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ESQUEMA GENERAL
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OBJETIVO DE LA PRCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAEscherichia coli
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Se introducir el vector pET-TEM
Sitio mltiple de restriccinOrigen de replicacinGen que confiere
resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa
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PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled
circular covalently closedOc: open circular
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PlsmidosLa diferencia en TAMAO entre el DNA cromosomal y el DNA
plasmdico permite desarrrollar estrategias de purificacin
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TOPOISMEROS DE PLSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISMEROS DE PLSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISMEROS DE PLSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled
circular covalently closedOc: open circular
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Purificacin de plsmidos1. LisisQumica Mecnica Cambios en la
Tempratura2. Remover partculas grandesCentrifugacin Filtracin (uso
de membranas)3. Purificacin intermediaPrecipitacin fraccionada
Adsorcin a membranas 4. Purificacin alta resolucinMtodos
cromatogrficos: Intercambio inico Filtracin en gel Afinidad
Disolver Liofilizar Formular5. Conservar
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ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE PLSMIDOS POR LA TCNICA DE
LISIS ALCALINA
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Aislamiento de plsmidos por el mtodo de lisis alcalinaLas
bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
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Solucin GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9 La glucosa no tiene
carga pero es un osmolito El EDTA une cationes divalentes como Mg2+
y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la membrana. Tambin el
Mg2+ es cofactor de Dnasas
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Componentes de la solucin GTE
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Solucin de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%Esta solucin disuelve los
fosfolpidos y los componentes protecos de las membranas celulares.
SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CLULASSolucin de lisis
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Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con protenas y
lpidos.
El DNA cromosomal que se renaturaliza se atrapa en el
precipitado SDS/protenas/lpidos. Slo el DNA plasmdico y molculas de
RNA escapan del precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL SOBRENADANTE
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El isopropanol precipita los cidos nuclecosIncubar por 20 min a
-20CLavar el botn con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de
SDS. Tambin remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
evapora ms rpido
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Purificacin de plsmidosPor ejemplo unin al ptido
16merNH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH
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Cmo podramos monitorear el progreso de la purificacin de
plsmidos?Absorbancia 260 nmElectroforesis en geles de agarosa
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Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la
purificacin de plsmidosDNA cromosomalPlsmido abiertoPlsmido
superenrrollado1 Precipitacin con isopropanol2 Cromatografa
intercambo aninico3 Filtracin con membrana de nitrocelulosa4 Lo que
se retuvo en la membrana de nitrocelulosa
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Microscopia de polmero de agarosa
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Uso de colorantes
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Tincin con Syber Safe
