hele 35%, sammenlignet med 12% i kveitelarver 31 dpsf. I det samme tidsrommet var absorpsjonsraten fortsatt høy, med 15% av administrert radioaktivitet absorbert av larver både 25 og 31 dpsf. Dette indikerer at protein tapes gjennom avføringen samtidig som absorpsjonen går for fullt, og at dette skjer i større grad hos de yngste larvene, og at dette kan være årsaken til at disse totalt sett oppnår dårligere utnyttelse enn larver fra samme gruppe 6 dager

senere. Absorpsjonen av PHP og HHP derimot, var allerede tilnærmelsesvis fullført 4 timer etter sondefôring, og dermed mindre utsatt for å tapes gjennom avføring. Dette indikerer at tarm-tømmingsraten er en kritisk faktor for protein-utnyttelsen i kveitelarver, og at rask absorpsjon i seg selv bidrar til å øke absorpsjonseffektiviteten. Dette kan også forklare hvorfor utnyttelsen av intakt protein var tilnærmelsesvis like god som for hydrolysatene når gitt i små doser, men betydelig dårligere når gitt i større doser. Rask tarmtømming er tidligere beskrevet også for andre marine fiske-larver. Resultatene støtter således hypotesen om at AA tilgjengeligheten er en begrensende faktor for vekst hos marine fiskelarver i oppdrett. Formulerte dietter og proteinanrikningsprodukter baseres i dag i stor grad på fiskemel, og må i utgangspunktet antas til og med å ha lavere fordøyelighet i kveitelarver enn serumprotein (IntP), siden serumproteiner er godt løselige og dermed vil oppnå stor kontaktflate mot proteasene i tarmen. Dette indikerer videre at optimalisering av proteinfraksjonen i dietter til kveitelarver, det være seg formulert dietter eller anrikningsprodukter til levendefôr, har et stort potensiale. Gevinsten vil være raskere vekst og bedre økonomi. Referanse Tonheim, S.K., Espe, M., Rønnestad, I. Pre-hydrolysis of protein improve utilisation of dietary protein in larval Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus, L.). Submitted to J. Nutr., 2004.

Ark 14

En metode for syntese av proteiner egnet til metabolismestudier av fiskelarver

S. C. Hovde, A. J. Raae, I. Opstad For å kunne utføre metabolismeforsøk i fiskelarver, er det nødvendig å benytte 14C-merkede proteiner av høy konsentrasjon, renhet og spesifikk aktivitet. Dette studiet beskriver en metode velegnet for å syntetisere slike proteiner. Introduksjon Fordi fiskelarver ofte har et begrenset opptak av næringsstoffer, kan man utføre metabolismeforsøk for å avdekke assimileringsgrad av ulike fôr. For å kunne gjennomføre slike metabolismeforsøk, er det utviklet en metode for sondefôring av radiomerkede næringsstoffer (Rust et al., 1993), videreutviklet av Rønnestad (Rønnestad et al., 2001). Denne metoden krever 14C-merkede proteiner av høy konsentrasjon (dvs minst 10 mg/ml), renhet og spesifikk aktivitet (minst 0,01 µCi/ml). Slike proteiner er ikke kommersielt tilgjengelige. Derfor er en metode for syntese av protein med slike karakteristika utviklet og beskrevet i dette studiet. Materialer og metoder To ulike 14C-merkede proteiner ble syntetisert: R16 på 16 kDa og alfa-mini på 42 kDa. Alfa-mini er et aktinbindende minispectrin (Raae et al., unpubl.), der R16 inngår som et domene. Begge proteinene er His-merkede. R16 og alfa-mini ble klonet inn i henholdsvis pET-24d-tev-His dsb og pHAT2 ekspresjon-plasmider. PET-plasmidet inneholder et kanamycin resistanse-gen, og pHAT-plasmidet inneholder et ampicillin resistanse-gen. Plasmidet ble transfektert inn i cellekultur av BL-21 E. coli, og transformerte celler dyrket ved 37°C i en roterende rister satt til 250 rpm. Mediet brukt var Minimum Essential Medium Eagle’s deficient (MEM) uten L-leucine, som inneholdt 25 µg/ml av det nødvendige antibioticum. MEM var også tilsatt 25 mM HEPES buffer, pH 7,5. Ved en optisk tetthet (OD600) på 0,5, ble det tilsatt 1 mM IPTG og 0,4 mM 14C-merket L-leucine, og cellene ble videre innkubert ved 18°C ved 150 rpm, overnatt. Cellene ble pelletert ved sentrifugering i 10 min, og de His-merkede proteinene renset v.h.a. Ni-NTA Spin Kit. Proteinene av ønsket størrelse ble separert fra de andre ved gelekskluderingskromatografi. Konsentrasjonen av proteinene fra de rette fraksjonene (kombinert) ble så økt ved sentrifugering gjennom et filter (Centricon Centrifugal Filter Devices YM-10, Amicon) i en rotor ved 4000 rpm og 4°C. Ekspresjonen av proteinene ble deretter analysert ved denaturering med sodium dodecyl sulfate (SDS)-gel loading

buffer (5 min ved 95°C) og elektroforese på en SDS-polyacrylamide gel. Etter vandring ble gelen farget med Coomassie, tørket og eksponert. Radioaktiviteten ble målt ved Autoradiografi og ved væske-scintillering. Resultater Det var mulig å oppnå konsentrasjoner på minst 10 mg/ml. Renheten var relativt høy (figur 1). Den spesifikke aktiviteten ble regnet som tilfredsstillende for metabolismeforsøk (figur 2), selv om den ble høyere for alfa-mini enn for R16 (henh. 20 og 6 CPM/ml).

Figur 1. SDS-PAGE av R16 (16 kDa) og alfa-mini (42 kDa).

Figur 2. Autoradiografi av R16 (16 kDa) og alfa-mini (42 kDa).

16 kDa

42 kDa

16 kDa

42 kDa

Ark 14

Konklusjoner ϕ Denne metoden kan benyttes for å syntetisere

proteiner egnet for metabolismeforsøk i fiskelarver.

Referanse Rust, M.B., Hardy, R.W. & Stickney, R.R. 1993. A new method for force-feeding larval fish. Aquaculture, 116: 341-352. Rønnestad, I., Rojas-García, C.R., Tonheim, S.K. & Conceição, L.E.C. 2001. In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae. Aquaculture 201: 161-175. Raae, A.J., S. Banuelos, J. Ylänne, T. Olausson, K.N. Goldie, T. Wendt, A. Hoenger & M. Saraste. Not jet published. Actin binding of a minispectrin.

Ark 15

Proteinmetabolisme i kveitelarver; effekt av proteinstørrelse

S. C. Hovde, S. Tonheim, K. Hamre, A. J. Raae, I. Opstad og I. Rønnestad

For å avgjøre den ontogenetiske utviklingen i proteinopptak hos kveitelarver i forhold til proteinstørrelse, ble larver sondefôret med to ulike størrelser av 14C-merkede proteiner ved dag 13, 20, 27 og 41 etter startfôring, og grad av assimilering bestemt. Det ble observert en generell økning i assimilering av protein med økende larvestørrelse. Opptaket av det minste proteinet (16 kDa) var høyere enn for det største proteinet (42 kDa) fra dag 20. Introduksjon Tidligere studier har vist at kveitelarver spiser formulert fôr, men at de ikke vokser og utvikler seg normalt. Dette tyder på at de ikke klarer å assimilere nødvendige næringsstoffer. Store proteiner må brytes ned til frie aminosyrer eller peptider før de kan assimileres. Da tarmsystemet hos kveitelarver er udifferensiert, er det mulig at de ikke ennå kan utskille fordøyelsesenzymer nødvendige for å bryte ned større proteiner. Ved å sondefôre larver av ulik alder med proteiner av forskjellig størrelse, kan man avgjøre den ontogenetiske utviklingen i proteinopptak, og i hvilken grad formulert fôr bør hydrolyseres for at de skal kunne bli assimilert. Materialer og metoder Kveitelarvene ble overført fra 5m3 siloer til 1500-l kar ved 239 dagerº (startfôring). Temperaturen var 12±1 ºC, og de ble fôret med Artemia tre ganger om dagen. Fra dag syv etter startfôring og utover ble de i tillegg fôret med naturlig zooplankton. Doseringen ble justert i forhold til behov. Eksperimentet med kontrollert fôring ble utført ved Austevoll havbruksstasjon fire ganger i løpet av de seks første ukene etter startfôring. To ulike 14C-merkede

proteiner ble syntetisert og benyttet i forsøket; R16 på 16 kDa og alfa-mini på 42 kDa. Alfa-mini er et aktinbindende minispectrin (Raae et al., unpubl.), der R16 inngår som et domene. Sonden fylt med proteinløsning ble festet til en nanoliter injektor, og proteinene ble separat injisert inn i larvenes tarm via munn og svelg vha en mikromanipulator. Før injisering ble hver larve bedøvet med MS-222, deretter lagt i en vanndråpe på en petriskål. Et bestemt volum av protein ble injisert (60% av totalt tarmvolum), før larven ble renset i isotont vann og individuelt innkubert i scintillasjonsglass med 8 ml isotont vann. For å kvantifisere kataboliserte næringsstoffer (14C-CO2), ble glassene koblet til CO2-feller med 5 ml 0,5M KOH (Rønnestad et al., 2001). Etter ca 22t innkubering, da 0,1M HCl ble tilsatt glassene, ble larvenes tarm dissekert ut, og radioaktiviteten bestemt ved scintillasjonstelling i fire ulike fraksjoner: tarmen, resten av larven, inkubasjonsvannet og CO2-fellene.

Resultater Ved dag 13 etter startfôring var ca 50% av den injiserte proteinmassen assimilert i larven (figur 1), og det var da ingen signifikant forskjell i assimilering mellom de to proteinene. En signifikant økning i assimilering av R16 ble registrert fra dag 13 til dag 20, og fra dag 27 til dag 41. En slik økende grad i assimilering med alder var ikke like tydelig for alfa-mini, der assimileringen var signifikant lavere enn for R16 fra dag 20.

Figur 1. Gjennomsnittlig (N=8-20) andel (%) R16 (16 kDa) og alfa-mini (42 kDa) tatt opp i kveitelarver (A: CPM i innkuberingsvann; B: CPM i larve; C: CPM i CO2; T: CPM i tarm) dag 13, 20, 27, 34 og 41 etter startfôring, etter en innkuberingstid på ca 22 timer. 18-24% av den assimilerte proteinmassen kunne lokaliseres til tarmen, dvs 11-14% av total mengde protein injisert (figur 2). Katabolisert protein (lokalisert til CO2-feller) holdt seg også relativt konstant gjennom forsøket. Andel (evt. nedbrutt) protein evakuert i inkubasjonsvannet avtok med økende alder.

149

20

20

18

819

18

40

45

50

55

60

65

70

75

80

13 20 27 34 41

Dager etter startfôring

(B+T

)/(B

+T+A

+C) +

/- 95

%C

.I. Alfa-miniR16

Ark 15

Alfa-mini

0

10

20

30

40

50

60

13 20 27 34 41

Dager etter startfôring

Ford

elin

g (%

) TarmLarve minus tarm

VannCO2

N=14 N=9 N=20N=20

R16

0

10

20

30

40

50

60

13 20 27 34 41

Dager etter startfôring

Ford

elin

g (%

) TarmLarve minus tarmVannCO2

N=18N=19N=8N=18

Figur 2. Gjennomsnittlig fordeling (%CPM) av injisert 14C-protein lokalisert til tarm, resterende larve, inkubasjonsvann og CO2-feller dag 13, 20, 27, 34 og 41 etter startfôring, etter en innkuberingstid på ca 22 timer. a) Alfa-mini er det injisert proteinet. b) R16 er det injisert proteinet. Diskusjon Fordi assimileringen for R16 var høyere enn for alfa-mini fra dag 20, kan det se ut til at hydrolysering av større proteiner, som alfa-mini, kan gi økt opptak. Konklusjoner ϕ Assimilering av R16 økte med alder ϕ Assimileringen var høyere for R16 enn for

alfa-mini fra dag 20 ϕ Større proteiner bør hydrolyseres for å

muliggjøre et høyere opptak Referanse Rønnestad, I., Rojas-García, C.R., Tonheim, S.K. & Conceição, L.E.C. 2001. In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae. Aquaculture 201: 161-175. Raae, A.J., S. Banuelos, J. Ylänne, T. Olausson, K.N. Goldie, T. Wendt, A. Hoenger & M. Saraste. Not jet published. Actin binding of a minispectrin.

Ark 16

Vitamin C behov hos kveiteyngel – Effekt av vitamin E

Kristin Hamre og Ingegjerd Opstad Behovet for vitamin C og eventuelle interaksjoner med vitamin E ble undersøkt i dette forsøket. Resultater fra vekst og dødelighet antyder et vitamin C behov på 30 mg kg-1 , noe som samsvarer med resultater fra laks. Nivå av vitamin C i hel fisk og lever understøtter dette resultatet. Det ble ikke påvist interaksjoner med vitamin E. Det er dermed usannsynlig at kveitelarver har et vitamin C behov på 600-1000 mg kg-1 , som er nivået funnet i copepoder. Introduksjon Det er vist at vitamin C behovet hos laks, med bruk av stabilt vitamin C (askorbinsyre monofosfat), er 30 mg kg-1. Videre er det vist interaksjoner mellom vitamin C og E i laks. I litteraturen ser det ut som om man antar at vitamin C behovet hos marine fiskelarver er høyt, fordi copepoder inneholder svært høye nivå av vitamin C (600-1000 mg kg-1). Det er vanskelig å gjøre ernæringsforsøk med larver som er avhengige av levende fôr. En måte å estimere behovet på er å gjøre forsøk med liten yngel og ekstrapolere til larvestadiet (NRC 1993). Konklusjonene fra slike forsøk bør likevel tolkes med forsiktighet fordi det ikke er sikkert at larver har de samme ernæringsbehovene som ferdig metamorfosert fisk. Materialer og metoder Fôringsforsøket ble gjennomført ved Austevoll Havbruksstasjon. Det ble brukt 50L kar med 50 fisk per kar. Temperaturen var 12,3 °C og oksygenmetningen 92-103%. Forsøket varte i 3 måneder. Kar der fisken fikk vitaminmangel ble avsluttet før forsøksslutt. Tabell 1 Forsøksoppsett Fôr nr. vitamin C

(mg/kg ts) Vitamin E (mg/kg ts)

1 0 0 2 15 0 3 30 0 4 60 0 5 0 25 6 15 25 7 30 25 8 60 25 9 0 50 10 15 50 11 30 50 12 60 50 13 0 100 14 15 100 15 30 100 16 60 100

0 mg/kg vitamin C

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Uker

Død

elig

het (

% p

er u

ke)

70

95

120

160

Vit.E mg/kg

15 mg/kg vitamin C

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Uker

Død

elig

het (

% p

er u

ke)

70

95

120

160

Vit.E mg/kg

30 mg/kg vitamin C

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Uker

Død

elig

het (

% p

er u

ke)

70

95

120

160

Vit.E mg/kg

60 mg/kg vitamin C

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Uker

Død

elig

het (

% p

er u

ke)

70

95

120

160

Vit.E mg/kg

Figur 1. Overlevelse hos kveiteyngel fôret med graderte mengder vitamin C og E.

Ark 16

Det ble laget 16 fôr med gradert tilsetning av vitamin C og E (Tabell 1). Fôret var varmekoagulert og basert på torskefilet og akkarkappe som proteinkilder og fiskeolje og soyalecitin som fettkilder. Det var tillsatt kun 5% karbohydrat. Fôranalyser viste at fôrene inneholdt 3.9% vann, 76% protein og 10% fett. På grunn av vitamin E innholdet i fôringrediensene ble vitamin E nivå i fôrene betydelig høyere enn det som var tilsatt: 70±5, 94±4, 115±5 og 162±2 mg kg-1. Hvert fôr ble gitt til fisk i ett kar, bortsett fra fôr 11 som ble gitt til fisk i tre parallelle kar (senterpunkt). Resultater Figur 1 viser at fisk som fikk 0 og 15 mg kg-1 vitamin C fikk økt dødelighet i uke 7, der den største dødeligheten ble registrert i fisk gitt 0 mg kg-1 vitamin C. I denne gruppen ser det også ut til at fisk med høy vitamin E hadde den største dødeligheten. Det var lav dødelighet hos fisk fôret med 30 og 60 mg kg-1 vitamin C. Veksten flatet av etter uke 7 hos fisk fôret med 0 og 15 mg kg-1 vitamin C (Figur 2). Vitamin E hadde ingen effekt på vekst. Uttak til analyse av fisk fôret med 0 og 15 mg kg-1 vitamin C skjedde hhv i uke 8 og 11, da disse karene ble avsluttet. Sluttuttaket var i uke 13. Vitamin E påvirket ikke opptak av vitamin C i fisken, så gruppene på hvert vitamin C nivå ble slått sammen. Nivå av vitamin C i fisk som hadde vitamin C mangel var 3±1 mg kg-1 hel fisk i begge grupper og 9±4 og 9±7 i lever. Fisk som fikk 30 og 60 mg kg-1 vitamin C hadde hhv. 4,3±0,5 og 6,3±0,5 mg kg-1 vitamin C i hel fisk og 13±3 og 22±2 i lever (Figur 3). Det var ikke mulig å skille eventuelle effekter av vitamin C på opptak av vitamin E i fisken fra det faktum at gruppene med vitamin C mangel ble prøvetatt før forsøksslutt. Vitamin E nivå i hel fisk og lever er derfor gitt kun for fisk gitt 30 og 60 mg kg-1 vitamin C. Det var en nesten lineær økning av vitamin E nivå i hel fisk og lever med økende vitamin E nivå i fôret (Figur 4).

Vekst

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0 2 4 6 8 10 12 14

Uker

Vekt

(g)

0

15

30

60

Vit C mg/kg

Figur 2. Vekst hos kveiteyngel fôret med graderte mengder vitamin C. Vitamin E hadde ingen effekt på vekst, og gruppene er derfor slått sammen.

Vitamin C i hel fisk

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 2 4 6 8 10 12 14

Uker

Vita

min

C (m

g/kg

våt

vekt

)

0

15

30

60

Vit.C i fôr

Vitamin C i lever

0

5

10

15

20

25

30

0 15 30 60

Vitamin C i fôr (mg/kg tørrvekt)Vi

tam

in C

i le

ver (

mg/

kg v

åtve

kt)

Figur 3. Vitamin C nivå (mg/kg våtvekt) i hel fisk og i lever ved sluttuttaket. Grupppe 0 og 15 ble tatt ut i henholdsvis uke 8 og 11. Konklusjoner

Vekst og dødelighet gir et vitamin C behov på 30 mg kg-1 fôr (tørrvekt). Dette sammenfaller med behovet hos lakseyngel.

Vitamin C mangel ser ut til å oppstå ved et nivå av vitamin C på 3 mg kg-1 i hel fisk og 9 mg kg-1 i lever.

Vitamin E nivå i fisken øker nesten lineært med vitamin E nivå i fôret

Det ble ikke påvist interaksjoner mellom vitamin C og E. Dette kan være et resultat av forsøksoppsett og prøvetaking og/eller at vitamin E nivå i fôrene ble høyere enn planlagt. Interaksjonene funnet i laks var tydeligst ved lave nivå av vitamin C og E.

Figur 4. Vitamin E nivå i hel fisk og lever ved sluttuttaket. En eventuell effekt av vitammin C på vitamin E nivå kunne ikke skilles fra forskjell i tidspunkt ved uttak. Bare gruupene som fikk 30 mg/kg vitamin C eller mer er inkludert.

Vi t a m i n E i f i sk e n

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Hel f i sk Lever

70

95

120

160

Vit .E mg/ kg