site oct 2015 - ivb.roTabel 1. Numărul şi vârsta şoarecilor la momentul recepţiei lor în INCD Victor Babeş. Nr. lot Data naşterii Vârsta la 23 oct 2013 (±3 zile) Zile/săptămâni

Date Generale

Cod proiect PN-II-RU-PD-2012-3-0543

Nr contractului 10

Titlul proiectului in engleza**** Mineralocorticoid Receptor Blockade a Therapeutically Solution for Preventing Diabetic Nephropathy and Oxidative Stress Overexpression

Titlul proiectului in romana**** Blocarea receptorilor mineralocorticoizi o soluţie terapeutică pentru

prevenirea apariţiei nefropatiei diabetice şi a influenţei stresului oxidativ

Abstract (Romana)****

Având în vedere lipsa unui tratament cu adevărat eficient şi faptul că diabetul zaharat (DZ) reprezintă una din cauzele majore de progresie spre boala cronică de rinichi stadiul terminal (BCRT), în ultimii ani, s-a înregistrat un interes marcant faţă de înţelegerea corectă a mecanismelor fiziopatologice responsabile de apariţia nefropatiei diabetice (ND). În acest sens, există o serie de cercetări care au evaluat impactul stresului oxidativ (SO) asupra evoluţiei ND. Exacerbarea SO a fost corelată cu apariţia complicaţiilor DZ şi a insuficienţei renale cronice (IRC). Studii recente au sugerat posibilitatea atenuării SO şi scăderea riscului de complicaţii asociate DZ prin iniţierea terapiei antioxidante. De asemenea, s-a observat faptul că sinteza exagerată de aldosteron determină progresia BCR, indiferent de activitatea angiotensinei II (AT-II). După suprimarea sistemului renină-angiotensină-aldosteron (SRAA), "fenomenul de scăpare renală" al aldosteronului este responsabil de apariţia BCRT la pacienţii cu ND. Independent de acţiunea aldosteronului, şi hiperglicemia poate induce injurie podocitară şi creşterea proteinuriei prin exacerbarea SO mediate de acţiunea receptorilor mineralocorticoizi (RM). Având în vedere aceste considerente, ipoteza noastră de lucru presupune scăderea statusului oxidativ şi ameliorarea funcţiei renale la bolnavii obezi şi diabetici tip 2 prin inhibarea RM. Această abordare ar putea reprezenta stabilirea unui nou protocol terapeutic eficient pentru diminuarea riscului progresiei spre IRC la indivizii cu DZ. Pentru a confirma această ipoteză, folosind şoricei de laborator BTBR (Jackson Laboratories, SUA), vom evalua efectele antagoniştilor şi antioxidanţilor aldosteronului asupra evoluţiei ND. Metodologia de lucru va include analizarea probelor prin microscopiei electronică, fluocitometrie şi imunohistochimie.

Abstract (Engleza)****

Understanding diabetic nephropathy (DN) pathophysiology gained more interest, considering the lack of an efficient therapy and that diabetes is a major cause of ESRD. Several studies focused on evaluating the impact of oxidative stress (OS) on DN evolution. Enhanced OS activity has been correlated with diabetes complications and renal failure. New evidence suggested that antioxidative treatment might play a significant role in suppressing OS and decreasing diabetes complications. Recent data reported that aldosterone overexpression induces CKD progression, regardless of angiotensin II action. After suppressing RAAS, aldosterone ‘escape phenomena’ is responsible for ESRD in individuals diagnosed with DN. It has been suggested that hyperglycemia, independent from aldosterone, can determine podocyte injury, because of mediated OS by mineralocorticoids receptors (MR), and may lead to elevated proteinuria. Therefore, we hypothesized that MR blockade could be linked to OS activity lessening, and kidney

function improvement in type 2 diabetic and obese patients. It could represent a new therapeutic approach, able to delay CKD in diabetic subjects. To confirm our hypothesis, we will perform an experimental model including an engineered mouse model, strain BTBR (from Jackson Laboratories, US), to evaluate the effects of aldosterone antagonists and antioxidants on DN evolution. The methodology will involve light and electron microscopy, flow cytometry, and immunohistochemical studies.

Obiectivul proiectului****

OB.1. To examine the morphological consequences of the therapeutic schemes under study (light and electron microscopy). OB.2. To document functional differences between renal tissue under different therapeutic circumstances in vivo and immediately after renal tissue removal. OB.3. To explore changes in immunophenotype after treatment vs control.

Rezultatele estimate****

After assessing and statistical analyzing all data, we will presume to develop: 1. a new efficient and costless treatment targeting the delay of chronic kidney disease (CKD) in diabetic patients by suppressing mineralocorticoids receptors (MR) activity. 2. an important database to be used for future clinical and experimental trials, considering the possibility of long-term conserving the biological samples.

Cerere de finantare in limba engleza

PD_2012_dr_checherita.pdf (198.66kb)

Data inceperii proiectului 01/05/2013

Data incheierii proiectului 31/10/2015

Durata proiect (luni)* 30

Valoarea totala de la buget** 300.000,00

Website *** http://ivb.ro/v2/index.php/ro/2012-11-30-13-03-01/34-default/374-pru

Deviz cadru antecalcul

Anul Denumire capitol Buget

2013

Cheltuieli de personal 22.396,36

Cheltuieli indirecte (regie) 11.450,00

Cheltuieli de deplasare 0,00

Cheltuieli de logistica 92.153,64

TOTAL an 2013 126.000,00

2014



Cheltuieli de deplasare 0,00


TOTAL an 2014 112.500,00

2015



Cheltuieli de deplasare 4.375,00


TOTAL an 2015 61.500,00

Total general 300.000,00

Planificarea proiectului

An bugetar Tipul etapei Numarul

etapei Data încheierii etapei Valoarea etapei

2013 Etapă unică 1 31/12/2013 126.000,00

2014 Etapă unică 2 31/12/2014 112.500,00

2015 Etapă unică 3 31/10/2015 61.500,00

Institutul Naţional de Cercetare‐Dezvoltare in Domeniul Patologiei şi Ştiinţelor Biomedicale “Victor Babeş”

Proiect PN‐II‐RU‐PD‐2012‐3‐0543

Blocarea receptorilor mineralocorticoizi o soluţie terapeutică pentru prevenirea

apariţiei nefropatiei diabetice şi a influenţei stresului oxidativ

Raport ştiinţific

Raport final

30.10.2015

Elaborat de, Avizat de,

Ionel‐Alexandru CHECHERIŢĂ Mihail Eugen HINESCU

ObiectiveleproiectuluiOB 1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor terapeutice aplicate

OB 2. Demonstrarea diferenţelor funcţionale la nivelul ţesutului renal în diverse condiţii terapeutice, in vivo şi

după prelevarea ţesutului.

OB 3. Investigarea modificării imunofenotipului după tratament versus control.

PachetedelucruPL 1. Monitorizarea fiziologică a animalelor pe parcursul terapiei

PL 2. Recoltarea şi procesarea ţesutului renal

PL 3. Evaluarea morfologică a ţesutului renal prin microscopie

PL 4. Monitorizarea funcţională a probelor de ţesut

PL 5. Imunofenotipare.

Activitatiexperimentale

ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE IN ETAPA 1 1. Constituirea loturilor de animale

2. Terapie

3. Monitorizarea animalelor pe parcursul terapiei

4. Sacrificarea animalelor

5. Recoltarea şi stocarea probelor biologice relevante

6. Cultivarea celulelor renale

7. Determinarea parametrilor hematologici ai animalelor la finalul terapiei.

ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE IN ETAPA 2 1. Investigatii histologice si ultrastructurale

2. Evaluarea statusului oxidativ si a capacitatii antioxidante in urina

3. Identificarea genelor cu profil de expresie modificat, implicate in raspunsul celulelor renale la stres

oxidativ

4. Evidentierea unor modificari biochimice in urina

5. Investigatii hematologice.

ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE IN ETAPA 3 1. Investigatii celulare privind activitatea oxidativa intracelulara a celulelor renale

2. Investigatii serologice

Descriereaactivitatilor

1. Realizarea modelului animal si recoltarea probelor biologice Experimentele cu animale au fost făcute în acord cu legislaţia în vigoare şi normele metodologice de lucru pe

animale. Toate protocoalele experimentelor de studiu au fost aprobate de Comisia de etică a INCD „Victor Babeş”.

ConstituirealoturilordeanimaleAnimale: şoarecii transgenici Cg‐Lepob /WiscJ, heterozigoţi Lepob, cu genotipul at/at Lepob/Lepob tf/tf, sunt şoareci

diabetici cu hiperglicemie severă şi obezi, cu nivel crescut de triglyceride. Reprezintă un model animal adecvat

pentru studiul nefropatiei diabetice (diabet insulino‐independent), asociat cu obezitate.

Şoarecii cu vârstele descrise în Tabelul 1, au fost importati de la The Jackson Laboratory, SUA. Conform informaţiilor

obţinute de la furnizor, şoarecii homozigoti cu mutaţia spontană Lepob manifestă obezitate, hiperfagie, sindrom

hiperglicemic, intoleranţă la glucoză, valori plasmatice mari ale insulinei, subfertilitate, vindecare defectuoasă a

rănilor şi producere crescută de hormoni de către hipofiză şi glandele suprarenale. Sunt hipometabolici şi

hipotermici. Obezitatea este caracterizată de creşterea numărului şi a dimensiunii adipocitelor. Hiperinsulinemia

nu se dezvoltă decât după creşterea greutăţii corporale. Şoarecii Lepob dezvoltă diabet la 6 săptămâni (masculii) şi

la 8 săptămâni (femelele). Hiperglicemia este severă şi progresivă.

La nivelul sistemului urinar prezintă următoarele particularităţi:

Morfologie anormală a podocitelor (densitate redusă, număr redus de podocite)

Albuminurie (începând cu 8 săptămâni)

Rinichi mărit

Hipertrofia rinichiului

Masă crescută a rinichiului

Matrice mesangială glomerulară extinsă

Glomeruloscleroză

Mesangioliză (începând cu 8 săptămâni); scleroză mesangială

difuză

Hipertrofie renală glomerulară

Fibroză renală interstiţială (începând cu 12 săptămâni)

Tabel 1. Numărul şi vârsta şoarecilor la momentul recepţiei lor în INCD Victor Babeş.

Nr. lot Data naşterii

Vârsta la 23 oct 2013

(±3 zile)

Zile/săptămâni

Nr. total

şoareci

Din care:

F M

1 20 aug 2013 61 / 8,7 30 13 17

2 27 aug 2013 54 / 7,7 18 11 7

3 3 sep 2013 47 / 6,7 22 11 11

Protocolul de acomodare a şoarecilor în laboratorul gazdă:

- 23 – 24 oct: şoarecii au ramas 24 h în cuştile de transport

- 24‐28 oct: şoarecii au stat în cuşti obişnuite, conform repartizării descrise în Tabelul 4.

Şoarecii au fost cazaţi în camere cu iluminat artificial controlat (12/12, întuneric/lumină), cu temperatura (20‐

24C), umiditatea de 55 ± 10%, cuşti ventilate individual (Tehniplast, Italia) şi aşternut (talaj autoclavat).

Animalele au fost hrănite ad libidum cu nutreţ granulat concentrat special (provenit de la INCDMI Cantacuzino)

şi au fost adăpate cu apă filtrată şi sterilizată schimbată periodic pentru a asigurare prospeţime. Toţi şoarecii

au fost ţinuţi sub un program riguros de curăţenie şi igienizare.

ConstituirealoturilordeanimaleAu fost constituite 3 loturi de animale, în funcţie de vârstă şi implicit în funcţie de gradul de dezvoltare a diabetului

(Tabel 2). În cadrul fiecărui lot de şoareci, au fost constituite 4 subloturi în funcţie de tratament (Tabel 3): enalapril

şi spironolactonă (En+Sp), enalapril, spironolactonă şi vitamina E (En+Sp+VitE), vehicol (hidroxietil celuloză), apă

distilată.

Animalele din fiecare lot şi sublot au fost repartizate în cuşti normale (Tabel 4).

De cel puţin 3 ori pe parcursul terapiei, căte 2 animale de acelaşi sex din fiecare sublot au fost ţinute în cuşti

metabolice (Tabel 3), pentru recoltarea urinei.

Tabel 2. Loturile de animale constituite pe baza vârstei la momentul începerii tratamentului.

Nr. lot

Vârsta la momentul

începerii

tratamentului

Zile/săptămâni

Nr. total

şoareci

Din care:

F M

1 66 / 9,4 30 13 17

2 60 / 8,5 18 11 7

3 54 / 7,7 22 11 11

Tabel 3. Loturi/subloturide şoareci, constituite pe baza vârstei şi a tratamentului.

F=femele, M=masculi, T=număr total de animale/sublot

Lot Sublot

Nr. animale

Tratament Data începerii

tratamentului

Data plasării animalelor în

cuşca metabolică pentru 24h F M T

1 1.1 3 5 8 En+Sp 28.10.2013 28.10.2013

04.11.2013

18.11.2013

1.2 4 5 9 En+Sp+VitE 28.10.2013

1.3 3 3 6 Vehicol 28.10.2013

1.4 3 3 6 Apă distilată 28.10.2013

2 2.1 3 2 5 En+Sp 29.10.2013 29.10.2013

05.11.2013

13.11.2013

2.2 3 2 5 En+Sp+VitE 29.10.2013

2.3 3 2 5 Vehicol 29.10.2013

2.4 2 1 3 Apă distilată 29.10.2013

3 3.1 3 3 6 En+Sp 30.10.2013 30.10.2013

06.11.2013

14.11.2013

3.2 3 3 6 En+Sp+VitE 30.10.2013

3.3 3 3 6 Vehicol 30.10.2013

3.4 2 2 4 Apă distilată 30.10.2013

T=număr total de animale/sublot

Tabel 4. Repartizarea animalelor din loturi şi subloturi în cuşti normale.

Lot Sublot Femele Masculi

Cuşca Nr. animale Cuşca Nr. animale

1 1.1 1.1F 3 1.1M 5

1.2 1.2F 4 1.2M 5

1.3 1.3F 3 1.3M 3

1.4 1.4F 3 1.4M 3

2 2.1 2.1F 3 2.1M 2

2.2 2.2F 3 2.2M 2

2.3 2.3F 3 2.3M 2

2.4 2.4F 2 2.4M 1

3 3.1 3.1F 3 3.1M 3

3.2 3.2F 3 3.2M 3

3.3 3.3F 3 3.3M 3

3.4 3.4F 2 3.4M 2

Terapie

SchemedeterapieSchemele de terapie administrate animalelor prin gavaj zilnic au fost:

enalapril şi spironolactonă (En+Sp)

enalapril, spironolactonă şi vitamina E (En+Sp+VitE)

vehicol (hidroxietil celuloză)

apă distilată.

Dozele de agenţi terapeutici administraţi animalelor zilnic, prin gavaj (0,2 mL/animal) sunt descrise în Tabelul 5.

Tabel 5. Dozele de agenţi terapeutici/animal/zi, administrate zilnic prin gavaj.

Medicament Enalapril (En) Spironolactonă (Sp) Vitamina E (VitE)

Doza zilnică / şoarece 0,25 mg/zi 0,5 mg/zi 0,45 mg/zi

Concentraţia în soluţia de

gavaj (0,2 mL / şoarece) 1,25 mg/mL 2,50 mg/mL 2,25 mg/mL

PreparareamedicamentelorEnalaprilul (sare de maleat), spironolactona, vitamina E şi hidroxietil celuloza (vehicol) au fost procurate de la

Sigma‐Aldrich.

Datorită faptului că spironolactona este insolubilă în apă, s‐a ales varianta de suspensionare a acesteia, împreună

cu ceilalţi agenţi terapeutici, în hidroxietil celuloză (HEC), în vederea administrării controlate, prin gavaj, a

amestecurilor de substante (En+Sp, sau En+Sp+VitE).

Am utilizat o soluţie de 1% HEC în apă tridistilată, deionizată. Pe scurt, hidroxietil celuloză a fost pulverizată lent în

apă, sub agitare continuă la 1100‐1300 rpm, la temperatură medie de 40oC (±3oC). În aproximativ 40 min, soluţia

de polimer se clarifică. Toată procedura s‐a realizat în condiţii sterile.

Agenţii terapeutici ‐ Au fost pregătite soluţii triplu concentrate de de enalaprill, spironolactona şi vitamina E în HEC

(comparativ cu concentraţiile finale descrise în Tabelul 5). În cazul spironolactonei, s‐a realizat în fapt o suspensie,

care, pentru omogenizare a trebuit puternic vortexata. De asemenea, preparatul de vitamină E în HEC s‐a realizat

prin emulsionare.

Realizarea amestecurilor de agenţi terapeutici:

En+Sp 1 volum 3,75 mg/mL En + 1 volum 7,5 mg/mL Sp + 1 volum 1% HEC

En+Sp+VitE 1 volum 3,75 mg/mL En + 1 volum 7,5 mg/mL Sp + 1 volum 6,75 mg/mL VitE

Soluţiile/suspensiile de agenţi terapeutici şi amestecurile lor au fost preparate zilnic, cu cel mult 18 ore înainte de

administrarea terapiei la animale.

AdministrareamedicamentelorAdministrarea medicamentelor s‐a realizat zilnic, prin gavaj (0,2 mL) animal.

Durata terapiei pentru fiecare lot/sublot de animale este descrisă în Tabelul 6. În ziua sacrificării animalelor,

acestora nu li s‐a mai administrat medicaţie.

Loturile 2 şi 3, cu vârstele la sacrificare de 76, respectiv 70 zile (Tabel 7), au fost tratate timp de 16 zile. Lotul de

şoareci vârstnici (Lotul 1, cu vârsta l meomentul sacrificării de 87 zile), a fost tratat mai mult timp (21 zile) deoarece,

cel puţin teoretic, prezintă forme mai avansate de diabet.

Tabel 6. Durata terapiei pentru fiecare lot de animale.

Lot Sublot Tratament Data începerii

tratamentului

Data finalizării

tratamentului

Număr zile de

tratament

1 1.1 En+Sp

28.10.2013 17‐18.11.2013 21‐22 1.2 En+Sp+VitE

1.3 Vehicol

1.4 Apă distilată

2 2.1 En+Sp

29.10.2013 13.11.2013 16 2.2 En+Sp+VitE

2.3 Vehicol

2.4 Apă distilată

3 3.1 En+Sp

30.10.2013 14.11.2013 16 3.2 En+Sp+VitE

3.3 Vehicol

3.4 Apă distilată

Tabel 7. Vârsta animalelor la sacrificare.

Lot Sublot Tratament

Vârsta animalelor la

debutul terapiei

(zile – săptămâni)

Vărsta animalelor la

sacrificare

(zile – săptămâni)

1 1.1 En+Sp

66 / 9,4 87‐88 / 12,4 1.2 En+Sp+VitE

1.3 Vehicol

1.4 Apă distilată

2 2.1 En+Sp

60 / 8,5 76 / 10,8 2.2 En+Sp+VitE

2.3 Vehicol

2.4 Apă distilată

3 3.1 En+Sp

54 / 7,7 70 / 10,0 3.2 En+Sp+VitE

3.3 Vehicol

3.4 Apă distilată

MonitorizareaanimalelorpeparcursulterapieiPe parcursul terapiei, animalele au fost monitorizate privind semnele clinice.

Starea clinică a şoarecilor a fost controlată zilnic, iar greutatea a fost evaluată de la începutul

şi la sfarşitul experimentului. Evaluarea stării clinice a animalului a inclus examinarea

tegumentului, comportamentului şi sănătatea animalului. Examinarea comportamentului şi

a sănătăţii animalului a presupus observarea zilnică dacă animalul manâncă, bea apă, se

deplasează fără disconfort.

De 3 ori pe parcursul terapiei (înainte de instituirea terapiei, după 7 zile şi înaintea

sacrificării), animalele au fost plasate în cuşti metabolice (căte 2 animale/sublot/sex) pentru

recoltarea urinii în vederea analizei biochimice.

SacrificareaanimalelorSacrificarea animalelor s‐a realizat la 1 zi după terminarea tratamentului

(Tabel 6), prin dislocuire cervicală.

RecoltareaşistocareaprobelorbiologicerelevanteÎnainte de începerea terapiei, am realizat sîngerarea animalelor (puncţie retroorbitală) pentru exprimarea serului

în vederea realizării unor teste imunologice (profilul seric al citokinelor). Am evitat sângerarea animalelor pe

parcursul terapiei, întrucât ar fi putut induce perturbări biochimice şi hematologice necontrolabile, putând provoca

chiar moartea animalelor.

Imediat înainte de sacrificarea animalelor, s‐a recoltat sânge pentru realizarea investigaţiei hematologice (sânge

integral recoltat pe anticoagulat) şi a celei biochimice (ser).

Au fost recoltati rinichii, căntăriţi şi apoi au fost secţionaţi pentru diverse investigaţii:

Rinichiul mai mare de la fiecare animal a fost transferat pentru a) investigaţii ultrastructurale (a fost mărunţit

si plasat în soluţie 25% glutaraldehidă pentru fixare); b) culturi de celule renale

Celălalt rinichi a fost secţionat în plan orizaontal si repartizat pentru: a) analiză proteică prin Western blot

(porţiunea de rinichi a fost îngheţată imediat, ca atare, la ‐80oC); imunohistochimie (porţiunea de rinichi a fost

imediat plasată în formol 10%); analiză genomică (porţiunea de rinichi a fost plasată în RNAlater şi ţinută până

a doua zi la frigider).

Au fost recoltate şi alte organe decât rinichii, pentru diverse investigaţii:

Cord – o prţiune a fost plasată în formol 10% pentru analiză imunohistochimică, iar altă porţiune a fost

mărunţită şi plasată în glutaraldehidă pentru investigaţii ultrastructurale.

Pancreas ‐ a fost izolat şi plasat în glutaraldehidă pentru analiză ultrastructurală

Plamân – a fost plasat în formol 10% pentru analiză imunohistochimică

Creier – o porţiune a fost plasată în formol 10% pentru analiză imunohistochimică, iar altă porţiune a fost

îngheţată rapid în azot lichid şi apoi păstrată la ‐80oC pentru investigaţii proteomice

Splină – a fost plasată în mediu de cultură RPMI1640 suplimentat cu antibitic‐antimicotic, pentru izolarea şi

stocarea splenocitelor în vederea realizării unor investigaţii imunologice (capacitatea proliferativa, stres

oxidativ, răspunsul de citokine al splenocitelor la activarea experimentală cu LPS etc).

Pentru analiza profilului microelementelor prin ICP‐MS, s‐a recoltat şi îngheţat la ‐20oC piele cu păr, grăsime şi

plămân.

ConcluziiSoarecii Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti prezinta leziunile ultrastructurale la nivelul tesutului renal de mica

amplitudine si neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. S‐a inregistrat o mare variabilitate inter‐individuala in

ceea ce priveste dezvoltarea spontana a leziunilor In prezenta unui tratament, distributia leziunilor decelabile

ultrastructural este neuniforma si inegala. Exista spre exemplu, sectiuni ultrastructurale in care apar leziuni la

nivelul unui singur glomerul, care se gaseste la mica distanta de alti doi glomerului cu aspect ultrastructural normal.

Aspectul histopatologic este de nefropatie diabetica moderata si este similar intre acestea, neputandu‐se decela

diferente notabile morfologice la coloratia uzuala hematoxilin‐eozina si coloratia speciala PAS. Modificarile

histopatologice identificate sunt reprezentate de scleroza mesangiala usoara‐moderata si hipercelularitate

mesangiala (prezenta de 3 celule mesangiale in majoritatea spatiilor mesangiale hipercelulare). Nu se observa

hialinizare arteriolara sau alte leziuni vasculare si nici ingrosarea membranei bazale ale tubilor renali.

Productia de ROS la nivelul rinichiului soarecilor Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti pare sa fie redusa in comparatie cu

soarecii C57BL/6 normali, intrucat surse majore de ROS in rinichi, cum ar fi Nox4 si Nox1, sunt subexprimate. In

acelasi timp, remarcam ca sisteme antioxidante majore sunt de asemenea subexprimate. De asemenea, activitatea

antioxidanta a glutationului pare sa fie inhibata, prin subexprimarea unei enzime cheie in sinteza tripeptidului, ca

si prin inhibarea a 3 glutationperoxidaze. Subexpimarea unor gene importante pentru sistemul antioxidant s‐ar

putea sa fie consecinta gradului scazut de stres oxidativ in rinichiul soarecelui Cg‐Lepob /WiscJ. Alternativ, este

posibil sa reprezinte un defect de combatere a stresului oxidativ, si sa influenteze de asemenea negativ

semnalizarea redox intracelulara.

La soarecii Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti au fost evidentiate perturbari la nivelul metabolismului lipidic. De exemplu,

subexprimarea genei Scd1 poate determina scaderea sintezei de acizi grasi nesaturati si cresterea susceptibilitatii

la peroxidare lipidica. Perturbarea este adancita prin subexprimarea apolipoproteinei E, care mediaza legarea,

internalizarea si catabolizarea lipoproteinelor. Subexprimarea genei Ucp3 scade capacitatea mitocondriilor de a

controla fluxul de acizi grasi. Supraexprimarea genei care codifica pentru cicloxigenaza, de asemenea implicata in

metabolismul lipidic, indica existenta unui proces inflamator activ in rinichiul soarecilor Cg‐Lepob /WiscJ. Profilul

genic sugereaza insa ca procesul inflamator nu este asociat cu recrutare crescuta de leucocite pro‐inflamatoare

(fagocite si limfocite T). Aceasta constatare este sustinuta si de faptul ca gena Serpin 1 este subexprimata ceea ce

sugereaza faptul ca procesul inflamator nu este insotit de depunere crescuta de fibrina.

Terapia cu enalapril si spironolactona are efecte modeste asupra soarecilor Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti care

prezinta nefropatie diabetica moderata.

Terapia cu enalapril si spironolactona poate induce o crestere moderata a statusului oxidativ intracelular general,

dar aceasta nu se datoreaza intensificarii producerii de anion superoxid la nivel mitocondrial. In fapt, terapia cu

enalapril si spironolactona induce scaderea generarii intracelulare de anion superoxid la nivel mitocondrial, care se

coreleaza cu depolarizarea membranei mitocondriale.

Soarecii Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti tineri (lotul 3), dar nu si cei din loturile 1 si 2 mai varstnice, prezinta nivel

crescut de glucoza, care se normalizeaza in urma terapiei de 16 zile cu enalapril si spironolactona. In acelasi timp,

la acesti soareci terapia induce scaderea capacitatii antioxidante totale in urina, fara insa sa se inregistreze

cresterea markerilor de stres oxidativ, cum ar fi 8‐OHdG. Concluzionand, soarecii Cg‐Lepob /WiscJ heterozigoti

reprezinta un model animal util pentru investigarea nefropatiei diabetice incipiente. La acesti soareci transgenici

terapia cu enalapril si spironolactona induce modificari la nivelul statusului oxidativ renal, dar impactul functional

al terapiei trebuie investigat pe perioade mai indelungate decat cele realizate in prezentul studiu.

Diseminarearezultatelor

Publicatii a) A fost publicat articolul de tip review cu titlul "Redox signaling in diabetic nephropathy – hypertrophy

versus death choices in mesangial cells and podocytes", autori Gina Manda, Ionel Alexandru Checheriță, Maria

Victoria Comănescu, Mihail Eugen Hinescu. Articolul a fost publicat in revista “Mediators of Inflammation” (factor

de impact 3.236), in cadrul numarului special "Live or Die: Choice Mechanisms in Stressed Cells”

(http://www.hindawi.com/journals/mi/2015/604208/).

b) Articolul cu titlul NEW MOLECULAR INSIGHTS IN DIABETIC NEPHROPATHY a fost trimis spre publicare la

revista Romanian Journal of Morphology and Embryology (Impact factor 0,659).

Comunicări POSTERE

Balcangiu‐Stroescu A, Niculae A, Rădulescu D, David C, Peride I, Poenaru E, Ionel Alexandru Checheriță.

Influence of HbA1c and low phosphorus diet on cognitive impairment in chronic hemodialysis diabetic

patients. Nephrol Dial Transplant. 2015; 30(Suppl 3):iii624; 52nd ERA‐EDTA Congress, mai 2015, Londra,

Marea Britanie; SP745. Factor de impact 3,488.

Peride I, Lupușoru G, Lupușoru M, Niculae A, Ionel Alexandru Checheriță. Severe acidosis impact on total

antioxidant capacity in newly hemodialyzed patients ‐ an insidious foe. Fiziologia (Physiology). 2015;

Suppl:9; 39; The 28th National Conference of the Romanian Society of Physiological Sciences, mai 2015,

Constanța.

COMUNICĂRI ORALE

Ciocâlteu A, Ionel Alexandru Checheriță, David C. Terapii la modă. Practica Farmaceutică. 2013; 6(4):195;

Conferința Națională de Farmacie, noiembrie 2013, București.

Bibliografieselectiva1. National Kidney Foundation. KDOQI clinical practice guideline for diabetes and CKD: 2012 update. Am J Kidney Dis. 2012;60:850‐86.

2. de Boer IH, Rue TC, Hall YN, Heagerty PJ, Weiss NS, Himmelfarb J. Temporal trends in the prevalence of diabetic kidney disease in the United States. JAMA. 2011;305:2532‐9.

3. US Renal Data System. USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End‐Stage Renal Disease in the United States. Am J Kidney Dis. 2012;59(Suppl 1):e1‐420.

4. Ritz E. Pathogenesis, clinical manifestations, and natural history of diabetic nephropathy. In: Feehally J, Floege J, Johnson RJ, editors. Comprehensive clinical nephrology, 3rd edn. Philadelphia: Mosby Elsevier; 2007. p. 353‐64.

5. Bakris GL. Overview of diabetic nephropathy. UpToDate. 2013; http://www.uptodate.com/contents/overview‐of‐diabetic‐nephropathy.com.

6. Mogensen CE, Christensen CK, Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes. 1983; 32(Suppl 2):64‐78.

7. Tervaert TW, Mooyaart AL, Amann K, Cohen AH, Cook HT, Drachenberg CB, et al. Pathologic classification of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2010;21:556‐63.

8. Katz A, Caramori ML, Sisson‐Ross S, Groppoli T, Basgen JM, Mauer M. An increase in the cell component of the cortical interstitium antedates interstitial fibrosis in type 1 diabetic patients. Kidney Int. 2002;61:2058‐66.

9. Gilbert RE, Cooper ME. The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease: more than an aftermath of glomerular injury? Kidney Int. 1999;56:1627‐37.

10. Vashistha H, Meggs L. Diabetic nephropathy: lessons from the mouse. Ochsner J. 2013;13:140‐6.

11. Huang W, Gallois Y, Bouby N, Bruneval P, Heudes D, Belair MF, et al. Genetically increased angiotensin I‐converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:13330‐4.

12. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:13302‐5.

13. Kakoki M, Kizer CM, Yi X, Takahashi N, Kim HS, Bagnell CR, et al. Senescence‐associated phenotypes in Akita diabetic mice are enhanced by absence of bradykinin B2 receptors. J Clin Invest. 2006;116:1302‐9.

14. Kakoki M, McGarrah RW, Kim HS, Smithies O. Bradykinin B1 and B2 receptors both have protective roles in renal ischemia/reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:7576‐81.

15. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 2005;54:1615‐25.

16. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen species regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl 3):S241‐5.

17. Li JM, Shah AM. ROS generation by nonphagocytic NADPH oxidase: potential relevance in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl 3):S221‐6.

18. Mima A. Inflammation and oxidative stress in diabetic nephropathy: new insights on its inhibitions as new therapeutic targets. J Diabetes Res. 2013; doi: 10.1155/2013/248563. [Epub ahead of print].

19. Banba N, Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K. Possible relationship of monocyte chemoattractant protein‐1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000;58:684‐90.

20. Sassy‐Prigent C, Heudes D, Mandet C, Bélair MF, Michel O, Perdereau B, et al. Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocin‐induced diabetic rats. Diabetes. 2000;49:466‐75.

21. Okada S, Shikata K, Matsuda M, Ogawa D, Usui H, Kido Y, et al. Intercellular adhesion molecule‐1‐deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes. Diabetes. 2003;52:2586‐93.

22. Chow F, Ozols E, Nikolic‐Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH. Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy: correlation with diabetic state and progressive renal injury. Kidney Int. 2004;65:116‐28.

23. Gæde P, Poulsen HE, Parving HH, Pedersen O. Double‐blind, randomised study of the effect of combined treatment with vitamin C and E on albuminuria in Type 2 diabetic patients. Diabet Med. 2001;18:756‐60.

24. Locatelli F, Canaud B, Eckardt K‐U, Stenvinkel P, Wanner C, Zoccali C. Oxidative stress in end‐stage renal disease: an emerging threat to patient outcome. Nephrol Dial Transplant. 2003;18:1272‐80.

25. Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol. 1997;82:291‐5.

26. Ha H, Hwang IA, Park JH, Lee HB. Role of reactive oxygen species in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Diabetes Res Clin Pract. 2008;82(Suppl 1):S42‐5.

27. Rösen P, Nawroth PP, King G, Möller W, Tritschler HJ, Packer L. The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a congress series sponsored by UNESCO‐MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society. Diab Metab Res Rev. 2001;17:189‐212.

28. Giugliano D, Ceriello A, Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care. 1996;19:257‐67.

29. Duckworth WC. Hyperglycemia and cardiovascular disease. Curr Atheroscler Rep. 2001;3:383‐91.

30. Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS‐generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007;87:245‐313.

31. Sun YM, Su Y, Li J, Wang LF. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic nephropathy. Biochem Biophys Res Commun. 2013;433:359‐61.

32. Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res. 2010;107:1058‐70.

33. Cave AC, Brewer AC, Narayanapanicker A, Ray R, Grieve DJ, Walker S, Shah AM. NADPH oxidases in cardiovascular health and disease. Antioxid Redox Signal. 2006;8:691‐728.

34. Starkey JM, Tilton RG. Proteomics and systems biology for understanding diabetic nephropathy. J Cardiovasc Transl Res. 2012;5(4):479‐90.

35. Tao WA, Aebersold R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(1):110‐8.

36. Kostiainen R, Kotiaho T, Kuuranne T, Auriola S. Liquid chromatography/atmospheric pressure ionization‐mass spectrometry in drug metabolism studies. J Mass Spectrom. 2003;38(4):357‐72.

37. Yost RA, Enke CG. Triple quadrupole mass spectrometry for direct mixture analysis and structure elucidation. Anal Chem. 1979;51(12):1251‐64.

38. Butterfield DA, Dalle‐Donne I. Redox proteomics: from protein modifications to cellular dysfunction and disease. Mass Spectrom Rev. 2014;33(1):1‐6.

39. Butterfield DA, Dalle‐Donne I. Redox proteomics. Antioxid Redox Signal. 2012;17:1487‐9.

40. Sheehan D, Rainville LC, Tyther R, McDonagh B. Redox proteomics in study of kidney‐associated hypertension: new insights to old diseases. Antioxid Redox Signal. 2012;17(11):1560‐70.

41. Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress‐activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr Rev. 2002;23:599‐622.

42. Galler A, Muller G, Schinzel R, Kratzsch J, Kiess W, Munch G. Impact of metabolic control and serum lipids on the concentration of advanced glycation end products in the serum of children and adolescents with type 1 diabetes, as determined by fluorescence spectroscopy and nepsilon‐(carboxymethyl) lysine ELISA. Diabetes Care. 2003;26:2609‐15.

43. Vlassara H, Striker LJ, Teichberg S, Fuh H, Li YM, Steffes M. Advanced glycation end products induce glomerular sclerosis and albuminuria in normal rats. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:11704‐8.

44. Lu M, Kuroki M, Amano S, Tolentino M, Keough K, Kim I, et al. Advanced glycation end products increase retinal vascular endothelial growth factor expression. J Clin Invest. 1998;101:1219‐24.

45. Galkina E, Ley K. Leukocyte recruitment and vascular injury in diabetic nephropathy, J Am Soc Nephro. 2006;17:368‐77.

46. Imani F, Horii Y, Suthanthiran M, Skolnik EY, Makita Z, Sharma V, Sehajpal P, Vlassara H. Advanced glycosylation endproduct‐specific receptors on human and rat Tlymphocytes mediate synthesis of interferon : role in tissue remodeling. J Exp Med. 1993;178:2165‐72.

47. Wu CC, Chen JS, Lu KC, Chen CC, Lin SH, Chu P, Sytwu HK, Lin YF. Aberrant cytokines/chemokines production correlate with proteinuria in patients with overt diabetic nephropathy. Clinica Chim Acta. 2010;411:700‐4.

48. Glogowski EA, Tsiani E, Zhou X, Fantus IG, Whiteside C. High glucose alters the response of mesangial cell protein kinase C isoforms to endothelin‐1. Kidney Int. 1999;55:486‐99.

49. Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, et al. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008;233:4‐11.

50. Singh SB, Malamas MS, Hohman TC, Nilakantan R, Carper DA, Kitchen D. Molecular modeling of the aldose reductase‐inhibitor complex based on the X‐ray crystal structure and studies with single‐site‐directed mutants. J Med Chem. 2000;43:1062‐70.

51. James LR, Tang D, Ingram A, Ly H, Thai K, Cai L, et al. Flux through the hexosamine pathway is a determinant of nuclear factor κB‐dependent promoter activation. Diabetes. 2002;51:1146‐56.

52. Hebert LF, Daniels MC, Zhou JX, Crook ED, Turner RL, Simmons ST, et al. Overexpression of glutamine:fructose‐6‐phosphate amidotransferase in transgenic mice leads to insulin resistance. J Clin Invest. 1996;98:930‐6.

53. Tang J, Neidigh JL, Cooksey RC, McClain DA. Transgenic mice with increased hexosamine flux specifically targeted to β‐cells exhibit hyperinsulinemia and peripheral insulin resistance. Diabetes. 2000;49:1492‐9.

54. Veerababu G, Tang J, Hoffman RT, Daniels MC, Hebert Jr LF, Crook ED, et al. Overexpression of glutamine:fructose‐6‐phosphate amidotransferase in the liver of transgenic mice results in enhanced glycogen storage, hyperlipidemia, obesity, and impaired glucose tolerance. Diabetes. 2000;49:2070‐8.

55. Kagami S, Border WA, Miller DE, Noble NA. Angiotensin II stimulated extracellular matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor‐β expression in rat glomerular cells. J Clin Invest. 1994;93:2431‐7.

56. Kagami S, Kuhara T, Okada K, Kuroda Y, Border WA, Noble NA. Dual effects of angiotensin II on the plasminogen/plasmin system in rat mesangial cells. Kidney Int. 1997;51:664‐71.

57. Wilson HM, Haites NE, Booth NA. Effect of angiotensin II on plasminogen activator inhibitor‐1 production by cultured human mesangial cells. Nephron. 1997;77:197‐204.

58. Singh R, Alavi N, Singh AK, Leehey DJ. Role of angiotensin II in glucose‐induced inhibition of mesangial matrix degradation. Diabetes. 1999;48:2066‐73.

59. Giacchetti G, Sechi LA, Rilli S, Carey RM. The renin‐angiotensin‐aldosterone system, glucose metabolism and diabetes. Trends Endocrinol Metabol. 2005;16:120‐6.

60. Ortega MR, Ruperez M, Esteban V, Vita JR, Lopez ES, Carvajal G, et al. Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases. Nephrol Dial Transplant. 2006;21:16‐20.

61. Waanders F, Visser FW, Gans RO. Current concepts in the management of diabetic nephropathy. Neth J Med. 2013;71:448‐58.

62. Singh R, Singh AK, Alavi N, Leehey DJ. Mechanism of increased angiotensin II levels in glomerular mesangial cells cultured in high glucose. J Am Soc Nephrol. 2003;14:873‐80.

63. Badshah II, Baines DL, Dockrell ME. Erk5 is a mediator to TGFβ1‐induced loss of phenotype and function in human podocytes. Front Pharmacol. 2014;5:71.

64. Khalil N. TGF‐beta: from latent to active. Microbes Infect. 1999;1:1255‐63.

65. Reeves WB, Andreoli TE. Transforming growth factor beta contributes to progressive diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7667‐9.

66. Goldfarb S, Ziyadeh FN. TGF‐beta: a crucial component of the pathogenesis of diabetic nephropathy. Trans Am Clin Climatol Assoc. 2001;112:27‐32.

67. Siegel PM, Massagué J. Cytostatic and apoptotic actions of TGF‐beta in homeostasis and cancer. Nat. Rev. Cancer. 2003;3:807‐21.

68. Chuang, PY, He JC. Signaling in regulation of podocyte phenotypes. Nephron Physiol. 2009;111:9‐15.

69. Huang, F, ChenYG. Regulation of TGF‐β receptor activity. Cell Biosci. 2012;2:9.

70. Suzaki Y, Yoshizumi M, Kagami S, Nishiyama A, Ozawa Y, Kyaw M, et al. BMK1 is activated in glomeruli of diabetic rats and in mesangial cells by high glucose conditions. Kidney Int. 2004;65:1749‐60.

71. Browne JA, Pearson AL, Zahr RA, Niculescu‐Duvaz I, Baines DL, Dockrell MEC. TGF‐beta activates ERK5 in human renal epithelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008;373:440‐4.

72. Dorado F, Velasco S, Esparis‐Ogando A, Pericacho M, Pandiella A, Silva J, et al. The mitogen‐activated protein kinase Erk5 mediates human mesangial cell activation. Nephrol. Dial. Transplant. 2008;23:3403‐11.

73. Bohle A, Wehrmann M, Bogenschutz O, Batz C, Muller CA, Muller GA. The pathogenesis of chronic renal failure in diabetic nephropathy. Investigation of 488 cases of diabetic glomerulosclerosis. Pathol Res Pract. 1991;187:251‐9.

74. Furuta T, Saito T, Ootaka T, Soma J, Obara K, Abe K, et al. The role of macrophages in diabetic glomerulosclerosis. Am J Kidney Dis. 1993;21:480‐5.

75. Bending JJ, Lobo‐Yeo A, Vergani D, Viberti GC. Proteinuria and activated T‐lymphocytes in diabetic nephropathy. Diabetes. 1998;37:507‐11.

76. Moriya R, Manivel JC, Mauer M. Juxtaglomerular apparatus T‐cell infiltration affects glomerular structure in type 1 diabetic patients. Diabetologia. 2004;47:82‐8.

77. Fardon NJ, Wilkinson R, Thomas TH. Abnormalities in primary granule exocytosis in neutrophils from type I diabetic patients with nephropathy. Clin Sci (Lond). 2002;102:69‐75.

78. Takahashi T, Hato F, Yamane T, Inaba M, Okuno Y, Nishizawa Y, et al. Increased spontaneous adherence of neutrophils from type 2 diabetic patients with overt proteinuria: Possible role of the progression of diabetic nephropathy. Diabetes Care. 2000;23:417‐8.

79. Ikezumi Y, Hurst LA, Masaki T, Atkins RC, Nikolic‐Paterson DJ. Adoptive transfer studies demonstrate that macrophages can induce proteinuria and mesangial cell proliferation. Kidney Int. 2003;63:83‐95.

80. Chakravorty SJ, Cockwell P, Girdlestone J, Brooks CJ, Savage CO. Fractalkine expression on human renal tubular. epithelial cells: Potential role in mononuclear cell adhesion. Clin Exp Immunol. 2002;129:150‐9.

81. Cockwell P, Calderwood JW, Brooks CJ, Chakravorty SJ, Savage CO. Chemoattraction of T cells expressing CCR5, CXCR3 and CX3CR1 by proximal tubular epithelial cell chemokines. Nephrol Dial Transplant. 2002;17:734‐44.

82. Morii T, Fujita H, Narita T, Shimotomai T, Fujishima H, Yoshioka N, et al. Association of monocyte chemoattractant protein‐1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy. J Diabetes Complications. 2003;17:11‐5.

83. Tesch GH, Schwarting A, Kinoshita K, Lan HY, Rollins BJ, Kelley VR. Monocyte chemoattractant protein‐1 promotes macrophage‐mediated tubular injury, but not glomerular injury, in nephrotoxic serum nephritis. J Clin Invest. 1999;103:73‐80.

84. Yu XQ, Nikolic‐Paterson DJ, Mu W, Giachelli CM, Atkins RC, Johnson RJ, et al. A functional role for osteopontin in experimental crescentic glomerulonephritis in the rat. Proc Assoc Am Physicians. 1998;110:50‐64.

85. Sugimoto H, Shikata K, Hirata K, Akiyama K, Matsuda M, Kushiro M, et al. Increased expression of intercellular adhesion molecule‐1 (ICAM‐1) in diabetic rat glomeruli: Glomerular hyperfiltration is a potential mechanism of ICAM‐1 upregulation. Diabetes. 1997;46:2075‐81.

86. Matsui H, Suzuki M, Tsukuda R, Iida K, Miyasaka M, Ikeda H. Expression of ICAM‐1 on glomeruli is associated with progression of diabetic nephropathy in a genetically obese diabetic rat, Wistar fatty. Diabetes Res Clin Pract. 1996;32:1‐9.

87. Coimbra TM, Janssen U, Grone HJ, Ostendorf T, Kunter U, Schmidt H, et al. Early events leading to renal injury in obese Zucker (fatty) rats with type II diabetes. Kidney Int. 2000;57:167‐82.

88. Park CW, Kim JH, Lee JH, Kim YS, Ahn HJ, Shin YS, et al. High glucose‐induced intercellular adhesion molecule‐1 (ICAM‐1) expression through an osmotic effect in rat mesangial cells is PKC‐NF‐kappa B‐dependent. Diabetologia. 2000;43:1544‐53.

89. Okouchi M, Okayama N, Shimizu M, Omi H, Fukutomi T, Itoh M. High insulin exacerbates neutrophil‐endothelial cell adhesion through endothelial surface expression of intercellular adhesion molecule‐1 via activation of protein kinase C and mitogen‐activated protein kinase. Diabetologia. 2002;45:556‐9.

90. Hattori M, Nikolic‐Paterson DJ, Miyazaki K, Isbel NM, Lan HY, Atkins RC, et al. Mechanisms of glomerular macrophage infiltration in lipid‐induced renal injury. Kidney Int Suppl. 1999;71:S47‐50.

91. Basta G, Lazzerini G, Massaro M, Simoncini T, Tanganelli P, Fu C, et al. Advanced glycation end products activate endothelium through signal‐transduction receptor RAGE: A mechanism for amplification of inflammatory responses. Circulation. 2002;105:816‐22.

92. Onozato ML, Tojo A, Goto A, Fujita T. Radical scavenging effect of gliclazide in diabetic rats fed with a high cholesterol diet. Kidney Int. 2004;65:951‐60.

93. Ueda A, Ishigatsubo Y, Okubo T, Yoshimura T. Transcriptional regulation of the human monocyte chemoattractant protein‐1 gene. Cooperation of two NF‐kappaB sites and NF‐kappaB/Rel subunit specificity. J Biol Chem. 1997;272:31092‐9.

94. Bierhaus A, Schiekofer S, Schwaninger M, Andrassy M, Humpert PM, Chen J, et al. Diabetes‐associated sustained activation of the transcription factor nuclear factor‐kappaB. Diabetes. 2001;50:2792‐808.

95. Ihm CG, Park JK, Hong SP, Lee TW, Cho BS, Kim MJ, et al. A high glucose concentration stimulates the expression of monocyte chemotactic peptide 1 in human mesangial cells. Nephron. 1998;79:33‐7.

96. Wada T, Yokoyama H, Furuichi K, Kobayashi KI, Harada K, Naruto M, et al. Intervention of crescentic glomerulonephritis by antibodies to monocyte chemotactic and activating factor (MCAF/MCP‐1). FASEB J. 1996;10:1418‐25.

97. Kikuchi Y, Ikee R, Hemmi N, Hyodo N, Saigusa T, Namikoshi T, et al. Fractalkine and its receptor, CX3CR1, upregulation in streptozotocin‐induced diabetic kidneys. Nephron Exp Nephrol. 2004;97:e17‐25.

98. Chow FY, Nikolic‐Paterson DJ, Ozols E, Atkins RC, Tesch GH. Intercellular adhesion molecule‐1 deficiency is protective against nephropathy in type 2 diabetic db/db mice. J Am Soc Nephrol. 2005;16:1711‐22.

99. Amann B, Tinzmann R, Angelkort B. ACE inhibitors improve diabetic nephropathy through suppression of renal MCP‐1. Diabetes Care. 2003;26:2421‐5.

100. Nikolic‐Paterson DJ, Atkins RC. The role of macrophages in glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant. 2001;16(Suppl 5):3‐7.

101. Chow FY, Nikolic‐Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH. Macrophages in streptozotocin‐induced diabetic nephropathy: Potential role in renal fibrosis. Nephrol Dial Transplant. 2004;19:2987‐96.

102. Korpinen E, Groop PH, Fagerudd JA, Teppo AM, Akerblom HK, Vaarala O. Increased secretion of TGF‐beta1 by peripheral blood mononuclear cells from patients with type 1 diabetes mellitus with diabetic nephropathy. Diabet Med. 2001;18:121‐5.

103. Stahl RA, Thaiss F, Haberstroh U, Kahf S, Shaw A, Schoeppe W. Cyclooxygenase inhibition enhances rat interleukin 1 beta‐induced growth of rat mesangial cells in culture. Am J Physiol. 1990;259:F419‐24.

104. Floege J, Topley N, Hoppe J, Barrett TB, Resch K. Mitogenic effect of platelet‐derived growth factor in human lomerular mesangial cells: Modulation and/or suppression by inflammatory cytokines. Clin Exp Immunol. 1991;86:334‐41.

105. Vesey DA, Cheung C, Cuttle L, Endre Z, Gobe G, Johnson DW. Interleukin‐1beta stimulates human renal fibroblast proliferation and matrix protein production by means of a transforming growth factor‐beta‐dependent mechanism. J Lab Clin Med. 2002;140:342‐50.

106. Watanabe A, Tomino Y, Yokoyama K, Koide H. Production of hydrogen peroxide by neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in patients with diabetic nephropathy. J Clin Lab Anal. 1993;7:209‐13.

107. Musante L, Tataruch DE, Holthofer H. Use and isolation of urinary exosomes as biomarkers for diabetic nephropathy. Front Endocrinol. 2014; doi: 10.3389/fendo.2014.00149.

108. Spanu S, van Roeyen CRC, Denecke B, Floege J, Mühlfeld AS. Urinary exosomes: a novel means to non‐invasively assess changes in renal gene and protein expression. PLoS One. 2014;9:e109631.

109. Zubiri I, Posada‐Ayala M, Sanz‐Maroto A, Calvo E, Martin‐Lorenzo M, Gonzalez‐Calero L, et al. Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label‐free comparative analysis. J Proteomics. 2014;96:92‐102.

110. Barutta F, Tricarico M, Corbelli A, Annaratone L, Pinach S, Grimaldi S, et al. Urinary exosomal microRNAs in incipient diabetic nephropathy. PLoS One. 2013;8: e73798.

111. Raj DAA, Fiume I, Capasso G, Pocsfalvi G. Urinary exosomes for protein biomarker research. http://cdn.intechopen.com/pdfs‐wm/28194.pdf; accessed November 2014.

112. Zhou H, Pisitkun T, Aponte A, Yuen PST, Hoffert JD, Yasuda H, et al. Exosomal Fetuin‐A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney Int. 2006;70:1847‐57.

113. Zhou H, Cheruvanky A, Hu X, Matsumoto T, Hiramatsu N, Cho ME, et al. Urinary exosomal transcription factors, a new class of biomarkers for renal disease. Kidney Int. 2008;74:613‐21.

114. Cheruvanky A, Zhou H, Pisitkun T, Kopp JB, Knepper MA, Yuen PST, et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 2007;292:F1657‐61.

115. Smalley DM, Sheman NE, Nelson K, Theodorescu D. Isolation and identification of potential urinary microparticle biomarkers of bladder cancer. J Proteome Research. 2008;7:2088‐96.

116. Mitchell P, Welton J, Staffurth J, Court J, Mason M, Tabi Z, et al. Can urinary exosomes act as treatment response markers in prostate cancer? J Trans Med. 2009;7:4.

117. Sonoda H, Yokota‐Ikeda N, Oshikawa S, Kanno Y, Yoshinaga K, Uchida K, et al. Decreased abundance of urinary exosomal aquaporin‐1 in renal ischemia‐reperfusion injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2009;297:F1006‐16.

118. Gutwein P, Schramme A, Abdel‐Bakky M, Doberstein K, Hauser I, Ludwig A, et al. ADAM10 is expressed in human podocytes and found in urinary vesicles of patients with glomerular kidney diseases. J Biomed Sci. 2010;17:3.

119. Pryor WA. Oxy‐radicals and related species: their formation, lifetimes and reactions. Annu Rev Physiol. 1986;48:657‐67.

120. Furukawa M, Gohda T, Tanimoto M, Tomino Y. Pathogenesis and novel treatment from the mouse model of type 2 diabetic nephropathy. Scientific World Journal. 2013; doi: 10.1155/2013/928197. [Epub ahead of print].

121. Balakumar P, Arora MK, Ganti SS, Reddy J, Singh M. Recent advances in pharmacotherapy for diabetic nephropathy: current perspectives and future directions. Pharmacol Res. 2009;60:24‐32.

122. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. The effect of angiotensin‐converting‐enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. New Engl J Med. 1993;329:1456‐62.

123. Andersen S, Tarnow L, Rossing P, Hansen BV, Parving HH. Renoprotective effects of angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000;57:601‐6.

124. Hong SW, Isono M, Chen S, Iglesias‐De La Cruz MC, Han DC, Ziyadeh FN. Increased glomerular and tubular expression of transforming growth factor‐β1, its type II receptor, and activation of the smad signaling pathway in the db/db mouse. Am J Pathol. 2001;158:1653‐63.

125. Ha H, Kim KH. Amelioration of diabetic microalbuminuria and lipid peroxidation by captopril. Yonsei Med J. 1992;33:217‐23.

126. Katayama S, Kikkawa R, Isogai S, Sasaki N, Matsuura N, Tajima N, et al. Effect of captopril or imidapril on the progression of diabetic nephropathy in Japanese with type 1 diabetes mellitus: a randomized controlled study (JAPAN‐IDDM). Diabetes Res Clin Pract. 2002;55:113‐21.

127. Gerstein HC. Diabetes and the HOPE study: implications for macrovascular and microvascular disease. Int J Clin Pract Suppl. 2001;117:8‐12.

128. McLennan SV, Kelly DJ, Cox AJ, Cao Z, Lyons JG, Yue DK, et al. Decreased matrix degradation in diabetic nephropathy: effects of ACE inhibition on the expression and activities of matrix metalloproteinases. Diabetologia. 2002;45:268‐75.

129. Lin H, Huang S, Mi X, Sha Z. Effects of cilazapril on the expression of vascular endothelial growth factor and intercellular adhesion molecule‐1 in diabetic rat glomeruli. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2003;34:694‐7.

130. Yongman LV, Junwu D, Xiaochun N, Xiaocheng L. Renoprotective effect of benazepril on diabetic nephropathy mediated by P42/44MAPK. J Huazhong Uni Sci Technol. 2005;25:32‐5.

131. Eijkelkamp WBA, Zhang Z, Remuzzi G, Parving HH, Cooper ME, Keane WF, et al. Albuminuria is a target for renoprotective therapy independent from blood pressure in patients with type 2 diabetic nephropathy: post hoc analysis from the reduction of endpoints in NIDDM with the Angiotensin II Antagonist Losartan (RENAAL) Trial. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1540‐6.

132. Lewis EJ, Hunsicker LG, Clarke WR, Berl T, Pohl MA, Lewis JB, et al. Renoprotective effect of the angiotensin‐receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Eng J Med. 2001;345:851‐60.

133. Hunsicker LG. Emerging trends for prevention and treatment of diabetic nephropathy: blockade of the RAAS and BP control. J Manag Care Pharm. 2004;10(Suppl A):S12‐7.

134. Pugsley MK. The angiotensin‐II (AT‐II) receptor blocker olmesartan reduces renal damage in animal models of hypertension and diabetes. Proc West Pharmacol Soc. 2005;48:35‐8.

135. Lioa J, Kobayashi M, Kanamuru Y, Nakamura S, Makita Y, Funabiki K, et al. Effects of candesartan, an angiotensin II type 1 receptor blocker, on diabetic nephropathy in KK/Ta mice. J Nephrol. 2003;16:841‐9.

136. Moranne O, Bakris G, Fafin C, Favre G, Pradier C, Esnault VL. Determinants and changes associated with aldosterone breakthrough after angiotensin II receptor blockade in patients with type 2 diabetes with overt nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 2013;8:1694‐701.

137. Bomback AS, Klemmer PJ. The incidence and implications of aldosterone breakthrough. Nat Clin Pract Nephrol. 2007;3:486‐92.

138. Sato A, Hayashi K, Naruse M, Saruta T. Effectiveness of aldosterone blockade in patients with diabetic nephropathy. Hypertension. 2003;41:64‐8.

139. Horita Y, Taura K, Taguchi T, Furusu A, Kohno S. Aldosterone breakthrough during therapy with angiotensin‐converting enzyme inhibitors and angiotensin II receptor blockers in proteinuric patients with immunoglobulin A nephropathy. Nephrology (Carlton). 2006;11:462‐6.

140. Greene EL, Kren S, Hostetter TH. Role of aldosterone in the remnant kidney model in the rat. J Clin Invest. 1996;98:1063‐8.

141. Tsuchida K, Makita Z, Yamagishi S, Atsumi T, Miyoshi H, Obara S, et al. Suppression of transforming growth factor beta and vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy in rats by a novel advanced glycation end product inhibitor, OPB‐9195. Diabetologia. 1999;42:579‐88.

142. Forbes JM, Soulis T, Thallas V, Panagiotopoulos S, Long DM, Vasan S, et al. Renoprotective effects of a novel inhibitor of advanced glycation. Diabetologia. 2001;44:108‐14.

143. Bonke VT, Lindschau C, Rizkalla B, Bach LA, Boner G, Meier M, et al. Attenuation of extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy by the advanced glycation end product cross‐link breaker ALT‐711 via a protein kinase C dependent pathway. Diabetes. 2004;53:2921‐30.

144. Twigg SM, Cao Z, Mclennan SV, Burns WC, Brammar G, Forbes JM, et al. Renal connective tissue growth factor induction in experimental diabetes is prevented by aminoguanidine. Endocrinology. 2002;143:4907‐15.

145. Izuhara Y, Nangaku M, Takizawa S, Takahashi S, Shao J, Oishi H, et al. A novel class of advanced glycation inhibitors ameliorates renal and cardiovascular damage in experimental rat models. Nephrol Dial Transplant. 2008;23:497‐509.

146. Figarola J, Loera S, Weng Y, Shanmugam N, Natarajan R, Rahbar S. LR‐90 prevents dyslipidaemia and diabetic nephropathy in the Zucker diabetic fatty rat. Diabetologia. 2008;51:882‐91.

147. Hill C, Flyvbjerg A, Rasch R, Bak M, Logan A. Transforming growth factor‐β antibody attenuates fibrosis in the experimental diabetic rat kidney. J Endocrinol. 2001;170:647‐51.

148. Benigni A, Zoja C, Campana M, Corna D, Sangalli F, Rottoli D, et al. Beneficial effect of TGF‐ β antagonism in treating diabetic nephropathy depends on when treatment is started. Nephron Exp Nephrol. 2006;104:e158‐68.

149. Mizuno S, Nakamura T. Suppressions of chronic glomerular injuries and TGF‐β1 production by HGF in attenuation of murine diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;286:F134‐43.

150. Jeong HS, Park KK, Kim SP, Choi IJ, Lee IK, Kim HC. Effect of antisense TGF‐β1 oligodeoxynucleotides in streptozotocin‐induced diabetic rat kidney. J Kor Med Sci. 2004;19:374‐83.

151. Russo LM, Re ED, Brown D, Lin HY. Evidence for a role of transforming growth factor (TGF)‐β1 in the induction of postglomerular albuminuria in diabetic nephropathy. Amelioration by soluble (TGF)‐β1 type II receptor. Diabetes. 2007;56:380‐8.

152. Tuttle KR, Anderson PW. A novel potential therapy for diabetic nephropathy and vascular complications: protein kinase C beta inhibition. Am J Kidney Dis. 2003;42:456‐65.

153. Kelly DJ, Chanty A, Gow RM, Zhang Y, Gilbert RE. Protein kinase C beta inhibition attenuates osteopontin expression, macrophage recruitment, and tubulointerstitial injury in advanced experimental diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2005;16:1654‐60.

154. Kelly DJ, Buck D, Cox AJ, Zhang Y, Gilbert RE. Effects on protein kinase C‐beta inhibition on glomerular vascular endothelial growth factor expression and endothelial cells in advanced experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2007;293:F565‐74.

155. Schwartz S, Raskin P, Fonseca V, Graveline JF. Effect of troglitazone in insulin‐treated patients with type II diabetes mellitus. Troglitazone and Exogenous Insulin Study Group. New Engl J Med. 1998;338:861‐6.

156. Imano E, Kanda T, Nakatani Y, Nishida T, Arai K, Motomura M, et al. Effect of troglitazone on microalbuminuria in patients with incipient diabetic nephropathy. Diabetes Care. 1998;21:2135‐9.

157. Fujii M, Takemura R, Yamaguchi M, Hasegawa G, Shigeta H, Nakano K, et al. Troglitazone (CS‐045) ameliorates albuminuria in streptozotocin‐induced diabetic rats. Metabolism. 1997;46:981‐3.

158. McFarlane SI, Muniyappa R, Francisco R, Sowers JR. Clinical review145: pleiotropic effects of statins: lipid reduction and beyond. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87:1451‐8.

159. Endres M, Laufs U. Effects of statins on endothelium and signaling mechanisms. Stroke. 2004;35:2708‐11.

160. Dubey VK, Patil CR, Kamble SM, Tidke PS, Patil KR, Maniya PJ, et al. Oleanolic acid prevents progression of streptozotocin induced diabetic nephropathy and protects renal microstructures in Sprague Dawley rats. J Pharmacol Pharmacother. 2013;4:47‐52.

Documents

site oct 2015 - ivb.roTabel 1. Numărul şi vârsta şoarecilor la momentul recepţiei lor în INCD Victor Babeş. Nr. lot Data naşterii Vârsta la 23 oct 2013 (±3 zile) Zile/săptămâni