Realização de Experimentos Simples de RMN Utilizando o

Sistema de Automação ICON (1H, 13C, DEPT135, DEPT90)

1) Amostra

A amostra deve ser idealmente uma solução (mistura homogênea). A

presença de partículas dispersas e/ou de um corpo de fundo e/ou de bolhas

pode prejudicar a aquisição dos dados de RMN.

Os tubos de RMN devem ter diâmetro de 5 mm e altura de

aproximadamente 17 cm. Tubos menores que 13 cm não são detectados pelos

equipamentos e tubos maiores que 17 cm podem ser quebrados durante a

inserção ou ejeção da amostra.

A altura ideal da coluna de solvente/amostra é de aproximadamente

4 cm. Um volume menor não preenche totalmente a bobina de detecção e um

volume maior resulta em desperdício de solvente e diluição excessiva da

amostra.

2) Rotor (Spinner)

Inserir o tubo de RMN com a amostra no rotor (spinner). O rotor deve

ficar justo no tubo. Caso seja percebida uma folga, procurar outro rotor que

fique mais justo ao tubo. Ajustar a altura do rotor no tubo utilizando o medidor

adequado, como indicado na Figura 1. Com uma coluna de amostra/solvente

de pelo menos 4 cm, o ajuste é feito levando o tubo até o fundo do medidor

(Figura 1-a). Um volume menor pode ser ajustado, elevando-se o tubo e

centralizando-o (Figura 1-b). ATENÇÃO! Se o tubo fica abaixo do limite do

medidor ou com um folga no rotor (spinner), corre-se o risco do fundo do tubo

de RMN chocar-se com o equipamento, o que pode causar a quebra do tubo e

a contaminação da sonda com a amostra.

(a) (b)

Figura 1. Representação esquemática do ajuste do rotor (spinner) no tubo de

RMN (a) quando a coluna de amostra/solvente é igual ou maior que 4 cm e (b)

quando a coluna de amostra/solvente é menor que 4 cm.

3) Inserção e Remoção da(s) Amostra(s) no Equipamento

3.1) Amostrador automático de 16 posições

A Figura 2 apresenta uma imagem do amostrador automático de 16

posições. Após inserir o tubo de RMN no rotor (spinner) e medir sua posição, o

tubo da amostra pode ser adicionado ao amostrador.

Colocar as amostras em sequência e memorizar os números das

posições de suas amostras.

Inserir as amostras nas posições laterais e nas posições da frente.

ATENÇÃO! Não adicionar amostra na posição direcionada ao duto do

equipamento, pois caso haja uma amostra dentro do espectrômetro, ela será

ejetada nesta posição.

Figura 2. Amostrador automático de 16 posições.

Ao terminar a análise a amostra é ejetada automaticamente quando se

utiliza o modo de operação Icon. Após a amostra ser ejetada e a parte superior

do amostrador apresentar uma luz com a coloração verde, indicando que a

amostra ejetada foi detectada fora do equipamento, a amostra pode ser

removida do amostrador.

ATENÇÃO! Não retirar a amostra antes que a luz fique verde. Caso a

amostra seja retirada do amostrador antes da luz ficar verde, ou seja, antes de

ela ser detectada fora do equipamento, o sistema de automação irá travar e a

parte superior do amostrador apresentará uma luz vermelha. Um treinamento

específico para reiniciar o carrossel deve ser realizado para tentar solucionar o

problema.

3.2) Amostrador automático de 60 posições com display

A Figura 3-a apresenta uma imagem, meramente ilustrativa, do

amostrador automático de 60 posições. A inserção de amostras é realizada

com o auxílio de um display. Como nosso espectrômetro de RMN de 500 MHz

não apresenta blindagem do campo magnético, o display para controlar o

amostrador fica separado do equipamento, posicionado ao lado do console

(Figura 3-b).

(a) (b) Figura 3. (a) Imagem ilustrativa do amostrador automático de 60 posições e (b)

posicionamento real do display no espectrômetro de 500 MHz do IQ-UNICAMP.

Este amostrador apresenta uma tampa. Assim, o tamanho máximo do

tubo de RMN de 17 cm deve ser obrigatoriamente respeitado, pois caso o tubo

seja maior, haverá a quebra do mesmo ao girar o carrossel.

A Figura 4 apresenta uma imagem do display do amostrador automático

de 60 posições.

Figura 4. Display do amostrador automático de 60 posições.

O botão vermelho, apresentado na Figura 4, somente deve ser acionado

em casos de emergência, pois promove a parada do equipamento. ATENÇÃO!

Um exemplo de necessidade da parada de emergência é a quebra de um tubo

de RMN no carrossel.

3.2.1) Adicionar Amostra(s)

Para inserir a(s) amostra(s) tocar no display em “Add” (adicionar) para

abrir a janela de opções da Figura 5. Após tocar em “Add”, três opções são

fornecidas:

• “In sequence from position” → Para adicionar mais de uma amostra a

partir de uma posição específica. Neste caso, assim que uma amostra é

adicionada, o carrossel roda automaticamente para a próxima posição e

assim sucessivamente.

• “Go to position” → Para adicionar apenas uma amostra em uma

posição específica.

• “Go to free” → Para adicionar apenas uma amostra em uma posição

livre mais próxima da abertura da tampa.

Figura 5. Display do amostrador automático de 60 posições com as três

opções após tocar em “Add”.

Ao escolher uma das duas primeiras opções, a janela da Figura 6 será

apresentada na tela. Nela, notam-se todas as 60 posições.

As diferentes cores nas posições indicam diferentes status:

⚫ → Representa posições com amostras já analisadas.

⚫ → Representa a posição da amostra que está dentro do equipamento.

→ Representa posições com amostras na fila para análise.

⚫ → Representa posições disponíveis para adicionar amostra(s).

Figura 6. Display do amostrador automático de 60 posições com as 60

posições após escolher uma das duas primeiras opções para adicionar

amostra(s).

Ao tocar em uma das posições disponíveis (⚫), esta será direcionada

até a abertura da tampa para que a(s) amostra(s) seja(m) adicionada(s).

3.2.2) Remover Amostra(s)

Para remover a(s) amostra(s) tocar no display em “Remove” (remover)

para abrir a janela de opções da Figura 7. Após tocar em “Remove”, cinco

opções são fornecidas:

• “In sequence from position” → Para remover mais de uma amostra a

partir de uma posição específica. Neste caso, assim que uma amostra é

removida, o carrossel roda automaticamente para a próxima posição e

assim sucessivamente.

• “Measured” → Para remover todas as amostras que já foram

analisadas, representadas pela cor verde (⚫).

• All” → Para remover todas as amostras presentes no carrossel.

• “Go to position” → Para remover apenas uma amostra de uma posição

específica.

• “Cassette” → Para remover o carrossel. ATENÇÃO! Não selecionar

essa opção. O carrossel é pesado e sensível para ser removido e

adicionado. Um treinamento específico deve ser feito para este

procedimento.

Figura 7. Display do amostrador automático de 60 posições com as cinco

opções após tocar em “Remove”.

Caso sejam escolhidas as opções “In sequence from position” ou “go

to position”, a janela da Figura 8 irá ser apresentada no display.

Nota-se na Figura 8 que apenas as posições relacionadas às amostras

possíveis de serem removidas são apresentadas. A amostra da posição “5”,

por exemplo, está dentro do equipamento (como visto na Figura 6) e as

posições de 18 a 60 não apresentam amostras.

Figura 8. Display do amostrador automático de 60 posições com as posições

possíveis de que as amostras sejam removidas.

Ao tocar em uma das posições disponíveis para remoção, esta será

direcionada até a abertura da tampa para que a(s) amostra(s) seja(m)

removida(s).

4) Programação dos Experimentos no sistema de Automação (Icon)

Para abrir o modo automático de operação do espectrômetro, ler o

manual específico para este procedimento, disponibilizado em cada

equipamento. Normalmente, o sistema de automação já estará aberto e pronto

para programar os experimentos desejados. A Figura 9 apresenta a interface

do sistema de operação no modo automático, denominado Icon.

Figura 9. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon).

Considerar um exemplo de uma amostra que foi colocado na posição “1”

do amostrador de 16 posições.

Para iniciar a programação, clicar duas vezes na linha referente à

posição desejada, neste caso, posição “1”. Ao clicar duas vezes, abrem-se os

campos para preenchimento referente àquela amostra da posição “1”, como

apresentado na Figura 10.

Os campos para preenchimento são:

• “Disk” → Diretório no qual o espectro será salvo

• “Name” → Nome da pasta de arquivos gerados

• “No.” → Número da subpasta gerada (nº dos experimentos)

• “Solvent” → Solvente deuterádo utilizado na amostra

• “Experiment” → Experimento desejado (1H,13C, dept135, dept90...)

• “Par” → Parâmetros de aquisição

• “Title/Orig” → Título: Informações relevantes da amostra

Figura 10. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon) ao

clicar duas vezes sobre a linha de interesse para programar experimentos.

O Campo “Disk”

O Campo “Disk” deve ser alterado para que o espectro seja salvo em

uma pasta que permita o direcionamento dos dados para o nosso servidor. Isto

permite o acesso aos espectros de qualquer computador conectado à rede

interna do Instituto de Química.

Para acessar os espectros de qualquer computador conectado à rede

interna do Instituto de Química, é necessário mapear a seguinte unidade de

rede: “Z:\\nmrsparc\espectros”.

Os espectros em nossa rede são bloqueados para edição. Assim, deve-se

copiá-los da rede, salvando-os em computadores pessoais ou institucionais do

laboratório e desbloqueá-los quanto à edição dos dados. Para isto, clicar com o

botão direito do mouse no arquivo selecionar “Propriedades”, retirar a

marcação de “somente leitura”, e clicar em “OK” e novamente em “OK” para

aplicar a alteração na pasta, subpastas e arquivos selecionados.

Ao clicar na seta para baixo do campo “Disk” algumas sugestões devem

aparecer para que uma delas seja selecionada (Figura 11). Caso o referido

orientador/supervisor não esteja na lista, basta selecionar qualquer professor

da lista e editar apenas o nome.

Figura 11. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon) ao

clicar na seta para baixo do campo “Disk”.

Os diretórios corretos para salvar os arquivos são:

• Para o Espectrômetro de RMN Bruker Avance 400 MHz

D:\espectros\“ano4d”\“mes3letras-ano2d”\Reserva\“Professor”

Onde:

“ano4d” = ano com 4 dígitos

“mes3letras-ano2d” = mês com 3 letras e ano com 2 dígitos

Por exemplo:

D:\espectros\2018\jan18\Reserva\Claudio Tormena

D:\espectros\2018\fev18\Reserva\Claudio Tormena

D:\espectros\2018\mar18\Reserva\Claudio Tormena

...

• Para o Espectrômetro de RMN Bruker Avance 500 MHz

C:\espectros\“ano4d”\“mes3letras-ano2d”\Reserva\“Professor”

Onde:

“ano4d” = ano com 4 dígitos

“mes3letras-ano2d” = mês com 3 letras e ano com 2 dígitos

Por exemplo:

C:\espectros\2018\jan18\Reserva\Claudio Tormena

C:\espectros\2018\fev18\Reserva\Claudio Tormena

C:\espectros\2018\mar18\Reserva\Claudio Tormena

...

Ficar atento quando há mudança de mês nos finais de semana ou

feriados, pois as sugestões precisarão ser editadas.

Por exemplo, o dia primeiro de abril de 2018 foi um domingo. Assim, os

usuários que vieram utilizar os equipamentos nesse dia encontraram a seguinte

sugestão em “Disk”:

C:\espectros\2018\mar18\Reserva\Claudio Tormena

Após selecionar esta sugestão, deve-se editá-la para:

C:\espectros\2018\abr18\Reserva\Claudio Tormena

Ficar atento também em relação à pasta “Reserva”. Sempre que a

reserva é feita pelo agendamento on line, deve-se salvar na pasta “Reserva”:

C:\espectros\2018\abr18\Reserva\Claudio Tormena

Caso a sugestão indique a pasta “Sala”, alterar para “Reserva”,

considerando que a reserva no sistema foi realizada.

Caso a sugestão seja:

C:\espectros\2018\abr18\Sala\Claudio Tormena

Editá-la para:

C:\espectros\2018\abr18\Reserva\Claudio Tormena

Na pasta “Sala” devem estar apenas os experimentos solicitados a partir

das fichas de requisição e que, por consequência, não se utilizou o sistema de

agendamento online para reservar horário no equipamento.

O Campo “Name”

No campo “Name” deve ser digitado o nome da pasta de arquivos que

será gerada para a obtenção do espectro.

Sugere-se fortemente que os usuários utilizem o padrão de

nomenclatura do Laboratório de RMN:

mês3letras-dia2d-codigo3letras-H-nº

Por exemplo, o Professor Cláudio Francisco Tormena ao realizar um

experimento de 1H no dia 04 de abril, deve nomear o arquivo da seguinte

forme: “abr04cftH1”. Caso ele realize outro experimento de 1H no mesmo dia,

o próximo arquivo será nomeado com o final 2: “abr04cftH2” e assim

sucessivamente.

Ficar atento para não realizar experimentos com o mesmo nome e com

o mesmo número de experimento (“No.”), pois assim o espectro novo será

sobrescrito sobre o antigo e os dados anteriores serão perdidos.

O Campo “No.”

O Campo “No.” representa o número da subpasta gerada, ou seja, o

número dos experimentos dentro da pasta principal, sendo: 1, 2, 3...

Este campo é preenchido de forma automática pelo sistema, mas é possível

sua edição.

Dentro de um mesmo arquivo principal, podem ter vários experimentos,

como por exemplo, 1H, 13C, dept135 e dept90 (Figura 12).

Exemplo:

abr04cftH1

• No. 1 = experimento de 1H

• No. 2 = experimento de 13C

• No. 3 = experimento de dept135

• No. 4 = experimento de dept90

Figura 12. Exemplo de uma pasta com subpastas com “No.” de 1 a 4.

O Campo “Solvent”

No campo “Solvente”, selecionar o solvente deuterado utilizado na

preparação da amostra. Ao clicar na seta para baixo do campo “Solvent”

algumas sugestões devem aparecer para que uma delas seja selecionada

(Figura 13). AVISO! Caso o referido solvente não esteja na lista, reportar a um

dos responsáveis pelo gerenciamento do laboratório de RMN.

Figura 13. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon) ao

clicar na seta para baixo do campo “Solvent”.

A mistura de solventes deuterados não é ideal para a análise de RMN.

Entretanto, caso essa seja a condição para solubilizar a amostra, o solvente em

maior proporção de deutério deve ser selecionado neste campo.

Caso seja selecionado um solvente por engano, e a análise ainda estiver

com status de “Available” (disponível), é possível a direta edição para o

solvente correto.

Caso seja selecionado um solvente por engano, e a análise estiver com

status de “Queue” (fila), é possível edição para o solvente correto. Para isto,

selecionar a linha do experimento, clicar em “Cancel” (cancelar), em seguida

em “Edit” (editar), e fazer a correção da seleção do solvente.

ATENÇÃO! Caso seja selecionado um solvente por engano, e a análise

já estiver com status de “Running” (correndo) NÃO apertar “Stop”. Aguarde o

termino da análise. Ou o procedimento de “Lock” não será feito, gerando um

erro ou o espectro será obtido, porém descolado em relação ao solvente errado

selecionado previamente.

Ao terminar a análise, repita a programação do experimento,

selecionando agora o solvente correto.

O Campo “Experiment”

No campo “Experiment” (experimento), selecionar o experimento

desejado.

Dependendo do equipamento e do usuário estarão disponibilizadas

diferentes listas de experimento sendo os mais usuais:

• Sala_1H

• Sala_13C

• Sala_dept135

• Sala_dept90

• Sala_13CsemNOE (500 MHz)

• Sala_19F_acoplado (500 MHz)

• Sala_19F_desacoplado (500 MHz)

• Sala_31P_ acoplado (500 MHz)

• Sala_31P_desacoplado (500 MHz)

Ao clicar na seta para baixo do campo “Experiment” algumas sugestões

de experimentos devem aparecer para que uma delas seja selecionada.

O Campo “Par”

O campo “Par” (parâmetros) é utilizado para editar os parâmetros de

aquisição do experimento selecionado em “Experiment”.

Caso desejar realizar um experimento com os parâmetros de aquisição

padronizados pelo Laboratório de RMN, não é necessário realizar nenhum

procedimento nesse campo.

Os parâmetros permitidos para edição são:

• NS → Número de scans

• D1 → Intervalo entre pulsos (delay)

• SW → Janela espectral

• O1P → Centro do espectro

Para editar esses parâmetros clicar no ícone azul da Figura 14-a, o que

permitirá a edição dos parâmetros, abrindo a janela da Figura 14-b.

Digitar as alterações necessárias na janela da Figura 14-b e clicar em

“OK” para que as alterações sejam aplicadas. Assim, que os parâmetros são

editados, o ícone ficará vermelho, indicando que modificações das condições

padrão foram realizadas (Figura 14-c).

(a) (b) (c) Figura 14. Ícone (a) no qual deve ser clicado para abrir a janela (b) de edição

dos parâmetros de aquisição. Após edição o ícone é alterado para o

apresentado em (c) para alertar que os parâmetros de aquisição padrão foram

modificados.

O Campo “Title/Orig”

O campo “Title/Orig” (título/origem) é utilizado para escrever todas as

informações relevantes relacionadas à amostra e à análise em questão.

As informações desse campo aparecem no canto superior esquerdo do

espectro de RMN, como representado na Figura 15.

Figura 15. Espectro de RMN para ilustrar a informação fornecida no campo

“Title/Orig”.

Sugere-se adicionar informações como:

• Nome do usuário

• Código da amostra

• Solvente

• Equipamento

• Nome do arquivo

Por exemplo:

Cláudio Tormena – CFT186 – CDCl3 – Av. 400MHz – abr04cftH1

A importância em adicionar o solvente está relacionada com a

dependência do deslocamento químico dos sinais da amostra em função do

solvente utilizado.

A importância em adicionar o equipamento está relacionada com o

cálculo das constantes de acoplamento.

A importância em adicionar o nome do arquivo “abr04cftH1” está

relacionada à busca do arquivo em banco de dados, pois se o usuário precisar

achar no servidor um arquivo de um espectro antigo e que está impresso com

essa informação, a busca do dado no servidor é muito facilitada.

A Figura 16 ilustra a janela aberta para escrever as informações

relevantes da amostra e da análise em “Title/Orig”.

Figura 16. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon) ao

clicar no ícone do campo “Title/Orig”, onde devem ser registradas as

informações relevantes da amostra e da análise.

A Submissão da Análise

Após todo o preenchimento dos campos, desde “Disk” até “Title/Orig”,

selecionar a linha correspondente (a seleção da linha é indicada pela cor azul

clara) e clicar no botão “Submit” (submeter), indicado pelo retângulo vermelho

na Figura 17.

Figura 17. Interface do sistema de operação no modo automático (Icon) com a

indicação do botão “Submit” para submeter a linha de experimento

programada.

O Acompanhamento da Análise

Após a submissão, o status de “Available” (disponível) altera-se para

“Queue” (fila).

Durante a análise o status será “Running” (correndo) e ao terminar a

análise o status será “Finished” (terminado).

A análise pode ser acompanhada pelo histórico na aba “Preceding

Experiments”. A cada procedimento executado com sucesso um símbolo ✓

“checked” é apresentado na linha dos experimentos.

A Figura 18 apresenta um exemplo do histórico apresentado em

“Preceding Experiments” destacado com um retângulo vermelho.

Este exemplo representa a análise de uma única amostra. Foram

realizados os experimentos de 1H, 13C e dept135.

Nota-se que no primeiro experimento (1H), todos os procedimentos

devem obrigatoriamente ser realizados, desde o carregamento da amostra pra

dentro do equipamento (“Load”) até a aquisição dos dados (“Acq”).

Outros experimentos programados para a mesma amostra não

necessitam realizar todos os procedimentos (como “Lock” e “Shim”), e por isto

não recebem o símbolo ✓, pois já foram realizados para o primeiro

experimento.

Ao trocar de amostra, todos os procedimentos devem ser realizados

novamente, exceto o “Lock”, no caso das amostras apresentarem o mesmo

solvente deuterado.

Figura 18. Histórico apresentado em “Preceding Experiments” para o

acompanhamento das análises.

A seguir estão apresentadas as definições de cada um dos campos

presentes na aba “Preceding Experiments”:

• “#” → Sequência de execução dos experimentos

• “Date” → Data e horário do início da análise

• “Holder” → Posição da amostra (de 1 a 16 ou de 1 a 60)

• “Name” → Nome da pasta de arquivos gerados

• “No.” → Número da subpasta gerada (nº dos experimentos)

• “Experiment” → Experimento desejado (1H,13C, dept135, dept90...)

• “Load” → Carregamento da amostra para dentro do equipamento

• “ATMA” → Sintonia no(s) núcleo(s) de interesse

• “Lock” → Trava do sinal do deutério

• “Shim” → Ajuste da homogeneidade do campo

• “Acq” → Aquisição

• “User” → Usuário (Rotina)

• “Proc” → Processamento

• “Disk” → Diretório no qual o espectro será salvo

• “Title/Orig” → Título: Informações relevantes da amostra

A Finalização da Análise

Ao terminar a análise, o status de “Finished” (terminado) será

apresentado na linha de programação do experimento.

Clicar duas vezes na linha do seu experimento em “Preceding

Experiments” para que o espectro seja visualizado na outra tela (Figura 19).

Figura 19. Procedimento para visualizar os espectros obtidos, utilizando a

interface do Icon e do Topspin.

Para realizar um processamento simples no espectro, pode-se digitar na

linha de comandos (indicada na Figura 19 por *) do Topspin:

“ef” → Para aplicar a transformada de Fourier

“apk” → Para realizar um ajuste de fase de forma automática

Retirar as amostras do amostrador, como explicado na seção “Inserção

e Remoção da(s) Amostra(s) no Equipamento”.

Selecionar e deletar a linha de experimento com status “Finished” em

“Experiment Table” para que outros usuários tenham a oportunidade de

utilizar a referida posição.

Ao terminar a análise, em no máximo 30 minutos, o espectro pode ser

extraído da rede interna do Instituto de Química.

Dois cliques na linha

Para visualizar o espectro

*