Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ)
METODY
•využívají se k izolování (separaci) dokazované nebo stanovované
složky z analyzované směsi a k odstranění rušivých (interferujících)
komponent analyzovaného roztoku (účel získání čistých složek)
•Separace (dělení) → operace, při níž se vzorek dělí alespoň na dva
podíly odlišného složení
• k získání co nejčistší biologické látky v dostatečném množství.
Dříve – dílo náhody, dnes – vysoce racionální postup.
Podmínka oddělení dvou látek – odlišnost alespoň v jedné fyzikální nebo chemické vlastnosti. Např.
•v bodu varu - destilace, lyofilizace,
•v rozpustnosti – krystalizace, srážení, extrakce,
•v rozdělovací konstantě – rozdělovací chromatografie LLC, GLC,
•v disociační konstantě – chromatografie na iontoměničích,
•v iontové pohyblivosti – elektroforéza,
•ve velikosti a hmotnosti molekul – centrifugace, gelová chromatografie, dialýza, ultracentrifugace.
Po separaci se mohou tyto složky:
•izolovat,
•kvalitativně nebo kvantitativně vyhodnocovat záznam jejich
rozdělení.
•Nejjednodušší separace – destilace, sublimace, filtrace.
•V mezních případech se využívají mnohastupňové separační
metody. Jejich provedení povětšině bývá kontinuální.
Hodnocení dokonalosti a účinnosti dělení
distribuční poměr D.
distribuční koeficient.
rozdělovací poměr koncentrační Dc.
IAc
IIAc
CD
)(
)(
•Rozdělení separačních metod
Metody založené na různé:
• distribuci jednotlivých složek mezi dvě fáze
• rychlosti pohybu jednotlivých složek v téže fázi
rozdělovací poměr hmotnostní Dm
I
II
mAm
AmD
)(
)(
m(A) je hmotnost složky A v příslušné fázi I nebo II.
Distribuční koeficienty se užívají nejčastěji v chromatografii
V chromatografii je fází II fáze stacionární a fází I fáze mobilní.
mI
sII
gVAm
mAmD
/)(
/)(
ms - hmotnost sušiny stacionární fáze v gramech
Vm - objem mobilní fáze v ml,
mI
cII
vVAm
VAmD
/)(
/)(
Vc je objem náplně kolony v ml
mI
sII
sVAm
AAmD
/)(
/)(
As - povrch stacionární fáze (sorbentu) v m2.
distribuční nebo rozdělovací konstanta KD.
V tomto případě platí, že c(A)I = A I a c(A)II = A II, takže
I
II
DA
AK
fáze vodná- považujeme za fázi I,
fází II organické rozpouštědlo, při výměně iontů měničová
fáze, při adsorpci adsorbent.
výtěžek dělení R:
III
II
pů
II
AmAm
Am
Am
AmR
)()(
)(
)(
)(
m(A)pů - hmotnost látky A ve vzorku před dělením.
Dělení lze několikrát (n-krát) opakovat, potom výtěžek dělení
Rn je
n
nRR )1(1
Z tohoto vztahu lze vypočítat, kolikrát je třeba dělení
opakovat, aby se dosáhlo výtěžku Rn, je-li výtěžek jedné
separace R
)1log(
)1log(
R
Rn n
1)(/)(
)(/)(
)(/)(
)(/)()(
)( BD
AD
III
III
I
II
c
c
BcBc
AcAc
BcAc
BcAc
Veličina - separační faktor
pů
pů
BA
II
II
Bm
AmS
Bm
Am
)(
)(
)(
)(/
m - hmotnost oddělené složky
mpů - hmotnost téže složky ve vzorku před dělením.
obohacovací faktor
B
A
BAR
RS
/
Separační metody založené na fázových
rovnováhách
Fázový diagram
Fázový přechod je fyzikální
pojem, označující skokovou
změnu makroskopických
vlastností termodynamického
systému (fáze) při změně
termodynamické proměnné
(např. teploty).
fázový diagram jednosložkové soustavy (vody)
Separační metody založené na fázových
rovnováhách
Extrakce
• selektivní separační metoda založená na přenosu látky z jedné
kapalné fáze do druhé, která je v podstatě nemísitelná s první fází
• použitelná pro vzorky kapalné i tuhé (přenos z pevné fáze do
kapalné), pro org. látky a biochemické materiály
• provedení v děličce (nejjednodušší), v extraktoru (např. Soxhletův)
Požadavky na extrakční činidlo
•musí být nemísitelné nebo omezeně mísitelné s původním
rozpouštědlem
• mělo by lépe rozpouštět extrahovanou složku než původní
rozpouštědlo
•nemělo by být hořlavé, drahé a korozívní
•v potravinářství nesmí být jedovaté, životu nebezpečné
EXTRAKCE
Převod dané látky z tuhého nebo kapalného homogenátu do
kapaliny.
Základní typy extrakcí:
Pevná fáze → kapalina
Macerace – luhování do jedné dávky kapaliny při normální
teplotě,
Digesce – luhování do jedné dávky kapaliny při zvýšené teplotě
(čaj),
Perkolace – luhování za normální teploty do protékající kapaliny,
Kontinuální extrakce – perkolace v průmyslovém provedení.
EXTRAKCE
Pevná fáze → kapalina
REALIZACE
Zabezpečení dobrého kontaktu mezi fázemi(přenos hmoty):
•TŘEPÁNÍ (A ZÁHŘEV) –třepačka(vyhřívaná)
•HOMOGENIZACE –homogenizátory
•SONIKACE –ultrazvuk
•VAR POD ZPĚTNÝM CHLADIČEM –reflux rozpouštědla
(termostabilní analyty)
Vyluhování s nuceným tokem (Forced-FlowLeaching)
•vzorek naplněn do ocelové kolony, kterou je pumpováno za
zvýšeného tlaku extr. rozpouštědlo při záhřevu k jeho b. varu
•výsledky srovnatelné se Soxhletovou extrakcí, ale rychlejší
EXTRAKCE
Pevná fáze → kapalina
Soxhletova extrakce
•pevný vzorek umístěn do Soxhletovy extrakční patrony (tvrzený
filtrační papír nebo sklo s fritou místo dna)
•patrona umístěna do Soxhletovy aparatury; rozpouštědlo po
záhřevu na svůj bod varu kondenzuje v patroně, vymývá
analyty,vrací se s nimi do varné baňky, opět se odpařuje...
•POČET CYKLŮ/ hod
•max.teplota omezena b.varu rozpouštědla (stabilita analytů)
•Složení extrakční směsi v roztoku nemusí odpovídat složení v
parách HEX:ACET (1:1) x AZEOTROP (3:1)
•vysoká výtěžnost x velice pomalé
•dobře zavedená metoda, relativně nenáročná a levná
Aparatura pro extrakci
Chladič
Soxhletův extraktor
Varná baňka
Extrakční patrona se
směsí pro extrakci
Funkce extraktoru
Při zahřívání baňky jsou páry rozpouštědla vedeny spojovací
trubicí do chladiče, kde kondenzují.
Kondenzované rozpouštědlo stéká na extrahovanou směs
v patroně, rozpouští ji a hromadí se v extrakčním prostoru.
Když hladina roztoku dosáhne horního ohybu patrony, steče
zpět do varné baňky.
Z baňky se opět odpařuje rozpouštědlo a celý proces se
opakuje.
Na extrahovanou směs tak působí stále nové rozpouštědlo, je
tedy možné dosáhnout dokonalé extrakce poměrně malým
množstvím rozpouštědla.
Pevná fáze → kapalina
Extrakce podporovaná mikrovlnným ohřevem (Microwave-
Assisted Solvent Extraction, MASE)
Mikrovlny –elektromagnetické vlnění, frekvence 300 MHz –300
GHz, používaná frekvence 2450 MHz
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
Používaná frekvence 2450 MHz:
Záhřev – dipól rotace-molekuly s vysokou dielektrickou
konstantou se snaží orientovat v el. poli, to se ale mění tak rychle,
že začnou vibrovat a v důsledku tření (srážky sousedních molekul)
se zahřívat.
Jiná frekvence nezpůsobí
záhřev:
↓frekvence molekuly se
zorientují
↑frekvence molekuly se ani
nezačnou orientovat
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
•Rozpouštědlo absorbující mikrovlnnou energii
rozpouštědlo se v uzavřené nádobě zahřívá nad bod varu,
urychlení extrakce analytu-vysoká teplota a tlak (do 200oC a 175
psi (libra síly na čtverečný palec) = 1,2.106 Pa = 12,3 at)
•Rozpouštědlo neabsorbující mikrovlnnou energii
rozpouštědlo se nezahřívá, selektivní záhřev určitých látek ve
vzorku→uvolnění zahřátých analytů do chladné kapaliny
uzavřená či otevřená nádoba
mírnější-pro termolabilní látky
možnost použití kapalného CO2-neabsorbuje, náhrada SFE (↓p, t)
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
Body varu a teploty rozpouštědel v nádobce:
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
Záhřev rozpouštědel v závislosti na čase:
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
Fokusované pole:
-μ-vlny zacíleny na dno nádobky se vzorkem, hrdlo chladné
-účinný reflux (možný přídavek reagencií), magnet. míchadlo
-μ-vlnná frekvence: 2450 MHz, proměnný výkon 30 -300 W
-0,1 -15 g vzorku, cca 30 -50 ml rozpouštědla, do 30 min
Pevná fáze → kapalina
MASE (Microwave-Assisted Solvent Extraction)
Výhody:
-malá množství rozpouštědel (30 -50 ml)
-rychlost(minuty x hodiny Soxhletova extrakce)
–přímý záhřev vzorku, ne nádoby
-účinnost,reprodukovatelnost
-selektivita -lze ovlivnit výběrem rozpouštědla, dobou záhřevu
-lokální záhřev a selektivní extrakce a migrace určitých
látek z matrice do rozpouštědla
X
Soxhletova extrakce záhřev celé matrice a difùze
rozpouštědla do matrice
-simultánní extrakce více vzorků
Kapalina → kapalina
Vytřepávání – jedinou dávkou (lepšího) rozpouštědla (dnes již
téměř nepoužívané),
Perforace – (lepší) rozpouštědlo, do něhož má přejít dělená látka
je v neustálém oběhu. Prostupuje kapalným homogenátem,
odebírá z něj dělenou látku a hromadí se v oddělené baňce. V ní
se odpařuje a po kondenzaci v chladiči prostupuje homogenátem
znovu. Dělená látka se hromadí v destilačním zbytku.
Roztřepávání – jedna z prvních účinných metod umožňující
dělení látek, jejichž rozdělovací konstanty jsou velmi podobné.
Jejím zdokonalením je
Rozdělovací chromatografie (bude probráno později).
Kapalina → kapalina
Princip dělicích metod při přechodu kapalina → kapalina:
Požadovaná látka je (spolu s dalšími látkami) v kapalném
homogenátu – v nějakém rozpouštědle použitém při homogenizaci
nebo luhování. Při vytřepávání, perforaci, roztřepávání nebo
rozdělovací chromatografii musíme najít a použít další rozpouštědlo,
které se
•nemísí s prvním rozpouštědlem,
•v němž je daná látka (a pokud možno jen ona) rozpustná lépe, než v
rozpouštědle prvním.
Hlavním problémem extrakce z kapaliny do kapaliny je tedy volba
vhodného (druhého) rozpouštědla.
Kapalina → kapalina Hlediska a požadavky:
•Co nejmenší vzájemná mísitelnost obou rozpouštědel.
Východisko – mixotropní (eluotropická) řada organických
rozpouštědel seřazených podle rostoucí polarity (podle rostoucí
relativní permitivity, vzájemné rozpustnosti) – uhlovodíky <
alkoholy < voda – např.:
pentan < benzen < dietyléter < chloroform < aceton < dioxan < <
etylacetát < pyridin < etanol < metanol < voda
Platí - čím větší je rozdíl relativních permitivit - čím jsou
rozpouštědla v mixotropické řadě od sebe dále, tím hůře se mísí.
• Co nejvyšší rozpustnost dané látky. Pravidlo: podobné rozpouští
podobném. Pro látky lipofilní (hydrofóbní – bojící se vody), které
jsou nepolární, používáme uhlovodíky. Látky hydrofilní (polární)
se naopak velmi dobře rozpouštějí v polárních rozpouštědlech –
alkoholy, voda.
•Chemická stálost. Rozpouštědlo nesmí chemicky reagovat s
prvním rozpouštědlem ani s danou látkou
Kapalina → kapalina
Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE
Nernstův distribuční zákon -Jakákoliv sloučenina se rozdělí mezi
dvě nemísitelná rozpouštědla takovým způsobem, aby poměr
koncentrací v obou fázích zůstal konstantní:
KD.…distribuční konstanta
co....koncentrace analytu v organické fázi
caq....koncentrace analytu ve vodné fázi
•KD popisuje rovnováhu mezi koncentracemi analytu v obou fázích
(charakteristická pro daný analyt v daném systému)
•k separaci dvou látek dojde, jestliže se jejich KD liší
Kapalina → kapalina
Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE
Extrahované množství analytu(E):
KD.…distribuční konstanta
Vo.…objem organické fáze
Vaq.…objem vodné fáze
V.…fázový poměr Vo/Vaq
Kapalina → kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE
Distribuční konstanta KD:
Extrahované množství analytu:
Kapalina → kapalina Extrakce kapalina-kapalina (LLE) –TEORIE
JEDNOKROKOVÁ EXTRAKCE:
Pro kvantitativní výtěžnost KD musí být >10, protože praktické je 0,1
<V < 10
KD= 10, V = 1: E = ((10*1) / (1 + 10*1)) *100 =91 %
KD= 10, V = 0,1: E = ((10*0,1) / (1 + 10*0,1)) *100 =50 %
VÍCEKROKOVÁ EXTRAKCE:
Není-li splněna podmínka KD>10
Vícenásobná extrakce menším objemem rozpouštědla je účinnější než
jedna extrakce sumárním objemem
Kapalina → kapalina
Extrakce rozpouštědlem
Kontinuální extrakce
KDvelmi malévícekroková
extrakce nepraktická (mnoho
opakování, velký extrakční objem,
pomalé ustalování rovnováhy)
Kontinuální extraktor - rozpouštědla
těžší než voda
Kapalina → kapalina
Extrakce rozpouštědlem
Mikroextrakce (ME) X In vial extrakce
V 1
miniaturizace: V (0,001 – 0,01)
•malý objem rozp. lehčích než voda
•vysoká zakoncentrace
•nižší výtěžnost
•riziko emulzí (čisté vzorky)
•vhodné pro nepolární analyty
•vhodné vysolování
Aparatura pro vytřepávání
Dělící nálevka
Zátka
Voda
Chloroform
( s jodem)
Jímací nádoba
Zásady pro vytřepávání
•Extrakce kapaliny z kapalné směsi přidáním rozpouštědla,
v němž je extrahovaná složka velmi dobře rozpustná.
•Provádí se protřepáváním směsi s vhodným rozpouštědlem.
• Čím větší je tzv. rozdělovací koeficient (r.k.) a větší rozpustnost
složky v použitém rozpouštědle, tím lépe se extrahovaná složka
oddělí od směsi. Účinnost extrakce se zvýši také opakováním
extrakce.
•Rozdělovací koeficient je poměr koncentrací látky rozpuštěné
ve dvou různých, navzájem nerozpustných a nemísitelných
rozpouštědlech (kapalinách A, B); r.k. = cA / cB.
•Rozdělovací koeficient závisí pouze na teplotě a je pro danou
látku v daných rozpouštědlech konstantní.
•Jako příklad možno uvést vytřepávání bromu nebo jodu
z jejich vodných roztoků např. sirouhlíkem, benzínem,
chloroformem nebo petroletherem.
Destilace • neselektivní separační metoda k dělení složek kapalné směsi
•část směsi převedena odpařením do parní fáze, odděleně
•zkondenzována, získá se kondenzát obohacený těkavějšími složkami,
•v neodpařené části se koncentrují méně těkavé složky
•nejčastější využití destilace, resp. rektifikace při analýze ropy,
•ropných produktů, org. rozpouštědel apod.
•Látky destilují postupně podle zvyšujícího se bodu varu. Jejich páry se v chladiči postupně kondenzují (sráží) a odkapávají do jímadla
•Aby při jednorázové, tzv. jednoduché destilaci došlo k úplnému oddělení dvou látek ze směsi, musí být jedna buď úplně netěkavá, nebo se musí lišit teplotou varu alespoň o 150 oC.
•Některé kapaliny při určité koncentraci tvoří tzv. azeotropní směsi, tj. směsi, které mají konstantní bod varu, destilují spolu a jednoduchou destilací se nedají od sebe oddělit. Např. směs ethanol – voda tvoří tuto směs při poměru 96% lihu a 4 % vody ( přesně 95,57 % ethanolu) a bod varu je 78,15 oC.
Destilace
Filtrační metody
Kritérium pro dělení: velikost molekul a použitý tlak.
•reverzní osmóza – Mr <500; p (1 MPa - 10 MPa);
•ultrafiltrace – Mr (500 - 300000); p ( 0,1 MPa - 1 MPa);
• mikrofiltrace – velikost molekul 1 < mμ; p 0,1 MPa;
•filtrace – velikost molekul > 1 mμ; p 0,1 MPa.
Možnost kombinace těchto metod s použitím elektrického pole:
elektrodialýza, elektrodekantace (frakcionace vysokomolekulárních
látek).
Filtrace membránou
Ultrafiltrace: selektivní oddělování molekul protlačováním roztoku membránou s přesně definovanými póry: 0,1 nm - 50 nm. Přetlak, chlazení. Ultrafiltry: anizotropní membrány (kruhové, dutá vlákna). Základní charakteristika ultrafiltru: molekulový limit - hmotnost nejmenší částice, která je filtrem zadržena. Limit nebývá ostrý, jeho stanovení se provádí globulárními bílkovinami.
Použití: čištění a frakcionace labilních biomolekul (NK, enzymy, protilátky aj.).
Účinnost dělení: největší pro molekuly, jejichž hmotnost se liší o jeden řád.
Mikrofiltrace: podobná ultrafiltraci. Póry mikrofiltrů jsou však podstatně větší (0,05 μm - 10 μm ) . Použití podtlaku
Použití: separace buněčných organel, buněk, mikroorganizmů a virů sterilizace kapalin, izolace buněk pro cytologická vyšetření; koncentrování virů; odstraňování sorbentu – aktivního uhlí z reakčních směsí apod.
.
Molekulová síta Speciální membrány – látky anorganického nebo organického původu, jejichž
struktura a fyzikální vlastnosti umožňují selektivní oddělování látek s rozdílnou
hmotností molekul. Výhoda – jemnější dělení. Forma molekulových sít – prášek,
granule, gel. Dělení molekulovými síty je proces opačný k filtraci – malé molekuly
dělené látky vnikají do pórů a sítem procházejí velké molekuly.
Anorganická molekulová síta: Přírodní nebo syntetické zeolity- hlinitokřemičitany
(hydratované alumosilikáty alkalických kovů).
Použití:
•čištění a vysušování rozpouštědel (po zaplnění pórů molekulami H2O je nutná
aktivace síta vysušením při teplotě 300C-400 0C, jako adsorbenty v chromatografii.
Pórovitá skla – vyšší odolnost vůči chemikáliím a vyšším teplotám než u zeolitů
(BIOGLAS).
•separace virů, NK, také jako iontoměniče.
Organická molekulová síta: Makromolekulární látky se složitou vnitřní strukturou
(sítování) – dutiny definované velikosti – škrobové, želatinové a agarové gely ve
formě granulí (agar – komerčně dostupná látka z mořských ruduchovitých řas
rozpustná ve vroucí vodě. Při teplotě pod 50 0C tuhne v rosol – gel). Hydrofilní a
hydrofóbní forma. Značná dělící schopnost. Nevýhoda – snadná možnost
mechanického nebo chemického poškození.
Filtrace
Filtrace - separační metoda, která umožňuje oddělit pevnou látku od
kapaliny. Pevná látka se zachytí na filtru, kapalina proteče jako filtrát. V
laboratoři se jako filtru používá nejčastěji tzv. filtrační papír, který je
podobný obyčejnému papíru, ale má mnohem větší propustnost kapalin a
je dosti savý. Rozlišuje se několik druhů těchto papírů podle vlastností
materiálu, který chceme filtrovat.
Provedení filtrace •Nálevku s filtračním papírem upevníme do držáku
•Její stopka se musí dotýkat stěny kádinky postavené pod ní na jímání filtrátu.
•Filtrát musí stékat po stěně kádinky a nesmí se rozstřikovat.
•Roztok filtrujeme (pokud to látce nevadí) vždy horký, protože je filtrace za horka
mnohem rychlejší.
•Vléváme jej z kádinky do nálevky po tyčince přiložené ke stěně nálevky (pokud
používáme hladký filtr, přikládá se zpravidla ke trojité vrstvě filtračního papíru), aby se
kapalina nerozstřikovala a nepotřísnila stěny kádinky. Protože kapalina na filtru vzlíná,
nenaléváme jí více než centimetr pod okraj filtru.
Filtrace s odsáváním
slouží k filtraci tehdy, kdy účelem filtrace je získat nerozpustný produkt.
Filtrační nálevka (Büchnerova nálevka) bývá obvykle porcelánová, ale
existují i plastové. Její dno je ploché s mnoha malými otvory. Na dno
pokládáme kruhový filtrační papír, na kterém se při filtraci zachytí pevná
látka, zatímco roztok proteče do odsávací baňky pod nálevkou.
Pokud nám záleží na filtrátu (nikoli na sraženině zachycené na filtru), je
vhodné mezi odsávací baňku a vývěvu zapojit ještě promývací baňku
(viz následující obrázek).
Byla pojmenována po německém chemiku Eduardu Büchnerovi, který
roku 1907 získal Nobelovu cenu.
Schéma doporučeného zapojení vývěvy (1) k aparatuře (3,
4) přes pojistnou (promývací) láhev (2).