SFB- 8 Asam Nukleat

8/10/2019 SFB- 8 Asam Nukleat

1/10

Laporan Praktikum Hari,Tanggal : Jumat, 14 November 2014

Struktur dan Fungsi Biomolekul PJP : Inda Setyawati, S.TP, M.Si

Asisten : Yuyun Hikmatul Uyun

Selvi Muliani

Gia Permasku, S.SiNur Hidayah HL

ASAM NUKLEAT IKelompok 9

Yanti Fajarwati G84120054

Siti Khodijah G84120013Yahya Ramadhani G84120050

Melati Devina G G84120094

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014


2/10


3/10

3

PENDAHULUAN

Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA merupakan

material genetik yang tersimpan di dalam sel yang dikemas sedemikian rupa

menjadi struktur superkoil yang kompak. DNA berikatan dengan protein histon

membentuk struktur yang disebut dengan kromosom. Molekul DNA umumnya

tersusun oleh dua untai polinukleotida yang terpilin secara anti-paralel

membentuk struktur untai ganda (double helix) yang terikat oleh ikatan-ikatan

hidrogen yang terbentuk antara basa nitrogen untai yang satu dengan untai lain

yang saling berkomplementer. Tidak seperti molekul DNA, molekul RNA hanya

disusun oleh satu untai polinukleotida. Gula penyusunnya adalah ribosa,

sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa (Sinaga 2012).

Ada tiga macam jenis RNA dalam sel, baik eukariot maupun prokariot

yaitu mRNA (RNA messenger), tRNA (RNA transfer), dan rRNA (RNA

ribosomal) yang memiliki fungsi berbeda-beda. RNA messenger (mRNA)

berfungsi sebagai pembawa pesan atau informasi genetik yang diterjemahkan dariDNA, dan memberitahukan sel tentang struktur molekul protein yang akan dibuat.

RNA transfer (tRNA) berperan dalam membawa asam amino tertentu yang

dibutuhkan ke ribosom untuk dirangkai menjadi sebuah protein, sedangkan fungsi

rRNA merupakan bagian struktur ribosom, kompleks protein-mRNA, yang

berperan mensintesis protein sesuai dengan informasi genetik yang dibawa oleh

mRNA (Sinaga 2012).

Hampir semua sel mengandung protein, DNA, dan RNA yang jumlahnya

dalam jaringan tertentu sangat kecil. Sumber DNA yang biasanya digunakan

untuk percobaan harus mengandung kadar DNA yang cukup dan kadar DNA-ase

yang rendah. Beberapa jaringan mengandung DNA-ase yang aktivitasnya cukuptinggi, sehingga DNA harus dipecah menjadi fragmen yang lebih kecil. DNA

mudah mengalami denaturasi, sehingga percobaan yang menggunakan DNA harus

dilakukan dengan hati-hati, agar hasil isolasinya sesuai dengan kadar sebenarnya

dalam jaringan. DNA berperan dalam semua aktivitas sel, mendorong

pengembangan biologi molekular yang bertujuan untuk menerangkan proses-

proses biologis dalam hal struktur dan interaksinya antara asam nukleat dan

protein. DNA juga menyimpan dan mengekspresikan informasi genetik, sehingga

berpengaruh besar pada bidang-bidang studi lain seperti imunologi, kedokteran

(produksi insulin, interferon), tanaman transgenik, mikrobiologi, dan ilmu

forensik (Bintang 2010).

Larutan alkali menyebabkan dua untai DNA terpisah, tetapi berbedadengan efeknya pada RNA, alkali tidak menyebabkan pemutusan ikatan

fosfodiester DNA. Pemberian alkali digunakan untuk mengeluarkan RNA dari

DNA dan memisahkan untai DNA sebelum atau sesudah elektroforesis pada gel

poliakrilamid atau agarosa (Marks DB et al.2000). DNA dan RNA dapat diisolasi

dari sel melalui serangkaian tahap tertentu. Metode-metode isolasi ini telah

banyak dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang terbaik dari segi kualitas

dan kuantitas. Metode-metode tersebut di antaranya adalah metode Kit, metode

CTAB, dan metode lisis termal.

Praktikum bertujuan menghitung kandungan asam deoksiribonukleat

(DNA) dan asam ribonukelat (RNA) dalam sampel.


4/10

4

METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul dilakukan di Laboratorium

Pendidikan Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu PengetahuanAlam, IPB. Waktu praktikum yaitu hari Jumat, tanggal 14 November 2014, pukul

08.00-11.00 WIB.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu tabung reaksi, pipet

Mohr, Bulp, pipet tetes, spektrofotometer, wadah berisi es, tabung sentrifus,

penangas air. Bahan yang digunakan adalah homogenat hati tikus, KOH, air,

HClO4 60%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 100%, larutan standar RNA,

orsinol, FeCl3.6H2O, HCl, larutan standar DNA, larutan asetaldehida, difenilamin,

asam asetat, H2SO4, akuades.

Prosedur

Penentuan Konsentrasi RNA dalam homogenate hati tikus.

Homogenat dipipet sebanyak 2,5 mL ke dalam sebuah tabung sentrifus yang telah

didinginkan, kemudian ditambahkan 2,5 mL HClO4 0,6M dingin. Larutan

kemudian dikocok dan disimpan dalam es selama 10 menit. Campuran lalu

disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian

dibuang, dan pelet disuspensikan kembali dalam 4,0 mL KOH 0,3 M. Larutan

dipindahkan dalam sebuah tabung reaksi yang bersih, dan ditempatkan dalam

penangas air bersuhu 40oC selama 40 menit. Tabung didinginkan dalam es selama

5 menit, dan ditambahkan 2,5 mL HClO4 1,2 M. Larutan lalu dikocok dan

disimpan dalam es selama 10 menit. Selanjutnya, larutan dipindahkan ke dalamsebuah tabung sentrifus dingin dan disentrifugasi kembali seperti pada tahapsebelumnya. Selesai disentrifugasi, larutan supernatan dikumpulkan dan

dituangkan ke dalam sebuah tabung reaksi bersih dan diberi label sebagai ekstrak

RNA. Pelet disuspensikan kembali dalam 10 mL HClO4 0,2M dingin dan

dipindahkan ke dalam sebuah tabung reaksi dingin, kemudian ditempatkan dalam

tempat pembekuan (-20oC) dalam sebuah lemari es untuk penentuan kadar DNA-

nya. Disiapkan empat tabung reaksi yang masing-masing diisi oleh pereaksi

orsinol sebanyak 3 mL. Tabung 1 kemudian ditambahkan air suling (akuades)

sebanyak 4 mL, tabung 2 ditambahkan air suling sebanyak 3,8 mL dan larutan

RNA 0,2 mL (supernatan), tabung 3 ditambahkan 3,5 mL air suling dan 0,5 mL

larutan RNA (supernatan), sedangkan tabung 4 ditambahkan 3,5 mL air suling dan

0,5 larutan standar RNA. Standar RNA menggunakan RNA terhidrolisis sebanyak

500 g/mL dalam asam trikloroasetat 10%, dan pereaski orsinol ditambahkan

terakhir, kemudian larutan dikocok. Setelah itu, larutan didinginkan dalam wadah

berisi es, dan dibaca absorbansinya (A) pada spektrofotometer dengan panjang

gelombang 660 nm. Sebelumnya, nol-kan dengan tabung 1 (blanko). Konsentrasi

RNA dalam tabung 2 dan 3 kemudian dihitung.


5/10

5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip isolasi DNA dan RNA adalah pemecahan dinding sel dan yang

diikuti dengan pemisahan DNA dan RNA dari komponen-komponen lain

sehingga diperoleh DNA dan RNA murni. Penentuan RNA dapat menggunakancara reaksi orsinol. Prinsipnya reaksi orsinol merupakan reaksi umum untuk

pentosa, dan bergantung pada pembentukan furfuralnya apabila pentosa

dipanaskan dengan HCl pekat. Orsinol akan bereaksi dengan furfural jika ada

katalisator berupa FeCl3dan membentuk kompleks berwarna hijau. Reaksi positif

hanya untuk nukleotida purin (adenin dan guanin). RNA stabil pada suhu 90oC,

sedangkan protein-protein lain pada suhu ini sudah mengalami denaturasi

(Bintang 2010).

Proses isolasi diawali dengan penambahan larutan HClO4 dingin yang

berfungsi untuk mengendapkan makromolekul seperti protein. Kemudian

campuran disentrifugasi sehingga diperoleh pelet yang kemudian disuspensikandengan larutan basa KOH, yang bertindak sebagai alkali. Penambahan larutan

alkali dan proses pemanasan pada suhu 40o C dapat mendepolimerasi RNA,

sehingga RNA akan mengendap. Proses sentrifus selanjutnya dilakukan untuk

memisahkan DNA dan RNA (Faatih 2009). Pelet yang terbentuk kemudiandisentrifus kembali sebanyak tiga kali untuk mengendapkan makromolekul yang

masih tersisa, dibantu dengan larutan HClO4dingin. Berikut data absorban kurva

standar RNA setelah dilakukan pemisahan dari DNA.

Tabel 1 Absorban kurva standar RNA

[RNA] g/mL Absorbansi terukur Absorban terkoreksi

Blanko 0.102 0.000

6.25 0.420 0.318

12.5 0.669 0.567

25.0 1.143 1.041

62.5 1.418 1.316

125.0 1.436 1.334

Gambar 1 Grafik kurva standar RNA

y = 0,009x + 0,399

R = 0,664

0

1

2

0 50 100 150

Absorbansi

[RNA] g/mL

Kurva Standar RNA


6/10

6

Konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 660 nm. Pembuatan kurva standar sangat diperlukan dalam penentuan

kadar sampel yang menggunakan metode spektrofotometri. Tujuan pembuatan

kurva standar adalah untuk menentukan konsentrasi RNA berdasarkan absorbansi

serta untuk menentukan ketepatan hasil analisa yang sesuai dengan hukumLambert-Beer. Kurva standar digunakan sebagai standar eksternal. Kurva standar

dibuat melalui hubungan konsentrasi DNA dan absorbansinya (Paramita dan

Sukesi 2009).

Hasil kurva standar didapatkan persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan

R2=0,664. Nilai r yang didapat tidak begitu baik, karena belum mendekati 1,0

sehingga dapat disimpulkan kurva standar yang dibuat tidak diperoleh dengan

baik karena kurva yang didapat belum linier. Menurut Paramita dan Sukesi

(2009), nilai r harus terletak pada interval 0.9 1.0 yang menunjukkan bahwa

antara absorbansi dan konsentrasi memiliki korelasi yang linier. Hasil perhitungan

kurva standar akan mempengaruhi nilai konsentrasi sampel. Nilai absorbansi yangdiperoleh kemudian disubstitusi pada persamaan untuk menghitung konsentrasi

RNA terukur. Berikut data konsentrasi RNA yang terukur.

Tabel 2 Konsentrasi RNA

V larutan RNA (mL) Absorban [RNA] g/mL

0.2 -0.008 -45.22

0.5 0.134 -29.44

Contoh perhitungan [RNA]:

Y = a+ bx

Y = 0.399+0.009x

0.134 = 0.399+0.009x

[RNA] = -29.44

R =0.664

Menurut Ratnayani et al(2009), nilai absorbansi yang memenuhi hukum

Lambert Beer berada pada rentang 0,2 sampai dengan 1,0. Hasil percobaan yangdidapat nilai absorbansinya hanya berkisar dari -0,008 sampai 0,134. Nilai

absorbansi ini belum memenuhi hukum Lambert Beer. Konsentrasi RNA yang

diperoleh pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5 mL

sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya kenaikan konsentrasi dari volume

0,2 mL ke 0,5 mL. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai absorbansi

berbanding lurus dengan konsentrasi. Semakin besar absorbansi, maka semakin

besar juga konsentrasi RNA yang terukur.


7/10

7

SIMPULAN

Molekul DNA dan RNA dapat dihitung konsentrasinya menggunakan

metode spektrofotometri. Nilai absorbansi yang terukur akan setara dengan

konsentrasinya. Akan tetapi sebelumnya harus dilakukan isolasi DNA dan RNA

terlebih dahulu dengan teknik sentrifugasi. Hasil pengukuran kurva standar RNA

diperoleh persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan R2=0,664. Kemudian dengan

memasukkan nilai absorbansi yang diperoleh pada persamaan tersebut, didapatkan

konsentrasi RNA pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5

mL sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya hubungan antara nilai

absorbansi dengan konsentrasi yang terukur. Nilai absorbansi berbanding lurus

dengan konsentrasi, sehingga apabila absorbansinya meningkat, maka nilai

konsentrasi yang diperoleh juga meningkat.

DAFTAR PUSTAKA

Bintang M. 2010.Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta(ID): Erlangga.

Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan

Teknologi. 10(1): 61-67.

Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah

Pendekatan Klinis. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA.

2014. Biokimia Harper Edisi 29. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran

EGC.

Paramita GA, Sukesi. 2009. Produksi abon daging ikan pari (rayfish):

karakterisasi kimia daging ikan pari. Prosiding Skripsi. Surabaya(ID):

Institut Teknologi Sepuluh November.

Ratnayani K, SC Yowani, SL Syane. 2009. Amplifikasi fragmen 0, 4 kb daerah d-

loop DNA mitokondria lima individu suku Bali tanpa hubungan

kekerabatan dengan metodepolymerase chain reaction(PCR).Journal of

Chemistry. 3(1): 14-20.

Sinaga E. 2012.Biokimia Dasar. Jakarta(ID): PT. ISFI Penerbitan.


8/10


9/10

1


10/10

2

Documents

SFB- 8 Asam Nukleat