Tema 2:Estructura y Función de las Proteínas

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Prof. Vanessa Miguelvanessa.miguel@ucv.ve@bioquitips

Noviembre 2011

Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela de Medicina Luis RazettiCátedra de Bioquímica

¿Cómo se estudian las proteínas?

Aislando fracciones subcelulares

Purificación de proteínas

Métodos de purificación

Se basan en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas:

Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad

Característica

Procedimientos

Tamaño Diálisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografía de exclusión molecular Ultracentrifufación

Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes orgánicos ‘’ por pH

Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica

Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque

Selectividad Cromatografia de afinidad

Centrifugación

Utiliza la fuerza centrífuga (fuerza-g) para aislar partículas suspendidas.

Los componentes de la mezcla se separan por: peso, tamaño, densidad y forma.

Se utiliza para la separación de organelos subcelulares y para el aislamiento de macromoléculas, tales como ADN, ARN, proteínas o lípidos

Se separan es su coeficiente de sedimentación(s); medido en Svedbergs (1 S = 10-13 segundos), depende de la forma y el tamaño de la molécula o partícula.

Centrifugación

Centrifugación en gradientes de densidad

Gradientes continuos de sacarosa→ tubo de centrífuga

Aplicación de fuerza centrífuga

Muestra:tres componentes

mezclados

Fase móvil

Faseestacionaria

Se hace fluir una fasemóvil sobre

la estacionaria

Dependiendo de la afinidad

relativa por ambas fases, los

componentes de la mezcla

se separan

Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria

Fundamento de la cromatografía

Cromatografía

Exclusión molecular: Separa según tamaño molecular Fase estacionaria: dextrano o agarosa

entrecruzados Fase móvil: solución buffer Intercambio iónico: Separa según carga eléctrica Fase estacionaria: grupos cargados unidos a

un soporte insoluble Fase móvil: gradiente de sal o de pH

Exclusión molecular

Separa mezclas de proteínas por tamaño Las columnas rellenas de polímeros

inertes insolubles pero muy hidratados:

Sephadex: polimeros de dextranoSepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzadaSephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

Exclusión MolecularResina porosa

Fase estacionaria

AmortiguadorFase móvil

Resina

BA

A: Pasa sólo por fuera de las perlasMenos recorrido, sale primero

B: Pasa por dentro y por fuera de las perlasMayor recorrido, Sale después

Exclusión molecular

Proteínas de gran tamaño no Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la en el volumen de exclusión de la columna columna Vo

Volumen de exclusión

.

1.La columna se equilibra con el buffer de corrida2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)3. Elución.

Exclusión Molecular

Cromatografía en columna

La salida de las proteínas se detecta normalmente por absorción de la luz, en una longitud de onda de 280nm.

Los aminoácidos de las proteínas absorben tal luz y se cuantifica utilizando un espectrofotómetro,

Los datos se registran en un diagrama de elución que indica la posición de las proteínas que se han separado.

Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de las proteínas fraccionadas

G l u c a g o n

C i t o c r o m o c

R i b o n u c l e a s a

S e r o a l b ú m i n a

I g GT i r o g l o b u l i n a

V o l u m e n

P e s o m o l e c u l a r

2 8 0

2 4 0

2 0 0

1 6 0

1 2 0

8 0

4 0

1 03

1 04

1 05

1 06

B o m b a p e r i s t á l t i c a

G e n e r a d o rd e g r a d i e n t e

C o l u m n a

C o l e c t o r d ef r a c c i o n e s

R e s i n a d ei n t e r c a m b i oi ó n i c o

Cromatografía deintercambio iónico

Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente.

Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil (contraiónes), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz.

La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos.

Matriz Nombre

Dextrano Sephadex

Agarosa Sepharose CL-6B

Celulosa Sephacel

Intercambio Iónico

Los grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador.

Determinan el tipo y la fuerza del intercambiador

El número total y su disponibilidad, determinan la capacidad del intercambiador

Los de carga negativa adsorben cationes (intercambiadores catiónicos) mientras que los de carga positiva adsorben aniones (intercambiadores aniónicos)

Intercambiadores aniónicos

Intercambiadores catiónicos

Mecanismo de separación

• Separa a moléculas por carga neta.

• Grupos cargados unidos a la matriz unen las muestras de carga opuesta(reversible)

• La elución se logra a

través el cambio del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente.

Fig 1.1. Charged sample molecules adsorb to ion exchangers of the opposite sign. The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration.

Intercambio iónico

Resina carga (-)Atrae cationes

A: (+)

B: (-)

Retenidas por la resina

Para separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arriba del pI

Cromatografía de intercambio iónico

+

+

+

+

++

+

+

+

---

-

------

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

--

-

---

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- -- -

-

-

---

+

+

+

+

++

+

+

+

-

-

--

-

-

---

-

-

---

-

- -

--

-

Proteínas adsorbidasal intercambiador

iónico

A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos

electronegativas

A mayor concentraciónde sal se desprenden

las proteínas máselectronegativas

Electroforesis

Método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrico, de modo que se diferencian en el diferente comportamiento en un campo eléctrico.

Aquellas partículas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el cátodo y las cargadas negativamente (aniones) hacia el ánodo.

1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para minimizar

efectos de difusión

2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante,

a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica

3. Terminada la electroforesis, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (ej., Azul de Coomassie)

Muestra

+-ÁnodoCátodo

Electroforesis de zona

Papel de filtro o acetato de celulosa Revela la presencia de proteínas con

colorantes específicos No existe interacción con el soporte Resolución muy baja Rápido

Electroforesis en geles de poliacrilamida

Separa por carga y tamaño El material soporte interacciona con las

proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes

Utiliza geles de poliacrilamidas. Condicion nativa (PAGE) o

desnaturalizante(SDS-PAGE)

Electroforesis

SDS-Page

Las proteínas se separan sólo por su PM El SDS interacciona con las proteínas por

interacciones hidrofóbicas Recubre las proteínas con carga negativa

proporcional a su PM Desnaturaliza la estructura nativa de la

proteína β -mercaptoetanol rompe los puentes

disulfuros

Electroforesis

Electroforesis bidimensional

• Separar proteínas de una mezcla

• Determinación de PI y PM

• Fraccionamiento de las hemoglobinas

• Diferenciación de la hemoglobina fetal

• Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc

• Proteínas séricas• Proteínas urinarias• Lipoproteínas• Ácidos nucleicos• Enzimas• Inmunoelectroforesis• Etc.

Electroforesis: Aplicaciones

Solubilidad

Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación

Mantiene nativa a la proteina Redisolución sin pérdida de actividad Cada proteína tiene una composición de aa

diferente y diferente solubilidad

SolubilidadDepende de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura

Solubilidad-pHLa carga neta de las proteína depende del

contenido de aa ácidos y de aa básicosCuando el valor del pH donde la carga neta de

la proteína es cero ⇒ pI

Solubilidad es mínina

Ej: ↑contenido de aa ácidos ⇒pI bajo (4-5)

Solubilidad: disolventes

Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL)

Se usan en distintas proporciones Disminuyen la solvatación de las proteínas

en soluciones acuosas

Solubilidad-Fuerza iónica

Salting in

Salting out

Salting in (salado)

Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)

aumenta con la [ sales] → Salting in

Al aumentar la [sales]

→proteína se rodea de contraiones

→más soluble por > interacción proteína-solvente

Salting out (precipitación por salado)

La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0,02M) disminuye con la [sales] → Salting out

La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína y éstas precipitan

Solubilidad- Temperatura

0-40 oC >T > solubilidad. 40-50oC aumenta la inestabilidad y

DESNATURALIZAN (↓ solubilidad)