SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE …crzp.uniag.sk/Prace/2011/S/A76FFFFD56844C9E9CED1AEF8AA279DE.pdf · V Nitre 30.06.2011 ... ELISA method detect gliadin content below

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

OPTIMALIZÁCIA STANOVENIA PRÍTOMNOSTI

ŠPECIÁLNYCH SKUPÍN CELIAKÁLNE AKTÍVNYCH

BIELKOVÍN

2011 Peter Socha, Ing.

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

OPTIMALIZÁCIA STANOVENIA PRÍTOMNOSTI

ŠPECIÁLNYCH SKUPÍN CELIAKÁLNE AKTÍVNYCH

BIELKOVÍN

DIZERTAČNÁ PRÁCA

Ńtúdijný program: Technológia potravín

Ńtudijný odbor: 4170900 Technológia potravín

Ńkoliace pracovisko: Katedra biochémie a biotechnológie

Ńkoliteľ: doc. RNDr. Dana Urminská, CSc.

Nitra 2011 Ing. Peter SOCHA

Čestné vyhlásenie

Podpísaný Ing. Peter Socha vyhlasujem, ņe som záverečnú prácu na tému:

„Optimalizácia stanovenia prítomnosti ńpeciálnych skupín celiakálne aktívnych

bielkovín“ vypracoval samostatne s vyuņitím získaných teoretických poznatkov

a s pouņitím uvedenej literatúry.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre 30.06.2011 ...........................................

Poďakovanie

Dizertačná práca bola realizovaná na Katedre biochémie a biotechnológie,

Fakulty biotechnológie a potravinárstva, Slovenskej poľnohospodárskej univerzity

v Nitre. Časť výskumu bola realizovaná na Agriculture University in Krakow, Faculty

of Food Technology, Malopolska Centre of Food Monitoring and Certification.

Touto cestou by som sa chcel úprimne poćakovať vedúcej dizertačnej práce,

doc. RNDr. Dane Urminskej, CSc., za vedenie, podporu a cenné rady pri rieńení danej

problematiky, ako aj celého doktorandského ńtúdia.

Osobitné poćakovanie patrí aj Dr. Barbare Mickowskej z Agriculture University

in Krakow za odborné rady, vedenie pri realizácii experimentálnych prác a poskytnutie

laboratórnych priestorov a chemikálií.

V neposlednom rade ćakujem aj ostatným pracovníkom katedry za cenné

pripomienky, vńestrannú pomoc a podporu.

Abstrakt

Je vńeobecne známym faktom, ņe príjem pńeničných gliadínov a koreńpondujúcich

prolamínov raņe a jačmeňa je hlavnou príčinou pońkodenia tenkého čreva u ľudí

s celiakiou. Z tohto dôvodu sme v dizertačnej práci analyzovali ńirokú ńkálu rastlinného

materiálu (cereálie, pseudocereálie a strukoviny) so zameraním sa na chemické zloņenie

a imunologické vlastnosti prolamínového komplexu. Chemická kompozícia zrna

analyzovaných plodín bola determinovaná prostredníctvom stanovenia obsahu

celkového dusíka, hrubého proteínu a jednotlivých bielkovinových frakcií. Na

imunologickú charakteristiku prolamínového komplexu boli pouņité metódy ELISA

a Western blot. Pri jednotlivých druhoch bola zistená vysoká variabilita v obsahu

hrubého proteínu a bielkovinových frakcií. Vysoký obsah prolamínov bol stanovený

v zrne pńenice (najmä v pńenici ńpaldovej), jačmeňa, raņe a tritikale. V zrne ovsa

najväčńie zastúpenie mala frakcia glutelínov, kým prolamíny sa nachádzali v oveľa

menńom mnoņstve v porovnaní s ostatnými cereáliami. V zrne pseudocereálií, ryņe,

kukurice a strukovín predstavovali prolamíny minoritnú frakciu, pričom na druhej

strane, koncentrácia nutrične významných bielkovín – albumínov a globulínov bola

veľmi vysoká (hlavne v strukovinách). Na ELISA analýzu bol pouņitý komerčný kit

zaloņený na báze monoklonálnej protilátky a na Western blot analýzu sme pouņili

polyklonálnu protilátku proti pńeničnému gluténu. Reakcia s monoklonálnou protilátkou

R5, rovnako aj s polyklonálnou protilátkou, potvrdila prítomnosť vysokého obsahu

alergénnych prolamínov vo vńetkých odrodách pńenice (pńenice letnej, tvrdej

a ńpaldovej), jačmeňa, raņe a tritikale, čo znamená, ņe tieto plodiny nie sú vhodné pre

celiatikov. Obidve pouņité imunochemické analýzy detekovali prítomnosť celiakálne

aktívnych bielkovín aj v zrne ovsa. ELISA metódou bol stanovený obsah gliadínov pod

20 ppm (podľa Codex Alimentarius) vo vńetkých druhoch pseudocereálií (láskavec,

pohánka, quinoa, proso a mohár), v ryņi, kukurici a strukovinách (cícer a hrachor).

Imunologická reakcia s polyklonálnou protilátkou bola negatívna v ryņi,

pseudocereáliách (okrem prosa a mohára) a v strukovinách. Na základe nańich

výsledkov povaņujeme tieto plodiny za vhodné pre potreby bezlepkovej diéty.

Kľúčové slová: celiakia, prolamíny, cereálie, pseudocereálie, ELISA, Western blot

Abstract

It is well established that the ingestion of wheat gliadins and corresponding prolamins

from rye and barley causes the characteristic damage of small intestine in people with

celiac disease. Therefore, the authors of this thesis focused their attention on chemical

composition and immunological features of prolamin complex in diverse plant

materials. The collection of cereals, pseudocereals and legumes was analyzed. In this

collection we determined the content of total N-substances, the content of crude protein,

the composition of individual protein fractions and the immunological characteristics of

the prolamins using ELISA and Western blot methods. The analyzed crops differed by

the content of crude proteins and individual protein fractions. The proportion of

prolamins was high in wheat (particularly in spelt wheat), barley, rye and triticale

grains. The major protein fraction in oat grains was glutelins while content of prolamins

was lower as compared to others cereals. In examined pseudocereals, legumes, rice and

maize, the prolamin content was very low. On the other hand, they have a high

concentration of nutritionally valuable proteins – albumins and globulins (the highest

level was determined in legumes). ELISA analysis was carried out by commercial kit

with monoclonal antibody, and Western blot by polyclonal antibody against wheat

gluten. By reaction with monoclonal R5 antibody, we confirmed that all varieties of

wheat (including common, durum and spelt wheat), barley, rye and triticale are not

suitable for patients with celiac disease because of very high content of allergenic

prolamins. These results were also confirmed by reaction with polyclonal anti-gluten

wheat antibody. Both immunochemical analyses also detected celiac active proteins in

oat grains. ELISA method detect gliadin content below 20 ppm (according to Codex

Alimentarius) in all species of pseudocereals (amaranth, buckwheat, quinoa, millet and

foxtail millet), as well as in rice, maize and legumes (chickpea and chickling vetch).

Immunological reaction with polyclonal antibody was negative for rice, pseudocereals

(except millet and foxtail millet) and legumes. Based on our results, these species can

be considered as suitable for the gluten-free diet.

Key words: celiac disease, prolamins, cereals, pseudocereals, ELISA, Western blot

Obsah

Zoznam ilustrácií .........................................................................................................8

Zoznam tabuliek ..........................................................................................................9

Zoznam skratiek a značiek ........................................................................................ 11

Jedno- a troj- písmenový kód aminokyselín ............................................................. 13

Úvod ........................................................................................................................... 14

1 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí ..................................... 16

1.1 Obilniny a ich nutričný význam .......................................................................... 16

1.2 Charakteristika cereálnych bielkovín .................................................................. 17

1.2.1 Rozdelenie bielkovín ................................................................................. 18

1.2.2 Zásobné bielkoviny ................................................................................... 19

1.2.3 Glutén (lepok) ........................................................................................... 21

1.2.4 Celiakálne aktívne bielkoviny ................................................................... 23

1.3 Celiakálne ochorenie .......................................................................................... 25

1.3.1 História celiakie ........................................................................................ 26

1.3.2 Epidemiológia ........................................................................................... 26

1.3.3 Patogenéza ................................................................................................ 27

1.3.4 Klinický prejav a symptómy ochorenia...................................................... 27

1.3.5 Diagnostika ............................................................................................... 29

1.3.6 Liečba ....................................................................................................... 29

1.3.7 Alternatívne spôsoby liečby a výņivy ........................................................ 30

1.4 Charakteristika cereálií zapríčiňujúcich celiakálne ochorenie.............................. 31

1.4.1 Pńenica (Triticum) ..................................................................................... 32

1.4.2 Jačmeň (Hordeum) .................................................................................... 33

1.4.3 Raņ (Secale) .............................................................................................. 35

1.4.4 Tritikale (Triticosecale) ............................................................................. 36

1.4.5 Ovos (Avena) ............................................................................................ 36

1.5 Charakteristika niektorých druhov pseudocereálií ............................................... 38

1.5.1 Láskavec (Amaranthus) ............................................................................. 39

1.5.2 Pohánka (Fagopyrum) ............................................................................... 40

1.5.3 Proso (Panicum) ........................................................................................ 41

1.5.4 Quinoa (Chenopodium) ............................................................................. 43

1.6 Metódy detekcie celiakálne aktívnych bielkovín ................................................. 44

1.6.1 Separačné metódy – elektroforéza ............................................................. 44

1.6.2 Imunochemické metódy ............................................................................ 45

1.6.2.1 ELISA analýza ................................................................................... 45

1.6.2.2 Western blot ....................................................................................... 46

2 Ciele práce ............................................................................................................. 48

3 Metodika práce a metódy skúmania .................................................................... 49

3.1 Pouņité chemikálie a prístroje ............................................................................. 49

3.2 Pouņitý biologický materiál ................................................................................ 49

3.3 Pouņité metódy ................................................................................................... 51

3.3.1 Stanovenie obsahu dusíka a hrubého proteínu ............................................ 51

3.3.2 Metóda frakcionácie bielkovinového komplexu zrna obilnín ..................... 52

3.3.3 Stanovenie molekulových hmotností prolamínov metódou SDS-PAGE ..... 53

3.3.4 Elektrotransfer na PVDF membránu .......................................................... 56

3.3.5 Western blot .............................................................................................. 58

3.3.6 ELISA ....................................................................................................... 59

3.3.7 Matematicko-ńtatistické vyhodnotenie výsledkov ...................................... 61

4 Výsledky práce a diskusia..................................................................................... 62

4.1 Charakteristika bielkovinového komplexu analyzovaných cereálií, pseudocereálií

a strukovín .................................................................................................................. 62

4.2 Biochemická charakteristika zásobných bielkovín endospermu zrna

analyzovaných cereálií, pseudocereálií a strukovín ...................................................... 74

4.3 Detekcia celiakálne aktívnych bielkovín metódou ELISA .................................. 84

4.4 Detekcia celiakálne aktívnych bielkovín metódou Western blot .......................... 92

Záver ........................................................................................................................ 105

Návrh na využitie poznatkov pre ďalší rozvoj vedy a prax ................................... 108

Zoznam použitej literatúry ..................................................................................... 110

Zoznam publikovaných prác autora súvisiacich s riešenou problematikou ......... 130

Ohlasy na publikácie autora ................................................................................... 133

Prílohy...................................................................................................................... 134

8

Zoznam ilustrácií

Obr. 1 [Anatómia tenkého čreva pri celiakálnom ochorení] ..................................... 28

Obr. 2 [SDS-PAGE prolamínov pńenice letnej, tvrdej a ńpaldovej] ......................... 94

Obr. 3 [Western blot prolamínov pńenice letnej, tvrdej a ńpaldovej] ........................ 94

Obr. 4 [SDS-PAGE prolamínov ovsa, raņe, pńenice letnej a pńenice ńpaldovej]....... 95

Obr. 5 [Western blot prolamínov ovsa, raņe, pńenice letnej a pńenice ńpaldovej] ..... 95

Obr. 6 [SDS-PAGE prolamínov jačmeňa] ............................................................... 96

Obr. 7 [Western blot prolamínov jačmeňa].............................................................. 96

Obr. 8 [SDS-PAGE prolamínov ovsa, raņe, tritikale, pohánky, cícera a láskavca] ... 97

Obr. 9 [Western blot prolamínov ovsa, raņe, tritikale, pohánky, cícera a láskavca] .. 98

Obr. 10 [SDS-PAGE prolamínov prosa, cícera, hrachora, mohára, quinoi, ryņe

a kukurice] ................................................................................................. 100

Obr. 11 [Western blot prolamínov prosa, cícera, hrachora, mohára, quinoi, ryņe

a kukurice] ................................................................................................. 100

Obr. 12 [SDS-PAGE prolamínov pńeničných chlebov] ........................................... 102

Obr. 13 [Western blot prolamínov pńeničných chlebov] .......................................... 102

9

Zoznam tabuliek

Tab. 1 [Distribúcia bielkovín v jednotlivých obilninách (Alais, Linden, 1991;

Eliasson, Larsson, 1993; Belitz et al., 2009)] ................................................ 19

Tab. 2 [Zoznam analyzovaných odrôd jednotlivých druhov cereálií, pseudocereálií

a strukovín] .................................................................................................. 50

Tab. 3 [Zoznam analyzovaných odrôd jednotlivých druhov cereálií] ....................... 50

Tab. 4 [Prepočítavací koeficient jednotlivého biologického materiálu (Michalík,

2002)] .......................................................................................................... 52

Tab. 5 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna pńenice letnej (Triticum

aestivum L.), pńenice tvrdej (Triticum durum L.) a pńenice ńpaldovej

(Triticum spelta L.)] ..................................................................................... 64

Tab. 6 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna jačmeňa siateho (Hordeum

vulgare L.)] .................................................................................................. 66

Tab. 7 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna raņe siatej (Secale cereale

L.), tritikale (Triticosecale) a ovsa siateho (Avena sativa L.)] ....................... 67

Tab. 8 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu semena pohánky jedlej

(Fagopyrum esculentum Moench), láskavca (Amaranthus hypochondriacus

L.) a prosa siateho (Panicum miliaceum L.)] ................................................ 68

Tab. 9 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna ryņe siatej (Oryza sativa L.)

a kukurice siatej (Zea mays L.)] ................................................................... 69

Tab. 10 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu semena cícera baranieho (Cicer

arietinum L.), hrachora siateho (Lathyrus sativus L.) a sóje obyčajnej (Glycine

soja L.)] ....................................................................................................... 70

Tab. 11 [Kvantitatívne zastúpenie jednotlivých subfrakcií prolamínových bielkovín

stanovených SDS-PAGE v zrne pńenice letnej (Triticum aestivum L.), pńenice

tvrdej (Triticum durum L.) a pńenice ńpaldovej (Triticum spelta L.)] ............ 76


stanovených SDS-PAGE v zrne jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.)] ..... 78


stanovených SDS-PAGE v zrne tritikale (Triticosecale)] ............................. 78


stanovených SDS-PAGE v zrne raņe siatej (Secale cereale L.)] ................... 79


stanovených SDS-PAGE v zrne ovsa siateho (Avena sativa L.)]................... 80


stanovených SDS-PAGE v semenách pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum

Moench), mohára talianskeho (Setaria italica L.), quinoi (Chenopodium

10

quinoa), prosa siateho (Panicum miliaceum L.) a láskavca (Amaranthus

hypochondriacus L.)] ................................................................................... 81


stanovených SDS-PAGE v zrne ryņe siatej (Oryza sativa L.) a kukurice siatej

(Zea mays L.)].............................................................................................. 82


stanovených SDS-PAGE v semenách cícera baranieho (Cicer arietinum L.)

a hrachora siateho (Lathyrus sativus L.)] ...................................................... 82

Tab. 19 [Obsah celiakálne aktívnych bielkovín stanovených metódou ELISA v zrne

pńenice letnej (Triticum aestivum L.), pńenice tvrdej (Triticum durum L.)

a pńenice ńpaldovej (Triticum spelta L.)] ...................................................... 86


jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.)] ....................................................... 87


raņe siatej (Secale cereale L.), tritikale (Triticosecale) a ovsa siateho (Avena

sativa L.)] .................................................................................................... 88

Tab. 22 [Obsah celiakálne aktívnych bielkovín stanovených metódou ELISA

v semenách pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench), mohára

talianskeho (Setaria italica L.), quinoi (Chenopodium quinoa), prosa siateho

(Panicum miliaceum L.) a láskavca (Amaranthus hypochondriacus)] .......... 89


ryņe siatej (Oryza sativa L.), kukurice siatej (Zea mays L.) a v semenách

strukovín – cícera baranieho (Cicer arietinum L.) a hrachora siateho (Lathyrus

sativus L.)] .................................................................................................. 90

11

Zoznam skratiek a značiek

A-PAGE acid polyacrylamide gel electrophoresis – kyslá polyakrylamidová

gélová elektroforéza

AGA antigliadin antibodies – antigliadínové protilátky

Alb albumins – albumíny

AOAC Association of Official Analytical Chemists – Asociácia analytických

chemikov

APS ammonium persulfate – persulfát amónny

ARA antireticulin antibodies – antiretikulínové protilátky

BSA bovine serum albumin – hovädzí sérový albumín

CAPS 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid – kyselina 3-(cyklohexyl

amino)-1-propánsulfónová

Da daltons – daltony

DTT dithiothreitol – ditiotreitol

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay – enzýmová imunoadsorbentná

analýza

EmA endomysial antibodies – protilátky proti endomyziu (endomyziálne

protilátky)

ESPGAN European Society for Paediatric Gastroenterology and Nutrition –

Európska asociácia pre pediatrickú gastroenterológiu a výņivu

Glo globulins – globulíny

HLA human leukocyte antigens – ľudské leukocytárne antigény

HMW high molecular weight – vysokomolekulárne bielkoviny

HMW-GS high molecular weight-glutenin subunits – vysokomolekulárne

glutenínové podjednotky

HP hrubý proteín

(IFN)-γ interferon-γ – interferón-γ

IgA immunoglobulins A – imunoglobulíny A

IgE immunoglobulins E – imunoglobulíny E

IgG immunoglobulins G – imunoglobulíny G

KNK koeficient nutričnej kvality

LMW low molecular weight – nízkomolekulárne bielkoviny

12

LMW-GS low molecular weight-glutenin subunits – nízkomolekulárne

glutenínové podjednotky

LOD limit of detection – detekčný limit

MMW medium molecular weight – bielkoviny so strednou molekulovou

hmotnosťou

PAGE polyacrylamide gel electrophorsis – polyakrylamidová gélová

elektroforéza

PVDF polyvinylidene fluoride membrane – polyvinylidénfluoridová

membrána

RP-HPLC reversed-phase high-performance liquid chromatography –

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s reverznými fázami

SDS sodium dodecyl sulphate – dodecylsíran sodný

SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis –

polyakrylamidová gélová elektroforéza v prostredí dodecylsíranu

sodného

TBS Tris-buffered Saline – Trisový tlmivý roztok

TEMED (N, N, N´, N´- tetramethylethylenediamine) – N, N, N´, N´-

tetrametyletyléndiamín

Tricine N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine – N-[Tris(hydroxymetyl)metyl]-

glycín

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane – Tris-(hydroxymetyl)-aminometán

tTG tissue transglutaminase – tkanivová transglutamináza

13

Jedno- a troj- písmenový kód aminokyselín

A Ala alanín

B Asx kyselina asparágová / asparagín

C Cys cysteín

D Asp kyselina asparágová

E Glu kyselina glutámová

F Phe fenylalanín

G Gly glycín

H His histidín

I Ile izoleucín

K Lys lyzín

L Leu leucín

M Met metionín

N Asn asparagín

P Pro prolín

Q Gln glutamín

R Arg arginín

S Ser serín

T Thr treonín

U Sec selenocysteín

V Val valín

W Trp tryptofán

X Xaa neznáma, resp. „iná“ aminokyselina

Y Tyr tyrozín

Z Glx kyselina glutámová / glutamín

14

Úvod

Obilniny tvoria ekonomicky, agronomicky a spotrebiteľsky najdôleņitejńiu

skupinu plodín a zároveň sú najstarńími a najrozńírenejńími poľnohospodárskymi

plodinami v celej rastlinnej výrobe. Svojími nutričnými vlastnosťami zodpovedajú

poņiadavkám zdravej a racionálnej výņivy. Vhodne spracované a upravené obilniny sú

v celosvetovom meradle najvýznamnejńím zdrojom energie a súčasne poskytujú rad

biologicky dôleņitých látok, no zároveň sú aj zdrojom antinutričných látok, napríklad

alergénov.

Výskyt alergických ochorení zaznamenáva v súčasnosti stúpajúcu tendenciu,

pričom medzi veľmi významné alergické ochorenia zaraćujeme potravinové

intolerancie. Tieto intolerancie vyvolávajú v organizme nepriaznivú reakciu imunitného

systému po príjme určitej potraviny obsahujúcej alergén. Výskyt takýchto

potravinových intolerancií sa odhaduje na 5 % detskej populácie a u dospelých na 1 – 2

% populácie.

Významnou skupinou alergénov, nachádzajúcou sa v zrne cereálií, sú zásobné

bielkoviny nazývané prolamíny. Tie tvoria podstatnú časť z celkového obsahu bielkovín

zrna obilnín. Spolu s glutelínmi sa podieľajú významnou mierou na predikovaní

technologickej kvality zrna, predovńetkým pńenice. Zásobné bielkoviny pńenice sa

vyznačujú unikátnou schopnosťou vytvárať po navlhčení súvislú lepivú hmotu

označovanú ako lepok, čím poskytujú silné a kohézne cestá. Vyznačujú sa vńak nízkou

nutričnou hodnotou, a tým aj zníņenou stráviteľnosťou a tieņ nízkym zastúpením

esenciálnych aminokyselín. Pńeničné gliadíny sú po hydratovaní viac elastickejńie

a vplývajú predovńetkým na rozťaņnosť cesta, na druhej strane hydratované gluteníny

sú kohézne a ovplyvňujú pevnosť cesta. Gliadíny a gluteníny rovnakou mierou

ovplyvňujú aj technologické vlastnosti pečených produktov, najmä chleba.

Za spoluúčasti genetických a imunologických faktorov sa prolamíny podieľajú na

vzniku celiakálneho ochorenia. Celiakia je jednou z najrozńírenejńích foriem

potravinových intolerancií, vyskytujúca sa prevaņne v európskych krajinách. Ochorenie

je v súčasnosti oveľa rozńírenejńie ako sa predpokladalo, a jeho príčinou je intolerancia

na bielkoviny tvoriace lepok v zrne pńenice a tieņ na koreńpondujúce prolamíny v zrne

jačmeňa, raņe a ovsa u jedincov s určitou genetickou predispozíciou. Ako najaktívnejńia

sa javí frakcia pńeničných α-gliadínov s relatívnou molekulovou hmotnosťou okolo 30

15

kDa, v ktorej sa nachádza niekoľko peptidov obsahujúcich celiakálne aktívne epitopy

QQPFP, QQQFP, LQPFP a QLPFP.

Na detekciu týchto celiakálne aktívnych sekvencií v zrne cereálií existuje

mnoņstvo analytických metód, z ktorých sa v súčasnosti do popredia dostávajú

imunochemické metódy, ako je napríklad ELISA (enzýmová imunoadsorbentná

analýza) a imunobloting po SDS-PAGE. Detekcia je zaloņená na vyuņítí ńpecifických

protilátok, monoklonálnych a polyklonálnych, pričom monoklonálne protilátky sú oveľa

viac ńpecifickejńie. Jedinou komerčne dostupnou monoklonálnou protilátkou je R5

vyvinutá proti raņnému peptidu, ktorá sa pouņíva pri sendvičovej ELISA analýze, ktorá

je odporúčanou metódou podľa Codex Alimentarius, určená na detekciu celiakálne

aktívnych bielkovín v bezlepkových potravinách.

Striktná bezlepková diéta je jedinou efektívnou a kľúčovou terapiou pri tomto

celoņivotnom ochorení, pri ktorej musí pacient vylúčiť zo stravy vńetky spomínané

cereálie a produkty z nich. Táto strava vńak musí byť energeticky a biologicky

plnohodnotná, z toho dôvodu je dôleņité rozńirovať sortiment potravín a produktov

vhodných pre celiatikov.

Hlavnými plodinami vo výņive celiatikov sú ryņa, sója a kukurica. Jedným zo

zdrojov potravín pre celiatikov sú aj pseudocereálie, ktoré sú významným zdrojom

sacharidov a majú vyńńí obsah nutrične dôleņitých látok ako konvenčné obilniny,

naproti tomu sa vńak vyznačujú niņńími technologickými a senzorickými vlastnosťami.

16

1 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí

1.1 Obilniny a ich nutričný význam

Hoci sa v súčasnosti pestuje mnoņstvo rôznych druhov obilnín, pribliņne 70 %

celkovej produkcie z nich pripadá na tri hlavné druhy, kukuricu, pńenicu a ryņu

a zvyńnú časť predstavujú ćalńie obilniny, vrátane jačmeňa, ciroku, prosa, ovsa a raņe

(Shewry, Halford, 2002).

Obilniny sa pestujú v prvom rade pre zrno na konzum, ćalej pre výņivu zvierat,

pre priemyselné spracovanie a ako osivo. Prednosťou je moņnosť dlhodobého

uskladnenia a majú také chemické zloņenie, ktoré je vhodné pre výņivu ľudí, tak aj

zvierat (Gajdońová, Ńturdík, 2004).

Cereálne produkty sú základnými a najdôleņitejńími potravinami v humánnej

výņive. Z hľadiska svetovej populácie zabezpečuje zrno obilnín takmer 50 % svetovej

potreby kalórií, asi jednu tretinu svetovej potreby proteínov a 50 – 60 % potreby

vitamínov skupiny B. Navyńe sú produkty z obilnín zdrojom rôznych minerálií

a stopových prvkov (Pomeranz, 1988; Wrigley, 2004; Belitz et al., 2009).

Obilniny v potrave nie sú len dodávateľom hlavných ņivín a energie, ale tieņ

obohacujú stravu o nutrične a biologicky hodnotné látky a látky balastného charakteru,

ako je napr. vláknina, ktorá má priaznivý vplyv na niektoré fyziologické funkcie

tráviacej sústavy a pod. Z tohto pohľadu sú cereálie zloņkami potravín, ktoré sa

zaraćujú do skupiny označovanej ako funkčné potraviny, či potraviny pre ńpeciálne

zdravotné účely, vzhľadom ku zvýńenému obsahu účinných látok (flavonoidy,

glukanáty, fytáty, karotenoidy a pod.) (Moudrý et al., 2005).

Vńetky funkčné zloņky obilnín sa uplatňujú napríklad pri prevencii

kardiovaskulárnych ochorení, pri zniņovaní výskutu rôznych nádorov, pri zniņovaní

krvného tlaku a hladiny cholesterolu, pri spaľovaní tukov a pri prevencii rôznych

gastrointestinálnych ochorení. Obilniny sú taktieņ zdrojom fytoestrogénov a fenolových

kyselín s antioxidačnými účinkami. Technologické spracovanie obilnín vńak redukuje

mnoņstvo týchto nutrične a biologicky významných zloņiek (Ötles, Cagindi, 2006).

Je vńeobecne známe, ņe chemické zloņenie zrna obilnín je rôznorodé. Odlińnosti

nie sú len medzi druhmi, ale aj v rámci druhu. Zloņenie kolíńe v závislosti od odrody,

lokality pestovania, agroekologických a agrotechnických podmienok, vrátane výņivy

17

a hnojenia, doby zberu, dĺņky a kvality skladovania. Jednotlivé zloņky sú zastúpené

v rôznych mnoņstvách aj v závislosti od anatomickej časti zrna, v ktorej sa nachádzajú

(Muchová, Bojňanská, 2006).

Obilniny sú charakteristické relatívne nízkym obsahom bielkovín a vysokým

obsahom sacharidov. Aleurónová vrstva zrna obilnín je bohatá na bielkoviny, taktieņ

obsahuje lipidy, enzýmy a vitamíny. Bielkoviny aleurónovej vrstvy, z ktorých viac ako

polovicu tvoria vo vode rozpustné albumíny a globulíny, sa vyskytujú vo forme granúl.

Tieto bielkoviny nemajú ņiaden vplyv na pekárske vlastnosti zrna. Ńkrobnatý

endosperm, ktorý predstavuje 70 – 80 % obsahu zrna, je zdrojom múky. Nachádza sa vo

forme ńkrobových zŕn ukotvených v matrixe, ktorou sú práve bielkoviny. Časť týchto

bielkovín, nazývaných lepkové bielkoviny, je zodpovedná za pekárske vlastnosti

pńeničného zrna. Koncentrácia bielkovín, a niektorých ćalńích zloņiek (vitamínov

a minerálií) sa zmenńuje smerom od vonkajńích obalových vrstiev k vnútornému

endospermu. Zárodok, ktorý je oddelený od endospermu, je bohatý na enzýmy a lipidy

(Pomeranz, 1983; Belitz et al., 2009).

1.2 Charakteristika cereálnych bielkovín

V porovnaní so strukovinami, zrno obilnín obsahuje relatívne nízke koncentrácie

bielkovín, a to v priemere 10 – 12 % hmotnosti zrna. Aj napriek tomu, obilniny

poskytujú viac ako 200 militon bielkovín pre výņivu ľúdí a zvierat, čo je 3-krát viac ako

zrno strukovín, ktoré je bohatńie na bielkoviny (20 – 40 %). Z nutričného hľadiska

vplývajú cereálne bielkoviny tieņ na vyuņitie obilného zrna pre potravinárske účely,

predovńetkým čo sa týka pńenice, ktorá je dôleņitá pre výrobu chleba a ćalńích

pekárskych výrobkov (Shewry, Halford, 2002).

Na druhej strane, bielkoviny obilnín majú nevyváņený pomer esenciálnych

aminokyselín, predovńetkým lyzínu, metionínu, arginínu, treonínu a tryptofánu, pričom

nízke zastúpenie týchto aminokyselín je hlavne v prolamínovej frakcii zrna obilnín, čo

zniņuje biologickú hodnotu týchto bielkovín (Michalík et al., 2006; Matta et al., 2009).

Porovnávaním aminokyselinového zloņenia jednotlivých obilnín sa zistilo, ņe vo

väčńine z nich je limitujúcou aminokyselinou lyzín, s výnimkou kukurice a raņe,

v ktorých je tryptofán prvou limitujúcou aminokyselinou a lyzín aņ druhou. Kukurica,

cirok a proso sú taktieņ bohatńie na leucín. Vńetky obilniny obsahujú veľké mnoņstvo

18

kyseliny glutámovej, ktorá sa v natívnych bielkovinách vyskytuje vo forme amidu,

glutamínu (Southgate, 2000). Prolamínové bielkoviny obilnín zo skupiny Triticaea

(pńenica, raņ a jačmeň) majú pribliņne rovnaké aminokyselinové zloņenie, ktoré

predurčuje formovanie určitej ńtruktúry peptidov a preto sú tieto obilniny vņdy spoločne

dávané do súvislosti s celiakiou (Belitz et al., 2009).

1.2.1 Rozdelenie bielkovín

Najjednoduchńou klasifikáciou rastlinných bielkovín je ich rozdelenie do ńtyroch

skupín podľa T. B. Osborneho (1924), a aj napriek rôznym modifikáciám, sa takéto

rozdelenie vyuņíva do súčasnosti (Matta et al., 2009). Na základe Osborneho

klasifikácie sa bielkoviny endospermu zrna obilnín rozdeľujú podľa rozpustnosti

v rozličných rozpúńťadlách na albumíny (rozpustné vo vode), globulíny (rozpustné

v roztokoch solí), prolamíny (rozpustné v alkohole) a glutelíny (rozpustné v zriedených

roztokoch kyselín a zásad). V posledných rokoch sa vńak v terminológii častejńie

pouņíva delenie podľa funkčného významu bielkovinových zloņiek, na tzv.

cytoplazmatické a zásobné bielkoviny (Prugar, Hrańka, 1986; Černý, Ńańek, 1996;

Ciccocioppo, et al., 2005; Yalçin, 2010).

Hoci frakcionácia obilných bielkovín podľa Osborneho je základom v oblasti

cereálnej chémie, je potrebné zdôrazniť, ņe kaņdá z jednotlivých frakcií je zmesou

rôznych peptidov a polypeptidov a tieņ, ņe rozpustnosť týchto polypeptidov sa môņe

navzájom líńiť (Gianibelli et al., 2001).

Cytoplazmatické bielkoviny (albumíny a globulíny) sú uloņené najmä v klíčku

a v aleurónovej vrstve, a sú tvorené bielkovinami stavebnými, katalyticky

a enzymaticky aktívnymi. Zásobné bielkoviny (prolamíny a glutelíny) tvoria prevaņnú

časť zrna obilnín a predikujú technologickú, nutričnú, kŕmnu a biologickú kvalitu zrna

(Kučerová, 2004). Mnoņstvo cytoplazmatických a zásobných bielkovín sa medzi

jednotlivými druhmi obilnín líńi (Tabuľka 1). Vo väčńine obilnín tvoria cytoplazmatické

bielkoviny 25 – 30 % celkového obsahu bielkovín, iba v kukurici sú v menńom

zastúpení a v ovse sa nachádzajú v mnoņstve pribliņne 60 %. Naproti tomu, pńenica,

jačmeň a raņ obsahujú veľké mnoņstvá zásobných bielkovín (Southgate, 2000).

19

Tabuľka 1 [Distribúcia bielkovín v jednotlivých obilninách (Alais, Linden, 1991;

Eliasson, Larsson, 1993; Belitz et al., 2009)]

Obilnina Albumíny, % Globulíny, % Prolamíny, % Glutelíny, %

pšenica 9 – 15 6 – 7 32 – 45 40 – 46

raž 10 – 44 10 – 19 21 – 42 24 – 40

jačmeň 12 8 – 12 25 – 52 52 – 55

ovos 10 – 20 12 – 55 12 – 14 23 – 54

kukurica 4 – 8 3 – 4 47 – 55 38 – 45

ryža 5 – 11 10 2 – 7 77 – 78

Bielkoviny typu albumínov a globulínov sú dobre rozpustné vo fyziologických

roztokoch a ľahko hydrolyzovateľné proteolytickými enzýmami. Tieto vlastnosti

predurčujú ich dobrú stráviteľnosť. Bielkoviny typu prolamínov a glutelínov sú

lokalizované v ńkrobnatom endosperme. V zrne obilnín plnia zásobnú funkciu,

predstavujú zdroj dusíka pre klíčiace semeno. Vyznačujú sa vńak nízkou rozpustnosťou

a hydrolyzovateľnosťou, čo spôsobuje nedostatočnú stráviteľnosť (Michalík, 1994a).

1.2.2 Zásobné bielkoviny

Vńetky rastliny akumulujú väčńinu bielkovín v ńpecializovaných bunkách

a orgánoch, nachádzajúcich sa hlavne v semenách, hľuzách a cibuliach. Zásoba

bielkovín je nevyhnutná pri vývoji nového rastlinného jedinca v ńtádiu klíčenia

a prvotného rastu. Vćaka svojej funkcii sa takéto bielkoviny označujú ako zásobné

bielkoviny (Kraic, 2004).

V obilninách sú zásobné bielkoviny tvorené prolamínmi a glutelínmi. Prolamíny

jednotlivých plodín sa nazývajú nasledovne: v pńenici gliadíny, v jačmeni hordeíny,

v raņi sekalíny a v ovse aveníny. Glutelíny pńenice sa nazývajú gluteníny. Najvýraznejńí

rozdiel medzi gliadínmi a glutenínmi pńenice je v ich ńtruktúre. Gliadíny sú tvorené

jednoduchými polypeptidovými reťazcami, sú to monomérne bielkoviny. Gluteníny

vytvárajú viacreťazcové ńtruktúry z polypeptidov navzájom pospájaných disulfidickými

väzbami, sú to polymérne bielkoviny. Navyńe, vysoká molekulová hmotnosť glutenínov

je zodpovedná za ich čiastočnú nerozpustnosť (Gianibelli et al., 2001).

Gliadíny sú proteíny – polypeptidy s rôznym počtom aminokyselín (od 260 po

800), v ktorých aminokyselinovom zloņení aņ 35 % predstavuje iba jedna

20

aminokyselina – glutamín a aņ 15 % aminokyselina prolín. Odtiaľ je odvodený názov

pre prolamíny (prolín a glutamín) (Fuchs, 2005).

Vo vzťahu k celiakii sa prolamínové bielkoviny vyznačujú niekoľkými

unikátnymi imunogénnymi vlastnosťami. Vćaka vysokému obsahu prolínu sú

prolamíny relatívne rezistentné voči proteolýze v gastrointestinálnom trakte a vysoký

obsah glutamínu robí z prolamínov dobrý substrát pre črevný enzým tkanivovú

transglutaminázu (Catassi, Fasano, 2008; Gregorini et al., 2009).

Obsah a kvalita zásobných bielkovín pńeničného zrna sú hlavným faktorom,

ktorý ovplyvňuje technologickú kvalitu zrna pńenice. Gliadínové a glutenínové

bielkoviny sa vyznačujú dostatočnou genetickou, a jej zodpovedajúcou fenotypovou

premenlivosťou, vysokou expresivitou a heritabilitou, v dôsledku čoho ich moņno

vyuņiť pre účely predikcie technologickej kvality zrna pńenice (Gálová et al., 1998).

Gliadíny a gluteníny môņeme rozdeliť do dvoch skupín, a to na

vysokomolekulárne (HMW) a nízkomolekulárne (LMW) bielkoviny. Gliadíny

predstavujú pribliņne 50 % zásobných bielkovín, 10 % tvoria HMW glutenínové a 40 %

LMW glutenínové podjednotky. HMW skupina proteínov pozostáva v pńenici z HMW-

GS, v raņi z HMW sekalínov a v jačmeni z D-hordeínov. V závislosti od molekulovej

hmotnosti sa HMW-GS a HMW sekalíny ćalej môņu členiť na x-typ a y-typ.

Aminokyselinové zloņenie je charakterizované vysokým obsahom glutamínu, glycínu

a prolínu, ktoré spolu tvoria okolo 70 % celkových aminokyselinových zvyńkov. LMW

skupina môņe byť členená na monomérne proteíny zahŕňajúce α/β- a γ- gliadíny

(pńenica), γ-sekalíny (raņ), γ-hordeíny (jačmeň) a aveníny (ovos) a na agregované

proteíny zahŕňajúce LMW-GS (pńenica), γ-sekalíny (raņ) a B-hordeíny (jačmeň).

LMW-GS sú bohaté na sírne aminokyseliny (podobne ako α-, β- a γ- gliadíny) a tvoria

asi 80 % z celkového obsahu glutenínov (Gálová et al., 1998; Wieser, Koehler, 2008).

Okrem toho, existuje eńte MMW skupina bielkovín, do ktorej Shewry (2004) zaraćuje

ω-gliadíny pńenice, ω-sekalíny raņe a C-hordeíny jačmeňa. Sú charakteristické

neprítomnosťou cysteínových zvyńkov a tvoria pribliņne 10 – 20 % z celkového obsahu

jednotlivých bielkovinových frakcií.

Podľa Wiesera (2007) sú gliadíny klasifikované do ńtyroch skupín na základe

ich pohyblivosti v géli pri elektroforetickej separácii pri nízkom pH, a to na α-, β-, γ-

a ω-gliadíny, so zmenńujúcou sa mobilitou od α- k ω-gliadínom. Neskorńie analýzy

sekvencií aminokyselín poukázali na to, ņe elektroforetická separácia nemusí vņdy

21

odráņať vzťahy medzi bielkovinami, a preto α- a β-gliadíny patria do jednej skupiny

označovanej ako α/β-typ. Moderné metódy, ako je dvoj-rozmerná elektroforéza alebo

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s tzv. reverznými fázami (RP-HPLC)

umoņňujú separáciu gliadínovej frakcie na viac ako 100 komponentov. Na základe toho

môņu byť gliadíny rozdelené do ńtyroch odlińných typov: ω5-, ω1,2-, α/β- a γ-gliadíny.

Pre ω-gliadíny sú charakteristické vysoké obsahy glutamínu, prolínu a fenylalanínu; ω5-

gliadíny majú vyńńiu relatívnu molekulovú hmotnosť (≈ 50 000 Da) ako ω1,2-gliadíny

(≈ 40 000 Da); α/β- a γ-gliadíny majú molekulovú hmotnosť presahujúcu 28 000 –

35 000 Da a obsahujú repetitívnu N-terminálnu oblasť, reprezentujúcu viac ako

polovicu molekuly a nerepetitívnu C-terminálnu oblasť bohatú na cysteínové zvyńky.

Podobné delenie gliadínov uvádza aj Vaccino et al. (2009).

Aj glutenínové podjednotky môņu byť separované na základe rozdielnej

molekulovej hmotnosti a ich pohyblivosti pri elektroforetickej separácii na ńtyri rôzne

skupiny, a to skupina A (relatívna molekulová hmotnosť 95 000 – 140 000 Da), skupina

B (40 000 – 51 000 Da), skupina C (31 000 – 36 500 Da) a nakoniec skupina D (55 000

– 80 000 Da). Skupina A patrí medzi HMW-GS, kým skupiny B, C a D medzi LMW-

GS (Gianibelli et al., 2001; Figueroa et al., 2009).

1.2.3 Glutén (lepok)

Glutén predstavuje skupinu zásobných bielkovín pńenice (gliadíny a gluteníny),

ktorá po navlhčení má schopnosť vytvárať súvislú lepivú mrieņkovitú ńtruktúru. Tento

jav je dôleņitý z hľadiska prípravy kysnutého cesta a pekárskch produktov (Petr et al.,

2003). Z technologického pohľadu, termín glutén (lepok) obyčajne vyjadruje pńeničný

lepok. Na druhej strane, lepok je definovaný ako lepkavá, viskózna hmota, ktorá vzniká

odstránením ńkrobu z múky. Z tohto pohľadu môņeme hovoriť aj o kukuričnom gluténe,

hoci je úplne odlińný od pńeničného lepku. Pre ľudí trpiacich potravinovou

intoleranciou na cereálie, ńpeciálne pre celiatikov, lepok označuje aj koreńpondujúce

bielkoviny raņe, tritikale a jačmeňa a pravdepodobne aj bielkoviny ovsa (Batey, 2004).

Zo vńetkých múk získavaných z rôznych cereálií, iba pńeničná múka má

schopnosť vytvárať silné a kohézne cestá, ktoré zadrņiavajú plyny a poskytujú pekárske

produkty. Za túto unikátnu schopnosť pńenice sú zodpovedné pńeničné bielkoviny,

obzvláńť lepkové bielkoviny (van Bockstaele et al., 2008). Pńeničná múka, ktorá sa

22

získava z prevaņnej časti endospermu zrna pńenice, slúņi na výrobu rôznych produktov,

napr. chleba, cestovín a pod. Obsahuje okolo 80 % celkových bielkovín zrna, z ktorých

väčńinu predstavujú práve lepkové bielkoviny (Shewry, Halford, 2002). Kvalitu

pńeničnej múky, rovnako ako aj visko-elastické a ťaņné vlastnosti pńeničného cesta,

determinuje komplex glutenínov a gliadínov. Tieto rovnakou mierou ovplyvňujú aj

technologické vlastnosti pečených produktov, najmä chleba (Sciarini et al., 2010; Xie et

al., 2010).

Vývin cesta je zloņitý dynamický proces, pri ktorom dochádza kontinuálne

k zmenám jeho visko-elastických vlastností, na čo má vplyv aj samotné miesenie cesta.

Miesením cesta a rýchlosťou miesenia sa ovplyvňuje aj obsah bielkovín a koncentrácia

jednotlivých bielkovinových frakcií (Muchová, Ņitný, 2010). Dochádza k agregácii

proteínových reťazcov, ćalej k hydratácii ńkrobových zŕn a čiastočne neńkrobových

polysacharidov. Vytvárajú sa glykoproteíny a vzniká systém voda-ńkrob-lepok, ktorý je

čiastočne emulgovaný, napríklad monoacylglycerolmi a ich estermi, ktoré sa prirodzene

nachádzajú v múke, a tak v konečnom dôsledku dochádza k vytvoreniu kompaktnej

amorfnej ńtruktúry cesta (Muchová et. al., 2009).

Úloha pńeničných gliadínov a glutenínov z hľadiska reologických vlastností

cesta je odlińná. Hydratované gliadíny sú viac elastickejńie a menej kohézne ako

gluteníny a majú predovńetkým vplyv na viskozitu (rozťaņnosť) cesta. Hydratované

gluteníny sú kohézne, aj elastické a sú zodpovedné za pevnosť a elasticitu cesta

(Starovičová et al., 2003; Wieser, 2007).

Gliadínové frakcie bielkovín prispievajú k viskóznym a elastickým vlastnostiam

cesta vćaka ich nízkej relatívnej molekulovej hmotnosti (do 100 000 Da). Najväčńí

rozsah molekulových hmotností majú ω-gliadíny, ktoré sú zároveň chudobné na sírne

aminokyseliny, najmä cysteín. Z tohto dôvodu nie sú schopné sa kovalentne viazať

pomocou disulfidických väzieb. Hoci zvyńné gliadínové frakcie (α-, β- a γ-gliadíny)

obsahujú tiolové skupiny, vytvorené disulfidické mostíky sú prevaņne vnútroreťazcové

a preto sú gliadíny monomérnymi bielkovinymi. Táto vlastnosť ich odlińuje od

glutenínových polypeptidov, ktoré sú schopné vytvárať pomocou disulfidických väzieb

polyméry s molekulovou hmotnosťou presahujúcou 105 – 10

7 Da. Takéto neporuńené

disulfidické väzby v glutenínových polyméroch prispievajú k odolnosti cesta voči

nadmernej rozťaņnsti a zabezpečujú jeho pevnosť. Glutenínové molekuly musia byť vo

23

vyváņenom pomere s gliadínovými bielkovinami, čo sa následne odrazí na dobrej

kvalite cesta a dobrých pekárskych vlastnostiach (Bekes et al., 2004).

Pekársku kvalitu finálnych výrobkov do určitej miery ovplyvňuje prítomnosť

HMW glutenínových podjednotiek a rozdiely v kompozícii týchto podjednotiek. Avńak,

ich prítomnosť nevysvetľuje celkom jasne rozdiely v pekárskej kvalite medzi

jednotlivými odrodami pńenice. Z tohto hľadiska sú veľmi dôleņitými faktormi nielen

prítomnosť HMW-GS, ale aj LMW-GS, vzájomný pomer medzi nimi a pomer medzi

glutenínmi a gliadínmi (Li et al., 2006; Wang et al., 2006).

Glutén je komplex, ktorý neobsahuje len bielkoviny. Priliņne 75 % gluténu

tvoria bielkoviny, ćalej 8 % tvorí voda a zvyńok predstavujú ńkrob, lipidy a vláknina.

Mnoņstvo ńkrobu je rôzne. Intenzívnejńie premývanie cesta vodou spôsobuje straty

ńkrobu a vlákniny a naopak zvyńuje mnoņstvo bielkovín. Na obsah lipidov premývanie

nemá ņiadny vplyv. Väčńina lipidov z múky sa počas hydratácie spája s bielkovinami.

Lepkové bielkoviny sú hydrofóbne a lipidy sa viaņu práve na tieto hydrofóbne skupiny

proteínov. Obsah lipidov v lepku je primárne determinovaný ich obsahom v múke

(Batey, 2004).

Ľudia, ktorí trpia celiakálnym ochorením musia vylúčiť z potravy pńenicu

a výrobky z nej a nahradiť ich bezlepkovými produktami, ktoré majú niņńiu nutričnú

hodnotu a niņńie technologické a senzorické vlastnosti oproti konvenčným potravinám

(Waga et al., 2008). Bezlepkové produkty sú charakterizované hlavne nízkym obsahom

niektorých nutrične dôleņitých komponentov, ako sú bielkoviny (najmä zásobné),

minerálie a tieņ niektoré fyziologicky dôleņité látky, ako je napríklad vláknina

(Wronkowska et al., 2008).

1.2.4 Celiakálne aktívne bielkoviny

Z hľadiska celiakálneho ochorenia patrí frakcia pńeničných α-gliadínov medzi

najaktívnejńie frakcie prolamínových bielkovín, pretoņe obsahuje niekoľko peptidov

obsahujúcich celiakálne aktívne epitopy. Tieto epitopy α-gliadínov sú geneticky odlińné

(Vaccino et al., 2009; Xie et al., 2010).

Prvé výskumy uvádzali, ņe pri celiakálnom ochorení je aktívnou iba skupina α-

gliadínov. Neskorńie ńtúdie vńak potvrdili alergénne účinky aj β- a γ- gliadínov. Súčasné

24

práce popisujú aj celiakálnu aktivitu ω-gliadínov. Viacerí autori uvádzajú, ņe celiakálna

aktivita klesá od α-gliadínov k ω-gliadínom (Ensari et al., 1998; Stern et al., 2001).

Snaha o identifikáciu najmenńej ńtruktúrnej jednotky gliadínov zodpovednej za

exacerbáciu celiakie, viedla k enzymatickej degradácii gliadínov aņ na úroveň peptidov

a k príprave a následne testovaniu syntetických peptidov. Takto bola dokázaná toxicita

ńpecifických aminokyselinových sekvencií α-gliadínov (Michalík, 1994b). V súčasnosti

je veľmi spoľahlivou metódou pre stanovenie alergénnosti gliadínov ELISA, analýza

zaloņená na báze monoklonálnej protilátky R5, ktorá rozpoznáva potenciálne celiakálne

tetrapeptidy QQPFP, QQQFP, LQPFP a QLPFP vyskytujúce sa ako v α-gliadínoch, tak

aj v γ- a ω-gliadínoch (Kahlenberg et al., 2006; van Eckert et al., 2010).

Najviac tetrapeptidov (6 – 11) vyvolávajúcich celiakiu je moņné identifikovať

v α-gliadínoch pńenice letnej (Triticum aestivum L.). Vyskytujú sa najmä v N-koncovej

oblasti peptidového reťazca. V aminokyselinovej sekvencii hordeínov jačmeňa sú

hlavnými celiakálne aktívnymi tetrapeptidmi QPYP, QQPY a QQQP a v avenínoch

ovsa QPYP a QQQP (Dziuba et al., 2009).

Gliadínové bielkoviny sú známe tým, ņe vo svojej ńtruktúre obsahujú viacero

peptidov, ktoré sú schopné stimulovať T-bunky a aktivovať imunitnú reakciu.

Najznámejńí je 33-mérny imunodominantný gliadínový peptid, ktorý je po deaminácii

enzýmom tkanivová transglutamináza významným stimulátorom T-buniek (Catassi,

Fasano, 2008). Tento 33-mérny peptid (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYP

QPQPF) bol identifikovaný ako primárny iniciátor zápalového procesu sliznice tenkého

čreva u pacientov s celiakiou. Identifikácia gliadínových zvyńkov v polohách 57 – 89

poukazuje na to, ņe vysoko antigénne epitopy sú lokalizované predovńetkým v oblasti

bohatej na prolín. U pacientov s celiakiou sú rozpoznávané predovńetkým tri peptidy

z α-gliadínu bohaté na prolín, a to PFPQPQLPY, PQPQLPYPQ a PYPQPQLPY

(Mowat, 2003; Morón et al., 2008).

Z vedomostí o celiakálnych epitopoch plynie jeden dôleņitý poznatok, a to, ņe

celiakálne epitopy nie sú vôbec totoņné s epitopmi pri alergii na pńeničnú múku, čiņe pri

IgE väzbových mechanizmoch. IgE alergia na pńeničnú múku sa v zloņitosti

molekulárnej podstaty nedá porovnať s celiakiou. Túto alergiu môņe vyvolať prakticky

kaņdá pńeničná bielkovina, či uņ sú to albumíny, globulíny alebo prolamíny. V prípade

celiakie ide o protilátky epitopov IgG (a IgA) (Fuchs, 2005).

25

Najbeņnejńími sérologickými markermi pouņívanými pri screeningu

celiakálneho ochorenia sú sérové imunoglobulíny A (IgA) endomyziálnych protilátok

a IgA protilátok enzýmu tkanivová transglutamináza (Presutti et al., 2007). Tento

enzým bol identifikovaný v roku 1997 ako antigén vnútri endomyzia, čo je spojivové

tkanivo okolo hladkého svalstva (Hill, McMillan, 2006). Za určitých podmienok,

napríklad ak nie je dostupná ε-aminoskupina lyzínu alebo iné primárne aminoskupiny,

glutamín sa prostredníctvom tkanivovej transglutaminázy deaminuje na kyselinu

glutámovú pomocou reakcie s vodou. Biologická významnosť tejto reakcie môņe byť

stanovená iba v spojení s celiakiou. Okrem deaminácie, enzým tkanivová

transglutamináza katalyzuje vznik disulfidických mostíkov a formuje HMW komplexy.

Existencia tohto tTG/peptid komplexu poskytla vysvetlenie prečo sa protilátky proti

enzýmu tkanivová transglutamináza nachádzajú iba u pacientov s celiakiou (Wieser,

Koehler, 2008).

Okrem primárnej ńtruktúry sa výskumy gliadínov sústredili aj na sekundárnu

ńtruktúru. Hlavným typom celiakálne aktívnych bielkovín je reverzná β-závitnica, ktorá

zohráva potenciálnu úlohu v patogenéze celiakie (Cornell, Johnson, 2001). Terciárna

ńtruktúra bielkovín tvoriacich lepok nie je dôleņitá z hľadiska ich alergénneho efektu,

pretoņe rozkladom týchto bielkovín pomocou tráviacich enzýmov pepsínu a trypsínu

alebo následne pomocou pankreatínu, vznikajú peptidy s relatívnou molekulovou

hmotnosťou menńou ako 1 000 Da, ktoré sú stále toxické. Taktieņ rozklad

disulfidických väzieb oxidáciou alebo teplom počas procesov pečenia neeliminuje

alergénnosť gliadínov (Wieser, 2004).

1.3 Celiakálne ochorenie

Celiakálne ochorenie je jednou z najčastejńie sa vyskytujúcich potravinových

intolerancií v ekonomicky vyspelých krajinách a vzniká ako dôsledok príjmu lepku

v spojení s genetickou predispozíciou u detí a dospelých (Ciacci et al., 2002).

Celiakálne ochorenie je definované ako zápalové ochorenie horných častí

tenkého čreva (dvanástnika a lačníka) u geneticky predisponovaných jedincov,

vyvolané príjmom pńeničných, raņných, jačmenných a moņných ovsených produktov

(Wieser, Koehler, 2008). Dochádza k pońkodeniu sliznice tenkého čreva, ktoré je

výsledkom imunologickej reakcie na prijaté lepkové bielkoviny, pričom chronická

26

zápalová odpoveć je indukovaná priamo v primárnom mieste pońkodenia, čím sa

celiakia odlińuje od iných potravinových intolerancií (Murray, 1999).

Malá skupina pacientov s celiakálnou enteropatiou je rezistentná, imúnna voči

bezlepkovej diéte, a táto forma celiakie sa preto označuje aj ako refraktorická sprue

alebo neńpecifická sprue (Ryan, Kelleher, 2000).

1.3.1 História celiakie

Michalík a Bauerová (2001) uvádzajú, ņe celiakiu popísal uņ lekár Galenos (2

storočie p. n. l.), ktorý ochorenie pomenoval ako koiliakos, grécke slovo označujúce

ťaņkosti v bruńnej dutine.

V druhom storočí náńho letopočtu, grécky lekár známy ako Aretaeus

z Kappadócie popísal, čo je predpokladom rozvoja celiakálneho ochorenia. V tomto

spise sa zmienil o stave týkajúcom sa početných príznakov, vrátane bolestí brucha. Asi

o 1700 rokov neskôr, boli tieto spisy preloņené do angličtiny a grécke slovo koiliakos

bolo nahradené anglickým slovom „celiac“ (celiakia), ktoré sa pouņíva dodnes pre

pomenovanie tejto potravinovej intolerancie (Maher, 2008).

Aņ v roku 1888 S. Gee popísal klasické vlastnosti celiakálneho ochorenia,

pričom poznamenal: „ak pacienti sú schopní liečby, tak to musí byť prostredníctvom

diéty“. Extrémna diétna terapia, pri ktorej boli zo stravy úplne vylúčené chlieb a iné

obilné výrobky bola pouņívaná mnoho rokov (Wieser, 2004).

V roku 1953 W. K. Dicke zistil, ņe ńkodlivým agens je pńeničná múka, teda

frakcia bielkovín tvoriacich lepok, ktorá je súčasťou múky (Ciclitira, 2001).

1.3.2 Epidemiológia

Celiakálne ochorenie je chronickou enteropatiou, ktorej rozńírenie je

v súčasnosti rozsiahlejńie, ako sa pôvodne predpokladalo, a to so zvyńujúcim sa počtom

latentných foriem (Dewor, Ciclitira, 2005).

Za posledných päť dekád bolo uskutočnených mnoņstvo epidemiologických

ńtúdií, zameraných na stanovenie frekvencie výskytu celiakie, a to najmä v európskej

populácii. Pri týchto ńtúdiách sa zistilo, ņe výskyt ochorenia sa neustále zvyńuje

(Fasano, 2001).

27

Výskyt tohto ochorenia je celosvetový a postihuje ľudí vńetkých etnických

skupín, hoci častejńie sa vyskytuje u ľudí európskeho pôvodu, zahŕňajúc aj Severnú

Ameriku a Austráliu. Veľmi zriedka moņno ochorenie pozorovať u ľudí afro –

karibského pôvodu (Fraser, Ciclitira, 2001). Vo výskyte celiakálneho ochorenia sú

značné geografické rozdiely, pričom postupne stúpa vek pacientov s diagnostikovanou

celiakiou (Murray,1999).

1.3.3 Patogenéza

Mechanizmus, ktorý je zodpovedný za pońkodenie čriev pri celiakálnom

ochorení nie je stále presne známy (Chiarioni et al., 1997). Vo vńeobecnosti sa na

vzniku celiakie podieľa trojica faktorov: genetická predispozícia, environmentálne

faktory (glutén) a imunologické faktory. Celiakia môņe byť výsledkom evolučnej

kolízie medzi kultiváciou pńenice a ľudským imunitným systémom (Murray, 1999).

Náchylnosť na celiakiu sa vyskytuje u osôb, ktorí sú nositeľmi génov pre určité

ľudské leukocytárne antigény (HLA). Ak celiatickí pacienti konzumujú potravu

pripravenú z pńenice, jačmeňa alebo raņe, niektoré z ich HLA antigénov sa viaņu na

prolamínové bielkoviny, pričom imunitný systém odpovedá prostredníctvom tvorby

protilátok proti viacerým cieľovým antigénom (Maher, 2008).

Primárna imunitná odpoveć na bielkoviny tvoriace lepok ako antigény, je

zaloņená na pôsobení určitých peptidov, ktoré vznikajú rozkladom pomocou

proteolytických enzýmov v gastrointestinálnom trakte na črevnú sliznicu (Wieser,

2004).

1.3.4 Klinický prejav a symptómy ochorenia

Celiakálne ochorenie sa môņe vyskytnúť v akomkoľvek veku po zavedení

potravín obsahujúcich lepok do výņivy, pričom klinický prejav je variabilný, v rozsahu

od subklinických aņ po ťaņké klinické symptómy. Hoci choroba primárne pońkodzuje

tenké črevo, vyskytovať sa môņu klasické alebo neńpecifické gastrointestinálne

symptómy a extraintestinálne manifestácie. Gastrointestinálne príznaky (hnačka,

roztiahnutie ņalúdka a nedostatočný vzrast) sú beņné u dojčiat a malých detí, kým

28

u starńích vekových skupín má začiatok vývoja choroby neńpecifické príznaky (Hill,

McMillan, 2006).

V detskom veku je moņné pozorovať vývin ochorenia uņ v druhom roku ņivota,

ale hnačka sa môņe objaviť aj v období medzi 6. aņ 12. mesiacom, keć sa do výņivy

dieťaťa začínajú postupne pridávať produkty z cereálií. Dieťa prestáva prospievať,

pozorujú sa stolice 1 aņ 3-krát denne a dieťa má nápadne vyklenuté brucho (Závodský,

1996). Klinický prejav celiakálneho ochorenia je charakterizovaný absenciou

normálnych klkov tenkého čreva (Obrázok. 1), vyúsťujúc do vńeobecnej malabsorpcie

ņivín (Wieser, Koehler, 2008).

Typickým príznakom ochorenia u dospelých a adolescentných jedincov je

diarhea, čiņe hnačka a druhú skupinu príznakov reprezentuje celková telesná aj duńevná

únava, úbytok hmotnosti, opuchy jazyka a anémia (Ciclitira, 2001). Oslabená je

absorpčná funkcia čreva a pacienti môņu vykazovať okrem ņalúdočno-črevných

ťaņkostí s prevládajúcou malabsorpciou, aj poruchy negastrointestinálneho charakteru,

ako je osteoporóza a osteomalácia a ćalńie komplikácie (Dewor, Ciclitira, 2005).

Obrázok. 1 [Anatómia tenkého čreva pri celiakálnom ochorení]

Zdroj: www.health.harvard.edu

Spoločne s celiakiou sa môņe vyskytovať aj laktózová intolerancia. Ide o poruchu

funkcie črevných buniek, predovńetkým kefkovitého lemu, ktorá je spôsobená

nedostatkom enzýmu laktázy, ktorá rozkladá mliečny cukor. Ochorenie sa prejavuje

29

bolesťami brucha a dyspepsiou s vodnatými hnačkami. Podľa váņnosti ochorenia je

potrebné z diéty vylúčiť, buć iba čerstvé mlieko, alebo aj fermentované a iné mliečne

výrobky (Kohout, Pavlíčková, 1994).

Neliečená celiakia môņe viesť k chronickej chorobnosti a zvyńujúcej sa

úmrtnosti, čo do značnej miery spôsobuje rozvoj enteropatie spojenej s výskytom

nádorov, hlavne malígneho lymfómu čreva (Dewor, Ciclitira, 2005).

1.3.5 Diagnostika

Uņ v roku 1969 European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition

(ESPGAN) definovala diagnostické postupy pre celiakiu. Potrebné boli tri

endoskopické biopsie sliznice tenkého čreva a následné histologické vyńetrenia. Tieto,

pre pacienta veľmi zaťaņujúce zákroky boli postupne upravené (Luostarinen, 2003)

a v posledných rokoch sa podarilo čiastočne pochopiť nielen podstatu patogenézy

ochorenia, ale nájsť aj dostupné spôsoby vyńetrenia tejto choroby. Za týmto účelom sa

do značnej miery vyuņívajú screeningové metódy zaloņené na detekcii sérových

protilátok, ako sú protilátky proti gliadínom (AGA), ktoré v podstate môņu nahradiť

príliń nákladné, ale nie jednoznačné stanovenia endomyziálnych protilátok (EmA)

(Guandalini, Gupta, 2001). Pri neliečenej celiakii sú vylučované protilátky proti

gliadínom (AGA), retikulínu (ARA) a endomyziu (EmA). Odstránením lepku zo stravy

sa tieto protilátky prestávajú imunitnými bunkami produkovať (Ciclitira, 2001).

Kľúčovou metódou pre diagnostikovanie počiatočnej fázy celiakie vńak ostáva

biopsia časti sliznice tenkého čreva. Pońkodenie črevnej sliznice môņe mať niekedy

ohniskový základ, alebo môņe byť rozńírené do okolia, a histologické výsledky sú vtedy

neńpecifické a musia byť interpretované v súvislosti s klinickými a sérologickými

testami (Lowichik, Book, 2003).

1.3.6 Liečba

Jedinou efektívnou liečbou celiakálneho ochorenia je celoņivotná eliminačná

bezlepková diéta. Pacienti musia z potravy vylúčiť vńetky výrobky z obilnín, ktoré

obsahujú múku z pńenice (vrátane pńenice kamut, tvrdej a ńpaldovej), raņe, jačmeňa,

triticale a ovsa (Pruska-Kędzior et al., 2008). Naopak, vhodnými pre potreby

30

bezlepkovej diéty sú niektoré ćalńie plodiny, pričom najčastejńie vyuņívanými sú

kukurica, ryņa a sója (Zingone et al., 2010). Sandberg et al. (2003) poukazujú na to, ņe

hoci sa pri bezlepkovej diéte väčńinou vylučuje zo stravy aj ovos a ovsené výrobky,

viaceré novńie klinické, ako aj in vitro ńtúdie, poukazujú na dobrú toleranciu ovsa

pacientmi s celiakiou.

Podľa zrevidovaného ńtandardu Codex Alimentarius z roku 2008, v potravine,

ktorú chceme pouņiť v bezlepkovej diéte, musí byť maximálny obsah lepku 20 mg.kg-1

suńiny v potravinách „prirodzene bezlepkových“ a 100 mg.kg-1

suńiny v „potravinách

ńpeciálne upravených so zníņeným obsahom lepku“. Podľa tohto kódexu, bezlepkové

potraviny sú potraviny, ktoré neobsahujú pńenicu (vrátane pńenice tvrdej, ńpaldovej

a kamut), raņ, jačmeň, ovos, alebo ich kríņence, a ani ich zloņky (Codex Stan

118:1979).

V tejto súvislosti si treba uvedomiť, ņe bielkoviny tvoriace lepok sú prítomné

v ńirokom sortimente potravinárskych výrobkov a rôznych aditív (polievky, čokoláda,

cukrovinky, mleté korenie, pivo, výrobky z mäsa, liečivá a iné). V ojedinelých

prípadoch je nevyhnutné bezlepkovú diétu kombinovať s vylúčením mliečnych

výrobkov (Michalík, Bauerová, 2001).

Nedorieńenou otázkou zatiaľ ostáva, či je lepńie odporučiť pacientom absolútnu

bezlepkovú diétu alebo umoņniť príjem potravín s nízkym obsahom lepku. Dlhodobé

pozorovania totiņ ukázali, ņe väčńina postihnutých prijíma malé mnoņstvo lepku

a nedochádza u nich k chorobným príznakom, prípade len veľmi miernym (Keller et al.,

1993). Niektorí pacienti vńak reagujú uņ aj na celkom nepatrné mnoņstvá lepku

negatívne a preto sa predpokladá, ņe rôzni pacienti majú rôznu citlivosť na lepok

(Salková, 1998).

1.3.7 Alternatívne spôsoby liečby a výživy

Prísun doplnkových proteolytických enzýmov (prolyl-endopeptidáz) môņe

degradovať celiakálne aktívne epitopy a predísť imunitnej reakcii. Vhodnými sú

enzýmy z baktérií, húb a naklíčených obilnín (pńenica, raņ, jačmeň), problémom zatiaľ

ostáva tolerancia enzýmov voči kyslému pH v ņalúdku (Hartmann et al., 2006).

Moņným rieńením je aj modifikácia celiakálne toxických obilnín

prostredníctvom kríņenia alebo genetického inņinierstva, s cieľom vytvoriť celiakálne

31

bezpečné obilniny, napr. niektoré pńeničné kultivary nemajú alebo majú len malé

mnoņstvá celiakálne aktívnych epitopov (Wieser, Koehler, 2008).

Veľmi dôleņitá je identifikácia gliadínových sekvencií stimulujúcich T-bunky.

Ńľachtiteľské programy a/alebo transgénne technológie môņu viesť k tvorbe pńenice,

ktorej chýbajú biologicky aktívne peptidové sekvencie. Taktieņ môņu byť pouņité aj

bodové mutácie pńenice, ktoré vńak nesmú mať vplyv na pekárske vlastnosti, hoci

mnoņstvo a opakovanie sa týchto sekvecií v pńenici komplikuje takýto prístup (Esposito

et al., 2007).

Ćalńou terapeutickou stratégiou môņe byť inhibícia aktivity enzýmu črevnej

tkanivovej transglutaminázy. Tento enzým vńak má aj odlińnú biologickú úlohu

a lokálna inhibícia môņe mať neznáme nepriaznivé efekty (Hausch et al., 2003).

Vńetky riziká, výhody a cenové relácie alternatívnych spôsobov liečby musia

byť starostlivo zváņené a musí byť dôkladne definované, za akých podmienok môņu byť

takéto alternatívy aplikované (Kagnoff, 2007).

1.4 Charakteristika cereálií zapríčiňujúcich celiakálne ochorenie

Celiakia je celoņivotné ochorenie, liečba ktorého si vyņaduje stravovanie

systémom bezlepkovej diéty. To znamená absolútne vylúčenie potravín pripravených

z hlavných obilninových druhov, tzv. I. skupiny obilnín, ako je pńenica, raņ, jačmeň

a ovos. Naopak, obilniny II. skupiny, rastliny ako je kukurica a ryņa, teplomilné

a krátkodenné, majú takú skladbu bielkovín, ņe sú vhodné pre túto diétu (Moudrý et al.,

2005).

Ovos, raņ, jačmeň a pńenica sú zástupcami podčeľade Pooidae. Táto podčeľać

sa ćalej člení na podskupinu Triticeae, kde patrí pńenica, raņ a jačmeň a podskupinu

Avenae, kde patrí iba ovos. Toto členenie je zaloņené na ńtruktúre zásobných proteínov

zrna. Jedná sa o prolamínovú frakciu, ktorá v pńenici obsahuje gliadíny, v jačmeni

hordeíny, v raņi sekalíny, a v ovse aveníny, čo sú proteíny, ktoré majú určitú sekvenciu

homológnu s gliadínmi, preto sa v súčasnosti diskutuje o tom, ņe vo väčńích mnoņstvách

môņu byť aj aveníny celiakálne toxické (Garsed, Scott, 2007).

32

1.4.1 Pšenica (Triticum)

V nańich klimatických podmienkach je najzákladnejńou obilninou pre výņivu

obyvateľstva pńenica (Triticum L.) patriaca do čeľade Poaceae a do rodu Triticum

(Hrańka et al., 1989). V súčasnosti sú najviac pestovanými hlavne dva druhy, a to

pńenica letná (Triticum aestivum L. subsp. aestivum) a pńenica tvrdá (Triticum turgidum

L. subsp. durum). Vo významnej miere sa eńte pestuje pńenica ńpaldová (Triticum

aestivum L. subsp. spelta) (Graybosch, 2004).

Pńenica letná (T. aestivum L.) sa pouņíva prevaņne v pekárstve na výrobu chleba

a rôzneho pečiva, pńenica tvrdá (T. durum L.) má vyuņitie predovńetkým na výrobu

cestovín a pńenica ńpaldová (T. spelta L.) sa vyuņíva najmä v alternatívnom

poľnohospodárstve pre ńpeciálne výrobky (Kučerová 2004).

Z chemického hľadiska pozostáva pńeničné zrno z troch hlavných komponentov:

ńkrob, bielkoviny a vláknina (polysacharidy bunkovej steny), pričom bielkoviny tvoria

okolo 10 – 15 % hmotnosti. Na rozdiely v chemickom zloņení zrna majú vplyv

predovńetkým genetika a výņiva, pričom obsah bielkovín priamo súvisí s dostupnosťou

dusíkatej výņivy počas pestovania (Tatham, Shewry, 2008). Chemické zloņenie

pńeničného zrna je podľa viacerých autorov (Ńpaldon et al., 1986; Wrigley, 2004; Belitz

et al., 2009) nasledovné: 9 – 16 % bielkovín, 59 – 64 % sacharidov, 2 – 3 % lipidov, 2 –

3 % vlákniny (niektorí autori uvádzajú dokonca aņ 13 %) a 1 – 2 % minerálnych látok.

Hlavnou frakciou bielkovín zrna pńenice sú gliadíny a gluteníny (prolamíny

a glutelíny), čiņe zásobné bielkoviny, ktoré sa nachádzajú v mnoņstve viac ako 80 %

z celkového obsahu bielkovín a sú homológne podobné so zásobnými bielkovinami

jačmeňa, raņe a tritikale. Obsah albumínov a globulínov je oveľa niņńí, pribliņne 10 – 18

% (Gąsiorowski, 2005). Podobný obsah jednotlivých frakcií uvádzajú aj Bekes et al.

(2004) alebo van den Broeck et al. (2010).

Pńenica je unikátna spomedzi vńetkých jedlých obilnín, pretoņe ako jediná

obsahuje v zrne proteínový komplex nazývaný lepok (glutén), ktorý je zodpovedný za

formovanie cesta s určitými reologickými vlastnosťami, ktoré sú ņiaduce pre produkciu

kysnutého chleba (Bekes et al., 2004). Tento bielkovinový komplex zrna pńenice

predstavuje zloņitý heterogénny systém, ktorého bielkoviny majú rôzne vlastnosti

a ńpecificky ovplyvňujú technológiu spracovania a kvalitu finálnych produktov.

Pozostávajú z viacerých frakcií, resp. subfrakcií s charakteristickými vlastnosťami

33

a aminokyselinovým zloņením. Zásobné bielkoviny tvorené gliadínmi a glutenínmi sú

z nutričného hľadiska neplnohodnotné, majú vńak významný vplyv na technologickú

kvalitu pńenice (Bojňanská, Urminská, 2010).

Lipidy v pńeničnom zrne zohrávajú významnú úlohu z hľadiska ich vplyvu na

pekársku kvalitu hotových výrobkov. Základnú ńtruktúru pńeničného cesta tvoria

bielkoviny lepku a táto ńtruktúra môņe byť spevnená prostredníctvom väzby

s polárnymi lipidmi, najmä glykolipidmi obsahujúcimi galaktózu (Lásztity, Abonyi,

2009).

Pńenica tvrdá (Triticum durum L.) má v porovnaní s pńenicou letnou (Triticum

aestivum L.) zrno sklovitejńie, tvrdńie a väčńie, so ņltkastým nádychom. Mletím takejto

pńenice získavame hrubńiu múku označovanú ako „semolina“, ktorá je vhodná pre

výrobu cestovín (Wrigley, 2004).

Ćalńím druhom je pńenica ńpaldová (Triticum spelta L.). Chemickým zloņením

zrna je pńenica ńpaldová podobná pńenici letnej, vyznačuje sa vńak vyńńím obsahom

nutrične významných látok. Pńenica ńpaldová vćaka vyńńiemu podielu aleurónovej

vrstvy obsahuje viac bielkovín (16 – 17 %) ako zrno pńenice letnej. Napriek tomu, ņe

pńenica ńpaldová obsahuje vyńńie koncentrácie esenciálnych aminokyselín,

v aminokyselinovom zloņení konzervatívnych sekvencií, typických pre pńenice, nie sú

výrazné rozdiely medzi týmito dvoma pńenicami, čo znamená, ņe produkty z týchto

pńeníc nie sú vhodné pre ľudí s celiakiou (Bojňanská, Frančáková, 2002; Kohajdová,

Karovičová, 2008). Múka získaná zo zŕn pńenice ńpaldovej má unikátnu chuť, obsahuje

vitamíny a má vyńńiu výņivovú hodnotu v porovnaní s pńenicou letnou. Taktieņ

produkty z pńenice ńpaldovej sú lepńie stráviteľnejńie pre ľudský organizmus

(Brezhneva et al., 2010).

1.4.2 Jačmeň (Hordeum)

Jačmeň siaty (Hordeum vulgare L.) je jednou z najstarńie domestikovaných

plodín. Patrí do čeľade Poaceae a do rodu Hordeum, ktorý zahŕňa 31 druhov. Väčńina

pestovaných jačmeňov je plevnatá. Pestujú sa dva hlavné typy plevnatého jačmeňa, a to

dvojradový a ńesťradový, v závislosti od usporiadania zŕn v klase (Prugar, Hrańka,

1989; Kling et al., 2004). Na rozdiel od pńenice, v rode Hordeum sa nachádza iba jeden

34

domestikovaný diploidný druh (Hordeum vulgare L.) a jeho divoko rastúci predok

Hordeum spontaneum (Morrison, 2004).

Zrno jarného jačmeňa je surovinou na výrobu jačmenných krúp, kávovej

náhradky, sladových a farmaceutických výťaņkov. Predovńetkým je to vńak surovina na

výrobu sladu a piva (Ńpaldon et al., 1986). V potravinárstve sa najviac konzumujú

jačmenné krúpy, ale vyuņíva sa aj jačmenná múka, ktorá môņe byť zapracovaná do

pńeničných produktov, vrátane chleba (Gavurníková et al., 2010).

Obsah bielkovín je vńeobecne uznávaný ako najdôleņitejńí ukazovateľ

spracovateľskej hodnoty sladovníckeho jačmeňa, ale aj nutričnej hodnoty jačmeňa

určeného na kŕmenie. Môņe kolísať vo veľmi ńirokom rozpätí, od 7 aņ do 18 % v suńine.

Vo väčńine krajín sveta, s výnimkou Severnej Ameriky, obsah bielkovín v zrne

sladovníckeho jačmeňa musí byť niņńí ako 11,5 %. V Severnej Amerike je akceptované

mnoņstvo väčńie ako 13,5 %. V jačmeni určenom na kŕmne účely a pre ľudskú výņivu

neexistujú ņiadne limity z hľadiska obsahu bielkovín. Aj v jačmeni, podobne ako

v pńenici, sú bielkoviny heterogénnou zmesou cytoplazmatických (albumíny

a globulíny) a zásobných (prolamíny a glutelíny) zloņiek (Prugar, Hrańka, 1989;

Horsley, Hochhalter, 2004).

Prolamínová frakcia bielkovín sa v jačmeni nazýva hordeíny a tvoria okolo 50 %

celkového obsahu bielkovín. Vyznačujú sa niņńou nutričnou hodnotou, v dôsledku

nízkeho obsahu lyzínu a vysokého obsahu glutamínu a prolínu (Matta et al., 2009).

Obsah ńkrobu v jačmennom zrne varíruje v závislosti od odrody, vńeobecne

ńkrob tvorí okolo 55 %. Jačmenný ńkrob pozostáva zo 75 % amylopektínu a 25 %

amylózy. V porovnaní s ostatnými cereáliami je obsah lipidov v zrne jačmeňa pomerne

nízky. Pribliņne 25 % lipidov je uloņených v embryu a 75 % v endosperme zrna (Kling

et al., 2004).

Jačmeň je známy aj svojím vysokým obsahom vlákniny (10 – 20 %) a β-

glukánov, ktorých konzumácia má zdraviu prospeńné účinky, pretoņe sa podieľajú na

zniņovaní krvného cholesterolu, glykemického indexu a redukujú riziko vzniku

rakoviny hrubého čreva. Jačmeň je tieņ výborným zdrojom vitamínov skupiny B, najmä

tyamínu, pyridoxínu, kyseliny pantoténovej, niacínu, biotínu a folacínu. Minerálne látky

sa nachádzajú v jačmennom zrne v koncentrácii asi 2 – 4 %. Najviac zastúpené sú P,

K a Ca, menej Cl, Mg, S a Na (Izydorczyk, Dexter, 2004).

35

1.4.3 Raž (Secale)

Raņ siata (Secale cereale L.) je prevaņne európskou obilninou, ktorá sa pestuje

najmä v Rusku, Bielorusku, Poľsku, Nemecku a na Ukrajine, s podielom na svetovej

produkcii okolo 75 %. Vyznačuje sa vynikajúcou prezimovacou schopnosťou a vyńńou

odolnosťou voči vysychaniu a zasoleniu pôdy, spomedzi vńetkých ostatných obilnín

(Geiger, Miedaner, 2009).

Raņ sa spolu s pńenicou pouņíva na výrobu pńenično-raņného chleba alebo

samostatne na výrobu raņného chleba, ktorý zostáva dlho vláčny, je aromatickejńí

a chutnejńí ako pńeničný chlieb. Tieņ sa vyuņíva na výrobu sladovej kávovej náhradky

(Ńpaldon et al., 1982; Gajdońová, Ńturdík, 2004).

Raņ je dôleņitá aj pre produkciu mieńaniek pre hospodárske zvieratá a ako

surovina na destiláciu raņnej whisky. Raņná slama sa pouņíva ako krmivo alebo

podstielka pre hospodárske zvieratá a tieņ ako stavebný materiál (Bushuk, 2004).

Obsah bielkovín v zrne raņe sa pohybuje v ńirokom rozmädzí, od 7 do 12 %.

Z tohto mnoņstva pripadá 15 – 35 % na albumíny, čo je asi 3-krát viac ako v pńeničnom

zrne, 15 – 30 % na globulíny a 20 – 45 % na prolamíny. Zvyńok tvoria ťaņko rozpustné

glutelíny a komplexy iných bielkovín (Gąsiorowski, 1994). Kećņe raņné bielkoviny

pozostávajú z menńieho podielu prolamínov, väčńinou sa pri pečení chleba mieńa raņná

múka s pńeničnou, čím sa dosiahne produkcia bochníka s postačujúcim objemom

a vyhovujúcou ńtruktúrou striedky. Raņné chleby sa častejńie pripravujú vyuņitím

procesov mliečnej fermentácie, pričom chlieb má pomerne kompaktnejńiu ńtruktúru

striedky (Southgate, 2000).

Veľmi dôleņitý je obsah vitamínov skupiny B (tiamín, riboflavín, niacín

a pyridoxín) a niektorých biogénnych minerálnych látok (najmä K, Mg, Zn, Mn a F).

Múka obsahuje asi tretinu týchto látok, zvyńok ostáva v otrubách (Ńpaldon et al., 1986;

Gajdońová, Ńturdík, 2004). Raņné zrno obsahuje oveľa viac hemicelulóz (pentózanov)

ako pńenica, a to 6 – 9 % v porovnaní s 2 % v pńenici (Bushuk, 2004).

Raņ má oproti pńenici niekoľko výhod súvisiacich s ľudskou výņivou. Je to

napríklad vyńńí obsah lyzínu, ktorý nie je prvou limitujúcou aminokyselinou ako je

tomu u ostatných cereálií, na druhej strane limitujúcou aminokyselinou raņných

bielkovín je tryptofán (Bushuk, 2004).

36

1.4.4 Tritikale (Triticosecale)

Ńľachtiteľom sa po viac neņ sto rokoch podarilo získať nový obilný druh,

zámerne vytvorený človekom, ktorý sa neobyčajne rýchlo rozńíril. Doteraz

najpouņívanejńím názvom je Triticale, zavedené v roku 1926 T. Schermakom a rodové

označenie je Triticosecale (Petr et al., 1997).

Tritikale je medzidruhovým kríņencom pńenice („matka“) a raņe („otec“). Od

obidvoch druhov získal tie najlepńie kvalitatívne charakteristiky, konkrétne z pńenice

chlebopekársku kvalitu na výrobu rôznych cestovín, sladkého pečiva a niektorých

druhov chlebov a z raņe odolnosť voči rôznych chorobám a suchu, otuņilosť

a adaptabilitu na zasolené pôdy (National Research Council, 2002).

Zrno tritikale je tvrdé, sklovité s vysokým obsahom bielkovín a vysokou

enzymatickou aktivitou. U nás sa pouņíva na kŕmne účely, v zahraničí v zmesi

s pńeničnou múkou v pekárstve alebo pri výrobe trvanlivého pečiva (Dodok, 1989).

Obsah bielkovín v zrne tritikale je spravidla vyńńí, v rozmedzí 12 – 22 % ako

v zrne pńenice a tieto bielkoviny majú vyńńí podiel lyzínu ako raņ a pńenica. Pre

pouņitie v pekárenskom priemysle je rozhodujúca kvalita lepku. Tá je niņńia ako u múk

pńeničných a raņných (Varga et al., 2000).

Raņná zloņka v zrnách tritikale je príčinou horńích reologických vlastností

cesta, niņńej celkovej sily lepku a zvýńenej viskozity cesta, čo sa prejavuje zníņením

chlebopekárskej kvality (Makarska et al., 2008). Múka z tritikale poskytuje menńiu

výťaņnosť lepku a je veľmi náročné upiecť chlieb z takejto múky. Z tohto dôvodu sa

väčńinou mieńa s pńeničnou múkou v pomere 50 : 50. Po prídavku pńeničnej alebo

raņnej múky, sa pouņíva na prípravu rôzneho pečiva a chleba (Furman, 2004).

1.4.5 Ovos (Avena)

Rod ovos (Avena) zahŕňa mnoho druhov: Avena abyssinica, Avena byzantina,

Avena fatua, Avena sativa, Avena strigosa a mnoho ćalńích. Na viac ako 75 %

oblastiach vo svete sa pestujú odrody ovsa siateho (Avena sativa L.), zvyńné časti sú

pokryté ovsom Avena byzantina a iba malý podiel zaberá Avena strigosa a ostatné

druhy (Capouchová et al., 2004).

37

V súčasnej dobe je ovos z hľadiska svetovej produkcie na ńiestom mieste

spomedzi ostatných obilnín, a to po kukurici, ryņi, pńenici, jačmeni a ciroku. Jeho

produkcia sa vyrovná produkcii prosa a prevyńuje raņ a tritikale (Zwer, 2004).

Hospodársky význam ovsa spočíva vo vysokej energetickej a nutričnej hodnote,

ako je najmä vysoká stráviteľnosť, priaznivé dietetické vlastnosti a vysoký obsah

biologicky hodnotných bielkovín a lipidov v porovnaní s ostatnými obilninami,

priaznivé zloņenie sacharidov a vysoký obsah ľahko rozpustnej vlákniny, vitamínov

(zvláńť B a E) a minerálnych látok (Gajdońová, Ńturdík, 2004; Kučerová, 2004).

Z chemického zloņenia zrna ovsa je významný obsah bielkovín (11,5 %,

ojedinele aj viac ako 18 %) a vysoký obsah tuku (5 aņ 7 %), čo je 3-krát viac ako

v pńenici, raņi alebo jačmeni (Ńpaldon et al., 1986). Bielkoviny sú po ńkrobe

majoritnými zloņkami zrna ovsa. Ich obsah je odlińný v rôznych častiach, obalové

vrstvy zrna obsahujú 24 – 32 %, emryo 25 – 40 % a ńkrobnatý endosperm asi 9 – 17 %

bielkovín, pre ktoré je typický vysoký podiel esenciálnych aminokyselín, najmä lyzínu

(priemerne 4,2 %) (Asp et al., 1992). Ovos obsahuje vo svojom zrne taktieņ vysokú

koncentráciu lipidov v porovnaní s inými konvenčnými obilninami. Z nutričného

hľadiska sú významné predovńetkým obsahom nenasýtených mastných kyselín, najmä

esenciálnej kyseliny linolénovej (Demirbas, 2005).

Významný je aj obsah sacharidov, pretoņe niektoré z nich, prevaņne rozpustné

polysacharidy, sa svojími vlastnosťami podieľajú na zniņovaní krvného cholesterolu

a napomáhajú tak prevencii srdcovo-cievnych ochorení. Jedným z hlavných zdrojov

týchto polysacharidov sú β-glukány, ktoré sa nachádzajú aj v jačmeni. Okrem toho sa

prejavuje ich prospeńný účinok aj pri normalizácii hladiny glukózy v krvi a pri zníņení

rizika rakoviny čreva (Pomeroy et al., 2001; Zwer, 2004).

V poslednej dobe niekoľko vedeckých prác poukázalo na to, ņe ovos môņe byť

bezpečnou potravinou pre celiatikov a môņe byť zahrnutý do bezlepkovej diéty.

Aveníny ovsa majú niņńí obsah prolínových zvyńkov ako gliadíny, sekalíny a hordeíny,

čiņe obsahujú menej, alebo neobsahujú vôbec alergénne aminokyselinové sekvencie,

a v porovnaní s ostatnými obilninami sú aveníny v ovse v oveľa niņńom zastúpení

z celkového obsahu bielkovín (okolo 15 %) (Silano et al., 2007). Petr et al. (2003)

uvádzajú, ņe ovos má oveľa niņńí obsah prolamínovej frakcie ako pńenica, raņ alebo

jačmeň. Obsahuje pribliņne 10 – 15 % prolamínov z celkového obsahu bielkovín, zatiaľ

čo v pńenici tvoria 40 – 50 %, v raņi 30 – 50 % a v jačmeni 35 – 45 %.

38

Komplexnejńie ńtúdie zahŕňajú rozsiahlu skupinu pacientov s celiakiou, ktorí

konzumovali čistý ovos. Janatuinen et al. (1995 a 2002) uvádzajú, ņe ovos bol veľmi

dobre tolerovaný, nebol príčinou histologických zmien v tenkom čreve a neindukoval

imunitnú reakciu. Naproti tomu, Lundin et al. (2003) poukázali na zistenie, ņe u malého

počtu pacientov s celiakiou bola pozorovaná čiastočná atrofia klkov a zvýńená hladina

interferónu-γ. Arentz-Hansen et al. (2004) zistili, ņe niektorí celiatickí pacienti mali

v krvi prítomné T-bunky reaktívne voči avenínom (Wieser, Koehler, 2008).

1.5 Charakteristika niektorých druhov pseudocereálií

Zvýńený výskyt celiakálneho ochorenia vedie k zvýńeniu poņiadaviek na

bezlepkové produkty, ktoré neobsahujú pńenicu, raņ, jačmeň alebo ich zloņky. Väčńina

dneńných cereálnych výrobkov, ako je napríklad chlieb alebo cestoviny, sú zaloņené na

báze pńenice alebo raņe a preto je potrebné venovať zvýńenú pozornosť iným

konvenčným bezlepkovým cereáliam (Schoenlechner et al., 2010).

Pseudocereálie, vrátane termofilných, prevaņne krátkodenných rastlín, ako sú

kukurica, ryņa, cirok, proso a ćalńie, neobsahujú agens, vyvolávajúci intoleranciu voči

lepku a preto môņu byť vyuņité pre potreby bezlepkovej diéty (Petr et al., 2003;

Capouchová et al., 2006). Napriek tomu sú najčastejńie vyuņívanými plodinami iba

kukurica, ryņa a sója (Zingone et al., 2010). Hlavnou frakciou zásobných bielkovín vo

viacerých druhoch pseudocereálií sú globulíny, čo sú pre výņivu ľudí nutrične vhodné

bielkoviny. Pre pseudocereálie, ako sú napríklad láskavec, pohánka, proso, cirok alebo

quinoa je charakteristická neprítomnosť celiakálne aktívnych bielkovín (Gálová et al.,

2005; Gálová et al., 2006).

Zo ńtrukturálneho hľadiska sa pseudocereálie odlińujú od konvenčných obilnín

najmä tým, ņe pseudocereálie patria medzi dvojklíčnolistové rastliny, kým obilniny

medzi jednoklíčnolistové. Druhým významným rozdielom je umiestnenie embrya.

V semenách pseudocereálií je lokalizované v centrálnej časti endospermu a má dva

klíčne listy (Wijngaard, Arendt, 2006).

Z hľadiska kvalitatívneho zloņenia bielkovín bol v porovnaní s beņnými

obilninami dokázaný v láskavci a pohánke vyńńí obsah lyzínu. Podobne vykazujú tieto

plodiny aj väčńie mnoņstvo tuku. Taktieņ obsah minerálnych látok je v porovnaní

s beņnými obilninami výrazne vyńńí (Moudrý et al., 2005).

39

1.5.1 Láskavec (Amaranthus)

Láskavec patrí medzi pseudocereálie, pričom z nutričného hľadiska, ktoré sa

pribliņuje klasickým obilninám, sa najviac vyuņívajú tri druhy: Amaranthus caudatus

L., Amaranthus cruentus L. a Amaranthus hypochondriacus (Gorinstein et al., 1998;

Schoenlechner et al., 2008).

Veľký záujem o produkciu a vyuņitie semena láskavca je vćaka relatívne

vysokému obsahu bielkovín (okolo 15 %), najčastejńie v rozmedzí 16 aņ 18 %,

s priaznivým zloņením esenciálnych aminokyselín, najmä s vysokým podielom lyzínu

(Bressani et al., 1993; Muchová et al., 2000). Proteíny semena láskavca sú, podobne ako

v ostatných cereáliach, klasifikované do ńtyroch typov na základe rozpustnosti:

albumíny, globulíny, prolamíny a glutelíny. Väčńina ńtúdii poukazuje na to, ņe albumíny

sú hlavnou frakciou (48,9 – 65 %), za nimi nasledujú glutelíny (22,4 – 42,3 %), potom

globulíny (13,7 – 18,1 %) a nakoniec prolamíny (1,0 – 3,2 %) (Cai et al., 2004; Silva-

Sánchez et al., 2004).

Biologická hodnota láskavcových proteínov je vćaka obsahu esenciálnych

aminokyselín vysoká, má hodnotu 75 zo 100, čo je viac v porovnaní napríklad

s jačmeňom (62), pńenicou (57) a kukuricou (44) (Zheleznov et al., 1997).

Láskavcové semeno obsahuje asi 2 aņ 3-krát viac tukov v porovnaní s ostatnými

obilninami, pričom najväčńí podiel pripadá na nenasýtené mastné kyseliny (75 %).

Bohaté zastúpenie majú kyselina linolová (35 – 55 %), kyselina palmitová (20 – 23%)

a kyselina olejová (18 – 38 %) (Schoenlechner et al., 2008). Vyńńí obsah proteínov, ako

aj tukov, prispieva k faktu, ņe láskavec sa vyuņíva prevaņne ako energetická potravina

(Kauffman, Weber, 1990). Semená láskavca obsahujú tieņ celý rad vitamínov, ktoré sú

koncentrované hlavne v klíčku. Významnou je najmä skupina vitamínov B (riboflavín

a niacín) a tieņ vitamín E, menej vitamín C (Habánová, Habán, 2003). Hladina P, Ca,

K a Mg je obyčajne vyńńia ako v zrnách ostatných cereálií. Z nutričného hľadiska je

ņiaduci aj vyńńí obsah ņeleza v porovnaní s ostatnými cereáliami (Cai et al., 2004).

Láskavec nie je taxonomicky príbuzný s pńenicou a na rozdiel od nej neobsahuje

lepok. V dôsledku nízkeho obsahu prolamínov sa môņu výrobky z múky z láskavca

pouņiť ako vhodná náhrada pńeničnej múky vo výņive ľudí s celiakiou (Gajdońová,

Ńturdík, 2004; Calderón de la Barca et al., 2010).

40

1.5.2 Pohánka (Fagopyrum)

Rod Fagopyrum zahŕňa okolo 19 druhov, z ktorých niektoré boli objavené

nedávno. Spomedzi týchto druhov iba dva typy pohánky sa vyuņívajú v potravinárstve,

a to pohánka jedlá (Fagopyrum esculentum Moench) a pohánka tatárska (Fagopyrum

tataricum L.) (Yu-Xia et al., 2008).

Pohánka jedlá (Fagopyrum esculentum Moench) patrí do čeľade Polygonaceae.

Pochádza z juho – západnej Číny, z juņnej oblasti Himalájí. Do Európy sa dostala

v období Stredoveku zo Sibíri cez Rusko a Ukrajinu. Neskôr sa jej pestovanie rozńírilo

ako alternatívnej plodiny pre jej nutričné a zdraviu prospeńné účinky (Petr et al., 2003).

Bielkoviny, sacharidy, tuky a vláknina sa nachádzajú v pohánke v optimálnom

pomere. Pohánka je cenená aj ako zdroj ńpecificky účinných látok, ktoré priaznivo

pôsobia na tráviaci trakt, pečeň a kardiovaskulárny systém. Pri porovnávaní zloņenia

s ćalńími pseudocereáliami (láskavec alebo quinoa) má pohánka vysoký obsah ńkrobu

a bielkovín (Moudrý et al., 2005).

Chemické komponenty zrna pohánky sú distribuované v odlińných častiach

semena, napríklad proteíny sa vyskytujú hlavne v aleurónovej vrstve a v embryu, ńkrob

v endosperme a vláknina, minerálne látky a flavonoidy v osemení a v perikarpe (Cai et

al., 2004). Pohánkové semeno obsahuje vysoký podiel sacharidov (73,3 %), z ktorých

najviac pripadá na ńkrob. Lipidy sa nachádzajú najmä v embryu, a to v mnoņstve

pribliņne 6,5 %. Endosperm obsahuje menej neņ 0,4 % lipidov (Wijngaard, Arendt,

2006).

Pohánkové semeno je bohaté na vitamíny, hlavne vitamíny skupiny B, a je

dôleņitým zdrojom mikroelementov (Zn, Cu, Mn, Se) a makroelementov (K, Na, Ca,

Mg). Obsahuje komponenty s liečivými účinkami a vysokou biologickou aktivitou, ako

sú napríklad flavonoidy, flavóny, fenolické kyseliny, kondenzované taníny, fytosteroly

a fagopyríny (Bojňanská et al., 2009).

Pohánka je jedným z najlepńích zdrojov vysokej biologickej hodnoty proteínov

v celej rastlinnej ríńi. Biologická hodnota pohánkových proteínov je 93, v porovnaní so

sójovým proteínom (68) a pńeničnými proteínmi (63) (Cai et al., 2004). Obsah

proteínov v pohánkovej múke sa pohybuje v rozpätí od 8,5 do 18,9 %, v závislosti od

odrody. Pohánkové bielkoviny majú vysokú biologickú hodnotu vćaka dobre

41

vybilancovanému zastúpeniu esenciálnych aminokyselín, hoci ich stráviteľnosť je

relatívne nízka (Wronkowska, Soral-Śmietana, 2008).

V pohánke sú hlavnou frakciou bielkovín albumíny, ktoré tvoria 28 – 42 %, za

ktorými nasledujú glutelíny (11 – 21 %), globulíny (14 – 20 %) a prolamíny, ktoré sú

minoritnou frakciou (1,7 – 2,3 %) (Cai et al., 2004). Podľa Nałęcz et al. (2009) sa

prolamíny vyskytujú v mnoņstve 1 – 4 %, a vzhľadom na tento nízky obsah prolamínov,

je pohánka povaņovaná za vhodnú surovinu pre pacientov s celiakiou.

Napriek tomu, ņe naņky pohánky majú veľmi vyváņené zloņenie bielkovín, ich

biologická dostupnosť pre človeka je nízka. Jedným z pravdepodobných dôvodov nízkej

stráviteľnosti bielkovín je prítomnosť inhibítorov proteáz. V rôznych pohánkových

produktoch bola nájdená značná aktivita trypsín – inhibítorov. V pńeničných a sójových

produktoch je aktivita inhibítorov trypsínu výrazne niņńia. K hlavným faktorom

zniņujúcich stráviteľnosť bielkovín patrí tieņ vysoká hladina tanínov v rôznych

pohánkových produktoch. Obsah tanínov v naņke je 0,5 – 4,5 % v závislosti od odrody

a ekologických podmienok pestovania (Moudrý et al., 2005).

Vo farmaceutickom priemysle má pohánka význam ako prírodný zdroj rutínu,

ktorý má posilňujúce účinky na imunitný systém, reguláciu krvnej zráņanlivosti a obsah

cholesterolu v krvi (Gajdońová, Ńturdík, 2004).

1.5.3 Proso (Panicum)

Proso siate (Panicum miliaceum L.) je tieņ známe aj ako proso obyčajné alebo

biele proso a prevaņne sa pestuje na Ukrajine, v Rusku, Rumunsku, Turecku, Indii a na

strednom východe. Vyņaduje iba malý príjem vody a preto sa môņe pestovať aj

v suchńích oblastiach (Zarnkow et al., 2010).

Okrem prípavy rôznych tradičných jedál je proso vhodnou surovinou aj

v pivovarníctve a v pekárenskom priemysle (Gaffa et al., 2004). Hlavným výrobkom

mlynského spracovania prosa je pńeno, ćalej prosná múka, krupica a vločky. Vedľajńím

produktom je kŕmne proso, prosné otruby, prosná kŕmna múka, prosný prach

a pokrutiny (Moudrý et al., 2005).

Matz (1991) uvádza nasledovné chemické zloņenie semena prosa: pribliņne 11

% tvoria bielkoviny; 72,9 % sacharidy; 4,2 % lipidy; 3,3 % minerálne látky a 1 %

vláknina. Z vitamínov je proso bohaté hlavne na niacín a z minerálnych látok na Mg, P

42

a K. Parameswaran a Sadasivam (1994) uvádzajú celkový obsah bielkovín v semene

prosa 12,3 %, čo je porovnateľné mnoņstvo s obsahom bielkovín v zrne pńenice

a ciroku, ale vyńńie v porovnaní s ryņou alebo kukuricou.

Prosné bielkoviny majú pozitívny vplyv na metabolizmus cholesterolu, pôsobia

preventívne pri pońkodení pečene a tieņ pre nízky obsah prolamínovej frakcie je proso

vhodnou surovinou pre potreby bezlepkovej diéty. V porovnaní s ostatnými obilninami

majú vńak bielkoviny prosa niņńí obsah lyzínu (okolo 3,7 %) (Kalinová, Moudrý, 2006).

Ńkrob je primárnou zloņkou celého semena, ale koncentruje sa hlavne

v endosperme. Proteíny sa primárne nachádzajú v embryu a v menńom rozsahu

v ostatných častiach semena. Aj väčńina tukov je lokalizovaná v embryu (Baltensperger,

Cai, 2004).

Proso má v porovnaní s ostatnými obilninami vyńńiu nutričnú hodnotu vćaka

proteínom s dobre vybilancovaným pomerom aminokyselín, lipidom, vitamínom

a minerálnym látkam. Pravidelná konzumácia prosa ako diétneho a nutričného

komponentu v potrave môņe redukovať výskyt chronických humánnych chorôb

(Baltensperger, Cai, 2004).

Čeľać lipnicovité (Poaceae) so skupinou prosovité (Panicoideae) zahŕňa okrem

prosa (Panicum) aj jemu podobné druhy: čumízu siatu (Setaria italica subsp. maxima)

a prstovku krvavú (Digitaria sanquinalis) (Moudrý et al., 2005). Podľa Petr et al.

(2003) tieto druhy, spolu s prosom preukázali pri imunologických testoch obsah

gliadínu niņńí ako je limit podľa Codex Alimentarius a je ich moņné povaņovať za

vhodné pre bezlepkovú diétu pri celiakii.

Proso siate patrí do skupiny minoritných obilnín, medzi ktoré radíme aj mohár

taliansky (Setaria italica L.), ktorý je jednou z najstarńie kultivovaných plodín na svete.

Chemické zloņenie semena je v porovnaní s prosom odlińné, pričom hlavnou frakciou

bielkovín sú prolamíny (Kamara et al., 2009), označované aj ako setaríny, ktoré tvoria

viac ako polovicu celkového obsahu bielkovín. Aminokyselinové zloņenie týchto frakcií

je podobné so zeínmi kukurice, vyznačuje sa vysokým obsahom kyseliny glutámovej

a glutamínu (19 – 24 %), alanínu (11 – 15 %) a leucínu (9 – 16 %) (Shewry, 2002).

Obsah bielkovín je pribliņne 12,3 % a z ostatných základných komponentov má mohár

vyńńí obsah tukov a asi 3,3 % minerálnych látok (Vithal, Machewad, 2006).

43

1.5.4 Quinoa (Chenopodium)

Rod Chenopodium (Chenopodiaceae) zahŕňa okolo 250 druhov, ktoré sú

rozńírené v rozsiahlej časti Ameriky, Ázie a Európy. Ekonomicky významnými druhmi

sú Ch. quinoa vyuņívaná ako zrnina, Ch. pallidicaule a Ch. berlandieri pouņívané ako

zrnina a zelenina a Ch. album pouņívaná prevaņne ako listová zelenina (Bhargava et al.,

2005).

Quinoa (Chenopodium quinoa) je svojím pôvodom podobná láskavcu

(Amaranthus). Bola rozńirovaná spoločne s ćalńími plodinami po objavení Ameriky.

V súčasnosti sa pestuje z dôvodu jej nutričnej hodnoty (Petr et al., 2003), pretoņe

obsahuje vysoké mnoņstvo bielkovín, nenasýtených mastných kyselín, minerálnych

látok a vitamínov C a E. V zmesi s inými cereáliami sa pouņíva na prípravu potravín,

ktoré majú vysokú výņivovú hodnotu (Berti et al., 2004).

Mnoņstvo bielkovín sa pohybuje v rozpätí 8 – 22 % a je v priemere vyńńie ako

v ostatných cereáliach. Najviac bielkovín je lokalizovaných v embryu (Valencia-

Chamorro, 2004; Fuentes et al., 2009). Aminokyselinové zloņenie bielkovín je úplne

odlińné od ostatných obilnín, predovńetkým sa líńi vysokým obsahom lyzínu. Zloņením

bielkovín je quinoa podobná sóji alebo odstredenému mlieku, z pseudocereálií sú

bielkoviny quinoi podobné láskavcovým bielkovinám (Taylor, Parker, 2002).

Hlavným komponentom semena quinoi sú vńak sacharidy, ktoré tvoria viac ako

77,4 %. Obsah tukov je okolo 9,5 % a vlákniny 5,8 %. V porovnaní s ostatnými

obilninami má vyńńí obsah minerálnych látok, hlavne Ca, Mg, P, K a Fe. Neņiadúca je

vńak prítomnosť saponínov, ktoré majú antinutričné účinky (Fletcher, 2004). Obsah

vitamínov je podobný ako v zrne tradičných obilnín. Semeno quinoi je dobrým zdrojom

tiamínu, kyseliny listovej, vitamínov C, E a taktieņ má vyńńí obsah riboflavínu ako

ostatné obilniny (Schoenlechner, 2008).

Najviac zastúpenou frakciou bielkovín semena quinoi sú albumíny a globulíny

(44 – 77 % z celkového obsahu bielkovín), pričom prolamíny predstavujú len 0,5 – 7,0

%. Hlavnou skupinou bielkovín sú 11S globulíny, nazývané aj chenopodíny, a 2S

globulíny, bohaté na cysteín, arginín a histidín. Quinoa je povaņovaná za bezlepkovú

cereáliu práve kvôli nízkemu obsahu prolamínov a vysokému obsahu ľahko

stráviteľných bielkovín. Z nutričného a ekonomického hľadiska predstavuje významný

44

potravinový zdroj pre ľudí trpiacich celiakiou (Taylor, Parker, 2002; Valencia-

Chamorro, 2004).

1.6 Metódy detekcie celiakálne aktívnych bielkovín

1.6.1 Separačné metódy – elektroforéza

Elektroforéza predstavuje jednoduchú a relatívne rýchlu metódu, ktorá sa

vyuņíva predovńetkým na analýzu a purifikáciu makromolekulových látok, ako sú

proteíny a nukleové kyseliny. Agarózové a polyakrylamidové géli sú najčastejńie

pouņívanými stabilnými médiami pri separácii molekúl (http://www.scribd.com/doc/

22613588/Amersham-Technical-Manual-ProteinElectrophoresis-Handbook).

Gélová elektroforéza poskytuje informácie o molekulových hmotnostiach

a elektrických nábojoch proteínov, čiastočne o ńtruktúre proteínov, ako aj informácie

o vhodnosti puņitých extrakčných postupov. Zahŕňa rozličné typy techník, z ktorých

najčastejńie praktizovanou je elektroforéza na polyakrylamidovom géli (PAGE) pre

analýzu proteínov (Garfin, 2003).

Akrylamid, pouņívaný pri tomto type elektroforézy, je silne karcinogénnou

a neurotoxickou látkou s kumulatívnymi účinkami, a to ako v pevnom, tak aj

v kvapalnom stave. Z tohto dôvodu je potrebné venovať zvýńenú opatrnosť pri jeho

pouņívaní. Zpolymerizované gély sú relatívne netoxické, ale rezíduá akrylamidu

predstavujú eńte stále potenciálne riziko (Pingoud et al., 2002).

Polyakrylamidová gélová elektroforéza v prítomnosti dodecylsíranu sodného

(SDS-PAGE) je osvedčenou metódou beņne pouņívanou v oblasti molekulárnej

biológie. Prvý krát ju popísal Laemmli (1970) a umoņňuje kvantitatívne stanoviť

mnoņstvo proteínov a peptidov vo vzorkách, podať spoľahlivé informácie o ich

molekulovej hmotnosti a v kombinácii s imunoblotingom zhodnotiť ich alergénne

vlastnosti (Judd, 2002).

Ćalńím typom PAGE je elektroforéza v kyslom prostredí, tzv. A-PAGE, ktorá sa

pouņíva na izoláciu a analýzu jednotlivých frakcií bielkovín (gliadínov pńenice,

hordeínov jačmeňa a avenínov ovsa). Hoci táto metóda sa beņne nepouņíva k purifikácii

gliadínov, poskytuje moņnosť získať bielkoviny v natívnom stave, zatiaľ čo ńtrukturálne

http://www.scribd.com/doc/%2022613588/Amersham-Technical-Manual-ProteinElectrophoresis-Handbook



45

a funkčné vlastnosti bielkovín nie sú výrazne pozmenené extrakčnými a separačnými

procesmi (Waga, Zientarski, 2007).

Elektroforetické separačné metódy sa najčastejńie vyuņívajú v biologickom

a biochemickom výskume, vo farmakológii, v súdnon lekárstve, pri klinickom

testovaní, pri determinovaní chemickej ńtruktúry proteínov, pri kontrole potravín, ako aj

v molekulárnej biológii. Vyuņiteľné sú aj pre posúdenie extrakčných postupov

(Westermeier, 2005).

1.6.2 Imunochemické metódy

1.6.2.1 ELISA analýza

V súčasnosti je ELISA jednou z najrozńírenejńích analytických techník určená

pre jednoduchú determináciu a screening rôznych alergénov v potravinách. Detekcia

alergénov alebo rôznych potravinových proteínov je zaloņená na vyuņití ńpecifických

protilátok (Schubert-Ullrich et al., 2009). Veľká pozornosť sa venuje vyuņitiu hlavne

monoklonálnej protilátky R5 vyvinutej proti raņnému peptidu, ktorá sa pouņíva pri

sendvičovej ELISA analýze, ktorá je odporúčanou metódou podľa Codex Alimentarius,

určená na detekciu celiakálne aktívnych bielkovín v bezlepkových potravinách.

(Kahlenberg et al., 2006; Konic-Ristic et al., 2009; van Eckert et al., 2010).

Ćalńou monoklonálnou protilátkou, ktorá sa tieņ vyuņíva pri sendvičovej ELISA

analýze je protilátka proti pńeničným ω-gliadínom. Výhodou tejto analýzy je, ņe táto ω-

gliadínová frakcia v porovnaní s ostatnými frakciami pńenice nie je denaturovaná

termickými procesmi počas pečenia. Nevýhodou tejto ω-gliadín ELISA analýzy je to, ņe

nedokáņe presne detekovať a kvantifikovať jačmenné hordeíny (Thompson, Méndez,

2008).

Schubert-Ullrich et al. (2009) uvádzajú rozdelenie ELISA na dva typy analýz,

a to sendvičovú a kompetitívnu ELISA. Pri sendvičovej ELISA je protilátka ńpecifická

voči určitému antigénu imobilizovaná na mikrotitračnú platňu, pričom po vytvorení

komplexu antigén-protilátka sa na tento komplex viaņe sekundárna protilátka

(konjugát), ktorá je naviazaná na detekujúci enzým a ńpecifická pre tento antigén.

Následne vzniká tzv. sendvič – protilátka-antigén-protilátka. Táto sendvičová ELISA

analýza sa pouņíva najmä k detekcii väčńích molekúl v potravinách, ako sú napríklad

46

bielkoviny. Pri kompetitívnej ELISA analýze je na mikrotitračnú platňu naviazaný

antigén. Na takto naviazaný antigén sa pridá sérum obsahujúce ńpecifickú, enzýmom

značenú protilátku spolu s primerane zriedeným extraktom vzorky. Komplex obsahujúci

naviazaný antigén a vzorku v roztoku s antigénne-ńpecifickou protilátkou je následne

inkubovaný so sekundárnou protilátkou. Kompetitívna ELISA slúņi predovńetkým

k detekcii menńích antigénov.

1.6.2.2 Western blot

Separácia bielkovín alebo nukleových kyselín na elektroforetických géloch je

potrebná pre ich ćalńiu charakteristiku alebo mikropreparáciu, na čo slúņia rôzne

blotovacie techniky. Pri blotingu sa separované molekuly transferujú z gélu na

membránu, kde sa ćalej analyzujú rôznymi spôsobmi v závislosti od druhu pouņitej

molekuly. Pre bielkoviny sa pouņíva technika Western blot (Pingoud et al., 2002).

Rozdelené bielkoviny z SDS-PAGE sú najprv elektrotransferom prenesené na

membránu, z ktorých v súčasnosti sa najčastejńie pouņíva polyvinylidénfluoridová

membrána (PVDF). Okrem nej sa v minulosti vyuņívala aj nitrocelulózová membrána

(Pingoud et al., 2002). PVDF membrány sa vyznačujú vysokou väzbovou kapacitou

a vysokou mechanickou stabilitou oproti nylónovým membránam a môņu sa pouņívať

k priamej sekvenácii bielkovín (Westermeier, 2005).

Kurien a Hal Scofield (2006) uvádzajú niekoľko ńpecifických výhod Western

blot analýzy:

o navlhčená membrána je pruņná, ohybná a ľahko sa s ňou manipuluje,

o bielkoviny imobilizované na membráne sú ľahko prístupné pre rôzne ligandy,

o pre elektrotransfer je potrebné iba malé mnoņstvo chemikálií,

o poskytuje viacnásobnú replikáciu gélu,

o bielkovinový transfer je moņné vyuņiť k viacnásobným, za sebou idúcim

analýzam.

Pre analýzu Western blot sa vyuņívajú ako monoklonálne, tak aj polyklonálne

protilátky, pričom populárnejńími sú polyklonálne protilátky. Oboje majú svoje výhody,

aj nevýhody. Hlavnou výhodou polyklonálnych protilátok je to, ņe obsahujú veľké

47

mnoņstvo molekúl pre väzbu s cieľovým antigénom, čiņe proteínmi. Ich nevýhodou je

vńak vznik kríņových reakcií so ńtrukturálne podobnými bielkovinami. Monoklonálne

protilátky sú v porovnaní s polyklonálnymi protilátkami oveľa senzitívnejńie

a ńpecifickejńie voči väzbe k cieľovému antigénu, čo predstavuje ich obrovskú výhodu.

Ich nevýhoda spočíva v obmedzenej interakcii s antigénom (bielkovinami) pri tepelne

upravených potravinách, kde dochádza k ich denturácii (MacPhee, 2010).

Western blot je vysoko ńpecifická kvalitatívna metóda, ktorá determinuje, či

analyzovaná vzorka obsahuje mnoņstvo bielkoviny pod alebo nad určenú limitnú

hodnotu. Čiastočne sa vyuņíva aj pre analýzu nerozpustných bielkovín. Kećņe

elektroforetická separácia bielkovín je uskutočnená za podmienok ich denaturácie,

eliminuje sa tým agregácia a precipitácia bielkovín s cudzími molekulami. Táto metóda

je oveľa viac vhodnejńia pre aplikovaný výskum, ako pre beņné testovanie (Ahmed,

2002).

48

2 Ciele práce

1) Cieľom dizertačnej práce bolo získať a rozńíriť nové poznatky v oblasti

cereálnej chémie a v oblasti analýzy celiakálne aktívnych bielkovín základnými

metódami (frakcionácia bielkovín a elektroforetická separácia)

a imunochemickými metódami (ELISA a Western blot).

2) Ciele dizertačnej práce boli nasledovné:

o analýza prolamínového komplexu bielkovín zrna vybraných druhov cereálií,

pseudocereálií a strukovín,

o izolácia jednotlivých bielkovinových frakcií proteínov, so zameraním sa na

obsah prolamínov, ktoré sú alergénnym agens pre celiatikov,

o elektroforetická separácia a detekcia prolamínových bielkovín,

o kvantitatívna a kvalitatívna detekcia prolamínov a ich frakcií pomocou

imunochemických metód – ELISA a Western blot,

o návrh surovín a potravín vhodných pre potreby bezlepkovej diéty.

49

3 Metodika práce a metódy skúmania

3.1 Použité chemikálie a prístroje

Markery pre stanovenie molekulových hmotností metódou SDS-PAGE sme

zakúpili od Fermentas International Inc. (Kanada), Anti-gluten pńeničnú protilátku od

US Biological (USA), Anti-králičiu HRP protilátku od BD Pharmingen (USA),

SIGMAFASTTM

3,3'-diaminobenzidín – tablety od Sigma (USA), ImmobilonPSQ

PVDF

membránu od Millipore (USA), ELISA test RIDASCREEN® Gliadin od R-Biopharm

(Nemecko). Vńetky ostatné pouņité chemikálie sme zakúpili od firiem Sigma (USA),

Fluka (Ńvajčiarsko) a Applichem (Nemecko).

Pre elektroforetickú separáciu sme pouņili zariadenie Bio-Rad Laboratories Inc.

(USA), pre prípravu biologicky aktívnych vzoriek sme pouņívali vákuový lyofilizátor

Christ® Alpha 1-2 LD Plus (Martin Christ, Nemecko) a Lyovac GT 2 (Amsco/Finn-

Aqua, Nemecko), pre stanovenie dusíka podľa Kjeldahla sme pouņili poloautomat Velp

Scientifica (Taliansko) a pre stanovenia metódou ELISA sme merali absorbancie

pomocou ELISA-reader BioTek (USA).

3.2 Použitý biologický materiál

Na analýzy sme pouņili súbor odrôd rôznych druhov cereálií (pńenica, jačmeň,

raņ, tritikale a ovos), pseudocereálií (pohánka, proso, mohár, quinoa a láskavec)

a strukovín (cícer, hrachor a sója). Vzorky sme získali z Génovej banky semenných

druhov Slovenskej republiky Slovenského centra poľnohospodárskeho výskumu,

Výskumného ústavu rastlinnej výroby (SCPV VÚRV) v Pieńťanoch. Vzorky ryņe

a kukurice sme kúpili v obchodnej sieti (Tabuľka. 2).

Na analýzy sme ćalej pouņili aj súbor odrôd cereálií (pńenica letná a pńenica

ńpaldová, raņ a ovos) a rôznych druhov pńeničných chlebov, ktoré sme získali, resp. boli

pripravené, z Department of Carbohydrate Technology, Faculty of Food Technology,

Agriculture University in Krakow (Poľsko) (Tabuľka. 3). Pńenica pouņitá na prípravu

chlebov pochádzala z ekologickej farmy Bartkowski (pńeničná mieńanka BIO I.),

Tykarska (pńeničná mieńanka BIO II.) a Babalski (pńenica ńpaldová ozimná, odrody

Oberkulmer Rothkorn a Frankienkorn a pńenica ńpaldová jarná bez ńpecifikácie

50

odrody). Pńenice boli dopestované v rovnakých klimatických podmienkach. Ako

kontrolná vzorka bola pouņitá múka z pńenice letnej (typ 500) vyprodukovaná v mlyne

PZZ Krakow S.A.

Tabuľka. 2 [Zoznam analyzovaných odrôd jednotlivých druhov cereálií, pseudocereálií

a strukovín]

Číslo

vzorky Biologický materiál Odroda

1. Pńenica letná – jarná (Triticum aestivum L.) Granny, Saxana

2. Pńenica letná – ozimná (Triticum aestivum L.) Arida, Balaton, Blava, Brea, Hana, ID

Karpatia, Ignis, Markola, Viginta,

Vlada

3. Pńenica tvrdá – ozimná (Triticum durum L.) Riveldur, Soldur

4. Pńenica ńpaldová (Triticum spelta L.) Ceralio, Rubiota

5. Jačmeň siaty – jarný (Hordeum vulgare L.) Levan, Ludan, Radegast, Sladar

6. Jačmeň siaty – ozimný (Hordeum vulgare L.) Amsterdam, Babette (2-radový)

Gerlach, Luran (6-radový)

7. Raņ siata – ozimná (Secale cereale L.) Dankowskie Nowe

8. Tritikale – jarné (Triticosecale) Wanad

9. Tritikale – ozimné (Triticosecale) Kendo, Kinerit

10. Ovos siaty (Avena sativa L.) Ardo, Atego

11. Ovos siaty – nahý (Avena sativa L.) Detvan, Izák

12. Pohánka jedlá (Fagopyrum esculentum Moench) FAG 120/82, Pyra, Ńpačinská

13. Láskavec (Amaranthus hypochondriacus L.) Koniz

14. Proso siate (Panicum miliaceum L.) Unikum

15. Mohár taliansky (Setaria italica L.) Čiernoklas, Friderika, Z2300002

16. Quinoa (Chenopodium quinoa) Baer, Carmen, Faro

17. Ryņa siata (Oryza sativa L.) Basmati, lúpaná guľatá, natural

18. Kukurica siata (Zea mays L.) bez ńpecifikácie odrody

19. Sója obyčajná (Glycine soja L.) bez ńpecifikácie odrody

20. Cícer baraní (Cicer arietinum L.) Punjab, Slovák

21. Hrachor siaty (Lathyrus sativus L.) Arida

Tabuľka. 3 [Zoznam analyzovaných odrôd jednotlivých druhov cereálií]

Číslo

vzorky Biologický materiál Odroda

1. Pńenica letná (Triticum aestivum L.) Sakwa

2. Pńenica ńpaldová (Triticum spelta L.) B10, Schwabenkorn a jedna bez

ńpecifikácie odrody

3. Raņ siata (Secale cereale L.) Amilo

4. Ovos siaty (Avena sativa L.) Polar

51

3.3 Použité metódy

3.3.1 Stanovenie obsahu dusíka a hrubého proteínu

1) Stanovenie celkového dusíka podľa Kjeldahla (Michalík, 2002)

Princíp: Stanovenie je zaloņené na mineralizácii rastlinnej hmoty v prostredí

koncentrovanej kyseliny sírovej a vhodného katalyzátora. Organicky viazaný dusík

v organickej hmote sa pri oxidácii v prostredí koncentrovanej kyseliny sírovej mení na

amoniak, ktorý reaguje s kyselinou sírovou za vzniku síranu amónneho. Kyselina sírová

odoberá látke kyslík a vodík (organická hmota sčernie). Časť kyseliny sírovej sa varom

rozkladá a uvoľňuje kyslík, ktorý oxiduje uhlík na oxid uhličitý. Zloņité dusíkaté látky

sa vplyvom kyseliny sírovej ńtiepia na jednoduchńie, aņ na oxid uhličitý, vodu

a amoniak. Amoniak, ktorý reakciou vzniká, sa viaņe na kyselinu sírovú a vzniká síran

amónny. Zo síranu amónneho sa amoniak, ako slabńia zásada, vytesní prebytkom

alkalického hydroxidu. Vytesnený amoniak sa predestiluje do predlohy so známym

mnoņstvom kyseliny sírovej.

Postup: Do suchej mineralizačnej trubice sme odváņili 3 g biologického

materiálu, pridali sme 25 ml koncentrovanej kyseliny sírovej, zmes sme zahriali a

spaľovali v mineralizačnej jednotke. Po mineralizácii sme vzorku kvantitatívne preniesli

do 250 ml odmernej banky, doplnili destilovanou vodou na objem 250 ml a premieńali.

Z roztoku sme do ńpeciálnej trubice (Velp) odpipetovali 25 ml, v poloautomatickom

destilačnom zariadení bolo pridaných 50 ml 30 % roztoku hydroxidu sodného a zmes

bola predestilovaná do „predlohy“ – titračnej banky s 0,1 mol.dm-3

kyselinou sírovou.

Nezreagované mnoņstvo H2SO4 sme titrovali pomocou 0,1 mol.dm-3

hydroxidu sodného

na indikátor metylčerveň. Od mnoņstva kyseliny sírovej v „predlohe“ sme odpočítali

mnoņstvo spotrebovaného 0,1 mol.dm-3

hydroxidu sodného, pričom pri výpočte sme

vychádzali zo vzťahu, ņe 0,1 mol.dm-3

kyseliny sírovej zodpovedá 1,401 mg dusíka.

2) Stanovenie bielkovinového dusíka podľa Barnsteina

Princíp: Stanovenie je zaloņené na vyzráņaní bielkovín pomocou CuSO4 a po

odstránení ostatných dusíkatých látok ako sú aminokyseliny, amidy a anorganické

52

zlúčeniny, sa dusík stanoví metódou podľa Kjeldahla. Nebielkovinové dusíkaté látky

prejdú do roztoku a odstraňujú sa filtráciou. Zvyńok na filtri, ktorý obsahuje bielkoviny

sa spaľuje, destiluje a titruje.

Postup: Do kadičky sme naváņili 1 g biologického materiálu a varili 1 – 2 min.

s 50 – 100 ml destilovanej vody. Za varu sme pridali 25 ml 1,25 % roztoku hydroxidu

sodného. Zrazeninu sme nechali minimálne hodinu stáť pri laboratórnej teplote (20 – 25

°C), potom sme kvapalinu prefiltrovali cez filtračný papier Filtrak 391 a zrazeninu sme

premývali vriacou vodou dovtedy, kým filtrát nedával pozitívnu reakciu na ferokyanid

draselný. Filter so zrazeninou sme vysuńili v termostate pri teplote 40 °C, vloņili do

mineralizačnej trubice a stanovili dusík postupom podľa Kjeldahla.

3) Stanovenie hrubého proteínu (HP)

Percentuálne zastúpenie hrubého proteínu (% HP) sme vypočítali prepočtom

z obsahu dusíka (% N) stanoveného podľa Kjeldahla podľa nasledovnej rovnice:

% HP = % N x prepočítavací koeficient

Tabuľka 4 [Prepočítavací koeficient jednotlivého biologického materiálu (Michalík,

2002)]

Biologický materiál Prepočítavací koeficient

pńenica letná, pńenica tvrdá, pńenica ńpaldová,

tritikale, jačmeň, láskavec, proso, mohár,

quinoa, sója

5,7

raņ, ovos 5,83

kukurica, pohánka, cícer, hrachor 6,0

ryņa 5,95

3.3.2 Metóda frakcionácie bielkovinového komplexu zrna obilnín (Michalík,

2002)

Do 250 ml kyvety sme naváņili 10 g obilného ńrotu a pridali sme 100 ml 10 %

NaCl. Zmes sme extrahovali na trepačke 45 minút a odstrećovali pri 5 000 ot.min-1

počas 10 min. Supernatant, ktorý obsahoval albumíny a globulíny, sme dekantovali.

K sedimentu sme pridali 100 ml 10 % NaCl a bielkoviny sme extrahovali na trepačke

53

45 minút. Po odstredení pri 5 000 ot.min-1

počas 10 min. sme získali supernatant, ktorý

sme priliali k prvému a frakciu bielkovín albumíny a globulíny sme zahustili vo

vákuovej odparke a lyofilizovali.

K sedimentu sme pridali 100 ml 70 % etanolu a zmes sme extrahovali na

trepačke 45 minút a odstredili pri 5 000 ot.min-1

počas 10 min. Supernatant, ktorý

obsahoval prolamíny sme dekantovali a k sedimentu sem znovu pridali 100 ml 70 %

etanolu. Bielkoviny sme extrahovali na trepačke 45 minút a odstredili pri 5 000 ot.min-1

počas 10 min. Supernatant sme priliali k predchádzajúcim prolamínom a zahustili vo

vákuovej odparke a lyofilizovali.

K sedimentu sme pridali 100 ml 0,2 % NaOH a zmes sme extrahovali na

trepačke 45 minút. Po odstredení pri 5 000 ot.min-1

počas 10 min. sme supernatant,

ktorý obsahoval glutelíny dekantovali. K sedimentu sme pridali 100 ml 0,2 % NaOH

a bielkoviny sme extrahovali na trepačke 45 minút a odstredili pri 5 000 ot.min-1

počas

10 min. Získaný supernatant sme priliali k predchádzajúcemu a glutelíny sme zahustili

vo vákuovej odparke a lyofilizovali.

3.3.3 Stanovenie molekulových hmotností prolamínov metódou SDS-PAGE

(Schägger, von Jagow, 1987)

Elektroforetická separácia Tris-tricine SDS-PAGE, teda polyakrylamidová

gélová elektroforéza v prítomnosti dodecylsíranu sodného, sa vyuņíva predovńetkým na

separáciu malých bielkovín a peptidov s molekulovou hmotnosťou vyńńou ako 1,5 kDa.

Extrakcia proteínov:

Vzorky sme homogenizovali v laboratórnom mlyne na celozrnný ńrot a do

skúmaviek typu Falcon (50 ml) sme naváņili 0,5 g homogenátu.

Pre extrakciu albumínov a globulínov sme do skúmavky k homogenátu pridali

15 ml 0,5 mol.dm-3

NaCl a bielkoviny sme extrahovali 1 hod. na magnetickej trepačke

pri laboratórnej teplote (20 – 25 °C). Vzorky sme odstredili pri 9 000 ot.min-1

počas 15

min. pri 4 °C a supernatant sme dekantovali do novej skúmavky. Extrakciu albumínov

a globulínov sme opakovali 2-krát, pričom supernatant z druhej extrakcie sme priliali

k prvému a vloņili do mraziaceho boxu s -80 °C. Po zmrazení sme vzorky lyofilizovali.

54

Po extrakcii albumínov a globulínov sme k sedimentu pre odstránenie NaCl

pridali 25 ml deionizovanej vody a po dôkladnom premieńaní sme vzorky odstredili pri

9 000 ot.min-1

počas 15 min. pri 4 °C. Supernant – vodu, sme dekantovali a pre

extrakciu prolamínov sme do skúmavky k sedimentu pridali 15 ml 70 % etanolu.

Vzorky sme extrahovali 1 hod. na magnetickej trepačke a následne odstredili pri 9 000

ot.min-1

počas 15 min. pri 4 °C. Supernatant, ktorý obsahoval prolamíny sme

dekantovali do novej skúmavky, pridali sme asi 5 ml deionizovanej vody a vloņili do

mraziaceho boxu s -80 °C. Po zmrazení sme vzorky lyofilizovali.

Príprava polyakrylamidových gélov:

Základné roztoky pre elektroforetickú separáciu sme pripravili nasledovne:

- Roztok A: obsahoval 3 mol.dm-3

Tris-HCl s pH 8,45 a 0,3 % SDS,

- Roztok B: obsahoval 48 g akrylamid a 1,5 g N,N-metylénbisakrylamid, ktoré

sme rozpustili v100 ml deionizovanej vody,

- Roztok C: obsahoval 46,5 g akrylamid a 3 g N,N-metylénbisakrylamid, ktoré

sme rozpustili v 100 ml deionizovanej vody,

- Roztok D: obsahoval 10 % persíran amónny (čerstvo pripravený).

Pre elektroforetické delenie bielkovín v zariadení BioRad MiniProtean II sme

pripravili nasledovné gély:

- gél pre nanášanie vzoriek, ktorý obsahoval 0,3 ml roztoku B; 0,93 ml roztoku

A; 2,52 ml deionizovanej vody; 30 μl roztoku D a 3 μl TEMED,

- prechodový gél, ktorý obsahoval 1,52 ml roztoku B; 2,5 ml roztoku A; 3,48

ml deionizovanej vody; 25 μl roztoku D a 2,5 μl TEMED,

- gél pre separáciu bielkovín1, ktorý obsahoval 1,83 ml roztoku B; 3 ml

roztoku A; 1 ml glycerolu; 3,24 ml deionizovanej vody; 45 μl roztoku D a 4,5

μl TEMED,

- gél pre separáciu peptidov2, ktorý obsahoval 3 ml roztoku C; 3 ml roztoku A;

1 ml glycerolu; 2 ml deionizovanej vody; 30 μl roztoku D a 3 μl TEMED.

1 gél pre separáciu bielkovín s molekulovou hmotnosťou od 10 do 100 kDa

2 gél pre separáciu peptidov s molekulovou hmotnosťou od 1,5 do 20 kDa

55

Vo vertikálnom usporiadaní sa gély navrstvujú vzostupne v nasledovných

objemových pomeroch:

- pre separáciu bielkovín: 6/10 bielkovinový gél, 3/10 prechodový gél, 1/10 gél

pre nanáńanie vzoriek,

- pre separáciu peptidov: 6/10 peptidový gél, 3/10 prechodový gél, 1/10 gél pre

nanáńanie vzoriek.

Prechodový gél sme navrstvili na gél separujúci eńte pred jeho

spolymerizovaním, doplnili po vrch deionizovanou vodou na urovnanie hladiny gélu

a nechali polymerizovať. Polymerizácia trvala pribliņne 90 minút pri laboratórnej

teplote (20 – 25 °C). Po spolymerizovaní gélu sme vodu odobrali, vloņili hrebeň

a navrstvili gél pre vzorky, ktorý sme nechali asi 30 minút polymerizovať pri

laboratórnej teplote.

Vlastná separácia bielkovín:

Do Eppendorfovej skúmavky sme odváņili 2 mg lyofilizovaných prolamínov, ku

ktorým sme pridali 200 μl riediaceho roztoku SDS Tris-Tricine, ktorý obsahoval 125

mmol.dm-3

Tris-HCl, pH 6,8 s 4 % SDS a 20 % glycerolom. Vzorky sme dôkladne

premieńali.

Pre vizualizáciu bielkovín v géli sme pripravili roztok, ktorý obsahoval 50 mg

DTT (ditiotreitol) na 1 ml riediaceho roztoku SDS Tris-Tricine, ku ktorému sme pridali

Coomasie Brilliant Blue G-250 (do slabomodrého zafarbenia). Po dôkladnom

premieńaní sme roztok odstredili pri 15 000 ot.min-1

počas 5 min. pri 4 °C. Roztok

farbiva sa mieńa so vzorkami v objemovom pomere 1:1 (v/v). Pripravené vzorky sme

spolu s markermi zahriali počas 5 minút v termobloku na 100 °C a odstredili pri 15 000

ot.min-1

počas 5 min. pri 4 °C. Do pripraveného gélu sme nanáńali celý objem vzorky.

Elektroforetickú separáciu sme uskutočnili za nasledovných podmienok: počas 1

hod. boli vzorky pri napätí 30 V v géli pre nanáńanie vzoriek (vrchný gél), 30 min. pri

napätí 60 V boli vzorky v prechodovom géli a 1,5 hod. pri napätí 90 V boli vzorky

v géli pre separáciu bielkovín alebo peptidov (hodnota intenzity elektrického prúdu

v ampéroch bola nastavená automaticky), pričom zloņenie elektródových tlmivých

roztokov bolo nasledovné:

- vnútorný elektródový roztok (-) obsahoval 0,1 mol.dm-3

Tris; 0,1 mol.dm-3

Tricine a 0,1 % SDS,

56

- vonkajńí elektródový roztok (+) obsahoval tlmivý roztok 0,2 mol.dm-3

Tris-

HCl s pH 8,9.

Farbenie gélov:

Po ukončení elektroforetického delenia sme gél vloņili na 30 min. do roztoku 50

% metanolu s 10 % kyselinou octovou, čím sa zabezpečila fixácia bielkovín v géli.

Vizualizáciu seprarovaných bielkovín sme uskutočnili pomocou farbenia v roztoku

0,025 % Coomasie Brilliant Blue R-250 s 10 % kyselinou octovou počas 2 – 8 hodín na

trepačke. Po zafarbení sme pozadie gélu odfarbovali v 10 % kyseline octovej.

Ak má byť po skončení elektroforetického delenia gél pouņitý na elektrotransfer

na PVDF membránu, transfer je potrebné uskutočniť ihneć po skončení elektroforézy

bez predchádzajúceho farbenia.

3.3.4 Elektrotransfer na PVDF membránu (Millipore, uņívateľská príručka:

Immobilon-P Transfer Membrane)

Millipore Immobilon-PSQ

membrána je polyvinylidénfluoridová (PVDF)

mikropórová membrána pre väzbu proteínov prenesených na túto membránu z rôznych

gélových matríc.

Príprava roztokov a membrány pred samotným transferom:

Tlmivý roztok sme pripravili rozpustením 22,13 g CAPS (3-(cyklohexylamino)-

1-propánsulfónová kyselina) v 900 ml deionizovanej vody, pH sme upravili na hodnotu

11 s 1 mol.dm-3

NaOH a objem roztoku na 1 000 ml sme doplnili deionizovanou vodou.

Tlmivý roztok sme uchovávali pri teplote 4 – 6 °C.

Tlmivý roztok potrebný pre elektrotransfer obsahoval 100 ml CAPS roztoku,

100 ml koncentrovaného metanolu a 800 ml deionizovanej vody.

Membránu Immobilon-PSQ

(veľkosti podľa rozmerov elektroforetického gélu)

sme navlhčili počas 15 sekúnd v koncentrovanom metanole, prepláchli v deionizovanej

vode a 5 – 15 min. ekvilibrovali v tlmivom roztoku pre elektrotransfer.

57

Transfer:

Pred samotným transferom sme si pripravili systém s nádobou na elektrotransfer,

2 penové podloņky (Scotch Brite®), dôkladne navlhčené v deionizovanej vode, ktoré

sme ekvilibrovali v tlmivom roztoku pre elektrotransfer počas 30 sekúnd, 2 kúsky

papiera Whatman® 3mm, ktoré sme vystrihli na rozmer gélu, navlhčili v deionizovanej

vode a ekvilibrovali v tlmivom roztoku pre elektrotransfer počas 30 sekúnd.

Gél po elektroforetickom delení bielkovín, ktorý nie je farbený, sme umiestnili

na 5 minút do tlmivého roztoku pre elektrotransfer.

”Kazetu” pre elektrotransfer sme formovali od strany mínus k strane plus

nasledovne: (-) pena – filtračný papier – gél – membrána – filtračný papier – pena (+)3

Zdroj: Millipore, užívateľská príručka – Protein blotting handbook

Kazetu sme uzatvorili a umiestili do nádoby na elektrotransfer tak, aby strana,

kde je umiestnený gél bola otočená ku záporne nabitej katóde; potom sme pridali

dostatočné mnoņstvo tlmivého roztoku pre elektrotransfer a systém sme uzatvorili.

Prenos bielkovín sa uskutočnil počas 1,5 hod. pri napätí 90 V a intenzite elektrického

prúdu max. 170 mA.

Farbenie membrány:

Po ukončení elektrotransferu sme membránu vloņili na sekundu do

koncentrovaného metanolu a premyli deionizovanou vodou. Farbenie membrány sme

3 strana (-) – čierna strana kazety, strana (+) – priehľadná strana kazety

58

realizovali ihneć, ponorením membrány do roztoku 0,1 % Coomasie Brilliant Blue R-

250, ktorý obsahoval 40 % metanol a 1 % kyselinu octovú po dobu 1 minúty.

Odfarbenie pozadia membrány sme uskutočnili v 50 % metanole, a po následnom

premytí deionizovanou vodou sme membránu suńili v tme pri laboratórnej teplote (20 –

25 °C).

Ak boli bielkoviny prenesené na membránu imunizované s protilátkou pomocou

imunoblotingu, tak sme membránu farbili v reverzibilnej farbe Ponceau S podľa

postupu pre Western blot analýzu.

3.3.5 Western blot (Millipore, uņívateľská príručka: Protein blotting handbook)

Western bot alebo imunobloting, je vysoko senzitívna metóda, najčastejńie

pouņívaná pre identifikáciu a lokalizáciu proteínov na základe ich väzby so

ńpecifickými protilátkami (monoklonálnymi alebo polyklonálnymi), pričom ńpecifita

protilátky proti skúmanej bielkovine je určujúcim faktorom analýzy.

Postupnosť krokov pre imunobloting:

Prvým krokom pred samotnou procedúrou imunoblotingu je elektroforetická

separácia bielkovín s pouņitím polyakrylamidových gélov v prítomnosti dodecylsíranu

sodného (SDS-PAGE). Druhý krok spočíva v elektrotransfere bielkovín

z polyakrylamidového gélu na PVDF membránu a posledným krokom je vytváranie

imunokomplexov cieľových bielkovín s protilátkou a ich detekcia.

Western blot:

Po skončení elektrotransferu sme membránu s naviazanými bielkovinami

vizualizovali farbením v roztoku 0,5 % Ponceau S, ktorý obsahoval 1 % kyselinu

octovú po dobu asi 1 aņ 5 minút. Po premytí v deionizovanej vode boli viditeľné iba

prúņky separovaných fragmentov bielkovín. Zaznačili sme polohu prúņkov a odfarbili

ich.

Bielkoviny sme na membráne blokovali ponorením do roztoku 1 % hovädzieho

sérového albumínu, ktorý bol rozpustený v TBS s pH 7,6 po dobu 1 hodiny. Membránu

sme následne premývali 4-krát po sebe po 15 min. v TBS 10-krát riedenom.

59

Naviazané bielkoviny sme nechali reagovať s prvou protilátkou – antigluténová

protilátka (riedenie 1:1 000 v blokovacom roztoku – BSA rozpustený v TBS) po dobu

1,5 hod. pri laboratórnej teplote (20 – 25 °C). Membránu sme premyli 5-krát po sebe po

15 min. v roztoku TBS 10-krát riedenom.

Reakciu s druhou protilátkou – protilátka značená enzýmom chrenová

peroxidáza (riedenie 1:2 000 v blokovacom roztoku – BSA rozpustený v TBS) sme

uskutočnili po dobu 1 hod. pri laboratórnej teplote (20 – 25 °C). Membránu sme

premyli 6-krát po sebe po 15 min. v roztoku TBS 10-krát riedenom.

Detekciu naviazaných bielkovín sme realizovali pomocou chromogénneho

substrátu, ktorým bol 3,3'-diaminobenzidín, aņ do úplného zafarbenie prúņkov.

3.3.6 ELISA (R-Biopharm, uņívateľská príručka: RIDASCREEN® Gliadin)

Enzýmová imunoadsorbentná analýza – ELISA (postup podľa pokynov výrobcu

konkrétneho kitu) je metóda detekcie a kvantifikácie látok, zaloņená na princípe

ńpecifickej väzby medzi antigénom a zodpovedajúcou protilátkou, pričom pri stanovení

alergénneho účinku bielkovín sme sledovali vplyv koncentrácie prolamínov, iónovej

sily a rôznych rozpúńťadiel na citlivosť stanovenia celiakálne aktívnych bielkovín.

Test RIDASCREEN®

Gliadin:

Sendvičová enzýmová imunoadsorbentná analýza kvantitatívneho stanovenia

prolamínov pńenice (gliadíny), raņe (sekalíny) a jačmeňa (hordeíny) je zaloņená na

reakcii monoklonálnej protilátky R5 reagujúcej s menovanými prolamínmi.

Ako ńtandardy test obsahoval gliadíny o koncentrácii 0, 5, 10, 20, 40, 80 ppm,

protilátka R5 bola viazaná v komplexe s enzýmom chrenová peroxidáza, pre ktorý bol

substrátom karbamid peroxid (CH6N2O3), farbivom – chromogénom bol

tetrametylbenzidín a fotometrické stanovenie imunokomplexov sme realizovali

meraním absorbancie pri vlnovej dĺņke 450 nm.

Extrakcia vzoriek:

Vzorky rastlinného materiálu sme homogenizovali v laboratórnom mlyne, čím

sme získali celozrnný ńrot. Do skúmaviek typu Falcon (50 ml) sme odváņili 0,25 g

vzorky a pridali sme 2,5 ml extrakčného roztoku (obsahuje 2-merkaptoetanol), ktorý je

60

súčasťou testu RIDASCREEN® Gliadin a zmes sme dôkladne premieńali. Vzorky sme

inkubovali 40 min. pri teplote 50 °C, ochladili na laboratórnu teplotu (20 – 25 °C)

a pridali sme 7,5 ml 80 % etanolu. Skúmavky sme uzatvorili a bielkoviny sme

extrahovali na trepačke počas 1 hod. pri laboratórnej teplote. Po odstredení pri 2 500

ot.min-1

počas 10 min. pri laboratórnej teplote sme získali supernatant, ktorý obsahuje

prolamínové bielkoviny. Supernatant je moņné skladovať v dobre uzatvorených

skúmavkách bez prístupu svetla pri laboratórnej teplote po dobu max. 4 týņdňov.

Pre reakciu s protilátkou sme bielkoviny riedili v základnom pomere

1:12,5 riediacim roztokom, ktorý je súčasťou testu RIDASCREEN® Gliadin. Výsledný

prepočítavací faktor riedenia bol 500. Podľa predpokladaného obsahu prolamínov vo

vzorkách sme robili ćalńie potrebné riedenia.

Stanovenie prolamínov metódou ELISA:

Do jamiek v mikrotitračnej platničke, v ktorých bola imobilizovaná

monoklonálna protilátka R5 sme napipetovali po 100 µl z kaņdého ńtandardu a vzoriek.

Reakcia tvorby imunokomplexov sa uskutočnila počas 30 min. pri laboratórnej teplote

(20 – 25 °C). Nenaviazaný obsah jamiek sme dekantovali a jamky sme vysuńili

pritlačením a poklepaním o filtračný papier. Vńetky vzorky a ńtandardy sme premyli

250 µl premývacieho roztoku, ktorý je súčasťou testu RIDASCREEN® Gliadin,

následne sme ho z jamiek dekantovali a jamky sme vysuńili pritlačením a poklepaním

o filtračný papier; vymývanie bolo potrebné uskutočniť aņ 3-krát.

Do jamiek sme pridali 100 µl konjugátu protilátky a enzýmu chrenová

peroxidáza a reakčnú zmes sme inkubovali 30 min. pri laboratórnej teplote. Po

inkubácii sme obsah jamiek dekantovali a jamky sme vysuńili pritlačením a poklepaním

o filtračný papier. Vńetky vzorky a ńtandardy sme premyli 250 µl premývacieho

roztoku, ktorý je súčasťou testu RIDASCREEN® Gliadin, následne sme ho z jamiek

dekantovali a jamky sme vysuńili pritlačením a poklepaním o filtračný papier;

vymývanie bolo potrebné uskutočniť aņ 3-krát.

K imunokomplexom, ktoré sa vytvorili v jamkách sme pridali 50 µl substrátu

a 50 µl chromogénu, mikrotitračnú platničku sme jemne premieńali a inkubovali v tme

počas 30 min. pri laboratórnej teplote. Enzýmovú reakciu sme zastavili pridaním 100 µl

zastavovacieho roztoku (obsahuje H2SO4), ktorý je súčasťou testu RIDASCREEN®

Gliadin a do 30 min. sme merali absorbanciu pomocou fotometra „ELISA reader“ pri

61

vlnovej dĺņke 450 nm. Koncentráciu celiakálne aktívnych bielkovín vo vzorkách sme

stanovili pomocou kalibračnej krivky, nameranej prostredníctvom ńtandardov so

známymi mnoņstvami bielkovín.

3.3.7 Matematicko-štatistické vyhodnotenie výsledkov

Získané výsledky sme vyhodnotili matematicko-ńtatistickými metódami,

pomocou programu Statgraphics. Ako základné ńtatistické analýzy, ktoré charakterizujú

súbor nameraných hodnôt , sme pouņili priemer ( x͞ ), smerodajnú odchýlku (s alebo ζ)

a variačný koeficient (VK).

Priemer ( x͞ ) sa vypočíta ako podiel úhrnu hodnôt k počtu pozorovaní, t. j.

vyjadruje objem skúmanej premennej na jedno pozorovanie (na jednu ńtatistickú

jednotku). Smerodajná odchýlka (s, ζ) predstavuje stranu priemerného ńtvorca odchýlok

jednotlivých hodnôt od stredu vyjadreného priemerom. Predstavuje druhú odmocninu

rozptylu, pretoņe rozptyl vyjadruje variabilitu v ńtvorcoch merných jednotiek. Variačný

koeficient (VK) predstavuje relatívnu mieru variability. Pouņíva sa na porovnávanie

variability medzi súbormi dát s odlińnými priemermi. Vypočíta sa ako podiel

smerodajnej odchýlky k priemeru a po vynásobení 100 dostaneme hodnotu v %.

Pre denzitometrickú analýzu polyakrylamidových gélov sme pouņili program

GelWorks.

62

4 Výsledky práce a diskusia

Vedecké práce zaoberajúce sa analýzou biochemických a technologických

vlastností prolamínov sú veľmi náročné, pretoņe tieto bielkoviny sa vyznačujú vysokou

heterogenitou a nerozpustnosťou v rôznych rozpúńťadlách. Prolamíny majú ńpecifickú

chemickú ńtruktúru. Tvorené sú komplexom mnohých polypeptidov, ktoré sa navzájom

odlińujú elektrickým nábojom, relatívnou molekulovou hmotnosťou, aminokyselinovým

zloņením a hodnotou izoelektrického bodu. Identifikácia niekoľkých alebo viacerých

alergénnych subfrakcií si vyņaduje ich predchádzajúcu separáciu a purifikáciu (Nałęcz

et al., 2009).

Dôleņitým kritériom pre stanovenie prítomnosti a obsahu prolamínov v zrne

cereálií je výber vhodnej analytickej metódy (Ebo, Stevens, 2001). Základnými

metódami pre stanovenie prítomnosti prolamínov sú frakcionácia cereálnych bielkovín

na základe ich rozdielnej rozpustnosti v rôznych rozpúńťadlách a elektroforetická

separácia bielkovín v polyakrylamidových géloch, SDS-PAGE a A-PAGE (Urminská et

al., 2009). Tieto metódy sú vńak nepostačujúce na dôkladnú analýzu prolamínového

komplexu zrna cereálií a preto sa v súčasnosti čoraz viac do popredia dostávajú

imunochemické metódy, ako je napr. ELISA (enzýmová imunoadsorbentná analýza)

a imunobloting po SDS-PAGE (Battais et al., 2003). Tieto metódy poskytujú dôleņité

informácie, ako pre medicínsky výskum, tak aj pre oblasť cereálnej chémie. Poukazujú

na imunoafinitu prolamínových bielkovín k sérovým protilátkam a na vzťahy medzi

ńtrukturálnymi vlastnosťami bielkovín a ich alergenicitou (Waga, Zientarski, 2007).

Dizertačná práca je orientovaná na optimalizáciu kvantitatívneho

a kvalitatívneho stanovenia prolamínovej frakcie bielkovín imunochemickými

analýzami v zrne cereálií, pseudocereálií a strukovín, so zameraním sa na celiakálne

aktívne subfrakcie týchto bielkovín a následne na návrh moņného vyuņitia skúmaných

plodín v bezlepkovej diéte.

4.1 Charakteristika bielkovinového komplexu analyzovaných cereálií,

pseudocereálií a strukovín

Obsah bielkovín a ich jednotlivých frakcií je významný ako z nutričného, tak aj

z technologického hľadiska. Tento obsah kolíńe v ńirokom rozmädzí, v závislosti od

63

druhu plodiny. V nami analyzovaných vzorkách, obsah hrubého proteínu varíroval od

7,02 % (ryņa) do 31,98 % (sója). Najvyńńí priemerný obsah hrubého proteínu v zrne

obilnín sme stanovili v zrne ovsa (13,04 %), potom v zrne pńenice (12,20 %), v zrne

jačmeňa (11,11 %), v zrne tritikale (9,82 %) a najniņńí obsah hrubého proteínu

obsahovalo zrno raņe (8,34 %) (Tabuľka 5, Tabuľka 6 a Tabuľka 7).

Pseudocereálie v súčasnosti nemajú porovnateľný význam ako tradičné obilniny,

no aj napriek tomu sa významne podieľajú na zlepńovaní výņivy obyvateľstva

v niektorých častiach sveta. Taktieņ zohrávajú dôleņitú úlohu vo výņive ľudí, ktorí trpia

intoleranciou na klasické obilniny. Medzi najvýznamnejńie pseudocereálie patria

láskavec, pohánka a quinoa (Fletcher, 2004). Z nańich analýz vyplýva, ņe najvyńńí

priemerný obsah hrubého proteínu bol stanovený v semene láskavca (14,07 %),

a pohánky (11,10 %), a najmenńí podiel hrubého proteínu obsahovalo semeno prosa

(7,20 %) (Tabuľka 8). Zo vńetkých analyzovaných druhov cereálií a pseudocereálií,

najvyńńí podiel hrubého proteínu obsahoval láskavec (14,07 %) a najniņńí proso (7,20

%).

Okrem obilnín, sú ekonomicky významnými plodinami ryņa a kukurica, ktorých

svetová produkcia je na prvých dvoch miestach. Hoci v ryņi sme stanovili priemerný

obsah hrubého proteínu iba 7,70 % (Tabuľka 9), bielkoviny ryņe sú plnohodnotné a

majú priaznivé aminokyselinové zloņenie. Juliano (2004) uvádza, ņe ryņa má najniņńí

obsah bielkovín (7 %) spomedzi vńetkých cereálií, ale na rozdiel od nich má najvyńńiu

koncentráciu esenciálnej aminokyseliny lyzínu. Vysoký obsah lyzínu v bielkovinách

ryņe sa dáva do súvislosti s nízkym podielom prolamínovej frakcie. V kukurici sme

stanovili mnoņstvo hrubého proteínu 10,27 % (Tabuľka 9), čo je porovnateľné napríklad

s tritikale.

Z analýz vybraných druhov strukovín vyplýva, ņe obsah hrubého proteínu bol

takmer dvojnásobne vyńńí v porovnaní s cereáliami (priemerne 22,47 %) (Tabuľka 10).

Vyváņené aminokyselinové zloņenie bielkovinového komplexu strukovín je výborným

nutričným doplnkom v bezlepkovej diéte. Podľa Michaelsa (2004), majú stukoviny

vysokú koncentráciu lyzínu a nízky obsah metionínu, kým v zrne cereálií je to naopak.

Obsah bielkovín v zrne cereálií je dôleņitým faktorom ovplyvňujúcim ich

výņivovú hodnotu a tieņ spracovateľskú kvalitu, predovńetkým čo sa týka pńenice

a jačmeňa. Napríklad vyńńia koncentrácia bielkovín sa vyņaduje v pńeniciach určených

pre pekárske účely a naopak, niņńie mnoņstvo bielkovín sa vyņaduje v jačmeni

64

pouņívanom v pivovarníctve. Na mnoņstvo bielkovín majú vplyv ako genetické, tak aj

environmentálne faktory (Shewry, 2004).

Spomedzi vńetkých cereálií, je pńenica unikátnou obilninou, pretoņe obsahuje

komplex bielkovín, ktoré majú schopnosť vytvárať ńtruktúru cesta, čo je ņiadúce pri

výrobe chleba a ćalńích pekárskych výrobkov. Z tohto pohľadu patrí pńenica medzi

najdôleņitejńie zdroje bielkovín v ľudskej výņive (Gianibelli et al., 2001).

V analyzovaných odrodách pńenice (vrátane pńenice ńpaldovej) sme stanovili obsah

celkového dusíka podľa Kjeldahla, hrubého proteínu a jednotlivých bielkovinových

frakcií (Tabuľka 5).

Tabuľka 5 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna pńenice letnej (Triticum

aestivum L.), pńenice tvrdej (Triticum durum L.) a pńenice ńpaldovej (Triticum spelta

L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

protein,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Pšenica letná – ozimná

Arida 2,25 12,83 20,00 38,75 31,22 8,73 74,14

Balaton 1,82 10,37 25,38 35,36 27,69 9,98 100,00

Blava 2,05 11,69 22,61 36,33 29,44 10,94 92,35

Brea 2,08 11,86 23,65 36,51 29,72 8,77 88,80 Hana 2,25 12,83 21,87 38,75 28,11 9,98 82,19

ID

Karpatia 2,10 11,97 21,34 39,35 32,65 6,65 71,13

Ignis 1,82 10,37 24,62 36,90 31,52 6,91 85,45

Markola 1,82 10,37 26,92 35,36 30,76 6,91 95,67

Viginta 1,96 11,17 22,86 38,59 29,99 8,55 81,39

Vlada 2,47 14,08 21,02 39,77 27,26 11,38 81,47

Pšenica letná – jarná

Granny 2,16 12,31 26,66 36,69 24,67 11,36 103,62

Saxana 2,08 11,86 25,67 36,51 27,02 10,12 98,03

Pšenica tvrdá

Riveldur 2,25 12,83 24,99 39,38 28,73 6,24 79,30

Soldur 2,10 11,97 26,00 36,69 27,33 9,32 96,27

Pšenica špaldová

Ceralio 2,50 14,25 24,71 44,93 23,59 6,73 69,98

Rubiota 2,53 14,42 22,22 44,44 28,32 4,99 61,23

x 2,14 12,20 23,78 38,39 28,63 8,60 85,06

σ 0,23 1,31 2,14 2,84 2,42 1,99 12,16

VK 10,75 10,74 9,00 7,40 8,45 23,14 14,30

Vysvetlivky: Alb – albumíny, Glo – globulíny, KNK – koeficient nutričnej kvality,

x – priemer, σ – smerodajná odchýlka, VK – variačný koeficient

Odrody pńenice letnej forma ozimná (Arida, Balaton, Blava, Brea, Hana, ID

Karpatia, Ignis, Markola, Viginta a Vlada) sa v zastúpení jednotlivých bielkovinových

65

frakcií nelíńili od odrôd pńenice letnej forma jarná (Granny a Saxana). Najvyńńiu

koncentráciu protoplazmatických bielkovín, teda albumínov a globulínov sme stanovili

v zrne odrôd Markola (26,92 %) a Granny (26,66 %), na druhej strane, najmenńí podiel

tejto bielkovinovej frakcie obsahovalo zrno odrody Arida (20,00 %). Zastúpenie

prolamínových bielkovín bolo v rozsahu 35,36 % (Balaton a Markola) aņ 39,77 %

(Vlada). Zistili sme, ņe zrno pńenice letnej obsahuje 24,67 % (Granny) aņ 32,65 % (ID

Karpatia) glutelínov. Jarná forma pńenice letnej mala vyńńí podiel látok označovaných

ako N-zvyńok (10,12 – 11,36 %) ako ozimná forma (6,65 – 11,38 %). Koeficient

nutričnej kvality, ktorý dáva do vzťahu obsah výņivovo plnohodnotných bielkovín typu

albumínov a globulínov a obsah prolamínových bielkovín bol najvyńńí pre bielkoviny

zrna odrody Granny (103,62 %) a najniņńí pre bielkoviny zrna odrody ID Karpatia

(71,13 %). Z nańich analýz vyplýva, ņe bielkovinový komplex zrna pńenice tvrdej,

odrody Riveldur a Soldur, sa v zastúpení jednotlivých frakcií nelíńi od pńenice letnej.

Prekvapivým zistením bolo stanovenie najvyńńích koncentrácií prolamínových biekovín

v zrne pńenice ńpaldovej, odrôd Ceralio a Rubiota, a to viac ako 44 %; čo sa odrazilo aj

na najniņńích hodnotách koeficientu nutričnej kvality (61,23 – 69,98 %). Na základe

získaných výsledkov môņeme konńtatovať, ņe zrno pńenice (letnej, tvrdej a ńpaldovej)

obsahuje v priemere 23,78 % bielkovín typu albumínov a globulínov (od 20,00 % do

26,92 %), ćalej 38,39 % prolamínov (od 35,36 % do 44,93 %) a 28,63 % glutelínových

bielkovín (od 24,67 % do 32,65 %). Najmenńiu variabilitu sme zistili v prolamínovej

frakcii (Tabuľka 5).

Prolamíny patria medzi zásobné bielkoviny, kým albumíny a globulíny medzi

bielkoviny protoplazmatické (Waga et al., 2006). Prolamíny sa syntetizujú v prvej fáze

ņivotného cyklu počas vývinu semena a ukladajú sa do zásoby ako zdroj dusíka a síry

počas fázy dozrievania semena (Matta et al., 2009). Endosperm zrna cereálií je hlavným

miestom akumulácie prolamínových bielkovín, ktoré pozostávajú prevaņne z krátkych

peptidov a obsahujú iba málo elektricky nabitých molekúl aminokyselín a z toho

dôvodu sú nerozpustné vo vodných roztokoch (Holding, Larkins, 2009). Ako uvádzajú

výskumy a ńtúdie mnohých autorov (Bietz, 1982; Shewry, Tatham, 1990; Bekes et al.,

2004; Belitz et al., 2009), prolamíny sú hlavnou frakciou pńeničných bielkovín.

Z ostatných konvenčných obilnín, najvyńńie zastúpenie prolamínovej frakcie

obsahoval jačmeň (v priemere 33,34 %), kde v jednotlivých odrodách obsah prolamínov

varíroval od 27,79 % (Gerlach) do 39,38 % (Amsterdam). V práci sme analyzovali

66

odrody jačmeňa siateho forma jarná (Levan, Ludan, Radegast a Sladar) a forma ozimná

(dvojradový – Amsterdam a Babette, a ńesťradový – Gerlach a Luran). Albumíny

a globulíny tvoria v priemere 23,74 % bielkovín zrna jačmeňa, pričom sme nezistili

významné rozdiely medzi odrodami jarnej a ozimnej formy. Najniņńiu koncentráciu

protoplazmatických bielkovín sme stanovili v zrne odrody Amsterdam (21,25 %),

naproti tomu najviac albumínov a globulínov obsahovalo zrno odrody Levan (27,51 %).

Pri tejto bielkovinovej frakcii sa prejavila najmenńia variabilita medzi jednotlivými

odrodami. Glutelíny tvorili v priemere 29,43 %; a to od 24,18 % v zrne odrody Levan

do 34,23 % v zrne odrody Babette. Čo sa týka koeficientu nutričnej kvality, tak

priemerná hodnota pre bielkoviny jačmenného zrna je 109,74 %; čo je o 24 % viac ako

je hodnota pre pńeničné bielkoviny (Tabuľka 6).

Tabuľka 6 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna jačmeňa siateho (Hordeum

vulgare L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

proteín,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Jačmeň siaty – ozimný

Amsterdam 2,25 12,83 21,25 39,38 26,86 11,27 82,58

Babette 2,04 11,63 22,61 30,13 34,23 12,35 116,03

Gerlach 1,52 8,66 25,02 27,79 32,41 12,94 136,60

Luran 1,68 9,58 24,18 30,01 31,67 12,48 122,16

Jačmeň siaty – jarný

Levan 1,68 9,58 27,51 33,33 24,18 13,31 122,47

Ludan 1,96 11,17 22,86 35,69 30,70 10,69 94,00

Radegast 2,16 12,31 22,73 33,80 29,21 13,01 105,74

Sladar 2,30 13,11 23,77 36,59 26,21 12,21 98,33

x 1,95 11,11 23,74 33,34 29,43 12,28 109,74

σ 0,29 1,66 1,90 3,87 3,45 0,90 17,76

VK 14,87 14,94 8,00 11,61 11,72 7,33 16,18



Tritikale je medzidruhovým kríņencom pńenice a raņe, a preto aj podiel

prolamínov z celkového obsahu bielkovín bude vyńńí, čo potvrdili aj nańe analýzy.

Frakčnú skladbu sme stanovili v dvoch odrodách ozimnej formy (Kendo a Kinerit)

a v jednej odrode jarnej formy (Wanad). V zrne tritikale je takmer rovnaký podiel

protoplazmatických (32,64 %) a prolamínových (32,31 %) bielkovín. Najmenej

zastúpenou frakciou sú glutelíny (22,90 %). Medzi odrodami, ani formami tritikale sme

nezaznamenali výrazné odlińnosti v kvantitatívnom zastúpení jednotlivých

bielkovinových frakcií. Vysoký podiel albumínov a globulínov sa prejavil aj v náraste

67

hodnôt koeficientu nutričnej kvality, ktorý bol v priemere 137,89 % (Tabuľka 7).

V analyzovanej odrode raņe (Dankowskie Nowe) bol obsah prolamínov pomerne nízky

(25,51 %) v porovnaní s pńenicou. Na druhej strane, obsah albumínovej a globulínovej

frakcie bol najvyńńí (39,20 %), spomedzi vńetkých obilnín, čo výrazne zvýńilo hodnotu

koeficientu nutričnej kvality na 207,37 % (Tabuľka 7).

Vo vzťahu k celiakii je najviac diskutovanou obilninou ovos. Analyzovali sme

dve odrody ovsa plevnatého (Ardo a Atego) a dve odrody ovsa nahého (Detvan a Izák).

Výrazne najvyńńie zastúpenie sme stanovili pre frakciu glutelínov, ktoré tvoria aņ 40,37

% vńetkých bielkovín zrna ovsa. Prolamíny boli stanovené ako minoritná frakcia,

pričom ich obsah dosahoval hodnoty od 13,72 % (Atego) do 20,02 % (Ardo), čo je

najniņńie v porovnaní s pńenicou, jačmeňom, tritikale alebo raņou. Práve pre tento nízky

obsah prolamínov sa o ovse uvaņuje ako o surovine, ktorá môņe byť súčasťou výņivy

tých celiatikov, ktorí nemajú agresívny prejav ochorenia a mohli by prolamíny ovsa

tolerovať (Tabuľka 7).

Tabuľka 7 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna raņe siatej (Secale cereale

L.), tritikale (Triticosecale) a ovsa siateho (Avena sativa L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

proteín,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Raž siata

Dankowskie

Nowe 1,43 8,34 39,20 25,51 19,64 13,70 207,37

Tritikale

Kendo 1,52 8,66 33,33 32,41 23,17 11,09 137,06

Kinerit 1,74 9,92 32,24 31,44 24,20 12,07 140,94

Wanad 1,91 10,89 32,34 33,07 21,33 12,53 135,68

x 1,72 9,82 32,64 32,31 22,90 11,90 137,89

σ 0,20 1,12 0,60 0,82 1,45 0,74 2,73

VK 11,63 11,41 1,84 2,54 6,33 6,22 1,98

Ovos siaty

Ardo 1,68 9,79 33,33 20,02 35,83 9,98 216,33

Atego 2,05 11,95 28,76 13,72 44,53 11,67 294,68

Detvan (nahý) 2,69 15,68 32,83 16,67 41,66 8,32 246,85

Izák (nahý) 2,53 14,75 33,35 19,45 39,45 7,76 211,36

x 2,24 13,04 32,07 17,47 40,37 9,43 242,31

σ 0,46 2,69 2,22 2,89 3,67 1,76 38,28

VK 20,54 20,63 6,92 16,54 9,09 18,66 15,80



V pseudocereáliach, na rozdiel od ostatných obilnín, sú hlavnou bielkovinovou

frakciou albumíny a globulíny, pričom prolamíny sa nachádzajú iba v minimálnom

68

mnoņstve z celkového obsahu bielkovín. V práci sme analyzovali tri odrody pohánky

jedlej (FAG 120/82, Pyra a Ńpačinská), láskavec (odroda Koniz) a proso siate (odroda

Unikum). Najväčńie zastúpenie albumínov a globulínov sme stanovili v semene

láskavca (58,53 %). V pohánke sa obsah tejto frakcie pohyboval v rozpätí 44,21 – 55,87

%. Proso ako jediné malo pomerne nízky podiel albumínov a globulínov (15,52 %),

pričom práve v najväčńom mnoņstve v semene prosa bol stanovený nerozpustný N-

zvyńok (aņ 64,45 %). Obsah prolamínov bol najniņńí v semene pohánky (v priemere

3,52 %) a v prose (4,43 %). V láskavci bol obsah prolamínov o niečo vyńńí (18,75 %).

Nízky podiel prolamínovej frakcie predurčuje vyuņitie pseudocereálií ako potenciálnych

surovín pre potreby bezlepkovej diéty. Pomer v zastúpení frakcie protoplazmatických

bielkovín a prolamínov výrazne zvýńil hodnotu koeficientu nutričnej kvality, ktorá je

pre bielkoviny pohánky odrody Ńpačinská aņ 2 775,51 % (Tabuľka 8).

Tabuľka 8 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu semena pohánky jedlej

(Fagopyrum esculentum Moench), láskavca (Amaranthus hypochondriacus L.) a prosa

siateho (Panicum miliaceum L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

protein,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Pohánka jedlá

FAG 120/82

1,96 11,76 45,72 4,28 18,58 30,70 1 785,51

Pyra 1,68 10,08 44,21 3,33 15,03 36,66 2 428,53

Ńpačinská 1,91 11,46 55,87 2,94 14,73 25,73 2 775,51

x 1,85 11,10 48,60 3,52 16,11 31,03 2 329,85

σ 0,15 0,90 6,34 0,69 2,14 5,47 502,32

VK 8,11 8,11 13,05 19,60 13,28 17,63 21,56

Láskavec

Koniz 2,47 14,07 58,53 18,75 22,72 0 312,16

Proso siate

Unikum 1,26 7,20 15,52 4,43 15,52 64,45 1 805,19



Ryņa a kukurica patria, podobne ako pseudocereálie, medzi plodiny s nízkym

zastúpením prolamínovej frakcie bielkovín a sú základom bezlepkovej diéty pre

celiatikov. Analyzovali sme biologický materiál, ktorý sme zakúpili v obchode

ńpecializujúcom sa na produkty zdravej výņivy a diétne potraviny, vrátane bezlepkovej

diéty, pretoņe v génovej banke neuchovávajú tieto rastlinné druhy. Majoritnou frakciou

v zrne ryņe a kukurice sú glutelíny. Ich priemerný obsah v nami analyzovaných

69

vzorkách bol 47,08 % v zrne ryņe a 32,79 % v zrne kukurice. V kukurici sme stanovili

pomerne vysoké mnoņstvo tzv. nerozpustného N-zvyńku (45,12 %). Priemerný podiel

prolamínovej frakcie bol v zrne ryņe 4,31 % a v zrne kukurice 3,27 %. Tento obsah

prolamínov je porovnateľný s obsahom prolamínov v pohánke a v prose. Analyzované

vzorky ryņe sa výrazne líńia koncentráciami protoplazmatických bielkovín. Najvyńńí

podiel albumínov a globulínov obsahovala ryņa natural (17,83 %), potom ryņa lúpaná

guľatá (16,25 %) a najmenej bielkovín tohto typu sme stanovili v ryņi Basmati (9,41 %).

Tento druh ryņe je síce vńeobecne prezentovaný ako najuńľachtilejńí, najlepńie

stráviteľný a najkvalitnejńí, ale na základe nańich výsledkov pre konzumáciu

odporúčame ryņu natural (Tabuľka 9).

Tabuľka 9 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu zrna ryņe siatej (Oryza sativa

L.) a kukurice siatej (Zea mays L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

proteín,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Ryža siata

Basmati 1,49 8,87 9,41 4,71 47,14 37,73 1 000,85

lúpaná

guľatá 1,21 7,20 16,25 4,64 48,84 29,10 977,37

natural 1,18 7,02 17,83 3,57 45,25 32,17 1 400,56

x 1,29 7,70 14,50 4,31 47,08 33,00 1 126,26

σ 0,17 1,02 4,48 0,64 1,80 4,37 237,84

VK 13,18 13,25 30,90 14,85 3,82 13,24 21,12

Kukurica siata

neurčená

odroda 1,71 10,27 17,24 3,27 32,79 45,12 1 907,03



Okrem obilnín patria medzi veľmi významné zloņky ľudskej výņivy strukoviny.

V svetovej produkcii zaberajú druhé miesto hneć po obilninách. Kećņe semená

strukovín obsahujú 2 aņ 3-krát viac bielkovín ako zrná cereálií, sú veľmi cenným

a dôleņitým zdrojom týchto bielkovín (Sathe, Venkatachalam, 2004). Z celkového

obsahu bielkovín, hlavnú frakciu predstavovali albumíny a globulíny (v priemere 73,24

%). Najväčńie mnoņstvo tejto fracie sme stanovili v dvoch analyzovaných odrodách

cícera (~ 83 %) a v hrachori (80,12 %). V semenách sóje bol stanovený 45,75 % podiel

albumínov a globulínov. Zásobné bielkoviny sa nachádzali vo veľmi malom mnoņstve,

pričom prolamíny tvorili v semenách strukovín priemerne 1,44 % z celkového obsahu

bielkovín. Výsledky získané analýzou frakčnej skladby bielkovín strukovín výrazne

70

ovplyvnili aj výpočet koeficientu nutričnej kvality. Hodnota KNK bielkovín sóje je

5 217,33 % a hrachora 5 247,50 %, ale bielkoviny cícera majú hodnotu KNK aņ

6 427,34 – 7 090,40 % (Tabuľka 10). Koeficient nutričnej kvality sa nepovaņuje za

najvýznamnejńí ukazovateľ biologickej, resp. výņivovej hodnoty bielkovín, tým je

Index esenciálnych aminokyselín, ale nepriamo poukazuje na vyuņiteľnosť

a stráviteľnosť daných bielkovín, pretoņe priamo-úmerne závisí od obsahu albumínov

a globulínov, ktoré sú ľahko rozpustné a hydrolyzovateľné enzýmami tráviaceho traktu.

Pre celiatikov, ktorí môņu trpieť určitou podvýņivou alebo malnutríciou, môņe byť

informácia o KNK odporúčaním pre konzumáciu určitej suroviny a výrobkov z nej.

Tabuľka 10 [Frakčná skladba bielkovinového komplexu semena cícera baranieho

(Cicer arietinum L.), hrachora siateho (Lathyrus sativus L.) a sóje obyčajnej (Glycine

soja L.)]

Odroda N celk.,

%

Hrubý

proteín,

%

Alb+Glo,

%

Prolamíny,

%

Glutelíny,

%

N-zvyšok,

%

KNK,

%

Cícer baraní

Punjab 2,25 13,47 83,74 1,25 9,98 4,89 7 090,40

Slovák 3,03 18,18 83,33 1,39 9,27 6,01 6 427,34

Hrachor siaty

Arida 4,38 26,26 80,12 1,60 13,14 3,84 5 247,50

Sója obyčajná

neurčená

odroda 5,61 31,98 45,75 1,50 18,75 32,51 5 217,33

x 3,82 22,47 73,24 1,44 12,79 11,81 5 995,64

σ 1,48 8,25 18,39 0,15 4,32 13,83 922,02

VK 38,74 36,72 25,11 10,42 33,78 117,10 15,38



Aj podľa Belitza et al. (2009), sú rôzne druhy obilnín veľmi variabilné v zloņení

a mnoņstve jednotlivých bielkovinových frakcií. Pńenica má najvyńńí obsah

prolamínovej frakcie. Albumíny sú zastúpené v najväčńom mnoņstve v raņi

a v najmenńom mnoņstve v kukurici. Obsah albumínov v zrne ovsa je porovnateľný

s obsahom albumínov v raņi. Ovos, spolu s ryņou, má taktieņ vyńńiu koncentráciu

glutelínov v porovnaní s pńenicou, kým raņ a proso obsahujú malý podiel glutelínovej

frakcie. Navyńe, prolamíny obilnín z rodu Triticeae majú relatívne podobné

aminokyselinové zloņenie, čo môņe byť príčinou toho, ņe vńetky vyvolávajú celiakálne

ochorenie.

71

Abdel-Aal et al. (1995) analyzovali vo svojej práci niekoľko kultivarov pńeníc,

vrátane Triticum monococcum a Triticum spelta, pričom dospeli k záveru, ņe väčńí

obsah bielkovín obsahovala práve pńenica ńpaldová a Triticum monococcum,

v porovnaní s pńenicami s vyńńím podielom ńkrobnatej zloņky. V dvoch kultivaroch

pńenice ńpaldovej bol tento obsah 16 % a v Triticum monococcum 16,5 %. Podobné

výsledky získali aj Bojňanská a Frančáková (2002), ktoré analyzovali 5 odrôd pńenice

ńpaldovej, z ktorých vńetky vykazovali vysoké hodnoty obsahu bielkovín (viac ako 15

%). Rozdiely medzi pńenicou letnou a pńenicou ńpaldovou nie sú len v celkovom

obsahu bielkovín, ale aj v obsahu jednotlivých frakcií. Pruska-Kędzior et al. (2008)

metódou RP-HPLC zistili v pńenici ńpaldovej väčńí obsah gliadínov a menńí podiel

glutenínov, pričom pomer gliadínov a glutenínov je významne vyńńí ako v pńenici letnej

a dominantnou frakciou sú α-gliadíny, za nimi nasledujú γ-gliadíny a LMW glutenínové

podjednotky a minoritný podiel majú ω-gliadíny a HMW glutenínové podjednotky.

Yalçin (2010) sa vo svojej práci zaoberal chemickými a funkčnými vlastnosťami

jačmenných múk a ich foriem s čiastočne odstránenými prolamínmi pomocou extrakcie

so 70 % etanolom. Jedným zo sledovaných parametrov bol aj obsah hrubého proteínu,

ktorý stanovil na 9 – 13,7 % a v múkach s čiastočne odstránenými prolamínmi bol tento

obsah zníņený na 5,4 – 8,6 %. Zároveň uvádza, ņe hlavnou frakciou bielkovín v jačmeni

sú hordeíny (35 – 55 %) a glutelíny (35 – 45 %). V nańej práci sme zistili, ņe jačmeň

obsahuje v priemere 33,34 % hordeínov a 29,43 % glutelínov. Vo svojej predońlej práci

Yalçin et al. (2008) popisujú, ņe v súčasnosti existuje iba veľmi málo odrôd jačmeňa

určených pre humánnu výņivu, väčńina odrôd sa pouņíva pre produkciu sladu

v pivovarníctve.

Na rozdiel od pńenice, jačmeňa alebo raņe, tvoria prolamíny v zrne ovsa a ryņe

minoritnú frakciu bielkovín. Chen et al. (1997) uvádzajú, ņe prolamíny v ovse a ryņi

tvoria menej ako 15 % celkového obsahu bielkovín. Dominantnou frakciou sú v zrne

ovsa globulíny a v zrne ryņe glutelíny, ktoré sú homológne s bielkovinami strukovín, aj

napriek rozdielom v rozpustnosti. Iní autori (Bietz, 1982; Dong et al., 1999) uvádzajú,

ņe prolamíny sa v zrne ryņe vyskytujú v menńom mnoņstve (< 3 %), ako je tomu v zrne

ovsa. Navyńe prolamíny ryņe sú heterogénne a viac komplexnejńie, čo komplikuje ich

charakterizáciu.

Aveníny ovsa sú ńtrukturálne odlińné od gliadínov pńenice a prolamínov

jačmeňa a raņe, hoci niektoré sekvencie sú homológne. Vńeobecne, sú aveníny v ovse

72

zastúpené v oveľa menńom mnoņstve ako prolamíny v iných obilninách. Podľa Garseda

a Scotta (2007) reprezentujú aveníny v zrne ovsa iba 5 – 15 % celkového obsahu

bielkovín, na rozdiel od ostatných druhov Triticae, kde prolamíny tvoria aņ 50 %. Butt

et al. (2008) vo svojej ńtúdii uvádzajú, ņe kým v pńenici sa prolamíny môņu nachádzať

v mnoņstve 40 – 50 %, v raņi 30 – 50 % a v jačmeni 35 – 45 %, tak v ovse, aveníny

predstavujú iba 10 – 15 % z celkového obsahu bielkovín. V nami analyzovaných

odrodách ovsa sme stanovili priemerný obsah avenínov 17,47 %. Z hľadiska

aminokyselinového zloņenia sú bielkoviny ovsa veľmi kvalitné a plnohodnotné, pretoņe

obsahujú dostatočné mnoņstvo esenciálnych aminokyselín, predovńetkým lyzínu,

ktorého je v zrne ovsa priemerne 4,2 % zo vńetkých aminokyselinových zvyńkov

(Gajdońová, Ńturdík, 2004). Rovnako, kombinácia relatívne vysokého obsahu

globulínov a nízkeho obsahu prolamínov, spoločne s vysokým podielom hrubého

proteínu (15 %), robí z ovsa výborný zdroj nutrične kvalitnej bielkoviny v porovnaní

s ostatnými obilninami (Matta et al., 2009).

Petr et al. (2003) vo svojej práci analyzovali ńirokú ńkálu rôznych rastlinných

surovín, medzi ktorými boli aj pseudocereálie. Najvyńńí obsah hrubého proteínu

stanovili v semene láskavca Amaranthus hypochondriacus (15,3 %). Zároveň tento druh

vykazoval aj najvyńńí podiel albumínov a globulínov (56,2 %), pričom prolamíny sa

nachádzali v minimálnom mnoņstve (3,3 %). V semenách láskavca Amaranthus

cruentus bol stanovený niņńí obsah hrubého proteínu (12,4 %) ako v semenách A.

hypochondriacus. Podobné zloņenie frakčnej skladby stanovili aj v semene pohánky,

kde z celkového obsahu bielkovín (6,7 %), najväčńie zastúpenie mala frakcia albumínov

a globulínov (50,0 %) a najmenńie frakcia prolamínov (6,2 %). Pri analýze semena

prosa zistili, ņe najväčńí podiel predstavoval nerozpustný zvyńok (67,5 %), pričom

prolamíny boli opäť minoritnou frakciou (6,7 %), z celkového obsahu bielkovín (9,6

%). Muchová et al. (2000) stanovili najvyńńí priemerný obsah hrubého proteínu

v semenách druhu Amaranthus cruentus (17,2 %) a najniņńí v semenách druhu

Amaranthus hypochondriacus (15,7 %). Na prepočet tohto obsahu pouņili prepočítavací

koeficient 6,25; kým Petr et al. (2003) vychádzali z koeficientu 5,7. Z rozborov frakčnej

skladby stanovili najväčńí podiel albumínov a globulínov (74,6 %) v semenách A.

hypochondriacus. Porovnaním zastúpenia jednotlivých bielkovinových frakcií dospeli

k záveru, ņe najväčńiu nutričnú hodnotu mal práve A. hypochondriacus.

73

Parameswaran a Thayumanavan (1995) sa zaoberali analýzou frakčnej skladby

a elektroforetickou separáciou bielkovinového komplexu viacerých druhov prosa, medzi

ktorými bolo aj proso siate (Panicum miliaceum L.). Celkový obsah bielkovín sa

pohyboval medzi 10,5 – 12,9 %, v závislosti od druhu prosa, pričom v prose siatom to

bolo 12,3 %, ale my sme stanovili iba 7,19 %. Frakcionácia bielkovinového komplexu

odhalila, ņe prolamínová frakcia tvorila 15,8 – 29,4 % z celkového obsahu bielkovín,

pričom glutelíny tvorili 45,8 – 55,0 %, a to vo vńetkých druhoch prosa, s výnimkou

mohára talianskeho (Setaria italica L.), v ktorého semenách prolamíny predstavovali aņ

60 % a glutelíny iba 15,2 %. V nańich analýzach predstavoval najväčńí podiel v semene

prosa siateho tzv. N-zvyńok, a to aņ 64,45 %. Tieto zistenia potvrdzujú skutočnosť, ņe

metóda frakcionácie bielkovín neposkytuje jednoznačné výsledky, pretoņe rozpustnosť

bielkovín nie je exaktná, takáto separácia proteínov nemá presné ohraničenie.

Na základe získaných výsledkov môņeme konńtatovať, ņe pre pseudocereálie je

charakteristická odlińná frakčná skladba v porovnaní s konvenčnými obilninami.

Láskavec, pohánka alebo proso sa vyznačujú frakčnou skladbou, ktorá je pre vysoký

podiel protoplazmatických bielkovín čiastočne porovnateľná so strukovinami. Vysoký

obsah frakcie tzv. nerozpustného N-zvyńku v semene prosa siateho je pravdepodobne

spôsobený nedostatočnou solubilitou bielkovín v pouņitom systéme rozpúńťadiel. Tieto

závery potvrdzujú aj Michalík et al. (2006).

Z percentuálneho zastúpenia jednotlivých frakcií bielkovín bol vypočítaný

koeficient nutričnej kvality, ktorý je jedným z paramentrov charakterizujúcim nutričnú

kvalitu zrna obilnín. Z tradičných obilnín, najvyńńiu priemernú hodnotu koeficientu

nutričnej kvality sme stanovili pre bielkoviny zrna ovsa (242,31 %). Z ostatných obilnín

hodnota koeficientu varírovala od 61,23 % pre bielkoviny zrna pńenice ńpaldovej do

103,62 % pre bielkoviny zrna pńenice letnej; bielkoviny zrna jačmeňa majú hodnoty

KNK od 82,58 % do 136,60 %; bielkoviny zrna tritikale od 135,68 % do 140,94 %

a raņné bielkoviny majú hodnotu KNK 207,37 %. V bielkovinách zrna ryņe, kukurice

a pseudocereálií bola hodnota koeficientu nutričnej kvality oveľa vyńńia, a to vćaka

vysokému podielu protoplazmatických bielkovín a nízkemu zastúpeniu prolamínových

bielkovín. Priemerná hodnota koeficientu bielkovín ryņe dosiahla 1 126,26 %

a bielkovín kukurice 1 907,03 %. Z analyzovaných druhov pseudocereálií, najvyńńiu

hodnotu koeficientu nutričnej kvality sme určili pre bielkoviny pohánky (v priemere

2 329,85 %) a prosa (1 805,19 %), na druhej strane najmenńiu hodnotu koeficientu mali

74

bielkoviny láskavca (312,16 %). Eńte vyńńie hodnoty koeficientu nutričnej kvality boli

vypočítané pre bielkoviny strukovín, pretoņe hlavnou frakciou bielkovín v semenách

strukovín sú protoplazmatické bielkoviny (albumíny a globulíny). V bielkovinách

semien sóje bola hodnota koeficientu 5 217,33 %, v bielkovinách hrachora 5 247,50 %

a najvyńńiu hodnotu sme určili pre bielkoviny cícera (6 427,34 – 7 090,40 %). Podobné

výsledky uvádzajú aj niektorí ćalńí autori (Michalík et al., 2006; Urminská et al., 2010),

ktorí analýzou bielkovinového komplexu rôznych rastlinných surovín zistili vysokú

variabilitu nielen v obsahu celkových bielkovín, ale aj v zastúpení jednotlivých

bielkovinových frakcií.

4.2 Biochemická charakteristika zásobných bielkovín endospermu

zrna analyzovaných cereálií, pseudocereálií a strukovín

Vńeobecne sa zásobné bielkoviny obilnín rozdeľujú na rozpustné prolamíny

a nerozpustné glutelíny. Jednotlivé subfrakcie prolamínov sú klasifikované do rôznych

skupín predovńetkým na základe ich rozdielnej rozpustnosti a elektroforetického

delenia. V závislosti od ńtruktúry týchto bielkovín a ich relatívnej molekulovej

hmotnosti sa rozdeľujú do troch skupín, a to na vysokomolekulárne podjednotky

(HMW), podjednotky so strednou molekulovou hmotnosťou (MMW)

a nízkomolekulárne podjednotky (LMW). Oveľa precíznejńie rozdelenie individuálnych

prolamínových bielkovín umoņňuje determinácia kompletných aminokyselinových

sekvencií s rozdielnym aminokyselinovým zloņením a molekulovou hmotnosťou

(Shewry, 2004; Wieser, Koehler, 2008).

Na základe aminokyselinového zloņenia prolamínov v rôznych plodinách,

viacerí autori (Shewry et al., 1984; Vaccino et al., 2009) rozčleňujú prolamíny na

prolamíny bohaté na síru (S-rich), prolamíny chudobné na síru (S-poor)

a vysokomolekulárne prolamíny (HMW). Medzi prolamíny bohaté na síru patria α- a γ-

gliadíny a LMW podjednotky v pńenici, γ-sekalíny v raņi a B- a γ-hordeíny v jačmeni.

Medzi prolamíny chudobné na síru patria ω-gliadíny v pńenici, ω-sekalíny v raņi a C-

hordeíny v jačmeni. Medzi HMW prolamíny patria HMW podjednotky v pńenici,

HMW-sekalíny v raņi a D-hordeíny v jačmeni.

Najkomplexnejńi ńtúdie boli vykonané na pńeničných prolamínoch. Viacerí

autori (Belitz et al., 2009; Matta et al., 2009; van den Broeck et al., 2009 a 2010; van

75

Eckert et al., 2010) na základe elektroforetickej pohyblivosti, teda relatívnej

molekulovej hmotnosti a aminokyselinového zloņenia sa zhodli na rozdelení pńeničných

prolamínov na α/β-gliadíny a γ-gliadíny s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa, ω-

gliadíny, v ktorých asi 80 % aminokyselinových zvyńkov tvoria glutamín, prolín

a fenylalanín, s molekulovou hmotnosťou 55 – 80 kDa a HMW podjednotky

s molekulovou hmotnosťou 85 – 120 kDa a viac. ω-gliadíny sa eńte delia podľa

elektroforetickej pohyblivosti na pomaly migrujúce ω-1, ω-2 a ω-3 gliadíny a na rýchlo

migrujúce ω-4 a ω-5 gliadíny.

Odlińné zastúpenie jednotlivých prolamínových subfrakcií v rôznych druhoch

cereálií a pseudocereálií, a tieņ odrodách, má vplyv na technologickú a výņivovú kvalitu

ich zrna. Kaņdá z týchto subfrakcií má iné aminokyselinové zloņenie a inú relatívnu

molekulovú hmotnosť, ktoré sú významnými faktormi, na základe ktorých sa rozdeľujú

prolamíny. Kvalitatívna a kvantitatívna aminokyselinová analýza jednotlivých

prolamínových subfrakcií má význam aj z hľadiska celiakálneho ochorenia.

Predpokladá sa, ņe hlavným alergénnym agens vo vzťahu k celiakii ako potravinovej

intolerancii sú α/β- a γ-gliadíny.

Vńetky odrody cereálií, pseudocereálií a tieņ strukovín sme analyzovali

pomocou elektroforetickej separácie v polyakrylamidovom géli za prítomnosti

dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE). Pre vyhodnotenie separačného procesu sme

pouņili vyhodnocovací počítačový program Gel-Works, pomocou ktorého bol

stanovený relatívny percentuálny obsah jednotlivých subfrakcií prolamínov.

Nomenklatúra prolamínových subfrakcií a ich molekulové hmotnosti boli zostanovené

podľa vyńńie uvedených autorov.

V analyzovaných odrodách pńenice, vrátane pńenice ńpaldovej, ku ktorým boli

okrem odrôd získaných z génovej banky SR pridané aj odrody, ktoré boli predmetom

výskumu na Department of Carbohydrate Technology, Krakow (Poľsko), a to Sakwa,

B10, Schwabenkorn a bliņńie neńpecifikovaná odroda pńenice ńpaldovej jarnej, sme

stanovili najvyńńí obsah frakcie prolamínov s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa.

Túto nízkomolekulárnu frakciu predstavujú v zrne pńenice monomérne α/β- a γ-

gliadíny, pričom ich podiel v jednotlivých odrodách mal najmenńiu variabilitu. Obsah

frakcie varíroval od 57,76 % (pńenica ńpaldová) do 79,05 % (pńenica letná). Petr et al.

(2003) a Urminská et al. (2009) uvádzajú, ņe v tejto gliadínovej frakcii sú prítomné

celiakálne aktívne epitopy a vo vzťahu k celiakii je najviac riziková frakcia

76

s molekulovou hmotnosťou okolo 30 kDa, nazývaná α-gliadíny. Súčasné výskumy

potvrdzujú celiakálnu aktivitu aj u ostatných gliadínových frakcií (β-, γ- a ω-gliadínov),

hoci ich účinok je niņńí v porovnaní s α-gliadínmi. Podiel frakcie ω-gliadínov

s molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa varíroval medzi odrodami pńenice v rozpätí od

11,32 % (pńenica ńpaldová) do 22,64 % (pńenica letná) (Tabuľka 11).

Tabuľka 11 [Kvantitatívne zastúpenie jednotlivých subfrakcií prolamínových bielkovín

stanovených SDS-PAGE v zrne pńenice letnej (Triticum aestivum L.), pńenice tvrdej

(Triticum durum L.) a pńenice ńpaldovej (Triticum spelta L.)]

Odroda

Subfrakcie prolamínov (relatívne hodnoty v %)

LMW

skupina

MMW

skupina

HMW

skupina

LMW

(< 30 kDa)

α/β-, γ-gliadíny

(30 – 45 kDa)

ω-gliadíny

(45 – 80 kDa)

HMW

podjednotky

(80 – 140 kDa)


Arida 4,99 72,37 22,64 0

Balaton 14,33 71,13 14,54 0

Blava 7,28 70,37 22,35 0

Brea 13,64 73,48 12,88 0

Hana 7,91 79,05 13,04 0

ID Karpatia 11,28 71,23 17,49 0

Ignis 10,36 74,78 14,86 0 Markola 10,53 69,34 20,13 0

Sakwa 13,93 66,17 11,66 8,24

Viginta 14,53 69,86 15,61 0

Vlada 9,69 76,37 13,94 0


Granny 11,83 71,72 16,45 0

Saxana 13,99 62,71 19,49 3,81

Pšenica tvrdá

Riveldur 11,38 67,90 20,72 0

Soldur 12,20 65,33 22,47 0

Pšenica špaldová

B10 22,75 57,76 13,86 5,63

Ceralio 8,16 78,09 13,75 0

Rubiota 16,23 65,09 18,68 0

Schwabenkorn 20,00 63,75 11,32 4,93

neurčená odroda 15,07 66,40 18,53 0

x 12,50 69,65 16,72 1,13

σ 4,22 5,39 3,70 2,44

VK 33,76 7,74 22,13 215,93

Vysvetlivky: x – priemer, σ – smerodajná odchýlka, VK – variačný koeficient

V analyzovanom súbore odrôd a typov druhu pńenica teda 85 – 90 % bielkovín

tvoria tie, ktoré môņu vyvolať patologickú reakciu a môņu byť príčinou celiakie.

Frakcia bielkovín s relatívnou molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa je veľmi

77

konzervatívna, jej zastúpenie je asi 70 % vo vńetkých odrodách druhu Triticum, a preto

je akákoľvek pńenica a výrobky z nej zakázanou potravinou pre celiatikov.

HMW skupinu zásobných bielkovín s vysokou molekulovou hmotnosťou (> 80

kDa) v zrne pńenice predstavujú v alkohole nerozpustné gluteníny. Zistili sme, ņe vo

viacerých odrodách sa tieto gluteníny nachádzali v nedetekovateľnom mnoņstve, čoho

príčinou môņe byť nekompletná extrakcia prolamínových bielkovín v 70 % etanole.

Shewry (2004) uvádza, ņe pri extrakcii prolamínov môņe dôjsť čiastočne aj k extrakcii

zvyńkových glutenínov a iných ńtrukturálne príbuzných bielkovín, ktoré pravdepodobne

obsahujú nerozpustné bunkové steny. Z porovnania podielu jednotlivých frakcií

prolamínov zrna pńenice vyplýva, ņe majoritnou frakciou v T. aestivum, T. durum a T.

spelta sú bielkoviny s relatívnou molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa. V pńenici

tvrdej je na rozdiel od ostatných dvoch typov vyńńí podiel bielkovín s relatívnou

molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa. V pńenici ńpaldovej, s výnimkou odrody

Ceralio, je vyńńí podiel peptidov s molekulovou hmotnosťou do 30 kDa. Zaujímavé je

porovnanie odrôd Blava a Viginta, pretoņe základom pre vyńľachtenie odrody Blava

bola práve Viginta. Ńľachtením sa výrazne zníņil podiel nízkomolekulárnych proteínov

(Viginta 14,53 %; Blava 7,28 %), na druhej strane bol zvýńený podiel ω-gliadínov

(Vigiinta 15,61 %; Blava 22,35 %) (Tabuľka 11).

LMW frakcia prolamínov s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa sa v zrne

jačmeňa nazýva B-hordeíny a jej podiel predstavoval najväčńie mnoņstvo

z prolamínových bielkovín, podobne ako obsah α/β- a γ-gliadínov v zrne pńenice

(Tabuľka 12). Priemerný obsah frakcie B-hordeínov v zrne jačmeňa bol o niečo niņńí

(64,64 %) v porovnaní s obsahom α/β- a γ-gliadínov v zrne pńenice (69,65 %). Na

rozdiel od pńenice, sme v zrne jačmeňa stanovili aj prítomnosť HMW skupiny

prolamínov, označovanú ako D-hordeíny a jej priemerné zastúpenie bolo 5,06 %.

Rovnako ako gliadíny pńenice, aj hordeíny jačmeňa s nízkou molekulovou hmotnosťou

(~ 30 kDa) sú hlavným spúńťajúcim faktorom celiakálneho ochorenia. Jačmeň a

výrobky z neho, vrátane piva a sladu, sú pre celiatikov zakázanými potravinami.

Z ostatných konvečných obilnín, sme stanovili vysoký podiel

nízkomolekulárnych LMW prolamínov s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa v zrne

tritikale. V troch analyzovaných odrodách bol stanovený priemerný obsah v mnoņstve

64,72 %. HMW prolamíny, podobne ako v zrne pńenice, sa v zrne tritikale nenachádzali

(Tabuľka 13).

78


stanovených SDS-PAGE v zrne jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.)]

Odroda


LMW

skupina

MMW

skupina

HMW

skupina

LMW

(< 30 kDa)

B-hordeíny

(30 – 45 kDa)

C-hordeíny

(45 – 80 kDa)

D-hordeíny

(80 – 140 kDa)


Amsterdam 25,28 62,60 8,52 3,60

Babette 23,71 61,47 9,85 4,97

Gerlach 25,63 54,60 11,94 7,83

Luran 26,14 60,04 7,16 6,66


Levan 21,20 67,24 5,60 5,96

Ludan 20,74 73,43 5,83 0

Radegast 22,45 66,58 6,46 4,51

Sladar 17,52 71,18 4,37 6,93

x 22,83 64,64 7,47 5,06

σ 2,95 6,17 2,50 2,47

VK 12,92 9,55 33,47 48,81



stanovených SDS-PAGE v zrne tritikale (Triticosecale)]

Odroda


LMW

skupina

MMW

skupina

HMW

skupina

LMW

(< 30 kDa)

LMW-prolamíny

(30 – 45 kDa)

MMW-prolamíny

(45 – 80 kDa)

HMW-prolamíny

(80 – 140 kDa)

Tritikale

Kendo 23,77 63,73 12,50 0

Kinerit 13,43 69,62 16,95 0

Wanad 21,22 60,82 17,96 0

x 19,47 64,72 15,80 0

σ 5,39 4,48 2,91 0

VK 27,68 6,92 18,42 0


Raņné sekalíny sa delia na ńtyri frakcie, ktoré sa označujú ako HMW, ω-, 75k-γ-

a 40k-γ-sekalíny, pričom do skupiny LMW prolamínov sa zaraćujú predovńetkým 40k-

γ-sekalíny. Zistili sme, ņe ich priemerný obsah v dvoch skúmaných odrodách bol 30,96

%. Na rozdiel od pńenice, jačmeňa alebo tritikale, boli v raņi v najväčńom mnoņstve

stanovené sekalíny (75k-γ- a ω-sekalíny) s molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa

(v priemere 36,79 %). HMW sekalíny tvorili v raņi priemerne 13,84 % z obsahu

jednotlivých prolamínových subfrakcií. Rovnako ako pńeničné α-gliadíny a jačmenné

79

B-hordeíny, aj nízkomolekulárne frakcie prolamínov (~ 30 kDa) v zrne raņe a tritikale

vyvolávajú u geneticky predisponovaných jedincov celiakiu.


stanovených SDS-PAGE v zrne raņe siatej (Secale cereale L.)]

Odroda


LMW

skupina

MMW

skupina

HMW

skupina

LMW

(< 30 kDa)

40k-γ-sekalíny

(30 – 45 kDa)

75k-γ-sekalíny

ω-sekalíny

(45 – 80 kDa)

HMW-sekalíny

(80 – 140 kDa)

Raž siata

Amilo 24,74 31,94 37,87 5,45

Dankowskie

Nowe 12,09 29,97 35,71 22,23

x 18,42 30,96 36,79 13,84

σ 8,94 1,39 1,53 11,87

VK 48,53 4,49 4,16 85,77


Ovos neobsahuje gliadíny, ale ńtrukturálne príbuzné aveníny. Aveníny

predstavujú v alkohole rozpustné bielkoviny s molekulovou hmotnosťou do 45 kDa

(prevaņne vńak 17 – 23 kDa). Ich aminokyselinové zloņenie je pribliņne rovnaké ako

majú prolamíny pńenice, raņe a jačmeňa (Shotwell et al., 1990). Nańe analýzy potvrdili,

ņe nízkomolekulárne prolamíny zrna ovsa s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30

kDa sa nachádzali v najväčńom mnoņstve (v priemere 52,47 %). Za nimi nasledovali

aveníny s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa (v priemere 39,89 %). V porovnaní

s ostatnými tradičnými cereáliami (pńenica, raņ, tritikale alebo jačmeň) obsahoval ovos

viac frakcií s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30 kDa. Podobne ako v zrne

tritikale, ani v zrne ovsa neboli detekované HMW prolamíny (Tabuľka 15). Alergenicita

ovsených avenínov je stále kontroverznou a diskutabilnou otázkou pri zaradení

ovsených produktov do bezlepkovej diéty.

Prolamíny sú hlavnými zásobnými bielkovinami v cereáliách, s výnimkou ryņe,

v zrne ktorej sú akumulované predovńetkým glutelíny. V pseudocereáliách majú úlohu

zásobných bielkovín albumíny a globulíny. Globulíny sú taktieņ akumulované ako

zásobné bielkoviny v strukovinách (Gorinstein, et al., 1999). V nami skúmaných

druhoch pseudocereálií, sme najväčńie zastúpenie LMW prolamínových bielkovín

s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30 kDa stanovili v semene mohára talianskeho,

kde v priemere tvorili aņ 90,28 % a v zrne pohánky (v priemere 61,53 %).

80

V bielkovinách semien mohára úplne absentujú frakcie s molekulovou hmotnosťou nad

45 kDa. Veľmi zaujímavý profil subfrakcií sme zistili v semenách pohánky, pretoņe

v odrode FAG 120/82 aņ 28 % tvorili bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 30 – 45

kDa, zatiaľ čo v ostatných dvoch analyzovaných odrodách (Pyra a Ńpačinská)

predstavovala táto frakcia iba 8 – 9 %, ale bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 45 –

80 kDa tvorili aņ 26 – 32 %. Z nańich výsledkov ćalej vyplýva, ņe quinoa obsahuje viac

bielkovinových podjednotiek s molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa (v priemere

66,56 %). LMW skupina prolamínových bielkovín s molekulovou hmotnosťou 30 – 45

kDa v zrne quinoi predstavovala priemerne 33,44 %, ale nepodarilo sa nám

identifikovať bielkoviny s molekulovou hmotnosťou menńou ako 30 kDa.

Z elektroforetických profilov taktieņ vyplýva, ņe prolamíny v zrne prosa siateho tvorili

iba súčasť subfrakcie s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30 kDa, naproti tomu,

láskavec obsahoval iba subfrakcie s molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa. Pre vńetky

skúmané pseudocereálie je charakteristická neprítomnosť skupiny HMW prolamínov

(Tabuľka 16). Uvedené percentuálne zastúpenia jednotlivých subfrakcií predstavujú

podiel daných bielkovín z celkového obsahu prolamínov, ktoré v semenách pohánky

tvoria len 3,52 %, v semenách láskavca 18,75 % a v semenách prosa 4,43 % vńetkých

typov bielkovín. Z pohľadu celiakie vńak môņe byť aj takéto mnoņstvo alergénom,

a preto nie je elektroforetická separácia a následná identifikácia bielkovín dostatočnou

metódou pre určenie alergenicity a potrebné sú imunochemické analýzy.


stanovených SDS-PAGE v zrne ovsa siateho (Avena sativa L.)]

Odroda


LMW

skupina

MMW

skupina

HMW

skupina

LMW

(< 30 kDa)

aveníny

(30 – 45 kDa)

MMW-prolamíny

(45 – 80 kDa)

HMW-prolamíny

(80 – 140 kDa)

Ovos siaty

Ardo 59,87 31,35 8,78 0 Atego 44,32 44,91 10,77 0

Detvan (nahý) 53,45 36,75 9,80 0

Izák (nahý) 54,77 36,39 8,84 0

Polar 49,96 50,04 0 0

x 52,47 39,89 7,64 0

σ 5,78 7,47 4,35 0

VK 11,02 18,73 56,94 0


81


stanovených SDS-PAGE v semenách pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench),

mohára talianskeho (Setaria italica L.), quinoi (Chenopodium quinoa), prosa siateho

(Panicum miliaceum L.) a láskavca (Amaranthus hypochondriacus L.)]

Odroda


LMW prolamíny

(< 30 kDa) LMW prolamíny

(30 – 45 kDa) MMW prolamíny

(45 – 80 kDa)

Pohánka jedlá

FAG 120/82 62,40 28,00 9,60

Pyra 57,75 9,90 32,35

Ńpačinská 64,43 8,73 26,84

x 61,53 15,54 22,93

σ 3,42 10,80 11,87

VK 5,56 69,50 51,77

Mohár taliansky

Čiernoklas 93,71 6,29 0

Friderika 87,83 12,17 0

Z2300002 89,30 10,70 0

x 90,28 9,72 0

σ 3,06 3,06 0

VK 3,39 31,48 0

Quinoa

Baer 0 27,82 72,18

Carmen 0 35,52 64,48

Faro 0 36,97 63,03

x 0 33,44 66,56

σ 0 4,92 4,92

VK 0 14,71 7,39

Proso siate

Unikum 100 0 0

Láskavec

Koniz 0 0 100


Zistili sme, ņe prolamíny ryņe a kukurice sú nízkomolekulárne bielkoviny,

v ktorých má najväčńie zastúpenie subfrakcia s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30

kDa. V zrnách ryņe tvorí táto subfrakcia v priemere aņ 91,84 %. Prolamíny kukurice sa

nazývajú zeíny a rozdeľujú sa do viacerých subfrakcií na základe rozdielnej

molekulovej hmotnosti a aminokyselinového zloņenia. Shewry, Tatham (1990),

Holding, Larkins (2009) a Matta et al. (2009) rozdeľujú kukuričné zeíny na α-zeíny (19

– 22 kDa), β-zeíny (14 a 16 Dka), γ-zeíny (> 27 kDa) a δ-zeíny (10 kDa). Nańe analýzy

potvrdili, ņe subfrakcie prolamínov s molekulovou hmotnosťou menńou ako 30 kDa boli

v zrne kukurice prítomné v najväčńom mnoņstve (80,18 %) a iba malé percento

subfrakcií (13,02 %) malo molekulovú hmotnosť 45 – 80 kDa (Tabuľka 17).

82


stanovených SDS-PAGE v zrne ryņe siatej (Oryza sativa L.) a kukurice siatej (Zea mays

L.)]

Odroda


LMW prolamíny (< 30 kDa)

LMW prolamíny (30 – 45 kDa)

MMW prolamíny (45 – 80 kDa)

Ryža siata

Basmati 86,96 13,04 0

lúpaná guľatá 94,60 5,40 0 natural 93,95 6,05 0

x 91,84 8,16 0

σ 4,24 4,24 0

VK 4,62 51,96 0

Kukurica siata

neurčená odroda 80,18 13,02 6,8



stanovených SDS-PAGE v semenách cícera baranieho (Cicer arietinum L.) a hrachora

siateho (Lathyrus sativus L.)]

Odroda


LMW prolamíny

(< 30 kDa) LMW prolamíny

(30 – 45 kDa) MMW prolamíny

(45 – 80 kDa)

Cícer baraní

Punjab 30,01 25,76 44,23

Slovák 32,52 26,16 41,32

x 31,27 25,96 42,78

σ 1,77 0,28 2,06

VK 5,66 1,08 4,82

Hrachor siaty

Arida 100 0 0


V semenách strukovín sa prolamínové bielkoviny vyskytujú iba vo veľmi malom

zastúpení a prvotné miesto predstavujú protoplazmatické bielkoviny (albumíny

a globulíny). Na základe elektroforetických profilov a následného denzitometrického

vyhodnotenia, prolamíny semien dvoch analyzovaných odrôd cícera sú tvorené frakciou

MMW bielkovín s molekulovou hmotnosťou 45 – 80 kDa (v priemere 42,78 %), za

ktorými nasledovali LMW bielkoviny s molekulovou hmotnosťou menńou ako 30 kDa

(v priemere 31,27 %) a nakoniec LMW bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 30 – 45

kDa (v priemere 25,96 %). V semene hrachora sme zistili prítomnosť iba subfrakcie

83

s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 30 kDa a neprítomnosť skupiny HMW

prolamínov, podobne ako v ryņi, kukurici alebo pseudocereáliách (Tabuľka 18).

Wieser et al. (1994) analyzovali percentuálne zastúpenie subfrakcií α-, γ- a ω-

gliadínov v 16 kultivaroch pńenice pochádzajúcich z rôznych krajín. Z ich výsledkov

vyplýva, ņe mnoņstvo jednotlivých gliadínových subfrakcií bolo veľmi variabilné.

V najväčńom zastúpení boli prítomné α-gliadíny (43,9 – 59,9 %), potom γ-gliadíny

(30,5 – 45,6 %) a najmenńie mnoņstvo zistili v obsahu ω-gliadínov (6,2 – 20,0 %).

Pre tri analyzované pńenično-raņné hybridy bol typický vysoký podiel subfrakcie ω-

gliadínov (17 – 20 %). V práci taktieņ uvádzajú, ņe tieto gliadínové podjednotky majú

oveľa menńí vplyv na technologické vlastnosti múk ako glutenínové podjednotky.

Podobné zastúpenie gliadínových subfrakcií v odlińných druhoch a genotypoch pńeníc

uvádza vo svojej práci aj Wieser (2000), v ktorej na ich charakterizáciu pouņil metódy

SDS-PAGE a RP-HPLC. Obidve metódy sú vhodné a efektívne pre stanovenie

bielkovín tvoriacich lepok.

Raņná múka obsahuje ńtyri rôzne typy zásobných bielkovín. Tri z nich (γ-40k-,

ω- a HMW sekalíny) sú homológne s koreńpondujúcimi gliadínmi pńenice. Ńtvrtý typ

(γ-75k-sekalíny) sú pre raņ unikátne. Gellrich et al. (2003) pomocou metódy SDS-

PAGE stanovili v dvoch analyzovaných odrodách raņe prítomnosť vńetkých

spomínaných subfrakcií. Molekulové hmotnosti separovaných bielkovín boli 40 kDa

pre γ-40k-sekalíny, 50 kDa pre ω-sekalíny, 70 kDa pre γ-75k-sekalíny a 100 kDa pre

HMW sekalíny. Následne metódou RP-HPLC stanovili obsahy týchto subfrakcií,

pričom γ-75k-sekalíny predstavovali takmer polovicou (~ 46 %) z celkového obsahu

zásobných bielkovín, γ-40k-sekalíny 24 % a ω-sekalíny 17 %. HMW sekalíny boli

minoritnou frakciou (7 %). Raņné sekalíny vńak nie sú schopné vytvárať porovnateľné

mnoņstvo polymérnych bielkovín ako pńeničné gluteníny, a to kvôli charakteristickej

ńtruktúre γ-75k- a HMW sekalínov, ktoré obsahujú vysoký podiel agregovaných

bielkovín.

Hordeíny jačmeňa klasifikujú Matta et al. (2009) na základe ich molekulovej

hmotnosti na B-hordeíny (35 – 46 kDa), C-hordeíny (55 – 70 kDa) a D-hordeíny (105

kDa). B- a D-hordeíny sú polymérne bielkoviny, stabilizované prostredníctvom

intermolekulárnych disulfidických väzieb. Na základe aminokyselinového zloņenia

rozčleňujú jačmenné prolamíny na hordeíny bohaté na sírne aminokyseliny, ktoré

zahŕňajú B-hordeíny v mnoņstve okolo 80 % z celkového obsahu hordeínov, ćalej na

84

hordeíny chudobné na sírne aminokyseliny, ktoré zahŕňajú C-hordeíny a nakoniec

HMW prolamíny, medzi ktoré patria D-hordeíny, ńtrukturálne podobné pńeničným

HMW glutenínom.

Prolamínové subfrakcie pńenice, raņe a jačmeňa predstavujú komplex rôznych

bielkovín, ktorých celkový obsah nie je moņné presne stanoviť, ale analýzy pomocou

jedno- a dvoj-rozmernej elektroforézy poukazujú na prítomnosť najmenej 50 rôznych

proteínov v hexaploidných chlebových pńeniciach a 20 – 30 rôznych proteínov

v jačmeni a inbredných líniách raņe (Gianibelli et al., 2001; Shewry, 2004).

Capouchová et al. (2004) sa vo svojej práci zaoberali vyuņítim ovsa pre

bezlepkovú diétu. Za týmto účelom uskutočnili niekoľko analýz, ktorými testovali

kolekciu 16 rôznych druhov a genotypov ovsa dopestovaných v priebehu dvoch rokov.

Z SDS-PAGE analýzy zásobných bielkovín vyplýva, ņe LMW bielkoviny spolu

s prolamínmi predstavovali najväčńí podiel, ktorý varíroval medzi jednotlivými

odrodami v rozpätí 56,1 – 77,8 % v úrode roku 2001 a 46,4 – 73,8 % v úrode roku

2002. S cieľom analyzovať individuálne prolamínové subfrakcie uskutočnili A-PAGE,

z výsledkov ktorej sa potvrdila prítomnosť najväčńieho mnoņstva subfrakcie α-

prolamínov (50,7 – 88,2 % v roku 2001 a 77,7 – 100 % v roku 2002). Obsah β- a γ-

prolamínov sa pohyboval v rozpätí 11,8 – 49,3 % v roku 2001 a 0 – 22,3 % v roku

2002, kým koncentrácia ω-prolamínov dosiahla nulovú koncentráciu. Autori ćalej

uvádzajú, ņe tieto výsledky nie sú postačujúce pre zhodnotenie ovsa pre potreby

bezlepkovej diéty a z toho dôvodu podrobili jednotlivé odrody ELISA analýze.

Z nańich výsledkov denzitometrického vyhodnotenia SDS-PAGE gélov, rovnako

ako aj z výsledkov frakčnej skladby bielkovinového komplexu zrna analyzovaných

druhov a odrôd pseudocereálií a strukovín vyplýva, ņe sú charakteristické vyńńím

obsahom frakcie albumínov a globulínov a nízkym zastúpením prolamínovej frakcie,

ktorá je viac nízkomolekulárna, ako bielkoviny zrna cereálií.

4.3 Detekcia celiakálne aktívnych bielkovín metódou ELISA

V súčasnosti je najpouņívanejńou metódou na detekciu celiakálne aktívnych

bielkovín v rastlinnom materiály a v potravinách ELISA analýza, ktorá je vysoko

ńpecifická a citlivá. Vyvinutých bolo viacero komerčných ELISA testov, ktoré sú

zaloņené na pouņití rôznych protilátok. Van Eckert et al. (2010) poukazujú na to, ņe

85

mnoņstvo celiakálne aktívnych bielkovín detekovaných komerčnými ELISA testmi je

závislé od pouņitých protilátok a referenčného materiálu. Najčastejńie sa pouņívajú

polyklonálne protilátky pripravené proti pńeničným gliadínom alebo monoklonálne

protilátky pripravené proti pńeničným ω-gliadínom. Kećņe gliadíny izolované

z rôznych obilnín predstavujú veľmi heterogénne antigény, ktorých účinok sa prejavuje

rôznymi imunogénnymi vlastnosťami, zvyčajne je problémom výber imunologického

testu, pretoņe získané výsledky závisia od pôvodu a typu gliadínu, ktorý sa pouņíva ako

ńtandard (Konic-Ristic et al., 2009).

Pri kaņdej imunochemickej analýze prolamínov je rozhodujúca extrakcia týchto

bielkovín, ktorá je zaloņená na pouņití 60 % etanolu a prídavku redukujúceho činidla (2-

merkaptoetanolu alebo ditiotreitolu), ktorý môņe zvýńiť efektívnosť extrakcie

glutelínov, ale nesmie narúńať imunochemickú reakciu (van den Broeck et al., 2009).

Méndez et al. (2005) pouņili vo svojej práci komerčný ELISA test zaloņený na báze

monoklonálnej protilátky R5 a na extrakciu bol pouņitý extrakčný koktail obsahujúci

zmes 2-merkaptoetanolu a guanidínhydrochloridu. Autori uvádzajú, ņe nepozorovali

ņiadny negatívny vplyv na následnú imunologickú reakciu.

Protilátka R5 je navrhnutá proti pńeničným gliadínom a je jedinou registrovanou

a komerčne pouņívanou protilátkou v troch rôznych ELISA testoch s detekčným

limitom 10 aņ 80 ppm. Protilátka vytvára imunokomplex s prolamínmi pńenice a raņe

a tieņ s jačmennými a ovsenými prolamínmi v bezlepkových produktoch, a to s veľmi

nízkym detekčným limitom. Je vhodná, ako pre detekciu prolamínov v natívnom stave,

tak aj po ich denaturácii, pretoņe motív QQPFP je rezistentný voči proteolýze počas

tepelného spracovania potravín (Sorell et al., 1998; Thompson, Méndez, 2008).

V práci sme pouņili komerčný ELISA test RIDASCREEN® Gliadin od firmy R-

Biopharm, ktorý je zaloņený na báze monoklonálnej protilátky R5. Test zahŕňal

extrakciu vzoriek tzv. „koktailovým“ roztokom, ktorý obsahuje 2-merkaptoetanol

a guanidín hydrochlorid. 2-merkaptoetanol je redukujúce činidlo, ktoré redukuje

disulfidické väzby na tiolové skupiny a tak je moņné postupne poruńiť agregovanú

ńtruktúru gliadínových bielkovín a uvoľniť vńetky prítomné, celiakálne aktívne

aminokyselinové sekvencie pre reakciu s monoklonálnou protilátkou R5. Týmto testom

sme kvantitatívne stanovili obsah prolamínovej frakcie bielkovín v zrne vybraných

odrôd cereálií, pseudocereálií a strukovín.

86

Tabuľka 19 [Obsah celiakálne aktívnych bielkovín stanovených metódou ELISA

v zrne pńenice letnej (Triticum aestivum L.), pńenice tvrdej (Triticum durum L.)

a pńenice ńpaldovej (Triticum spelta L.)]

Odroda Prolamíny, mg.kg-1

Glutén, mg.kg-1


Arida 119 000 238 000

Balaton 109 000 218 000

Blava 83 000 166 000

Brea 108 500 217 000

Hana 113 500 227 000

ID Karpatia 97 500 195 000

Ignis 73 000 146 000

Markola 112 000 224 000

Viginta 110 500 221 000

Vlada 126 000 252 000


Granny 63 500 127 000 Saxana 67 000 134 000

Pšenica tvrdá

Riveldur 127 500 255 000

Soldur 140 000 280 000

Pšenica špaldová

Ceralio 90 500 181 000

Rubiota 121 500 243 000

x 103 875 207 750

σ 22 717 45 433

VK 21,87 21,87


Pńenica (Triticum L.) je v nańich podmienkach povaņovaná za najvýznamnejńiu

plodinu vyvolávajúcu celiakálne ochorenie. V nami analyzovaných druhoch pńeníc (T.

aestivum L., T. durum L. a T. spelta L.) sme zistili priemerné mnoņstvo bielkovín 121,9

g v 1 kg (Tabuľka 5), ale z tohto mnoņstva aņ 38,39 % (46,80 g.kg-1

) predstavovali

prolamíny – gliadíny (Tabuľka 5). Z výsledkov ELISA testu vyplýva, ņe celiakálne

aktívnych bielkovín v 1 kg zrna pńeníc bolo v priemere 103,88 g (Tabuľka 19).

Výsledky získané ELISA testom znamenajú, ņe v zrne pńenice je celiakálne aktívnych

dvakrát toľko bielkovín, ako je obsah prolamínov získaný analýzou frakčnej skladby.

Tento rozdiel je zapríčinený jednak tým, ņe prolamíny sú najhorńie rozpustnou

bielkovinovou frakciou a ich extrakcia nie je úplná, na druhej strane Lester (2008)

uvádza, ņe u pacientov v remisii vyvolali patologickú reakciu aj glutelíny, ktoré môņu

byť vysokońpecifickou imunochemickou reakciou zachytené ako alergény.

Z analyzovaných druhov pńenice obsahujú najviac celiakálne aktívnych bielkovín

odrody Triticum durum, aņ 140 g v 1 kg celozrnného ńrotu. Výsledky v Tabuľka 19

87

uvádzame v mg na 1 kg materiálu preto, lebo vo vńeobecnosti sa stanovenia metódou

ELISA uvádzajú v jednotkách ppm, teda mg.kg-1

. Pri analýzach pńeničných bielkovín sa

vńak jedná o podstatne vyńńie koncentrácie, a to aņ niekoľko g.kg-1

. Na základe

metodiky pouņitého ELISA testu je moņné následne prepočítať stanovené mnoņstvo

gliadínov na celkový obsah gluténu a klasifikovať suroviny a potraviny ako prirodzene

bezlepkové, v ktorých je obsah gluténu menńí ako 20 ppm. Z nańich výsledkov vyplýva,

ņe vńetky analyzované druhy a odrody pńeníc prevyńujú tento limit a sú zakázanými

plodinami vo výņive celiatikov.

Jačmeň jarný (Hordeum vulgare L.) obsahoval priemerne 111,1 g bielkovín v 1

kg zrna (Tabuľka 6). Obsah prolamínových bielkovín (hordeínov) bol niņńí ako v zrne

pńeníc a predstavoval priemerne 33,34 %, čo je 37,04 g.kg-1

(Tabuľka 6). ELISA

analýzou sme zistili, ņe celiakálne aktívnych bielkovín bolo v priemere 27,25 g.kg-1

(Tabuľka 20). Tieto výsledky neprevyńovali obsah prolamínových bielkovín získaných

frakčnou skladbou, pretoņe hordeíny sú lepńie rozpustnými bielkovinami ako gliadíny.

Imunochemická reakcia potvrdila, ņe jačmeň a výrobky z neho musia byť eliminované

z výņivy pre celiatikov.


v zrne jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.)]


Glutén, mg.kg-1


Amsterdam 25 500 51 000

Babette 26 250 52 500

Gerlach 27 250 54 500

Luran 25 500 51 000


Levan 28 000 56 000

Ludan 26 000 52 000

Radegast 29 500 59 000

Sladar 30 000 60 000

x 27 250 54 500

σ 1 768 3 536

VK 6,49 6,49


Raņ siata (Secale cereale L.) obsahovala najniņńí podiel bielkovín v zrne (83,4

g.kg-1

), spomedzi vńetkých konvenčných cereálií (Tabuľka 7). Z tohto mnoņstva tvorili

prolamíny (sekalíny) iba 25,51 % (21,28 g.kg-1

) (Tabuľka 7). ELISA analýza odhalila,

ņe celiakálne aktívnych bielkovín bolo aņ 34,50 g.kg-1

(Tabuľka 21). Tritikale

88

(Triticosecale L.) obsahovalo priemerne 98,1 g bielkovín v 1 kg zrna (Tabuľka 7),

a z nich aņ 32,31 % (31,70 g.kg-1

) predstavovali prolamíny (Tabuľka 7). ELISA

metódou sme stanovili priemerne 114,0 g.kg-1

celiakálne aktívnych bielkovín (Tabuľka

21). Podobne ako v pńenici, aj v raņi a tritikale obsah prolamínových bielkovín

stanovený ELISA testom prevyńoval hodnoty obsahu prolamínov získané analýzou

frakčnej skladby. Na základe získaných výsledkov môņeme, podobne ako (Petr et al.,

2003 a Michalík et al., 2006) konńtatovať, ņe jačmeň, raņ a tritikale sú zakázanými

plodinami pre výņivu celiatikov.


v zrne raņe siatej (Secale cereale L.), tritikale (Triticosecale) a ovsa siateho (Avena

sativa L.)]


Glutén, mg.kg-1

Raž siata

Dankowskie Nowe 34 500 69 000

Tritikale

Kendo 109 500 219 000

Kinerit 106 500 213 000

Wanad 126 000 252 000

x 114 000 228 000

σ 10 500 21 000

VK 9,21 9,21

Ovos siaty

Ardo 1 145 2 290

Atego 1 055 2 110 Detvan (nahý) 2 250 4 500

Izák (nahý) 960 1 920

x 1 353 2 705

σ 603 1 206

VK 44,57 44,58


Ovos siaty (Avena sativa L.) obsahoval priemerne 130,4 g bielkovín v 1 kg

(Tabuľka 7), z ktorých najviac zastúpenou bola frakcia albumínov a globulínov.

Prolamíny (aveníny) tvorili v priemere iba 17,47 %, čo je 22,78 g v 1 kg biologického

materiálu (Tabuľka 7). Ovos mal najniņńiu koncentráciu alergénnych bielkovín v

porovnaní s ostatnými konvenčnými cereáliami. ELISA testom sme stanovili, ņe ovos

obsahoval priemerne 1,35 g.kg-1

celiakálne aktívnych bielkovín (Tabuľka 21). V rámci

jednotlivých analyzovaných odrôd sa prejavili veľké rozdiely (hodnota variačného

koeficientu aņ 44,57). V odrode Izák, čo je ovos nahý, sme stanovili 0,96 g alergénnych

89

bielkovín v 1 kg suroviny, ale v odrode Detvan, čo je tieņ ovos nahý, sme stanovili aņ

2,25 g alergénnych bielkovín v 1 kg celozrnného ńrotu. Napriek tomu, ņe monoklonálna

protilátka R5 je ńpecifická voči sekvenciám aminokyselín, ktoré sa v avenínoch ovsa

nevyskytujú, stanovenie je vyuņiteľné aj na analýzu ovsa a ovsených produktov. Ellis et

al. (1998) uvádzajú, ņe ovsené aveníny obsahujú epitop QQQPF, ktorý môņe byť

príčinou reakcie s protilátkou R5. Osman et al. (2001) ńtudovali ćalńie sekvencie, ktoré

rozpoznáva protilátka R5, pričom zistili, ņe najdôleņitejńou ńtruktúrou v prolamínoch

obilnín je dipeptid FP. Tento dipeptid je veľmi malý a vyskytuje sa vo viacerých

bielkovinách rôzneho pôvodu a to je príčina, prečo protilátka R5 rozpoznáva mnoho

peptidov, niekedy dokonca aj tie, ktoré nie sú celiakálne aktívne. Bermudo Redondo et

al. (2005) uvádzajú, ņe kríņová reakcia medzi ovsenými avenínmi a protilátkou R5 je

veľmi diskutabilná a preto je potrebný ćalńí výskum v tejto oblasti, čo potvrdili aj nańe

výsledky s vysokou variabilitou.


v semenách pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench), mohára talianskeho

(Setaria italica L.), quinoi (Chenopodium quinoa), prosa siateho (Panicum miliaceum

L.) a láskavca (Amaranthus hypochondriacus)]


Glutén, mg.kg-1

Mohár taliansky

Čiernoklas 5,9 11,8

Friderika 5,6 11,2

Z2300002 5,3 10,6

x 5,6 11,2

σ 0,3 0,6

VK 5,36 5,36

Pohánka jedlá

FAG 120/82 < LOD < LOD

Pyra < LOD < LOD

Ńpačinská < LOD < LOD

Quinoa

Baer < LOD < LOD

Carmen < LOD < LOD

Faro < LOD < LOD

Proso siate

Unikum < LOD < LOD

Láskavec

Koniz < LOD < LOD


LOD – detekčný limit

90

Z výsledkov získaných ELISA analýzou bielkovín pseudocereálií môņeme

konńtatovať, ņe vńetky skúmané druhy a odrody pseudocereálií sú vhodnou náhradou

klasických obilnín a môņu byť vyuņité pre potreby bezlepkovej diéty. S výnimkou

mohára talianskeho (Setaria italica L.), bol obsah celiakálne aktívnych bielkovín v zrne

pseudocereálií stanovený pod hranicou detekčného limitu pouņitého ELISA testu

(Tabuľka 22), čo nasvedčuje tomu, ņe dané plodiny majú len veľmi malý alebo takmer

ņiadny obsah alergénnych bielkovín. V troch analyzovaných odrodách mohára

talianskeho tvorili celiakálne aktívne bielkoviny v priemere 5,6 mg.kg-1

, čo predstavuje

11,2 mg gluténu v 1 kg. Limit pre bezlepkové suroviny a potraviny je podľa

potravinového kódexu 20 mg.kg-1

, čiņe aj mohár patrí medzi plodiny, ktoré môņu byť

súčasťou bezlepkovej diéty.

Základom bezlepkovej diéty pre celiatikov sú ryņa a kukurica, resp. kukuričný

ńkrob. Analyzované vzorky ryņe a kukurice vykazovali obsah celiakálne aktívnych

bielkovín pod hranicou detekčného limitu (Tabuľka 23), podobne ako pseudocereálie.

Prirodzene bezlepkovými surovinami sú aj strukoviny, v ktorých sme pouņitím ELISA

testu nestanovili prítomnosť alergénnych determinant (Tabuľka 23).


v zrne ryņe siatej (Oryza sativa L.), kukurice siatej (Zea mays L.) a v semenách

strukovín – cícera baranieho (Cicer arietinum L.) a hrachora siateho (Lathyrus sativus

L.)]


Glutén, mg.kg-1

Ryža siata

Basmati < LOD < LOD

lúpaná guľatá < LOD < LOD

natural < LOD < LOD

Kukucia siata

neurčená odroda < LOD < LOD

Cícer baraní

Punjab < LOD < LOD

Slovák < LOD < LOD

Hrachor siaty

Arida < LOD < LOD

Vysvetlivky: LOD – detekčný limit

Kahlenberg et al. (2006) vo svojej práci popisujú mechanizmus väzby

monoklonálnej protilátky R5 s celiakálne aktívnymi epitopmi v cereáliách. Zamerali sa

predovńetkým na celiakálne aktívnu sekvenciu QQPFP, ktorá je zastúpená

91

v bielkovinách obilnín v najväčńom mnoņstve (aņ 5 %) a v bielkovinách iných

rastlinných druhov iba v mnoņstve 0,01 %. Pri sendvičovej ELISA analýze sa vyņaduje

prítomnosť najmenej dvoch alergénnych epitopov v jednej molekule bielkoviny.

V druhoch, ako napríklad ryņa a kukurica, sa epitop QQPFP nevyskytuje vôbec a preto

protilátka R5 nevykazuje ņiadnu kríņovú reakciu s bielkovinami týchto plodín.

Treba zdôrazniť, ņe vzťah medzi obsahom celiakálne aktívnych bielkovín

stanovených metódou ELISA v potravinách a vlastnou toxicitou týchto bielkovín pre

celiatikov nebol nikdy presne ńpecifikovaný. Imunogénne vlastnosti celiakálne

aktívnych bielkovín sú totiņ závislé nielen na aminokyselinovej sekvencii, ale aj na

ńtruktúre bielkoviny, ktorá sa mení v procese jej spracovania, napríklad deamináciou

peptidov sa detekcia týchto bielkovín ELISA analýzou stáva neefektívnou. Veľkým

problémom imunochemickej analýzy celiakálne aktívnych bielkovín je aj presná

ńtandardizácia. Za najlepńí ńtandard sú povaņované gliadíny, hoci dnes je uņ známe, ņe

aj glutenínové peptidy spúńťajú imunologickú reakciu u celiatikov. Navyńe, gluteníny

sú oveľa ťaņńie prístupné lýze ako gliadíny a preto môņu zostať neporuńené počas

celého procesu spracovania obilnín (Lester, 2008).

Ćalńí problém ELISA analýzy spočíva aj v odlińnostiach medzi prolamínmi

jednotlivých obilných druhov. Ako ńtandard sa pouņívajú iba pńeničné gliadíny a pre

kvantifikáciu ostatných prolamínov (predovńetkým hordeínov a sekalínov) sa vychádza

z predpokladu, ņe vykazujú podobné vlastnosti ako gliadíny. Jačmenné a raņné

prolamíny sú vńak lepńie rozpustné v zriedených roztokoch alkoholov, ako v samotnom

etanole, čo môņe zapríčiniť falońnú interpretáciu výsledkov. Kanerva et al. (2006)

analyzovali prostredníctvom dvoch komerčných ELISA testov obsah prolamínov

v ovsenej múke kontaminovanej prídavkom jačmennej múky. Metódy boli zaloņené na

pouņití ω-gliadínovej a R5 protilátky. Zistili, ņe výsledky získané reakciou s R5

protilátkou „nadhodnocovali“ obsah hordeínov, kým ω-gliadínová protilátka

„podhodnocovala“ obsah hordeínov. Detekcia jačmenných kontaminantov ELISA

analýzou poskytla falońne pozitívne výsledky, čo môņe byť eliminované pouņitím

hordeínov ako ńtandardov. Jedine vtedy, ak je známy zdroj kontaminácie, môņe byť

zvolený správny ńtandard a uskutočnená detekcia celiakálne aktívnych prolamínov

v ovsených alebo iných bezlepkových produktoch.

Podľa Michalíka et al. (2006) iba ELISA metóda poskytuje objektívne výsledky

o obsahu lepkových, resp. alergénnych bielkovín v obilninách. Testovali účinnosť troch

92

ELISA testov (od rôznych výrobcov) a zistili, ņe pouņité ELISA testy nie sú vhodné pre

hodnotenie prolamínových bielkovín ovsa, pretoņe v niektorých odrodách nepotvrdili

prítomnosť alergénnych sekvencií, zatiaľ čo vo viacerých odrodách bolo stanovené

mnoņstvo celiakálne aktívnych bielkovín presahujúce limitné hodnoty. Autori zistili

výrazné rozdiely v obsahu celiakálne aktívnych bielkovín stanovených v jednotlivom

biologickom materiály rôznymi testami, čo umoņňuje predikovať vhodnosť daného

testu pre jednotlivé plodiny.

Capouchová et al. (2004 a 2006) analyzovali prítomnosť celiakálne aktívnych

bielkovín v zrne ovsa pomocou komerčného ELISA testu, pričom dospeli k rovnakému

záveru ako Michalík et al. (2006). Obsah celiakálnych determinant vo viacerých

druhoch a odrodách ovsa dopestovaných v priebehu dvoch rokov, teda za rôznych

klimatických podmienok, bol veľmi rozdielny. Hodnoty niektorých odrôd potvrdili

poznatky o aminokyselinových sekvenciách a ńtruktúre peptidov ovsených bielkovín

a nepresahovali limit pre bezlepkové potraviny, teda 20 ppm, na druhej strane vo

viacerých odrodách stanovili nadlimitné hodnoty. Výraznejńie rozdiely boli

zaznamenané v obsahu týchto bielkovín medzi jednotlivými odrodami v porovnaní

s variabilitou vplyvom ročníka.

Aj napriek tomu, ņe obsah alergénnych prolamínov stanovený ELISA analýzou

bol v zrne pńenice, tritikale a raņe veľmi vysoký a pred samotným stanovením bolo

potrebné vzorky niekoľkonásobne riediť, je táto metóda základom pre posúdenie

vhodnosti surovín a potravín pre potreby bezlepkovej diéty. V súčasnosti je k dispozícii

viacero rôznych testov zaloņených na báze monoklonálnych protilátok od rôznych

výrobcov. Dôleņitým faktorom je vńak výber testu vhodného pre jednotlivé plodiny

a predchádzajúca analýza frakčnej skladby, ktorá poskytne základnú informáciu pre

úpravu vzorky pred ELISA stanovením.

4.4 Detekcia celiakálne aktívnych bielkovín metódou Western blot

Potreba poznania a determinácie antigénovej ńpecifity k prísluńnej protilátke

viedla k vývinu metódy, ktorá umoņňuje získať kópiu bielkoviny, elektroforeticky

separovanej pomocou SDS-PAGE, na nitrocelulózovú alebo PVDF membránu. Pre túto

metódu sa zauņívalo označenie Western blot a vyuņíva sa predovńetkým za účelom

93

ńtúdia prítomnosti, relatívneho obsahu, molekulovej hmotnosti a post-translačnej

modifikácie ńpecifických proteínov a ich vzájomných interakcií (MacPhee, 2010).

Hoci ELISA analýza je najpouņívanejńou imunochemickou metódou na

kvantitatívnu determináciu proteínovej expresie v biologickom materiáli, niektorí autori

(Kurien, Hal Scofield, 2006; Heidebrecht et al., 2009) uvádzajú, ņe aj Western blot má

niekoľko ńpecifických výhod. Najpodstatnejńou výhodou je to, ņe separácia bielkovín

podľa ich relatívnej molekulovej hmotnosti umoņňuje stanovenie ich ńpecifickej

väzbovosti s prísluńnou protilátkou.

Cieľom tejto analýzy bolo zhodnotiť imunogénne vlastnosti prolamínových

bielkovín analyzovaných druhov a odrôd cereálií, pseudocereálií a strukovín reakciou

s polyklonálnou anti-gluténovou protilátkou a porovnať ich s výsledkami získanými

pomocou ELISA metódy. Prolamínové bielkoviny separované v systéme SDS-PAGE

sme preniesli elektrotransferom na PVDF membránu, kde boli farbené reverzibilnou

farbou Ponceau S. Detekciu prolamínov naviazaných s primárnou anti-gluténovou

protilátkou sme uskutočnili pouņitím sekundárnej protilátky značenej enzýmom

chrenová peroxidáza. Na základe relatívnych molekulových hmotností sme následne

porovnali subfrakcie prolamínov z SDS-PAGE gélov s blotovanými prolamínmi po

imunizácii s protilátkou.

Elektroforetickou analýzou jednotlivých odrôd pńeníc Triticum aestivum L.,

Triticum durum L. a Triticum spelta L. sme zistili, ņe separované prolamíny sa svojou

relatívnou molekulovou hmotnosťou výrazne od seba neodlińujú (Obrázok 2 a Obrázok

4). Pre separáciu bolo aplikované pri kaņdom biologickom materiáli mnoņstvo vzorky v

µg, prepočítané podľa obsahu aminokyselín v extrakte. Na základe pouņitých markerov

molekulových hmotností sme stanovili molekulové hmotnosti jednotlivých

prolamínových subfrakcií: 30 – 45 kDa pre α/β- a γ-gliadíny, 45 – 80 kDa pre ω-

gliadíny a bielkoviny s molekulovou hmotnosťou vyńńou ako 80 kDa sú zvyńkové

HMW glutenínové podjednotky. α-gliadíny s molekulovou hmotnosťou okolo 35 kDa

sú najviac rizikovou frakciou bielkovín pńenice, v ktorej sú prítomné celiakálne aktívne

epitopy. Práve tieto α-gliadíny sú vo veľkom mnoņstve zastúpené vo vńetkých

analyzovaných vzorkách pńeníc.

94

Obrázok 2 [SDS-PAGE prolamínov pńenice letnej, tvrdej a ńpaldovej]

Vysvetlivky: 1. Ignis, 2. Markola, 3. Arida, 4. Balaton, 5. Blava, 6. Viginta, 7. Brea, 8.

ID Karpatia, 9. Hana, 10. Vlada, 11. Granny, 12. Saxana, 13. Riveldur, 14. Soldur, 15.

Rubiota, 16. Ceralio, markery molekulových hmotností.

Obrázok 3 [Western blot prolamínov pńenice letnej, tvrdej a ńpaldovej]

Vysvetlivky: 1. Ignis, 2. Markola, 3. Arida, 4. Balaton, 5. Blava, 6. Viginta, 7. Brea, 8.

ID Karpatia, 9. Hana, 10. Vlada, 11. Granny, 12. Saxana, 13. Riveldur, 14. Soldur, 15.

Rubiota, 16. Ceralio, markery molekulových hmotností.

Pri posudzovaní reakcie bielkovín s polyklonálnou protilátkou môņeme

konńtatovať, ņe vńetky gliadínové frakcie bielkovín s molekulovou hmotnosťou vyńńou

ako 25 kDa vysoko pozitívne reagovali a boli vizualizované na membráne.

Imunologická reakcia nebola pozorovaná jedine pri frakciách s niņńou molekulovou

hmotnosťou (< 25 kDa), ktoré nereagovali s protilátkou (Obrázok 3 a Obrázok 5).

Metódou Western blot sme potvrdili, ņe vńetky druhy a odrody pńeníc obsahujú vysoké

koncentrácie celiakálne aktívnych bielkovín.

95

Obrázok 4 [SDS-PAGE prolamínov ovsa, raņe, pńenice letnej a pńenice ńpaldovej]

Vysvetlivky: 1. ovos Polar, 2. pńenica letná Sakwa, 3. raņ Amilo, 4. pńenica ńpaldová

B10, 5. pńenica ńpaldová bez ńpecifikácie odrody, 6. pńenica ńpaldová Schwabenkorn,

markery molekulových hmotností.

Obrázok 5 [Western blot prolamínov ovsa, raņe, pńenice letnej a pńenice ńpaldovej]

Vysvetlivky: 1. ovos Polar, 2. pńenica letná Sakwa, 3. raņ Amilo, 4. pńenica ńpaldová

B10 , 5. pńenica ńpaldová bez ńpecifikácie odrody, 6. pńenica ńpaldová Schwabenkorn,

markery molekulových hmotností.

Na základe elektroforetického profilu sme zistili, ņe v analyzovaných odrodách

jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.) majú najväčńie zastúpenie bielkovinové frakcie

s molekulovou hmotnosťou okolo 30 – 45 kDa (Obrázok 6). Vńetky tieto peptidy

výrazne reagovali s pouņitou polyklonálnou protilátkou (Obrázok 7). Podobne ako v

prípade pńenice, imunologická reakcia nebola pozorovaná pri peptidoch s molekulovou

hmotnosťou menńou ako 25 kDa. Naopak, pozitívna reakcia bola viditeľná

u prolamínov s molekulovou hmotnosťou 60 – 70 kDa, čo nasvedčuje tomu, ņe tieto

96

fragmenty vykazujú afinitu k pouņitej protilátke a celiakálne aktívne sú aj peptidy

s vyńńou molekulovou hmotnosťou.

Obrázok 6 [SDS-PAGE prolamínov jačmeňa]

Vysvetlivky: 1. Levan, 2. Ludan, 3. Radegast, 4. Sladar, 5. Amsterdam, 6. Babette, 7.

Gerlach, 8. Luran, markery molekulových hmotností.

Obrázok 7 [Western blot prolamínov jačmeňa]

Vysvetlivky: 1. Levan, 2. Ludan, 3. Radegast, 4. Sladar, 5. Amsterdam, 6. Babette, 7.

Gerlach, 8. Luran, markery molekulových hmotností.

Prolamíny raņe (Secale cereale L.) sa skladajú z dvoch hlavných fragmentov

veľkých pribliņne 35 kDa a 66 kDa, čo poukazuje na prítomnosť bielkovín typu α-

gliadínov (35 kDa) a tieņ ω-gliadínov (66 kDa), ktoré sú v pńenici menej výrazné.

V raņi sa tieto subfrakcie nazývajú 40k-γ-sekalíny (35 kDa) a ω-sekalíny (66 kDa). Na

elektroforeograme sú viditeľné aj bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 100 kDa

97

a viac, ktoré sú v raņi zastúpené HMW-sekalínmi (Obrázok 4 a Obrázok 8).

Prolamínové bielkoviny raņe vykázali slabńiu afinitu k pouņitej polyklonálnej protilátke,

ako tomu bolo v prípade pńeničných bielkovín. Napriek tomu, ņe bola imunologická

reakcia slabńia, polyklonálna protilátka detekovala prítomnosť celiakálne aktívnych

bielkovín aj v raņi (Obrázok 5 a Obrázok 9).

Z výsledkov elektroforetických profilov zrna tritikale vyplýva, ņe majoritný

podiel predstavuje bielkovinová frakcia s molekulovou hmotnosťou okolo 30 – 45 kDa

(podobne ako v pńenici) a frakcia s molekulovou hmotnosťou okolo 60 kDa. Kećņe

tieto bielkoviny sú v pńeniciach menej zastúpené, môņeme predpokladať, ņe sa jedná

o frakciu prolamínov, ktorá sa vo väčńom mnoņstve vyskytuje v raņi (Obrázok 8).

Protilátka reagovala pozitívne s frakciami bielkovín s molekulovou hmotnosťou väčńou

ako 30 kDa a nereagovala s frakciami s molekulovou hmotnosťou okolo 14 – 25 kDa,

podobne ako v pńenici a jačmeni (Obrázok 9).

Obrázok 8 [SDS-PAGE prolamínov ovsa, raņe, tritikale, pohánky, cícera a láskavca]

Vysvetlivky: 1. ovos Ardo, 2. ovos Atego, 3. ovos Detvan, 4. ovos Izák, 5. raņ

Dankowskie Nowe, 6. tritikale Kendo, 7. tritikale Kinerit, 8. tritikale Wanad, 9.

pohánka Ńpačinská, 10. pohánka FAG 120/82, 11. pohánka Pyra, 12. cícer Punjab, 13.

láskavec Koniz, markery molekulových hmotností.

98

Obrázok 9 [Western blot prolamínov ovsa, raņe, tritikale, pohánky, cícera a láskavca]

Vysvetlivky: 1. ovos Ardo, 2. ovos Atego, 3. ovos Detvan, 4. ovos Izák, 5. raņ

Dankowskie Nowe, 6. tritikale Kendo, 7. tritikale Kinerit, 8. tritikale Wanad, 9.

pohánka Ńpačinská, 10. pohánka FAG 120/82, 11. pohánka Pyra, 12. cícer Punjab, 13.

láskavec Koniz, markery molekulových hmotností.

Z nańich výsledkov vyplýva, ņe polyklonálna protilátka najvýraznejńie reagovala

so subfrakciou α/β-gliadínov v pńenici a tritikale, subfrakciou B-hordeínov v jačmeni

a subfrakciou 40k-γ- a ω-sekalínov v raņi. Tieto subfrakcie o veľkosti ~ 35 kDa (v raņi

a tritikale aj ~ 60 kDa) vykazujú najvýraznejńiu celiakálnu aktivitu.

Ovos siaty (Avena sativa L.) ako jediná analyzovaná cereália obsahoval

prolamínové frakcie s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 35 kDa (Obrázok 4

a Obrázok 8). Reakciou s polyklonálnou protilátkou sme aj v ovse detekovali alergénne

peptidy (Obrázok 5 a Obrázok 9), napriek tomu, ņe viacerí autori (Ellis et al., 1998;

Osman et al., 2001) tvrdia, ņe bielkoviny ovsa nemajú epitopy, ktoré vyvolávajú

celiakiu. Polyklonálne protilátky majú väčńí počet väzobných miest pre rozpoznávanie

epitopov bielkovín, čiņe existuje pri nich väčńia pravdepodobnosť vzniku kríņových

reakcií so ńtrukturálne podobnými bielkovinami. To je pravdepodobná príčina silnej

imunologickej reakcie protilátky s ovsenými prolamínmi. Podľa niektorých autorov je

konzumácia čistých ovsených produktov bezpečná pre pacientov s celiakiou, kým

názory ćalńích autorov sú rozdielne a výrobky z ovsa vylučujú z bezlepkovej diéty

(Størsrud et al., 2003; Silano et al., 2007).

Zistili sme, ņe zo skúmaných druhov pseudocereálií bol na prolamínovú frakciu

najbohatńí mohár taliansky (Setaria italica L.), v ktorom sme stanovili tri peptidové

frakcie s molekulovou hmotnosťou niņńou ako 25 kDa (Obrázok 10). Pohánka jedlá

99

(Fagopyrum esculentum Moench) a quinoa (Chenopodium quinoa) obsahovali iba malé

mnoņstvá prolamínov, čo sme stanovili prítomnosťou a počtom slabńích pásikov

v polyakrylamidovom géli (Obrázok 8 a Obrázok 10). V quinoi sme pozorovali dokonca

iba dve slabo detekovateľné peptidové frakcie na úrovni 60 kDa. V prose sme

detekovali iba jednu nevýraznú frakciu s molekulovou hmotnosťou pribliņne 20 kDa

(Obrázok 10) a v láskavci jeden peptid s molekulovou hmotnosťou okolo 60 kDa

(Obrázok 8). Ryņa a kukurica z pohľadu elektroforetického profilu obsahujú

prolamínové frakcie s nízkou molekulovou hmotnosťou (pribliņne 14 – 20 kDa)

(Obrázok 10). Z analyzovaných dvoch druhoch strukovín, iba cícer obsahoval väčńí

počet peptidov so ńirokým rozpätím molekulových hmotností (od 15 kDa aņ do 80 kDa)

(Obrázok 8 a Obrázok 10). Proso, mohár a kukurica obsahujú nízkomolekulárne

prolamíny (< 30 kDa), pričom vykázali pozitívnu imunologickú reakciu s pouņitou

polyklonálnou protilátkou (Obrázok 11). To znamená, ņe majú podobné imunologické

vlastnosti ako pńeničné gliadíny, a to aj napriek rozdielnym molekulovým hmotnostiam.

Z výsledkov ELISA analýzy, pri ktorej bola pouņitá monoklonálna protilátka vyplýva,

ņe tieto plodiny neobsahujú celiakálne aktívne bielkoviny. Na produkciu

polyklonálnych protilátok sa vńak pouņíva celá molekula gliadínu a to je príčinou

nedostatočnej ńpecifickosti týchto protilátok. Napríklad, Nassef et al. (2008) uvádza, ņe

polyklonálne protilátky reagovali aj s bielkovinymi kukurice a poskytovali tak falońne

pozitívne výsledky. Ostatné pseudocereálie (láskavec, pohánka a quinoa), ryņa a

strukoviny (cícer a hrachor) vykázali len veľmi nepatrnú alebo ņiadnu reakciu

s polyklonálnou protilátkou (Obrázok 9 a Obrázok 11). Obidve imunochemické analýzy

(ELISA a Western blot), ktoré sme pouņili v nańej práci, potvrdili neprítomnosť

celiakálne aktívnych bielkovín v analyzovaných druhoch pseudocereálií, ryņe, kukurice

a strukovín a na základe uvedených výsledkov ich môņeme zaradiť do bezlepkovej diéty

pre celiatikov. Zo získaných výsledkov vńak vyplýva obrovská dôleņitosť výberu

správnej protilátky, pretoņe môņeme získavať falońne pozitívne výsledky. Z pohľadu

výņivy celiatika to ale nepredstavuje nebezpečenstvo, pretoņe je lepńie nejednoznačnú

surovinu alebo potravinu nekonzumovať a ćalej analyzovať, ako falońne negatívnym

podhodnotením zaradiť takúto surovinu alebo potravinu do bezlepkovej diéty.

100

Obrázok 10 [SDS-PAGE prolamínov prosa, cícera, hrachora, mohára, quinoi, ryņe

a kukurice]

Vysvetlivky: 1. proso Unikum, 2. cícer Slovák, 3. hrachor Arida, 4. mohár Čiernoklas,

5. mohár Friderika, 6. mohár Z2300002, 7. quinoa Carmen, 8. quinoa Faro, 9. quinoa

Baer, 10. ryņa lúpaná guľatá, 11. ryņa natural, 12. ryņa Basmati, 13. kukurica, markery

molekulových hmotností.

Obrázok 11 [Western blot prolamínov prosa, cícera, hrachora, mohára, quinoi, ryņe

a kukurice]

Vysvetlivky: 1. proso Unikum, 2. cícer Slovák, 3. hrachor Arida, 4. mohár Čiernoklas,

5. mohár Friderika, 6. mohár Z2300002, 7. quinoa Carmen, 8. quinoa Faro, 9. quinoa

Baer, 10. ryņa lúpaná guľatá, 11. ryņa natural, 12. ryņa Basmati, 13. kukurica, 14.

kontrolná vzorka – pńenica (odroda Ignis), markery molekulových hmotností.

101

Ballabio et al. (2011) analyzovali pomocou ELISA metódy a imunoblotingu po

SDS-PAGE 36 odrôd ovsa siateho (vrátane nahého). Zistili, ņe vo väčńine vzoriek bol

obsah alergénnych sekvencií stanovených ELISA metódou pod 20 ppm, avńak niekoľko

odrôd vykázalo hodnoty väčńie ako 80 ppm. Reakcia ovsených avenínov

s polyklonálnou anti-gliadínovou protilátkou, ktorá bola pouņitá pri imunoblotingu, bola

vysoko pozitívna so vńetkými bielkovinovými frakciami ovsa, okrem peptidov s nízkou

a vysokou molekulovou hmotnosťou. Ako kontrolu pouņili pńeničný glutén (pozitívna

kontrola) a komerčnú bezlepkovú múku (negatívna kontrola) obsahujúcu ryņu

a kukuricu. V niektorých bielkovinových frakciách tejto múky bola pozorovaná

pozitívna imunologická reakcia, čo autori vysvetľujú vznikom kríņovej reakcie medzi

pouņitou polyklonálnou protilátkou a niektorými nealergénnymi epitopmi bielkovín

ryņe a kukurice. Selekcia jednotlivých odrôd ovsa je kritickým bodom pri zaradení tejto

cereálie do bezlepkovej diéty, a to z dôvodu rôznorodej imunologickej reakcie ovsených

avenínov s protilátkami.

Niekoľko vedeckých prác sa zaoberalo skúmaním homológne príbuzných

sekvencií medzi prolamínmi ryņe a ostatných cereálií, pričom bol dokázaný výskyt

kríņovej reakcie medzi protilátkami navrhnutými proti ryņovým prolamínom a inými

cereáliami. Shyur et al. (1994) testovali metódou Western blot protilátku navrhnutú

proti prolamínom ryņe, ktoré pomocou SDS-PAGE separovali na 15,5 kDa a 14,2 kDa

veľké polypeptidy. Protilátka pozitívne reagovala s bielkovinovými frakciami kukurice

s veľkosťou 14 – 28 kDa a s bielkovinovými frakciami jačmeňa s veľkosťou pribliņne

45 kDa, ale nevykázala ņiadnu kríņovú reakciu s bielkovinami pńenice. Uvedené

zistenia znamenajú, ņe prolamíny ryņe majú niekoľko epitopov homológnych

s bielkovinami kukurice alebo jačmeňa. Masumura et al. (1990) vo svojej práci

uvádzajú, ņe jedine oktapeptid QQQCCQQL, ktorý sa vyskytuje v prolamínoch ryņe

s veľkosťou 10 kDa a 13 kDa, bol rovnako dokázaný aj v zeínoch kukurice s veľkosťou

15 kDa a 27 kDa, v B- a γ-hordeínoch jačmeňa, v α/β- a γ-gliadínoch pńenice a v γ-

sekalínoch raņe.

Pomocou metódy Western blot sme analyzovali aj prolamínové subfrakcie

bielkovín v chlebe, a to v chlebe pripravenom zo zmesi múk pńenice letnej a pńenice

ńpaldovej a chleby pripravené iba zo ńpaldovej múky. Elektroforetickou analýzou sme

zistili, ņe prolamínové fragmenty boli v polyakrylamidovom géli menej výrazné

a v menńom mnoņstve, v porovnaní s prolamínmi izolovanými zo zrna cereálií (Obrázok

102

12). Pravdepodobnou príčinou je enzymatická hydrolýza a tepelné spracovanie počas

pečenia, a tieņ moņná nekompletná extrakcia prolamínových bielkovín z tepelne

spracovaných potravín.

Obrázok 12 [SDS-PAGE prolamínov pńeničných chlebov]

Vysvetlivky: 1. zmes pńeničnej mieńanky BIO I., 2. zmes pńeničnej mieńanky BIO II.,

3. ńpaldový chlieb z odrody Oberkulmer Rothkorn, 4. ńpaldový chlieb bez ńpecifikácie

odrody, 5. ńpaldový chlieb z odrody Frankienkorn, 6. kontrola – múka z pńenice letnej

(typ 500), markery molekulových hmotností.

Obrázok 13 [Western blot prolamínov pńeničných chlebov]

Vysvetlivky: 1. zmes pńeničnej mieńanky BIO I., 2. zmes pńeničnej mieńanky BIO II.,

3. ńpaldový chlieb z odrody Oberkulmer Rothkorn, 4. ńpaldový chlieb bez ńpecifikácie

odrody, 5. ńpaldový chlieb z odrody Frankienkorn, 6. kontrola – múka z pńenice letnej

(typ 500), markery molekulových hmotností.

Wieser a Koehler (2008) uvádzajú, ņe extrahovateľnosť prolamínov z tepelne

spracovaných potravín pomocou etanolu je veľmi obtiaņna a odporúčajú pouņiť

103

kombináciu alkoholového roztoku s redukčným činidlom (napríklad 2-merkaptoetanol),

čím sa zároveň zniņuje aj extrakcia glutelínov. Redukčné činidlo následne nemá ņiaden

vplyv na reakciu s protilátkou. Z nańich výsledkov vyplýva, ņe v chleboch z múky

pńenice letnej je moņné pozorovať malé mnoņstvo slabńie viditeľných fragmentov

s molekulovou hmotnosťou väčńou ako 30 kDa. V chleboch z múky pńenice ńpaldovej

boli tieto fragmenty viditeľnejńie, výraznejńie boli predovńetkým peptidy s molekulovou

hmotnosťou 35 – 45 kDa. Reakciou s polyklonálnou protilátkou bola detekovaná

prítomnosť vńetkých prolamínových subfrakcií s molekulovou hmotnosťou väčńou ako

30 kDa, a to vo vńetkých vzorkách pńeničných chlebov (Obrázok 13). Silná pozitívna

imunologická reakcia bola pozorovaná aj pri subfrakciách prolamínov, ktoré boli slabńie

separované elektroforetickým delením. Metódou Western blot sme potvrdili prítomnosť

celiakálne aktívnych bielkovín aj v chleboch pripravených z pńeničnej múky, teda

v potravinách, ktoré boli upravené fermentáciou a pečením rastlinnej suroviny.

Predikovať kvalitu pńeničných ciest a chlebov umoņňuje v súčasnosti pomerne

ńiroká ńkála rôznych reologických a pekárskych testov. Pre identifikáciu a kvantifikáciu

ńpecifických skupín bielkovín v pńeničnom ceste, chlebe a ćalńích pekárskych

výrobkoch sa môņu vyuņiť imunoanalýzy, ktorých výhodou je rýchlosť a jednoduchosť.

Nevýhodou je vńak nízka rozpustnosť a vysoký stupeň homológie aminokyselinových

sekvencií zásobných bielkovín, čo môņe byť príčinou vzniku kríņových imunologických

reakcií. Na minimalizáciu tohto rizika je lepńie pouņiť kombináciu monoklonálnych

alebo polyklonálnych protilátok s vhodne vybraným spôsobom extrakcie, za účelom

zvýńenia ńpecifickosti imunoanalýzy (Skerritt et al., 1994).

Deneri-Papini et al. (1999) vo svojej ńtúdii uvádzajú, ņe výber vhodného

imunochemického testu pre detekciu ńpeciálnych skupín bielkovín v pekárskych

výrobkoch je závislý od mnohých faktorov. Jedným z nich je aj spôsob extrakcie

prolamínov a tieņ dôsledok technologického spracovania cereálnych výrobkov (pečenie,

suńenie, extrudovanie, enzymatická hydrolýza a pod.), čo vedie k naruńeniu natívneho

stavu bielkoviny. Partridge et al. (2003) metódou imunobloting po SDS-PAGE zistili

rozdielnu imunologickú reakciu vybraných protilátok (monoklonálnych aj

polyklonálnych) s bielkovinami extrahovanými z pńeničných extrudátov a múky, čím

identifikovali ńpecifické frakcie bielkovín, ktoré mohli byť procesom extrudácie

modifikované.

104

Podľa Sorell et al. (1998) komerčné ELISA testy a Western blot analýza sa

vyuņívajú pre analýzu celiakálne aktívnych bielkovín v potravinách, hoci sa vyznačujú

niņńou ńpecifickosťou a citlivosťou voči jačmenným hordeínom. Navyńe Western blot

je časovo veľmi náročná metóda a preto odporúčajú pouņiť na analýzy ELISA metódu

s kombináciou viacerých protilátok. Na druhej strane, je podľa Sdepanian et al. (2001)

Western blot analýza veľmi vhodná pre identifikáciu bielkovinových frakcií, pretoņe

reakcia s anti-gliadínovými protilátkami sa uskutočňuje s presne ńpecifikovanými

bielkovinami, separovanými na základe ich molekulovej hmotnosti. Z tohto dôvodu

odporúčajú pre ľahkú identifikáciu a kvantifikáciu prolamínových bielkovín

v potravinách pouņiť kombináciu metódy Western blot s enzýmovou imunoanalýzou.

105

Záver

Dizertačná práca je orientovaná na biochemickú a imunochemickú analýzu

bielkovinového komplexu zrna cereálií, pseudocereálií a strukovín, so zameraním sa na

celiakálne aktívne epitopy a metódy ich detekcie. Celiakia je v súčasnosti jednou

z najrozńírenejńích potravinových intolerancií, pričom jej diagnostika je pomerne

zloņitá, a preto sa predpokladá, ņe celiatikom je pribliņne kaņdý stý aņ tisíci človek.

Základom liečby celiakie je eliminačná, tzv. bezlepková diéta a preto je potrebné, aby

boli k dispozícii presné analytické metódy pre stanovenie celiakálne aktívnych

bielkovín v surovinách a potravinách a odporúčania o ich vhodnosti pre výņivu

celiatikov.

Z dosiahnutých výsledkov môņeme vyvodiť nasledovné závery:

Z výsledkov frakčnej skladby bielkovinového komplexu zrna cereálií,

pseudocereálií a strukovín vyplýva, ņe tradičné cereálie (pńenica, tritikale a jačmeň) sú

bohaté na prolamínové bielkoviny, ktoré určujú ich technologickú kvalitu, ale na druhej

strane sa vyznačujú niņńou nutričnou hodnotou. Výnimkou boli iba raņ a ovos,

v ktorých sme detekovali vyńńie mnoņstvo albumínov a globulínov, ktoré sú zdrojom

esenciálnych aminokyslín. Albumíny a globulíny boli v najväčńom mnoņstve prítomné

vo vńetkých druhoch pseudocereálií, čím sa pribliņujú strukovinám. Práve kvôli

vysokému obsahu protoplazmatických bielkovín sme v zrne vńetkých strukovín

a pseudocereálií stanovili najvyńńiu hodnotu koeficientu nutričnej kvality. V ryņi

a kukurici predstavovali majoritnú frakciu glutelíny. Analýzou jednotlivých

bielkovinových frakcií sa potvrdila vysoká variabilita ich obsahu v skúmanom

rastlinnom materiáli.

Z výsledkov elektroforetických profilov a následne denzitometrického

vyhodnotenia SDS-PAGE gélov sme zistili, ņe prolamínová subfrakcia s nízkou

relatívnou molekulovou hmotnosťou (okolo 30 – 45 kDa) bola v najväčńom mnoņstve

zastúpená v zrne pńenice, tritikale a jačmeňa. Práve v tejto subfrakcii sa nachádza

vysoký podiel celiakálne aktívnych epitopov. V zrne raņe prevládali LMW a MMW

prolamíny (30 – 80 kDa), naproti tomu v zrne ovsa prevládali prolamíny s molekulovou

hmotnosťou niņńou ako 30 kDa. Nízka molekulová hmotnosť a priaznivé

106

aminokyselinové zloņenie avenínov odlińuje ovos od ostatných tradičných obilnín.

Pseudocereálie, ryņa, kukurica a strukoviny obsahovali iba malé mnoņstvo frakcie

prolamínov s molekulovou hmotnosťou 30 – 45 kDa.

Na základe výsledkov ELISA metódy s vyuņitím monoklonálnej protilátky R5

môņeme konńtatovať, ņe obsah celiakálne aktívnych bielkovín bol nadlimitný v zrne

pńenice, raņe a tritikale, a prevyńoval ako limit pre prirodzene bezlepkové potraviny

a suroviny stanovený potravinovým kódexom (20 ppm), tak aj optimálne rozhranie

detekčného limitu pouņitého ELISA testu (20 – 200 ppm). Vzorky týchto cereálií bolo

potrebné niekoľkonásobne riediť. V zrne jačmeňa sme detekovali niņńí podiel celiakálne

aktívnych bielkovín, mnoņstvo ktorých vńak tieņ niekoľkonásobne prevyńovalo limit 20

ppm. Reakcia s monoklonálnou protilátkou R5 potvrdila prítomnosť celiakálnych

epitopov aj v prolamínoch ovsa. V pseudocereáliách, ryņi, kukurici a strukovinách sme

stanovili podiel celiakálne aktívnych bielkovín pod detekčným limitom pouņitého

ELISA testu.

Imunologická reakcia metódou Western blot s anti-gluténovou polyklonálnou

protilátkou odhalila niekoľko rozdielov v porovnaní s ELISA analýzou. Polyklonálna

protilátka reagovala pozitívne aj s prolamínmi kukurice, prosa a mohára, čo je

zapríčinené niņńou ńpecifickosťou polyklonálnych protilátok, a tým moņnosťou vzniku

kríņových reakcií so ńtrukturálne homológnymi sekvenciami aminokyselín, aj

nealergénnymi, aké sú napríklad v kukurici, prose alebo mohári. Silnú imunologickú

reakciu s polyklonálnou protilátkou sme pozorovali u prolamínov pńenice, raņe,

tritikale, jačmeňa a ovsa, naopak len slabú alebo ņiadnu imunologickú reakciu sme

pozorovali u prolamínov vńetkých pseudocereálií (s výnimkou prosa a mohára), ryņe

a strukovín. Metódu Western blot sme vyuņili aj pre stanovenie prítomnosti celiakálne

aktívnych peptidov v pekárskych výrobkoch, konkrétne v pńeničnom chlebe. Analýzou

sme zistili, ņe ani technologické spracovanie pńeničného zrna neporuńí sekvenciu

obsahujúcu celiakálne aktívne epitopy a tie sú prítomné aj v hotovom výrobku.

Záverom môņeme konńtatovať, ņe vńetky spomínané metódy sú vhodné na

analýzu bielkovinového komplexu zrna cereálií, pseudocereálií a strukovín, poskytujú

presné údaje o kvantite a kvalite jednotlivých bielkovinových frakcií a determinujú

107

prítomnosť a mnoņstvo celiakálne aktívnych bielkovín. Najpresnejńími sú

imunochemické analýzy (ELISA a Western blot), z výsledkov ktorých vyplýva, ņe

tradičné obilniny (pńenica, raņ, tritikale a jačmeň) sú zakázanými plodinami vo výņive

celiatikov, pričom pseudocereálie, ryņa, kukurica a strukoviny slúņia ako základ

bezlepkovej diéty. Ovos ostáva aj naćalej predmetom ćalńích analýz a jeho zaradenie

do bezlepkovej diéty je diskutabilné.

108

Návrh na využitie poznatkov pre ďalší rozvoj vedy a prax

Základnými metódami pre stanovenie prítomnosti celiakálne aktívnych

bielkovín (prolamínov) v zrne cereálií a pseudocereálií sú frakcionácia bielkovín na

základe ich rozdielnej rozpustnosti v rôznych rozpúńťadlách a elektroforetická separácia

bielkovín v polyakrylamidových géloch (modifikácia s dodecylsíranom sodným, tzv.

SDS-PAGE, alebo kyslá gélová elektroforéza, tzv. A-PAGE). Elektroforetické metódy

poskytujú presnú kvalitatívnu analýzu, teda dôkaz prítomnosti peptidov, u ktorých sa

predpokladá alergénne pôsobenie. V súčasnosti sa vńak do popredia dostávajú

vysokońpecifické imunochemické analýzy, ktoré sa pouņívajú na dôkaz prítomnosti

a určenia mnoņstva celiakálne aktívnych bielkovín, pričom k dispozícii musí byť

prísluńná protilátka. Jedine reakciou prolamínov s monoklonálnymi alebo

polyklonálnymi protilátkami získavame odpovede o kvantite a kvalite týchto bielkovín,

a iba na základe týchto metód môņeme jednoznačne povedať, ņe daná surovina

neobsahuje lepok a je pre celiatika bezpečná.

Najznámejńou imunochemickou metódou je enzýmová imunoadsorbentná

analýza (ELISA), pri ktorej existuje niekoľko modifikácií tejto metódy. Podľa Codex

Alimentarius je referenčnou metódou sendvičová ELISA analýza, zaloņená na báze

komerčne dostupnej monoklonálnej protilátky R5 pre stanovenie prolamínov pńenice

(gliadínov), raņe (sekalínov) a jačmeňa (hordeínov) v rôznych potravinách. Protilátka

R5 nevykazuje ņiadnu kríņovú reakciu s bielkovinami kukurice, ryņe, prosa, pohánky,

láskavca a quinoi, čo predstavuje obrovskú výhodu. Naproti tomu, ćalńia významná

imunochemická analýza Western blot vyuņíva ako monoklonálne, tak aj polyklonálne

protilátky. Pri pouņití polyklonálnych protilátok je výhodou, ņe takáto protilátka sa

viaņe na mnoho rôznych epitopov vyskytujúcich sa v cieľovom antigéne a môņe tak

detekovať prítomnosť celiakálne aktívnych bielkovín aj v iných plodinách, hoci aj

v minimálnych koncentráciách. Hlavnou nevýhodou je vńak výskyt rôznych kríņových

reakcií s bielkovinami, ktoré nevykazujú ņiadny vzťah k celiakii.

Dizertačná práca významnou mierou prehĺbila poznatky o analýze celiakálne

aktívnych bielkovín a prinesla konkrétny návrh postupu analýz pre detekciu celiakálne

aktívnych bielkovín s čo najväčńou ńpecifickosťou a presnosťou. Veľký význam to má

109

nielen pre prvovýrobu – poľnohospodárstvo, ale aj pre potravinárstvo, pretoņe

v súčasnosti sa stretávame s názormi o bezpečnosti napr. raņných pekárskych

a pečivárenských výrobkov vo výņive celiatikov, alebo o rôznych „műsli“ tyčinkách,

„vločkách“ a podobne propagovaných výrobkoch, ako vhodných pre výņivu celiatikov.

Pritom sú buć úplne nevhodné, alebo obsahujú určité mnoņstvá celiakálne aktívnych

bielkovín. Preto je potrebné optimalizovať ńkálu presných, jednoznačných a citlivých

analytických metód pre stanovenie prítomnosti celiakálne aktívnych bielkovín.

110

Zoznam použitej literatúry

1. ABDEL-AAL, E.-S. M. – HUCL, P. – SOSULSKI, W. 1995. Compositional and

nutritional characteristics of spring einkorn and spelt wheats. In Cereal Chemistry,

roč. 72, 1995, č. 6, s. 621-624.

2. AHMED, F. E. 2002. Detection of genetically modified organisms in foods. In

TRENDS in Biotechnology, roč. 20, 2002, č. 5, s. 215-223.

3. ALAIS, CH. – LINDEN, G. 1991. Food Biochemistry, New York : Ellis Horwood,

1991, 222 s. ISBN 0133234118.

4. ASP, N. G. – MATTSSON, B. – ÖNNING, G. 1992. Variation in dietary fibre, β-

glucan, starch, protein, fat and hull content of oats grown in Sweden 1987-1989. In

European Journal of Clinical Nutrition, roč. 46, 1992, č. 1, s. 31-37.

5. BALLABIO, C. – UBERTI, F. – MANFERDELLI, S. – VACCA, E. – BOGGINI,

G. – REDAELLI, R. – CATASSI, C. – LIONETTI, E. – PEÑAS, E. – RESTANI, P.

2011. Molecular characterisation of 36 oat varieties and in vitro assessment of their

suitability for coeliacs’ diet. In Journal of Cereal Science, 2011, In Press, Accepted

Manuscript, Available online 6 June 2011.

6. BALTENSPERGER, D. – CAI, Y. Z. 2004. Millet – minor. In Wrigley, C., Corke,

H. and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA :

Academic Press, 2004. s. 261-268. ISBN 0-12-765490-9.

7. BATEY, I. L. 2004. Gluten and modified gluten. In Wrigley, C., Corke, H. and

Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA :


8. BATTAIS, F. – PINEAU, F. – POPINEAU, Y. – APARICIO, C. – KANNY, G. –

GUERIN, L. – MONERET-VAUTRIN, D. A. – DENERY-PAPINI, S. 2003. Food

allergy to wheat: identification of immunoglobulin E and immunoglobulin G-binding

proteins with sequential extracts and purified proteins from wheat flour. In Clinical

& Experimental Allergy, roč. 33, 2003, č. 7, s. 962-970.

9. BEKES, F. – GIANIBELLI, M. C. – WRIGLEY, C. 2004. Wheat: Grain proteins

and flour quality. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain

science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA : Academic Press, 2004. s. 416-423. ISBN 0-

12-765490-9.

111

10. BELITZ, H.-D. – GROSCH, W. – SCHIEBERLE, P. 2009. Cereals and cereal

products. In Belitz, H. D., Grosch, W. and Schieberle, P.: Food Chemistry, 4. vyd.,

Berlin : Springer, 2009. s. 670-745. ISBN 978-3-540-69933-0.

11. BERMUDO REDONDO, M. C. – GRIFFIN, P. B. – GARZON RANSANZ, M. –

ELLIS, H. J. – CICLITIRA, P. J. – O´SULLIVAN, C. K. 2005. Monoclonal

antibody-based competitive assay for the sensitive detection of coeliac disease toxic

prolamins. In Analytica Chimica Acta, roč. 551, 2005, č. 1, s. 105-114.

12. BERTI, C. – BALLABIO, C. – RESTANI, P. – PORRINI, M. – BONOMI, F. –

IAMETTI, S. 2004. Immunochemical and molecular properties of proteins in

Chenopodium quinoa. In Cereal Chemistry, roč. 81, 2004, č. 2, s. 275-277.

13. BHARGAVA, A. – RANA, T. S. – SHUKLA, S. – OHRI, D. 2005. Seed protein

electrophoresis of some cultivated and wild species of Chenopodium. In Biologia

Plantarum, roč. 49, 2005, č. 4, s. 505-511.

14. BIETZ, J. A. 1982. Cereal prolamin evolution and homoly revealed by sequence

analysis. In Biochemical Genetics, roč. 20, 1982, č. 11/12, s. 1039-1053.

15. van BOCKSTAELE, F. – DE LEYN, I. – EECKHOUT, M. – DEWETTINCK, K.

2008. Rheological properties of wheat flour dough and the relationship with bread,

volume I. - Creep-recovery measurements. In Cereal Chemistry, roč. 85, 2008, č. 6,

s. 753-761.

16. BOJŇANSKÁ, T. – FRANČÁKOVÁ, H. 2002. The use of spelt wheat (Triticum

spelta L.) for baking applications. In Rostlinná výroba, roč. 48, 2002, č. 4, s. 141-

147.

17. BOJŇANSKÁ, T. – FRANČÁKOVÁ, H. – CHLEBO, P. – VOLLMANNOVÁ, A.

2009. Rutin content in buckwheat enriched bread and influence of its consumption

on plasma total antioxidant status. In Czech Journal of Food Sciences, roč. 27, 2009,

ńpeciálne číslo 1, s. 236-241.

18. BOJŇANSKÁ, T. – URMINSKÁ, D. 2010. Influence of natural additives on protein

complex of bread. In Potravinárstvo, roč. 4, 2010, č. 4, s. 1-5.

19. BRESSANI, R. – DE MARTELL, E. C. M. – DE GODÍNEZ, C. M. 1993. Protein

quality evaluation of amaranth in adult humans. In Plant Foods for Human Nutrition,

roč. 43, 1993, č. 2, s. 123-143

112

20. BREZHNEVA, T. A. – UPELNIEK, V. P. – PUKHAL’SKY, V. A. 2010. Genetic

control of gliadin components in wheat Triticum spelta L. In Russian Journal of

Genetics, roč. 46, 2010, č. 5, s. 562-565.

21. van den BROECK, H. C. – AMERICA, A. H. P. – SMULDERS, M. J. M. –

BOSCH, D. – HAMER, R. J. – GILISSEN, L. J. W. J. – van der MEER, I. M. 2009.

A modified extraction protocol enables detection and quantification of celiac disease-

related gluten proteins from wheat. In Journal of Chromatography B, roč. 877, 2009,

č. 10, s. 975-982.

22. van den BROECK, H. C. – de JONG, H. C. – SALENTIJN, E. M. J. – DEKKING,

L. – BOSCH, D. – HAMER, R. J. – GILISSEN, L. J. W. J. – van der MEER, I. M. –

SMULDERS, M. J. M. 2010. Presence of celiac disease epitopes in modern and old

hexaploid wheat varieties: wheat breeding may have contributed to increased

prevalence of celiac disease. In Theoretical and Applied Genetics, roč. 121, 2010, č.

8, s. 1527-1539.

23. BUSHUK, W. 2004. Rye. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.: Encyclopedia

of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA : Academic Press, 2004. s. 85-91.

ISBN 0-12-765490-9.

24. BUTT, M. S. – TAHIR-NADEEM, M. – KHAN, M. K. I. – SHABIR, R. – BUTT,

M. S. 2008. Oat: unique among the cereals. In European Journal of Nutrition, roč.

47, 2008, č. 2, s. 68-79.

25. CAI, Y. Z. – CORKE, H. – LI, W. D. 2004. Buckwheat. In Wrigley, C., Corke, H.

and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA :


26. CAI, Y. Z. – CORKE, H. – WU, H. X. 2004. Amaranth. In Wrigley, C., Corke, H.

and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA :


27. CALDERÓN de la BARCA, A. M. – ROJAS-MARTÍNEZ, M. E. – ISLAS-RUBIO,

A. R. – CABRERA-CHÁVEZ, F. 2010. Gluten-free breads and cookies of raw and

popped amaranth flours with attractive technological and nutritional qualities. In

Plant Foods for Human Nutrition, roč. 65, 2010, č. 3, s. 241-246.

28. CAPOUCHOVÁ, I. – PETR, J. – KREJČÍŘOVÁ, L. 2006. Protein composition of

sorghum and oat grain and their suitability for gluten-free diet. In

Zemdirbyste/Agriculture, roč. 93, 2006, č. 4, s. 271-284.

113

29. CAPOUCHOVÁ, I. – PETR, J. – TLASKALOVÁ-HOGENOVÁ, H. – MICHALÍK,

I. – FAMĚRA, O. – URMINSKÁ, D. – TUČKOVÁ, L. – KNOBLOCHOVÁ, H. –

BOROVSKÁ, D. 2004. Protein fractions of oats and possibilities of oat utilisation

for patients with coeliac disease. In Czech Journal of Food Sciences, roč. 22, 2004, č.

4, s. 151-162.

30. CATASSI, C. – FASANO, A. 2008. Celiac disease. In Arendt, E. K., and Dal Bello,

F.: Gluten-free cereal products and beverages, USA : Academic Press, 2008. s. 1-

27. ISBN 978-0-12-373739-7.

31. CIACCI, C. – CIRILLO, M. – CAVALLARO, R. – MAZZACCA, G. 2002. Long-

term follow-up of celiac adults on gluten-free diet: prevalence and correlates of

intestinal damage. In Digestion, roč. 66, 2002, č. 3, s. 178-185.

32. CICCOCIOPPO, R. – DI SABATINO, A. – CORAZZA, G. R. 2005. The immune

recognition of gluten in celiac disease. In Clinical and Experimental Immunology,

roč. 140, 2005, č. 3, s. 408-416.

33. CICLITIRA, P. J. 2001. AGA Technical review on coeliac sprue. In

Gastroenterology, roč. 120, 2001, č. 6, s. 1526-1540.

34. CORNELL, H. J. – JOHNSON, G. W. 2001. Structure – activity relationship in

coeliac – toxic gliadin peptides. In Amino Acids, roč. 21, 2001, č. 3, s. 243-253.

35. ČERNÝ, J. – ŃAŃEK, A. 1996. Bílkovinné signální geny pńenice obecné, Praha :

Ústav zemědělských a potravinářskych informací, 1996. 62 s. ISBN 80-85120-55-0.

36. DEMIRBAS, A. 2005. β-glucan and mineral nutrient contents of cereals grown in

Turkey. In Food Chemistry, roč. 90, 2005, č. 4, s. 773-777.

37. DEWOR, D. H. – CICLITIRA, P. J. 2005. Clinical features and diagnosis of celiac

disease. In Gastroenterology, roč. 128, 2005, č. 4, s. 19-24.

38. DODOK, L. 1989. Cereálna chémia a technológia – Mlynské suroviny, Bratislava :

SVŃT, 1989. 65 s. ISBN 80-227-0130-0.

39. DONG, Y. – QIU, Y. – WANG, J. 1999. Varietal identification of rice prolamins by

capillary zone electrophoresis. In Chromatographia, roč. 50, 1999, č. 5/6, s. 376-378.

40. DZIUBA, J. – FORNAL, Ł. – DAREWICZ, M. 2009. Peptydy toksyczne dla osób

chorych na celiakię. In Dziuba, J. and Fornal, Ł.: Biologicznie aktywne peptydy

i białka żywności, Warszawa : Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, 2009. s. 50-55.

ISBN 978-83-204-3582-5.

114

41. EBO, D. G. – STEVENS, W. J. 2001. IgE-mediated food allergy – extensive review

of the literature. In Acta Clinica Belgica, roč. 56, 2001, č. 4, s. 234-247.

42. van ECKERT, R. – BOND, J. – RAWSON, P. – KLEIN, CH. L. – STERN, M. –

JORDAN, T. W. 2010. Reactivity of gluten detecting monoclonal antibodies to

a gliadin reference material. In Journal of Cereal Science, roč. 51, 2010, č. 2, s. 198-

204.

43. ELIASSON, A-CH. – LARSSON, K. 1993. Cereals in breadmaking: a molecular

colloidal approach, New York : M. Dekker, 1993. 376 s. ISBN 0824788168.

44. ELLIS, H. J. – ROSEN-BRONSON, S. – O’REILLY, N. – CICLITIRA, P. J. 1998.

Measurement of gluten using a monoclonal antibody against a coeliac toxic peptide

of A gliadin. In Gut, roč. 43, 1998, č. 2, s. 190-195.

45. ENSARI, A. – MARSH, M. N. – MORIARTY, K. J. et al. 1998. Studies in vivo of

ω-gliadins in gluten sensitivity (coeliac sprue disease). In Clinical Science, roč. 95,

1998, č. 4, s. 419-424.

46. ESPOSITO, C. – CAPUTO, I. – TRONCONE, R. 2007. New therapeutic strategies

for coeliac disease: tissue transglutaminase as a target. In Current Medicinal

Chemistry, roč. 14, 2007, č. 24, s. 2572-2580.

47. FASANO, A. 2001. Celiac disease: The past, the present, the future. In Pediatrics,

roč. 107, 2001, č. 4, s. 768-770.

48. FIGUEROA, J. D. C. – MAUCHER, T. – REULE, W. – PEÑA, R. J. 2009.

Influence of high molecular weight glutenins on viscoelastic properties of intact

wheat kernel and relation to functional properties of wheat dough. In Cereal

Chemistry, roč. 86, 2009, č. 2, s. 139-144.

49. FLETCHER, R. J. 2004. Pseudocereals – overview. In Wrigley, C., Corke, H. and



50. FRASER, J. S. – CICLITIRA, P. J. 2001. Pathogenesis of coeliac disease:

implications for treatment. In World Journal Of Gastroenterology, roč.7, 2001, č. 6,

s. 772-776.

51. FUENTES, F. F. – MARTINEZ, E. A. – HINRICHSEN, P. V. – JELLEN, E. N. –

MAUGHAN, P. J. 2009. Assessment of genetic diversity patterns in Chilean quinoa

(Chenopodiu quinoa Willd.) germplasm using multiplex fluorescent microsatellite

markers. In Conservation Genetics, roč. 10, 2009, č. 2, s. 369-377.

115

52. FUCHS, M. 2005. Mouka – imunologické reakce přecitlivělosti. In Alergie, roč. 3,

2005, s. 209-216.

53. FURMAN, B. J. 2004. Triticale. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.:

Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA : Academic Press,

2004. s. 298-303. ISBN 0-12-765490-9.

54. GAFFA, T. – YOSHIMOTO, Y. – HANASHIRO, I. – HONDA, O. – KAWASAKI,

S. – TAKEDA, Y. 2004. Physicochemical properties and molecular structures of

starches from millet (Pennisetum typhoides) and sorghum (Sorghum bicolor L.

Moench) cultivars in Nigeria. In Cereal Chemistry, roč. 81, 2004, č. 2, s. 255-260.

55. GAJDOŃOVÁ, A. – ŃTURDÍK, E. 2004. Biologické, chemické a nutrično-zdravotné

charakteristiky pekárskych cereálií. In Nova Biotechnologica, roč. 4, 2004, č. 1, s.

133-154.

56. GÁLOVÁ, Z. – CHŇAPEK, M. – GREGÁŇOVÁ, Ņ. – VIVODÍK, M. 2006.

Biochemická charakteristika pseudocereálií a cereálií. In Zborník abstraktov -

Bezpečnosť a kvalita surovín a potravín. Nitra : SPU, 2006. s. 33. ISBN 80-8069-

767-1.

57. GÁLOVÁ, Z. – MICHALÍK, I. – HOBLÍK, J. – CHŇAPEK, M. – GREGÁŇOVÁ,

Ņ. 2005. Ńtúdium prolamínov obilnín a pseudoobilnín vo vzťahu k celiakii. In

Zborník abstraktov - Bezpečnosť a kvalita surovín a potravín. Nitra : SPU, 2005. s. 9.

ISBN 80-8069-612-8.

58. GÁLOVÁ, Z. – SMOLKOVÁ, H. – GREGOVÁ, E. 1998. Biosyntéza

individuálnych HMW glutenínových subjednotiek vo formujúcom sa zrne pńenice. In

Zborník referátov z 1. vedeckej konferencie. Nitra : SPU, 1998. s. 54-57.

59. GARFIN, D. E. 2003. Gel electrophoresis of proteins. In Davey, J. and Lord, M.:

Essential Cell Biology, Volume 1: Cell Structure, A Practical Approach, USA :

Oxford University Press, 2003. s. 197-268. ISBN 0-19-963830-6.

60. GARSED, K. – SCOTT, B. B. 2007. Can oats be taken in a glute-free diet?

A systematic review. In Scandinavian Journal of Gastroenterology, roč. 42, 2007, č.

2, s. 171-178.

61. GAVURNÍKOVÁ, S. – MENDEL, Ľ. – HAVRLENTOVÁ, M. –

ZIRKELBACHOVÁ, K. – BIELIKOVÁ, M. – BOJŇANSKÁ, K. 2010. Pekárska

kvalita a reologické vlastnosti jačmenno-pńeničných múk. In Potravinárstvo, roč. 4,

2010, č. 1, s. 16-20.

116

62. GEIGER, H. H. – MIEDANER, T. 2009. Rye breeding. In Carena, M. J.: Cereals

(Handbook of plant breeding), 3. vyd., Germany : Springer, 2009. s. 157-182. ISBN

978-0-387-72294-8.

63. GELLRICH, C. – SCHIEBERLE, P. – WIESER, H. 2003. Biochemical

characterization and quantification of the storage protein (secalin) types in rye flour.

In Cereal Chemistry, roč. 80, 2003, č. 1, s. 102-109.

64. GIANIBELLI, M. C. – LARROQUE, O. R. – MacRITCHIE, F. – WRIGLEY, C. W.

2001. Biochemical, genetics and molecular charakterization of wheat endosperm

proteins. In Cereal chemistry [online], roč. 78, 2001, č. 6, s. 635-646. Dostupné na:

<http://www.aaccnet.org/cerealchemistry/freearticle/gianibelli.pdf>.

65. GORINSTEIN, S. – JARAMILLO, N. O. – MEDINA, O. J. – ROGRIQUES, W. A.

– TOSELLO, G. A. – PAREDES-LOPEZ, O. 1999. Evaluation of some cereals,

plants and tubers through protein composition. In Journal of Protein Chemistry, roč.

18, 1999, č. 6, s. 687-693.

66. GORINSTEIN, S. – ZEMSER, M. – FLIESS, A. – SHNITMAN, I. – PAREDES-

LOPEZ, O. – YAMAMOTO, K. – KOBAYASHI, S. – TANIGUCHI, H. 1998.

Computational analysis of the amino acid residue sequences of amaranth and some

other proteins. In Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, roč. 62, 1998, č. 10,

s. 1845-1851.

67. GRAYBOSCH, R. A. 2004. Grain crops – overview. In Wrigley, C., Corke, H. and



68. GREGORINI, A. – COLOMBA, M. – ELLIS, H. J. – CICLITIRA, P. J. 2009.

Immunogenicity characterization of two ancient wheat α-gliadin peptides related to

coeliac disease. In Nutrients, roč. 1, 2009, č. 2, s. 276-290.

69. GUANDALINI, S. – GUPTA, P. 2001. Do you still need a biopsy to diagnose celiac

disease. In Current Gastroenterology Reports, roč. 3, 2001, č. 5, s. 385-391.

70. GĄSIOROWSKI, H. 1994. Żyto (Chemia i technologia), Warszawa : PWRiL, 1994.

296 s. ISBN 83-09-01609-3.

71. GĄSIOROWSKI, H. 2005. Pszenica (Chemia i technolgia), Warszawa : PWRiL,

2005. 616 s. ISBN 83-09-01787-1.

117

72. HABÁNOVÁ, M. – HABÁN, M. 2003. Moņnosti vyuņitia láskavca ako funkčnej

potraviny. In Zborník - Výživa a potraviny pre 3 tisícročie - funkčné potraviny. Nitra

: SPU, 2003. s. 101-104. ISBN 80-8069-174-6.

73. HARTMANN, G. – KOEHLER, P. – WIESER, H. 2006. Rapid degradation of

gliadin peptides toxic for coeliac disease patients by proteases from germinating

cereals. In Journal of Cereal Science, roč. 44, 2006, č. 3, s. 368-371.

74. HAUSCH, F. – HALTTUNEN, T. – MÄKI, M. – KHOSLA, C. 2003. Design,

synthesis, and evaluation of gluten peptide analogs as selective inhibitors of human

tissue transglutaminase. In Chemistry & Biology, roč. 10, 2003, č. 3, s. 225-231.

75. HEIDEBRECHT, F. – HEIDEBRECHT, A. – SCHULZ, I. – BEHRENS, S.-E. –

BADER, A. 2009. Improved semiquantitative Western blot technique with increased

quantification range. In Journal of Immunological Methods, roč. 345, 2009, č. 1-2, s.

40-48.

76. HILL, P. G. – McMILLAN, S. A. 2006. Anti-tissue transglutaminase antibodies and

their role in the investigation of coeliac disease. In Annals of Clinical Biochemistry,

roč. 43, 2006, č. 2, s. 105-117.

77. HOLDING, D. R. – LARKINS, B. A. 2009. Zein storage proteins. In Kriz, A. L., and

Larkins, B. A.: Molecular genetic approaches to maize improvement, volume 63,

Berlin : Springer, 2009. s. 269-286. ISBN 978-3-540-68919-5.

78. HORSLEY, R. D. – HOCHHALTER, M. 2004. Barley – agronomy. In Wrigley, C.,

Corke, H. and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd.,

USA : Academic Press, 2004. s. 38-46. ISBN 0-12-765490-9.

79. HRAŃKA, Ń. et al. 1989. Ńpeciálna genetika poľnohospodárskych rastlín, Bratislava

: Príroda, 1989. 211 s. ISBN 80-07-00022-4.

80. CHEN, L. – FISCHER, H. – JENSEN, U. 1997. Accumulation of seed storage

proteins and the taxonomy of Poaceae. In Plant Systematics and Evolution, roč. 206,

1997, č. 1-4, s. 243-257.

81. CHIARIONI, G. – BASSOTTI, G. – GERMANI, U. – BATTAGLIA, E. –

BRENTEGANI, M. T. – MORELLI, A. – VANTINI, I. 1997. Gluten-free diet

normalizes mouth-to-cecum transit of a caloric meal in adult patients with celiac

disease. In Digestive Diseases And Sciences, roč. 42, 1997, č. 10, s. 2100-2105.

118

82. IZYDORCZYK, M. S. – DEXTER, J. E. 2004. Barley – milling and processing. In

Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1

– 3, 1. vyd., USA : Academic Press, 2004. s. 57-68. ISBN 0-12-765490-9.

83. JUDD, R. C. 2002. SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis of peptides. In Walker,

J. M.: The protein protocols handbook, 2. vyd., USA : Humana Press, 2002. s. 73-79.

ISBN 0-89603-940-4.

84. JULIANO, B. O. 2004. Rice – overview. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.:


2004. s. 41-48. ISBN 0-12-765490-9.

85. KAGNOFF, M. F. 2007. Celiac disease: Pathogenesis of a model immunogenetic

disease. In The Journal of Clinical Investigation, roč. 117, 2007, č. 1, s. 41-49.

86. KAHLENBERG, F. – SANCHEZ, D. – LACHMANN, I. – TUCKOVA, L. –

TLASKALOVA, H. – MÉNDEZ, E. – MOTHES, T. 2006. Monoclonal antibody R5

for detection of putatively coeliac-toxic gliadin peptides. In European Food

Research and Technology, roč. 222, 2006, č. 1, s. 78-82.

87. KALINOVÁ, J. – MOUDRÝ, J. 2006. Content and quality of protein in proso millet

(Panicum miliaceum L.) varieties. In Plant Foods for Human Nutrition, roč. 61,

2006, č. 1, s. 45-49.

88. KAMARA, M. T. – MING, Z. H. – KEXUE, Z. 2009. Extraction, characterization

and nutritional properties of two varieties of defatted foxtail millet flour (Setaria

italica L.) grown in China. In Asian Journal of Biochemistry, roč. 4, 2009, č. 3, s. 88-

98.

89. KANERVA, P. M. – SONTAG-STROHM, T. S. – RYÖPPY, P. H. – ALHO-

LEHTO, P. – SALOVAARA, H. O. 2006. Analysis of barley contamination in oats

using R5 and ω-gliadin antibodies. In Journal of Cereal Science, roč. 44, 2006, č. 3,

s. 347-352.

90. KAUFFMAN, C. S. – WEBER, L. E. 1990. Grain amaranth. In Janick, J. and Simon,

J. E.: Advances in new crops, USA : Timber Press, 1990. s. 127-139. ISBN 0-88192-

166-1.

91. KELLER, U. – MEIER, R. – BERTOLI, S. 1993. Klinická výņiva, Praha : Scienta

medica, 1993. 240 s. ISBN 80-85526-08-5.

92. KLING, J. G. – HAYES, P. M. – ULLRICH, S. E. 2004. Barley – genetics and

breeding. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.: Encyclopedia of grain science,

119

volume set 1 – 3, 1. vyd., USA : Academic Press, 2004. s. 27-38. ISBN 0-12-

765490-9.

93. KOHAJDOVÁ, Z. – KAROVIČOVÁ, J. 2008. Pńenica ńpaldová. In Potravinárstvo,

roč. 1, 2008, č. 2, s. 69-81.

94. KOHOUT, P. – PAVLÍČKOVÁ, J. 1994. Celiakie: Dieta bezlepková, Čestlice :

Nakladatelství Pavla Momčilová, 1994. 128 s. ISBN 80-901137-6-1.

95. KONIC-RISTIC, A. – DODIG, D. – KRSTIC, R. – JELIC, S. – STANKOVIC, I. –

NINKOVIC, A. – RADIC, J. – BESU, I. – BONACI-NIKOLIC, B. – JOJIC, N. –

DJORDJEVIC, M. – POPOVIC, D. – JURANIC, Z. 2009. Different levels of

humoral immunoreactivity to different wheat cultivars gliadin are present in patients

with celiac disese and in patients with multiple myeloma. In BMC Immunology, roč.

10, 2009, s. 1-7.

96. KRAIC, J. 2004. Genetické markery rastlín, Nitra : SPU, 2004. 67 s. ISBN 80-8069-

381-1.

97. KUČEROVÁ, J. 2004. Technologie cereálií, Brno : MZLU, 2004. 141 s. ISBN 80-

7157-811-8.

98. KURIEN, B. T. – HAL SCOFIELD, R. 2006. Western blotting. In Methods, roč. 38,

2006, č. 4, s. 283-293.

99. LÁSZTITY, R. – ABONYI, T. 2009. Prediction of wheat quality – past, present,

future. A review. In Food Reviews International, roč. 25, 2009, č. 2, s. 126-141.

100. LESTER, D. R. 2008. Gluten measurement and its relationship to food toxicity

for celiac disease patients. In Plant Methods, roč. 4, 2008, č. 26, s. 1-5.

101. LI, W. – DOBRASZCZYK, B. J. – DIAS, A. – GIL, A. M. 2006. Polymer

conformation structure of wheat proteins and gluten subfractions revealed by ATR-

FTIR. In Cereal Chemistry, roč. 83, 2006, č. 4, s. 407-410.

102. LOWICHIK, A. – BOOK, L. 2003. Pediatric celiac disease: clinicopathologic

and genetic aspects. In Pediatric and Developmental Pathology, roč. 6, 2003, č. 6, s.

470-483.

103. LUOSTARINEN, L. 2003. Neurological manifestation in coeliac disease :

dizertačná práca, Tampere : UOT, 2003. 81 s.

104. MACPHEE, D. J. 2010. Methodological considerations for improving Western

blot analysis. In Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, roč. 61,

2010, č. 2, s. 171-177.

120

105. MAHER, K. J. 2008. Against the grain: a celiac disease review. In Medical

Laboratory Observer, roč. 40, 2008, č. 8, s. 22-25.

106. MAKARSKA, E. – CIOŁEK, A. – KOCIUBA, W. 2008. Composition of gluten

proteins and quality parameters of winter triticale hybrids. In Polish Journal of Food

and Nutrition Sciences, roč. 58, 2008, č. 3, s. 341-344.

107. MASUMURA, T. – HIBINO, T. – KIDZU, K. – MITSUKAWA, N. –

TANAKA, K. – FUJII, S. 1990. Cloning and characterization of a cDNA encoding

a rice 13 kDa prolamin. In Molecular and General Genetics, roč. 221, 1990, č. 1, s.

1-7.

108. MATTA, N. K. – SINGH, A. – KUMAR, Y. 2009. Manipulating seed storage

proteins for enhanced grain quality in cereals. In African Journal of Food Science,

roč. 3, 2009, č. 13, s. 439-446.

109. MATZ, S. A. 1991. The chemistry and technology of cereals as food and feed, 2.

vyd., USA : Springer, 1991. 751 s. ISBN 0-442-30830-2.

110. MÉNDEZ, E. – VELA, C. – IMMER, U. – JANSSEN, F. W. 2005. Report of

a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked

immunoassay to determine gliadin in gluten-free food. In European Journal of

Gastroenterology and Hepatology, roč. 17, 2005, č. 10, s. 1053-1063.

111. MICHAELS, T. E. 2004. Pulses – overview. In Wrigley, C., Corke, H. and



112. MICHALÍK, I. 1994a. Charakteristika cereálnych bielkovín, ich výņivná kvalita

a vplyv na zdravotný stav. In Výživa a zdravie, roč. 39, 1994, č. 8, s. 159-160.

113. MICHALÍK, I. 1994b. Charakteristika cereálnych bielkovín, ich výņivná kvalita

a vplyv na zdravotný stav. In Výživa a zdravie, roč. 39, 1994, č. 9, s. 185-186.

114. MICHALÍK, I. 2002. Unifikovaná metóda diskontinuálnej frakcionácie

bielkovinového komplexu zrna obilnín. In Poľnohospodárstvo, roč. 48, 2002, č. 7, s.

333-341.

115. MICHALÍK, I. – BAUEROVÁ, M. 2001. Celiakálne ochorenia známe

i neznáme. In Výživa a zdravie, roč. 46, 2001, č. 1, s. 10-12.

116. MICHALÍK, I. – GÁLOVÁ, Z. – URMINSKÁ, D. – KNOBLOCHOVÁ, H.

2006. Bielkovinový komplex zrna obilnín a pseudoobilnín. In Výživná

121

a technologická kvalita rastlinných produktov a ich potravinárske využitie, Nitra :

SPU, 2006. s. 67-101. ISBN 80-8069-780-9.

117. MORÓN, B. – CEBOLLA, Á. – MANYANI, H. – ÁLVAREZ-MAQUEDA, M.

– MEGÍAS, M. – del CARMEN THOMAS, M. – LÓPEZ, M. C. – SOUSA, C. 2008.

Sensitive detecion of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using

monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide. In The American

Journal of Clinical Nutrition, roč. 87, 2008, č. 2, s. 405-414.

118. MORRISON, L. A. 2004. Cereals – evolution of species. In Wrigley, C., Corke,



119. MOUDRÝ, J. – KALINOVÁ, J. – PETR, J. – MICHALOVÁ, A. 2005. Pohanka

a proso, Praha : ÚZPI, 2005. 208 s. ISBN 80-7271-162-8.

120. MOWAT, A. M. 2003. Coeliac disease – a meeting point for genetics,

immunology, and protein chemistry. In The Lancet, roč. 361, 2003, č. 9365, s. 1290-

1292.

121. MUCHOVÁ, Z. – BOJŇANSKÁ, T. 2006. Funkčné zloņky cereálií a ich

transformácia v potravinách. In Výživná a technologická kvalita rastlinných

produktov a ich potravinárske využitie. Nitra : SPU, 2006. s. 137-166. ISBN 80-

8069-780-9.

122. MUCHOVÁ, Z. – ČUKOVÁ, Ľ. – MUCHA, R. 2000. Bielkovinové frakcie

semena láskavca (Amaranthus sp.). In Rostlinná výroba, roč. 46, 2000, č. 7, s. 331-

336.

123. MUCHOVÁ, Z. – ŅITNÝ, B. 2010. New approach to the study of dough mixing

processes. In Czech Journal of Food Sciences, roč. 28, 2010, č. 2, s. 94-107.

124. MUCHOVÁ, Z. – ŅITNÝ, B. – FRANČÁKOVÁ, H. 2009. Variabilita

kvalitatívnych parametrov pńeničných múk a modifikácia vlastností ciest miesením.

In Acta fytotechnica et zootechnica – mimoriadne číslo, roč. 12, 2009, s. 486-498.

125. MURRAY, J. A. 1999. The widening spectrum of coeliac disease. In The

American Journal Of Clinical Nutrition, roč. 69, 1999, č. 3, s. 354-365.

126. NASSEF, H. M. – BERMUDO REDONDO, M. C. – CICLITIRA, P. J. –

ELLIS, H. J. – FRAGOSO, A. – O´SULLIVAN, C. K. 2008. Electrochemical

immunosensor for detection of celiac disease toxic gliadin in foodstuff. In Analytical

Chemistry, roč. 80, 2008, č. 23, s. 9265-9271.

122

127. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. 2002. Triticale: A promising addition to

the world´s cereal grains, USA : The Minerva Group, Inc., 2002. 116 s. ISBN 0-

89499-179-5.

128. NAŁĘCZ, D. – DZIUBA, J. – MINKIEWICZ, P. – DZIUBA, M. –

SZERSZUNOWICZ, I. 2009. Identification of oat (Avena sativa) and buckwheat

(Fagopyrum esculentum) proteins and their prolamin fractions using two-

dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In European Food Research and

Technology, roč. 230, 2009, č. 1, s. 71-78.

129. OSMAN, A. A. – UHLIG, H. H. – VALDES, I. – AMIN, M. – MÉNDEZ, E. –

MOTHES, T. 2001. A monoclonal antibody that recognizes a potential celiac-toxic

repetitive pentapeptide epitope in gliadins. In European Journal of Gastroenterology

and Hepatology, roč. 13, 2001, č. 10, s. 1189-1193.

130. ÖTLES, S. – CAGINDI, Ö. 2006. Cereal based functional foods and

nutraceuticals. In Acta Scientarium Polonorum, Technologia Alimentaria, roč. 5,

2006, č. 1, s. 107-112.

131. PARAMESWARAN, K. P. – SADASIVAM, S. 1994. Changes in the

carbohydrates and nitrogenous components during germination of proso millet,

Panicum miliaceum. In Plant Foods for Human Nutrition, roč. 45, 1994, č. 2, s. 97-

102.

132. PARAMESWARAN, K. P. – THAYUMANAVAN, B. 1995. Homologies

between prolamins of different minor millets. In Plant Foods for Human Nutrition,

roč. 48, 1995, č. 2, s. 119-126.

133. PARTRIDGE, M. A. K. – JIANG, Y. – SKERRITT, J. H. – SCHAICH, K. M.

2003. Immunochemical and electrophoretic analysis of the modification of wheat

proteins in extruded flour products. In Cereal Chemistry, roč. 80, 2003, č. 6, s. 791-

798.

134. PETR, J. et al. 1997. Speciální produkce rostlinná - I.: obecná část a obilniny,

Praha : AF ČZU KRV, 1997. 197 s. ISBN 80-213-0152-X.

135. PETR, J. – MICHALÍK, I. – TLASKALOVÁ, H. – CAPOUCHOVÁ, I. –

FAMĚRA, O. – URMINSKÁ, D. – TUČKOVÁ, L. – KNOBLOCHOVÁ, H. 2003.

Extension of the spectra of plant products for the diet in coeliac disease. In Czech

Journal of Food Sciences, roč. 21, 2003, č. 2, s. 59-70.

123

136. PINGOUD, A. – URBANKE, C. – HOGGETT, J. – JELTSCH, A. 2002.

Biochemical methods – A concise guide for students and researchers, Weinheim :

Wiley-VCH, 2002. 374 s. ISBN 3-527-30299-9.

137. POMERANZ, Y. 1983. Grain endosperm structure and end-use properties. In

Developments in Food Science vol. 5: Progress in Cereal Chemistry and

Technology, Praha : Czechoslovak Medical Press, 1983. 694 s. ISBN 0-444-99651-6.

138. POMERANZ, Y. 1988. Wheat: Chemistry and technology, 3. vyd., St. Paul, MN

: American Association of Cereal Chemists, 1988. 514 s. ISBN 0-913250-73-2.

139. POMEROY, S. – TUPPER, R. – CEHUN-ADERS, M. – NESTEL, P. 2001. Oat

β-glucan lowers total and LDL-cholesterol. In Australian Journal of Nutrition and

Dietetics, roč. 58, 2001, č. 1, s. 51-55.

140. PRESUTTI, R. J. – CANGEMI, J. R. – CASSIDY, H. D. – HILL, D. A. 2007.

Celiac disease. In American Family Physician, roč. 76, 2007, č. 12, s. 1795-1802.

141. PRUGAR, J. – HRAŃKA, Ń. 1986. Kvalita pńenice, 1. vyd., Bratislava : Príroda,

1986. 224 s. ISBN 64-133-86.

142. PRUGAR, J. – HRAŃKA, Ń. 1989. Kvalita jačmeňa, 1. vyd., Bratislava :

Príroda, 1989. 228 s. ISBN 80-07-00353-3.

143. PRUSKA-KĘDZIOR, A. – KĘDZIOR, Z. – KLOCKIEWICZ-KAMIŃSKA, E.

2008. Comparison of viscoelastic properties of gluten from spelt and common wheat.

In European Food Research and Technology, roč. 227, 2008, č. 1, s. 199-207.

144. RYAN, B. M. – KELLEHER, D. 2000. Refractory celiac disease. In

Gastroenterology, roč. 119, 2000, č. 1, s. 243-251.

145. SALKOVÁ, Z. 1998. Ńpeciálna výņiva. In Potraviny v praxi, roč. 2, 1998, č.

3/4, s. 10-14.

146. SANDBERG, M. – LUNDBERG, L. – FERM, M. – YMAN, I. M. 2003. Real

time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten-free

foods. In European Food Research and Technology, roč. 217, 2003, č. 4, s. 344-349.

147. SATHE, S. K. – VENKATACHALAM, M. 2004. Beans. In Wrigley, C., Corke,



148. SCIARINI, L. S. – RIBOTTA, P. D. – LEÓN, A. E. – PÉREZ, G. T. 2010.

Influence of gluten-free flours and their mixtures on batter properties and bread

quality. In Food and Bioprocess Technology, roč. 3, 2010, č. 4, s. 577-585.

124

149. SDEPANIAN, V. L. – SCALETSKY, I. C. A. – FAGUNDES-NETO, U. – DE

MORAIS, M. B. 2001. Assessment of gliadin in supposedly gluten-free foods

prapared and purchased by celiac patients. In Journal of Pediatric Gastroenterology

and Nutrition, roč. 32, 2001, č. 1, s. 65-70.

150. SHEWRY, P. R. 2002. The major seed storage proteins of spelt wheat, sorghum,

millets and pseudocereals. In Belton, P. S. and Taylor, J. R. N.: Pseudocereals and

less common cereals: grain properties and utilization potential, Germany : Springer,

2002. s. 1-24. ISBN 3-540-42939-5.

151. SHEWRY, P. R. 2004. Improving the protein content and quality of temperate

cereals: wheat, barley and rye. In Çakmak, I. and Welch, R. M.: Impacts of

Agriculture on Human Health and Nutrition, vol. 1, Oxford : EOLSS Publishers Co

Ltd., 2004. ISBN 978-1848265448.

152. SHEWRY, P. R. – HALFORD, N. G. 2002. Cereal seed storage proteins:

structure, properties and role in grain utilization. In Journal of Experimental Botany,

roč. 53, 2002, č. 370, s. 947-958.

153. SHEWRY, P. R. – MIFLIN, B. J. – KASARDA, D. D. 1984. The structural and

evolutionary relationships of the prolamin storage proteins of barley, rye and wheat.

In Philosophical Transactions of the Royal Society B, roč. 304, 1984, č. 1120, s. 297-

308.

154. SHEWRY, P. R. – TATHAM, A. S. 1990. The prolamin storage proteins of

cereal seeds: structure and evolution. In Biochemical Journal, roč. 267, 1990, č. 1, s.

1-12.

155. SHOTWELL, M. A. – BOYER, S. K. – CHESNUT, R. S. – LARKINS, B. A.

1990. Analysis of seed storage protein genes of oats. In The Journal of Biological

Chemistry, roč. 265, 1990, č. 17, s. 9652-9658.

156. SHYUR, L.-F. – WEN, T.-N. – CHEN, CH.-S. 1994. Purification and

characterization of rice prolamins. In Botanical Bulletin of Academia Sinica, roč. 35,

1994, č. 2, s. 65-71.

157. SCHOENLECHNER, R. – DRAUSINGER, J. – OTTENSCHLAEGER, V. –

JURAČKOVÁ, K. – BERGHOFER, E. 2010. Functional properties of gluten-free

pasta produced from amaranth, quinoa and buckwheat. In Plant Foods for Human

Nutrition, roč. 65, 2010, č. 4, s. 339-349.

125

158. SCHOENLECHNER, R. – SIEBENHANDL, S. – BERGHOFER, E. 2008.

Pseudocereals. In Arendt, E. K. and Dal Bello, F.: Gluten-free cereal products and

beverages, USA : Academic Press, 2008. s. 149-190. ISBN 978-0-12-373739-7.

159. SCHUBERT-ULLRICH, P. – RUDOLF, J. – ANSARI, P. – GALLER, B. –

FÜHRER, M. – MOLINELLI, A. – BAUMGARTNER, S. 2009. Commercialized

rapid immunoanalytical tests for determination of allergenic food proteins: an

overview. In Analytical and Bioanalytical Chemistry, roč. 395, 2009, č. 1, s. 69-81.

160. SCHÄGGER, H. – von JAGOW, G. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1

to 100 kDa. In Analytical Biochemistry, roč. 166, 1987, č. 2, s. 368-379.

161. SILANO, M. BENEDETTO, R. – MAIALETTI, F. – VINCENZI, A. –

CALCATERRA, R. – CORNELL, H. J. – VINCENZI, M. 2007. Avenins from

different cultivars of oats elicit response by coeliac peripheral lymphocytes. In

Scandinavian Journal of Gastroenterology, roč. 42, 2007, č. 11, s. 1302-1305.

162. SILVA-SÁNCHEZ, C. – GONZÁLEZ-CASTAÑEDA, J. – DE LEÓN-

RODRÍGUEZ, A. – BARBA DE LA ROSA, A. P. 2004. Functional and rheological

properties of amaranth albumins extracted from two mexican varieties. In Plant

Foods for Human Nutrition, roč. 59, 2004, č. 4, s. 169-174.

163. SKERRITT, J. H. – ANDREWS, J. L. – BLUNDELL, M. – BEASLEY, H. L. –

BEKES, F. 1994. Applications and limitations of immunochemical analysis of

biopolymer quality in cereals. In Food and Agricultural Immunology, roč. 6, 1994, č.

2, s. 173-184.

164. SORELL, L. – LÓPEZ, J. A. – VALDÉS, I. – ALFONSO, P. – CAMAFEITA,

E. – ACEVEDO, B. – CHIRDO, F. – GAVILONDO, J. – MÉNDEZ, E. 1998. An

innovative sandwich ELISA system based on an antibody cocktail for gluten

analysis. In FEBS Letters, roč. 439, 1998, č. 1, s. 46-50.

165. SOUTHGATE, D. A. T. 2000. Cereals and cereal products. In Garrow, J. S.,

James, W. P. T. and Ralph, A.: Human nutrition and dietetics, 10. vyd., Netherlands :

Elsevier, 2000. s. 333-347. ISBN 0-4430-5627-7.

166. STAROVIČOVÁ, M. – GÁLOVÁ, Z. – KNOBLOCHOVÁ, H. 2003.

Identification of glutenin marker in cultivars of three wheat species. In Czech

Journal of Genetics and Plant Breeding, roč. 39, 2003, č. 2, s. 51-57.

126

167. STERN, M. – CICLITIRA, P. J. – van ECKERT, R. – FEIGHERY, C. –

JANSSEN, F. W. – MÉNDEZ, E. – MOTHES, T. – TRONCONE, R. – WIESER, H.

2001. Analysis and clinical effects of gluten in coeliac disease. In European Journal

of Gastroenterology and Hepatology, roč. 13, 2001, č. 6, s. 741-747.

168. STØRSRUD, S. – HULTHÉN, L. R. – LENNER, R. A. 2003. Beneficial effects

of oats in the gluten-free diet of adults with special reference to nutrient status,

symptoms and subjective experiences. In British Journal of Nutrition, roč. 90, 2003,

č. 1, s. 101-107.

169. ŃPALDON, E. a kol. 1982. Rastlinná výroba, Bratislava : Príroda, 1982. 628 s.

ISBN 64-032-82.

170. ŃPALDON, E. a kol. 1986. Rostlinná výroba, Praha : Státní zemědělské

nakladatelství, 1986. 720 s. ISBN 07-124-86.

171. TATHAM, A. S. – SHEWRY, P. R. 2008. Allergens in wheat and related

cereals. In Clinical and Experimental Allergy, roč. 38, 2008, č. 11, s. 1712-1726.

172. TAYLOR, J. R. N. – PARKER, M. L. 2002. Quinoa. In Belton, P. S. and Taylor,

J. R. N.: Pseudocereals and less common cereals: grain properties and utilization

potential, Germany : Springer, 2002. s. 93-119. ISBN 3-540-42939-5.

173. THOMPSON, T. – MÉNDEZ, E. 2008. Commercial assays to assess gluten

content of gluten-free foods: why they are not created equal. In Journal of the

American Dietetic Association, roč. 108, 2008, č. 10, s. 1682-1687.

174. URMINSKÁ, D. – SOCHA, P. – BOJŇANSKÁ, T. 2010. How to determine

coeliac disease active proteins in cereals and pseudocereals. In Proceedings and

Book of Abstracts – International Conference on Food Innovation, FoodInnova

2010. Valencia : Universidad Politecnica de Valencia, 2010. s. 1-5, ISBN 978-84-

693-5010-2.

175. URMINSKÁ, D. – SOCHA, P. – VOLLMANNOVÁ, A. 2009. ELISA and

PAGE analysis of protein determinants from cereal and pseudocereal grain causing

human coeliac disease. In FEBS Journal, roč. 276, 2009, suppl. 1, s. 294-295, ISSN

1742-464X.

176. VACCINO, P. – BECKER, H. A. – BRANDOLINI, A. – SALAMINI, F. –

KILIAN, B. 2009. A catalogue of Triticum monococcum genes encoding toxic and

immunogenic peptides for celiac disease patients. In Molecular Genetics and

Genomics, roč. 281, 2009, č. 3, s. 289-300.

127

177. VALENCIA-CHAMORRO, S. A. 2004. Quinoa. In Wrigley, C., Corke, H. and

Walker, Ch.: Encyclopedia of grain sciences, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA :


178. VARGA, J. – LÍŃKA, E. – ŅAJOVÁ, A. 2000. Tritikale, Nitra : ÚVTIP, 2000.

104 s. ISBN 80-85330-71-7.

179. VITHAL, D. S. – MACHEWAD, G. M. 2006. Processing of foxtail millet for

improved nutrient availability. In Journal of Food Processing and Preservation, roč.

30, 2006, č. 3, s. 269-279.

180. WAGA, J. – ZIENTARSKI, J. 2007. Isolation and purification of individual

gliadin proteins by preparative acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE)

for allergenic research. In Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, roč. 57,

2007, č. 1, s. 91-96.

181. WAGA, J. – ZIENTARSKI, J. – OBTUŁOWICZ, K. – BILO, B. 2006. Flour

quality and binding of immunoglobulin E by gliadin proteins of two winter wheat

genotypes. In Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, roč. 15/56, 2006, č. 3,

s. 305-310.

182. WAGA, J. – ZIENTARSKI, J. – OBTUŁOWICZ, K. – BILO, B. –

STACHOWICZ, M. 2008. Gliadin immunoreactivity and dough rheological

properties of winter wheat genotypes modified by thioredoxin. In Cereal Chemistry,

roč. 85, 2008, č. 4, s. 488-494.

183. WANG, Y. G. – KHAN, K. – HARELAND, G. – NYGARD, G. 2006.

Quantitative glutenin composition from gel electrophoresis of flour mill streams and

relationship to breadmaking quality. In Cereal Chemistry, roč. 83, 2006, č. 3, s. 293-

299.

184. WESTERMEIER, R. 2005. Electrophoresis in practice, 4. vyd., Weinheim :

Wiley-VCH, 2005. 406 s. ISBN 3-527-31181-5.

185. WIESER, H. 2000. Comparative investigations of gluten proteins from different

wheat species. I. Qualitative and quantitative composition of gluten protein types. In

European Food Research and Technology, roč. 211, 2000, č. 4, s. 262-268.

186. WIESER, H. 2004. Celiac disease. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.:


2004. s. 179-187. ISBN 0-12-765490-9.

128

187. WIESER, H. 2007. Chemistry of gluten proteins. In Food Microbiology, roč. 24,

2007, č. 2, s. 115-119.

188. WIESER, H. – KOEHLER, P. 2008. The biochemical basis of celiac disease. In

Cereal Chemistry, roč. 85, 2008, č. 1, s. 1-14.

189. WIESER, H. – SEILMEIER, W. – BELITZ, H.-D. 1994. Quantitative

determination of gliadin subgroups from different wheat cultivars. In Journal Of

Cereal Science, roč. 19, 1994, č. 2, s. 149-155.

190. WIJNGAARD, H. H. – ARENDT, E. K. 2006. Buckwheat – review. In Cereal

Chemistry, roč. 83, 2006, č. 4, s. 391-401.

191. WRIGLEY, C. 2004. Cereals – overview. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker,

Ch.: Encyclopedia of grain science, volume set 1 – 3, 1. vyd., USA : Academic

Press, 2004. s. 187-201. ISBN 0-12-765490-9.

192. WRONKOWSKA, M. – SORAL-ŚMIETANA, M. 2008. Buckwheat flour –

a valuable component of gluten-free formulations. In Polish Journal of Food and

Nutrition Sciences, roč. 58, 2008, č. 1, s. 59-63.

193. WRONKOWSKA, M. – TROSZYŃSKA, A. – SORAL-ŚMIETANA, M. –

WOŁEJSZO, A. 2008. Effects of buckwheat flour (Fagopyrum esculentum Moench)

on the quality of gluten-free bread. In Polish Journal of Food and Nutrition Sciences,

roč. 58, 2008, č. 2, s. 211-216.

194. XIE, Z. – WANG, C. – WANG, K. – WANG, S. – LI, X. – ZHANG, Z. – MA,

W. – YAN, Y. 2010. Molecular characterization of the celiac disease epitope

domains in a-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheats (Triticum

aestivum L.). In Theoretical and Applied Genetics, roč. 121, 2010, č. 7, s. 1239-1251.

195. YALÇIN, E. 2010. Effect of partial removal of prolamins on some chemical and

functional properties of barley flours. In Food Science and Biotechnology, roč. 19,

2010, č. 3, s. 735-742.

196. YALÇIN, E. – ÇELIK, S. – İBANOĞLU, E. 2008. Foaming properties of barley

protein isolates and hydrolysates. In European Food Research and Technology, roč.

226, 2008, č. 5, s. 967-974.

197. YU-XIA, Y. – WEI, W. – YOU-LIANG, Z. – WEN-TING, Y. – QIAN-RONG,

C. 2008. Genetic diversity of storage proteins in cultivated buckwheat. In Pakistan

Journal of Biological Sciences, roč. 11, 2008, č. 13, s. 1662-1668.

129

198. ZARNKOW, M. – FALTERMAIER, A. – BACK, W. – GASTL, M. –

ARENDT, E. K. 2010. Evaluation of different yeast strains on the quality of beer

produced from malted proso millet (Panicum miliaceum L.). In European Food

Research and Technology, roč. 231, 2010, č. 2, s. 287-295.

199. ZÁVODSKÝ, J. 1996. Celiakia a chlieb. In Výživa a zdravie, roč. 41, 1996, č. 1,

s. 28-29.

200. ZHELEZNOV, A. V. – SOLONENKO, L. P. – ZHELEZNOVA, N. B. 1997.

Seed proteins of the wild and the cultivated Amaranthus species. In Euphytica, roč.

97, 1997, č. 2, s. 177-182.

201. ZINGONE, F. – CAPONE, P. – CIACCI, C. 2010. Celiac disease: Alternatives

to a gluten free diet. In World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and

Therapeutics, roč. 1, 2010, č. 1, s. 36-39.

202. ZWER, P. K. 2004. Oats. In Wrigley, C., Corke, H. and Walker, Ch.:


2004. s. 365-375. ISBN 0-12-765490-9.

203. CODEX STAN 118:1979 Codex standard for foods for special dietary use for

persons intolerant to gluten.

204. <http://www.scribd.com/doc/22613588/Amersham-Technical-Manual-Protein-

Electrophoresis-Handbook>

http://www.scribd.com/doc/22613588/Amersham-Technical-Manual-Protein-Electrophoresis-Handbook

http://www.scribd.com/doc/22613588/Amersham-Technical-Manual-Protein-Electrophoresis-Handbook

130

Zoznam publikovaných prác autora súvisiacich s riešenou

problematikou

ADF – Vedecké práce v domácich nekarentovaných časopisoch

SOCHA, P. – RAŅDÍKOVÁ, A. – URMINSKÁ, D. 2010. Optimalizácia stanovenia

prítomnosti celiakálne aktívnych bielkovín v cereáliách a pseudocereáliách –

Optimization of celiatic disease active proteins estimation in cereals and pseudocereals.

In Potravinárstvo, roč. 4, 2010, mimoriadne číslo [CD-ROM], s. 497-508, ISSN 1338-

0230.

SOCHA, P. – MICKOWSKA, B. – MAZUR, E. – URMINSKÁ, D. – CIEŚLIK, E.

2011. Vyuņitie metódy Western blot na detekciu prolamínových bielkovín v zrnách

cereálií a v chlebe – Application of Western blot analysis for detection of prolamin

proteins in cereal grains and bread. In Potravinárstvo, roč. 5, 2011, č. 1, s. 51-55, ISSN

1338-0230.

AEG – Stručné oznámenia, abstrakty vedeckých prác v zahraničných

karentovaných časopisoch

URMINSKÁ, D. – SOCHA, P. – VOLLMANNOVÁ, A. 2009. ELISA and PAGE

analysis of protein determinants from cereal and pseudocereal grain causing human

coeliac disease. In FEBS Journal, roč. 276, suppl. 1, Oxford: Blackwell Publishing,

2009, s. 294-295, ISSN 1742-464X.

AFC – Publikované príspevky na zahraničných vedeckých konferenciách

URMINSKÁ, D. – HOBLÍK, J. – SOCHA, P. – MICHALÍK, I. – PETR, J. 2008.

Proteíny zrna cereálií a pseudocereálií a ich vzťah ku glutén-senzitívnej enteropatii –

Proteins of cereal and pseudocereal grains and their relation to gluten-sensitive

entheropathy. In Sborník příspěvků V. ročníku mezinárodní konference – Proteiny 2008.

Zlín: Univerzita Tomáńe Bati, 2008, s. 196-199, ISBN 978-80-7318-706-4.

131

SOCHA, P. – MICKOWSKA, B. – URMINSKÁ, D. 2010. Analýza celiakálne

aktívnych bielkovín metódou Western blot – Western blot analysis of celiac active

proteins. In Sborník příspěvků – Proceedings of International Ph.D. Students

Conference – Mendelnet 2010 [CD-ROM]. Brno: Mendel University, 2010, s. 787-795,

ISBN 978-80-7375-453-2.

MICKOWSKA, B. – SOCHA, P. – GAMBUŚ, H. – MAZUR, E. – URMINSKÁ, D. –

CIEŚLIK, E. 2011. The comparison of spelt and common wheat flour and bread –

technological value, amino acid composition and immunodetecion of prolamin proteins.

In Sborník příspěvků VI. ročníku mezinárodní konference – Proteiny 2011. Zlín:

Univerzita Tomáńe Bati, 2011, s. 80-84, ISBN 978-80-7454-022-6.

AFD – Publikované príspevky na domácich vedeckých konferenciách

VIVODÍK, M. – GREGÁŇOVÁ, Ņ. – SOCHA, P. – GÁLOVÁ, Z. 2008. Hodnotenie

technologickej kvality pńenice DNA markermi – Evaluation of wheat technological

quality by DNA markers. In Zborník vedeckých prác z III. vedeckej konferencie

s medzinárodnou účasťou – Bezpečnosť a kvalita surovín a potravín [CD-ROM]. Nitra:

SPU, 2008, s. 587-591, ISBN 978-80-8069-996-3.

URMINSKÁ, D. – HOBLÍK, J. – SOCHA, P. – KNOBLOCHOVÁ, H. – MICHALÍK,

I. – PETR, J. 2008. Bielkoviny cereálií a pseudocereálií a ich vzťah k celiakii – Relation

of cereal and pseudocereal proteins to coeliatic disease. In Zborník vedeckých prác z III.

vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou – Bezpečnosť a kvalita surovín

a potravín [CD-ROM]. Nitra: SPU, 2008, s. 573-577, ISBN 978-80-8069-996-3.

SOCHA, P. – MICKOWSKA, B. – URMINSKÁ, D. 2010. Elektroforetická

a imunologická analýza prolamínov extrahovaných zo zrna cereálií a pseudocereálií –

Electrophoretic and imunological analysis of prolamins extracted from cereal and

pseudocereal grains. In Zborník vedeckých prác z V. vedeckej konferencie doktorandov

s medzinárodnou účasťou. Nitra: SPU, 2010, s. 156-159, ISBN 978-80-552-0471-0.

132

AFG – Abstrakty príspevkov zo zahraničných konferencií

URMINSKÁ, D. – SOCHA, P. – BOJŇANSKÁ, T. 2010. How to determine coeliac

disease active proteins in cereals and pseudocereals. In Proceedings and Book of

Abstracts – International Conference on Food Innovation, FoodInnova 2010. Valencia:

Universidad Politecnica de Valencia, 2010, s. 1-5, ISBN 978-84-693-5010-2.

133

Ohlasy na publikácie autora

URMINSKÁ, D. – HOBLÍK, J. – SOCHA, P. – KNOBLOCHOVÁ, H. – MICHALÍK,

I. – PETR, J. 2008. Bielkoviny cereálií a pseudocereálií a ich vzťah k celiakii – Relation

of cereal and pseudocereal proteins to coeliatic disease. In Zborník vedeckých prác z III.

vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou – Bezpečnosť a kvalita surovín

a potravín [CD-ROM]. Nitra: SPU, 2008, s. 573-577, ISBN 978-80-8069-996-3.

Ohlasy:

1. PALENČÁROVÁ, E. – GÁLOVÁ, Z. 2009. Bielkovinové determinanty

celiakálneho ochorenia. In Acta fytotechnica et zootechnica, roč. 12, 2009,

mimoriadne číslo, s. 531-537, ISSN 1335-258X.

2. PALENČÁROVÁ, E. – GÁLOVÁ, Z. 2010. Detekcia celiakálne aktívnych

bielkovín elektroforetickou a imunochemickou metódou. In Potravinárstvo, roč.

4, 2010, mimoriadne číslo [CD-ROM], s. 485-490, ISSN 1338-0230.

SOCHA, P. – RAŅDÍKOVÁ, A. – URMINSKÁ, D. 2010. Optimalizácia stanovenia

prítomnosti celiakálne aktívnych bielkovín v cereáliách a pseudocereáliách –

Optimization of celiatic disease active proteins estimation in cereals and pseudocereals.

In Potravinárstvo, roč. 4, 2010, mimoriadne číslo [CD-ROM], s. 497-508, ISSN 1338-

0230.

Ohlasy:

1. GÁLOVÁ, Z. – TREBICHALSKÝ, A. – PALENČÁROVÁ, E. 2011. Protein

profil of triticale (X Triticosecale witt.), wheat (Triticum aestivum L.) and rye

(Secale cereale). In Potravinárstvo, roč. 5, 2011, mimoriadne číslo [CD-ROM],

s. 274-277, ISSN 1338-0230.

2. TRIPSKÁ, Eva. 2010. Spotřební koń celiatiků a rozdíly ve stravování :

bakalárska práca. Zlín : UTB, 2010. 70 s.

134

Prílohy

Príloha A: CD médiu – dizertačná práca v elektronickom formáte

Príloha B: Systémová príručka:

Príloha 1 Obrázky pouņitého prístrojového vybavenia

Príloha 2 Obrázky zrna analyzovaných cereálií, pseudocereálií a strukovín

Príloha 3 Denzitometrické záznamy jednotlivých elektroforetických profilov

135

Príloha B

Príloha 1 Obrázky použitého prístrojového vybavenia

a) b)

Obrázok 1 [analytické váhy: a) Sartorius CP224S-0CE, b) Radwag XA 110]

Zdroj: autor práce

a) b)

Obrázok 2 [a) automatické pipety, b) vortex]

Zdroj: autor práce

136

Obrázok 3 [2-stupňový systém na deionizáciu vody Millipore MilliQ + Elix]

Zdroj: autor práce

Obrázok 4 [poloautomat pre stanovenie dusíka podľa Kjeldahla Velp Scientifica]

Zdroj: autor práce

137

a) b)

Obrázok 5 [a) centrifúga MPW 350 R, b) zdroj na elektroforézu Bio-Rad]

Zdroj: autor práce

a) b)

Obrázok 6 [a) vákuový lyofilizátor Christ® Alpha 1-2 LD Plus, b) ELISA-reader BioTek]

Zdroj: autor práce

138

Príloha 2 Obrázky zrna analyzovaných cereálií, pseudocereálií a strukovín

Obrázok 7 [Pńenica letná (Triticum aestivum L.), Pńenica tvrdá (Triticum durum L.), Pńenica ńpaldová

(Triticum spelta L.)]

Zdroj: www.oardc.ohio-state.edu

Obrázok 8 [jačmeň siaty (Hordeum vulgare L.), raņ siata (Secale cereale L.), ovos siaty (Avena sativa

L.)]


139

Obrázok 9 [ryņa siata (Oryza sativa L.), kukurica siata (Zea mays L.)]


Obrázok 10 [proso siate (Panicum miliaceum L.), mohár taliansky (Setaria italica L.), pohánka jedlá

(Fagopyrum esculentum Moench)]

Zdroj: www.plants.usda.gov

140

Obrázok 11 [láskavec (Amaranthus sp.), quinoa (Chenopodium quinoa)]

Zdroj: www.stumptuous.com

Obrázok 12 [cícer baraní (Cicer arietinum L.), hrachor siaty (Lathyrus sativus L.), sója obyčajná

(Glycine soja L.)]

Zdroj: www.agraria.org

141

Príloha 3 Denzitometrické záznamy jednotlivých elektroforetických profilov

Obrázok 13 [pńenica letná (Triticum aestivum L.) – odroda Ignis]

Obrázok 14 [pńenica ńpaldová (Triticum spelta L.) – odroda Ceralio]

142

Obrázok 15 [raņ siata (Secale cereale L.) – odroda Amilo]

Obrázok 16 [tritikale (Triticosecale L.) – odroda Kendo]

143

Obrázok 17 [jačmeň siaty (Hordeum vulgare L.) – odroda Babette]

Obrázok 18 [ovos siaty (Avena sativa L.) – odroda Detvan]

144

Obrázok 19 [ryņa siata (Oryza sativa L.) – odroda Basmati]

Obrázok 20 [kukurica siata (Zea mays L.)]

145

Obrázok 21 [proso siate (Panicum miliaceum L.) – odroda Unikum]

Obrázok 22 [mohár taliansky (Setaria italica L.) – odroda Z2300002]

146

Obrázok 23 [cícer baraní (Cicer arietinum L.) – odroda Slovák]

Obrázok 24 [ńpaldový chlieb z odrody Frankienkorn]

Documents

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE …crzp.uniag.sk/Prace/2011/S/A76FFFFD56844C9E9CED1AEF8AA279DE.pdf · V Nitre 30.06.2011 ... ELISA method detect gliadin content below