ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS DE LECHE Y SOYA Y

ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS DE LECHE Y SOYA Y SU EFECTO EN LAAGREGACIÓN, DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIÓN EN LA PREPARACIÓN DE

YOGUR.

Ana Milena Díaz BautistaAna María Giraldo Menassé

Proyecto de grado presentado como requisito para optar por el título de:Ingeniera Química

Dirigida por:Oscar Alberto Álvarez SolanoPh.D

Andrés González BarriosPh.D

Universidad de Los AndesDepartamento de Ingeniería Química

Bogotá, Colombia2013

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Contenido

Agradecimientos………………………………………………………………………………....………....………....………....……….3

Lista de Figuras…………………………………………………………………………………….………....………....………...………..4

Lista de Tablas…………………………………………………………………………………….………....………....………...………...5

Resumen…………..…………………………………………………..………………………………………………....………....………….6

1. Estado del Arte………………………………………….……………………………………………....………....………....………...6

2. Materiales y Métodos……………………………….……………………………………………....………....………....………...72.1. Materiales………………………………………….……………………………………………....………....………....……….....72.2. Prueba de solubilidad de la proteína de soya………………………………………….………………………………….72.3. Preparación de las mezclas………………………………………….……………………………………………....……….....82.4. Distribución de tamaño de partícula de las muestras………………………………………….………………………82.5. Potencial Z ………………………………….………………………………………….…………………………………………….....82.6. Microscopía electrónica de barrido y óptica…………………………….…………………………………………….....82.7. Caracterización reológica de diferentes matrices lácteas…………………………….……………………………..92.8. Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo…………………………….…………………………92.9. Estudio electroforético de diferentes matrices lácteas…………………………….…………………………………9

3. Resultados y Discusión……………………………….……………………………………………....………....………....………..93.1. Prueba de solubilidad de la proteína de soya………………………………………....………....………....………...93.2. Seguimiento del pH………………………………………....………....………....………....…………………………………103.3. Distribución tamaño de partícula………………………………………....………....………....………..................123.4. Potencial Z de las diferentes leches………………………………………....………....………....………...............133.5. Microscopía electrónica de barrido y óptica…………………………....………....………....………...............143.6. Caracterización reológica…………………………....………....………....………...................………...............173.7. Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo………...................………....................193.8. Estudio electroforético………...................………...................………...................……….....................21

4. Conclusiones. ……………………………….……………………………………………....………....………....………..............23

Referencias bibliográficas………………….……………………………………………....………....………....……….............23

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Agradecimientos

Queremos agradecer, en primer lugar, aÓscar Álvarez y Andrés González por el constante apoyo,acompañamiento y la orientación a lo largo del proyecto, con lo cual fue posiblealcanzar las metas propuestas.De igual forma, agradecemos a Sara Pacheco, BernadetteKlotz y Gerardo González, grupo de apoyo del Institutode Investigación de Alpina, por la asesoría, la retroalimentación brindada y la motivación por obtener el mayorprovecho de este trabajo. A Jorge Mario Gómez por las observaciones realizadas y por mostrarnos la importanciade este tipo de proyectos dentro del diseño de productos. Finalmente, a los técnicos de los laboratorios y a losasistentes que estuvieron siempre dispuestos a colaborarnos en todas las pruebas realizadas.

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Lista de Figuras

1. Figura 1. Resultados de tamaño de partícula (a) y sólidos totales (b) en prueba de solubilidad de proteína desoya……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………10

2. Figura 2. Comportamiento del pH de las muestras a cada tiempo…………………………..………………………………….10

3. Figura 3. Variación del potencial Z para (a) Leche de soya (b) Leche bovina y del Tamaño de partícula para(c) Leche de soya (d) Leche bovina a diferentes pHs……………………………………………………….……………………………11

4. Figura 4. Seguimiento del tamaño de partícula (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina…..….13

5. Figura 5. Tamaño de partícula para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas defermentación….…………………………….…………………………………………………….………………………………………………………14

6. Figura 6.Imágenes de microscopio electrónico de barrido con aumento 2000x. Ancho de imagen: 131 μm.(a) 100% (b)80%(c)50%(d)20% (e) 0% Leche bovina…………………………………………………….………....……………15

7. Figura 7. Imágenes de microscopio óptico para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Lechebovina. Aumento de 1000x. Barra de 10µm.………………………………………………………………………………………………16

8. Figura 8. Curvas de flujo: Viscosidad vs. Velocidad de corte para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d)20% (e) 0% Leche bovina a diferentes horas de fermentación..……………………………………………………………………18

9. Figura 9. Viscosidad para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación…………………………………………………….…………………………………………………….………………………………………………………19

10. Figura 10. Tixotropía de las mezclas de leche bovina a las 7 horas de fermentación…………………………………..19

11. Figura 11. NIR de mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina, a diferentes horas defermentación y (f) de todas las mezclas a las 7 horas de fermentación……………………………………..……………….20

12. Figura 12. Geles de electroforesis para mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Lechebovina…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………21

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Lista de Tablas

1. Tabla 1. Cantidad de sólidos no grasos, azúcar y leche de soya según concentración de mezcla…………………8

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RESUMEN: El presente trabajo estudia la interacción de las proteínas de leche bovina y de soya, y su efecto en elfenómeno de agregación proteica durante la preparación de yogur, a diferentes concentraciones. Se empleóleche descremada-deslactosada Alpina y proteína de soya. Se realizó una caracterización macroscópica(evaluación de las propiedades reológicas), microscópica (tamaño de partícula), morfológica (microscopio ópticoy microscopio electrónico de barrido (SEM)), molecular (espectro de infrarrojo cercano (NIR)) y un estudio deelectroforesis. Se determinó que existe un efecto significativo de la proteína de soya en la caracterizaciónmacroscópica, microscópica y molecular de las mezclas, y que las proteínas de leche bovina y soya tienen formasde agregación diferentes observadas en el SEM, gránulos y malla, respectivamente, lo que afecta la reología y eltamaño de partícula del sistema. La viscosidad por su parte presenta valores de 0.71 Pa*s para la muestra de100% leche bovina, mientras que para el caso de 0%, la viscosidad es de 2.61 Pa*s. En este sentido, la estructurade la soya resulta más resistente, teniendo un efecto importante en el comportamiento creciente de laviscosidad, a medida que se aumenta la cantidad de soya de las mezclas.

1. Estado del arte

Las bebidas lácteas son un grupo de alimentos que están creciendo en producción y en consumo. En laproducción de yogur, la industria láctea utiliza leche descremada o entera y algunos otros ingredientes lácteoscomo la leche ligera, leche concentrada, y polvo de suero de leche, así como edulcorantes, estabilizantes,proteína de suero concentrada, sabores de frutas, entre otros, que se utilizan para aumentar sólidos, normalizarlas mezclas, y/o para mejorar la presentación, consistencia y atributos sensoriales. (Özer&Kirmaci, 2010).Elyogur, por su presencia en el mercado y su alto consumo, es el producto fermentado de consumo diario másimportante(Bakirci&Kavaz, 2008; Özer&Kirmaci, 2010). En el segmento del mercado de yogures, hay unapreferencia creciente por productos de baja, o sin, grasa que difieren en la textura, en comparación con losproductos de grasa entera (Duarte-Teles y Hickmann-Flores, 2007)

La soya es uno de los alimentos que ha llamado la atención en las últimas décadas por su alto valor nutritivo ysus propiedades en la prevención de enfermedades. Además tiene un alto valor energético, un elevadocontenido de proteínas (37%), superior al de la carne. En comparación con el resto de legumbres, la soya aportamayor cantidad de hierro, yodo, magnesio, ácido fólico y otras vitaminas como B1, B2, B3 Y B6. (Lehr, A. 2009).Elconsumo de alimentos de soya y la incorporación de la leche de soya y sus subproductos en las dietas humanashan estado aumentando debido a sus efectos beneficiosos sobre la nutrición y la salud (Rinaldoni et al., 2012).Estos efectos incluyen la reducción de colesterol, la prevención del cáncer, diabetes, osteoporosis, obesidad, laprotección contra enfermedades del intestino y riñón, y alivio de algunos problemas de la menopausia(Anderson et al, 1999;. Friedman y Brandon, 2001; Shah et al. , 2007)

Existe un número limitado de estudios disponibles sobre las interacciones de las proteínas de soya en lossistemas de mezclas de proteínas. Existen estudios sobre las propiedades funcionales de las proteínas de soya yproteínas de la leche a partir de un desarrollo de producto, por ejemplo, en estudios comparativos de productosde yogur a base de proteínas de leche bovina y de soya(Lee, et al., 1990). Se tiene poca información acerca de lacaracterización de los agregados formados entre las proteínas de soya y de leche durante el procesamiento delos alimentos. En los sistemas mixtos de proteínas de leche ysoya, se formanagregados, sin embargo, losmecanismos de formación de tales agregados no son bastante claros.

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Se necesita una mejor comprensión de la formación de agregados entre las proteínas de soya y proteínas de laleche, con el fin de mejorar la textura y la estabilidad de los productos alimenticios que contienen ambossistemas de proteínas. De esta forma, el entendimientode dicha agregación podría facilitar el diseño de unaamplia gama de nuevos ingredientes funcionales.

El presente trabajo tiene como fin estudiar los cambios de agregación de diferentes mezclas de leche bovina yleche de soya durante la preparación de yogur a partir de una caracterización macroscópica (evaluación de laspropiedades reológicas), microscópica (tamaño de partícula), morfológica (microscopio óptico y microscopioelectrónico de barrido), molecular (espectro infrarrojo cercano NIR) y una electroforesis.

2. Métodos y Materiales

2.1 Materiales

Para el estudio propuesto se trabajó con leche bovina UHT descremada-deslactosada, marca Alpina. Dicha lechecuenta con un porcentaje de proteína de 3.2% y de sólidos no grasos (SNG) de 8.02%, valores a los cuales seestandarizaron las mezclas. Por otro lado, se utilizó proteína de soya aislada, (SolaeCompany™), con uncontenido de 90% de proteína y 95% de SNG. Adicionalmente, para la fermentación, se incluyó el cultivo conLactobacillusdelbrueckii ss. bulgaricus y Streptococcussalivarius ss. thermophilus, (YO-flexMild 1.0® ChrHansen™). Cabe resaltar que en la metodología trabajada se desarrolló una réplica para cada prueba realizada.

2.2 Prueba de solubilidad de la proteína de soya

Con el fin de analizar la hidratación de la proteína de soya, se realizó la prueba de solubilidad, mezclandoinicialmente la proteína con agua desionizada a 38°C. Posteriormente, cada 15 minutos, a partir de la adición dela soya, se tomaron muestras de la mezcla, las cuales se centrifugaron en una centrífuga marcaThermoElectronCorporation IEC CL40R, por 10 minutos. Finalmente, se hallaron tanto el tamaño de partícula,como los sólidos totales de las muestras de sobrenadante. El procedimiento para la determinación de los sólidostotales consistió en calentar y secar las diferentes muestras y, por diferencia de pesos, determinar los sólidosremanentes.

2.3 Preparación de las mezclas

Como primer paso para la preparación de las muestras, se preparó la leche de soya utilizando la proteína desoya aislada. Dicha proteína se dispersó en agua desionizada a 38°C, con agitación rápida y constante, hasta unatemperatura entre 70-77°C, momento en el cual se incorporó azúcar blanca comercial. Se prosiguió con lahidratación por 10 minutos más; por último, se autoclavó la mezcla para esterilizarla. Cabe resaltar que laadición de azúcar tiene dos objetivos: incluir un sustrato de alimento para las bacterias utilizadas, así comoajustar todas las mezclas al valor correspondiente de SNG presentes en la leche bovina, mencionadoanteriormente. Los valores de SNG antes de agregar azúcar, así como las cantidades de la misma, según loscinco niveles de concentraciones a estudiar, se muestran en la Tabla 1.

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Tabla 1. Cantidad de sólidos no grasos, azúcar y leche de soya según concentración de mezcla

Posteriormente, se procedió a mezclar en un erlenmeyer de 500 mL la leche bovina, con la leche de soyapreparada anteriormente, en condiciones estériles y según las proporciones indicadas en la Tabla 1, paracumplir con las cinco concentraciones establecidas.

Con el fin de lograr mezclas más homogéneas, la mezcla fue llevada a agitación por 15 minutos en el agitadorautomático Orbital ShakerIncubator, marca MRC, así como a un sonicadorBranson 2510, por 15 minutos más.

Finalmente, se dispusieron 5 erlenmeyers de 100 mL para cada uno de los niveles de tiempo de incubación (0, 2,3, 5, 7 h) con la mezcla de leches, y se le adicionó 1% en volumen del inóculo. Estos erlenmeyers se llevaron auna incubadora marca Lab-Line Instruments INC. a 45°C por el tiempo designado para cada uno. Al ser retirados,se les tomó el pH con un pH-metro marca Mettler Toledo y se refrigeraron a 4°C.

2.4 Distribución de tamaño de partícula de las muestras

En primer lugar, para la distribución de tamaño de partículas, se utilizó la técnica de difracción de láser, con unequipo Mastersizer 3000 –Malvern Instruments, cuyos módulos empleados corresponden al Hydro EV y al AEROS, para líquidos y sólidos, respectivamente. Dado que se requiere cierta obscuricidad (alrededor de 10%), lasmuestras líquidas fueron diluidas en 500 mL de agua desionizada para sus respectivos análisis.

2.5 Potencial Z

En cuanto al potencial Z, las leches fueron tratadas con ácido fosfórico para disminuir el pH hasta valores de 7,6, 5.5, 5, 4.5 y 4, con el fin de obtener una curva que permitiera hallar el punto isoeléctrico de cada una de lasmatrices mencionadas. Cada una de las muestras se analizó en el equipo Zetasizer Nano ZS - MalvernInstruments, a una temperatura de 20°C.

2.6 Microscopía electrónica de barrido y óptica

Para las pruebas de las estructuras y la morfología de la superficie, se trataron las muestras puras con unmicroscopio electrónico de barrido (SEM -Phenom G2TM Pro), a un aumento de 2000x. Para esta prueba fuenecesario analizar una gota de la muestra congelada a -5°C, con el fin de evitar un cambio de fase instantáneo, acausa del haz de electrones.Así mismo, se utilizó un microscopio óptico, marca MoticType 102 M, donde seanalizan las muestras en fase líquida, con un aumento de 1000x.

Concentraciónde

Mezcla(p/p)

SNG Mezclasin

azúcar(p/p)

Cantidadazúcar en

100 mLLeche de soya (g)

Volumen deLeche de soya en

500 mLde mezcla (mL)

Cantidad deazúcar

enmezcla (g)

100% Leche bovina 8,02% 4,33 0 080% Leche bovina 7,15% 4,33 100 4,3350% Leche bovina 5,85% 4,33 250 10,8320% Leche bovina 4,55% 4,33 400 17,320% Leche bovina 3,69% 4,33 500 21,65

9

2.7 Caracterización reológica de diferentes matrices lácteas

Con el fin de obtener una caracterización de los fluidos de las muestras, se realizó una prueba estacionaria conel reómetro de esfuerzo impuesto DHR 1 – TA Instruments, a una velocidad variable entre 1 s-1y 500 s-1. Lageometría empleada de la base fue un cilindro concéntrico, con un control peltier, para mantener unatemperatura constante de 20°C. La base fue configurada con un rotor DIN de 14 mm de radio y 42 mm de alto.

2.8 Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo

Para los análisis de espectroscopía de infrarrojo cercanose trataron las muestras a temperatura ambiente (20°C-23°C), en un equipo FOSS SmartProbeTMAnalyzer5000, sobre la región espectral entre1100-2500nm, conintervalos de 2 nm. Para cada medición se utilizó un volumen de aproximadamente 10mL de muestra en unacubeta de vidrio. Los instrumentos fueron lavados con jabón, desengrasante y alcohol, luego fueron enjuagadoscon agua destilada y finalmente se secaron con aire entre cada prueba. Los datos de los espectros fueronreportados en modo de absorbancia, con el software VISION 3.50 service pack 6.

2.9 Estudio electroforético de diferentes matrices lácteas

Para la realización de las electroforesis de gel a base de poliacrilamida (SDS – PAGE), se empleó un equipocompleto de Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Las muestras fueron analizadas según el protocolorecuperado de http://mach7.bluehill.com/proteinc/tutorial/sdspage.html

La electroforesis se llevó a cabo para una concentración de 12% de acrilamida para el gel de corrido y 4% para elgel de almacenamiento. Las bandas individuales de las diferentes proteínas fueron observadas a través de lasmismas condiciones para todas las mezclas, diluyendo la muestra en agua desionizada, en una relación 1:6, envolumen total, para mayor definición sobre el gel. A su vez, las muestras diluidas se mezclaron con el buffer demuestra, en una relación 1:4 (buffer-muestra) y fueron sembradas, junto al marcador de pesos moleculares,cuyo rango de pesos se encuentra entre 6 y 200 kDa.

Tras sembrar un volumen de 12 μL en cada pozo, se corrió la prueba a 110 V, por 2 horas. Posteriormente, setiñeron los geles con azul de Comassieal 0.2% y se decoloraron tres veces, a partir de una solución de metanol,ácido acético y agua desionizada.

3. Resultados y discusión

3.1 Prueba de solubilidad de la proteína de soya

La Figura 1 muestra la variación del tamaño de partícula, en cuanto los diámetros promedio, D[3,2] y D[4,3]. Enambos casos, los valores tienden a disminuir y éstos alcanzan valores cercanos a 0 μm a partir de los 30 minutos,lo cual demuestra que la proteína se ha hidratado y disuelto en su gran mayoría para dicho momento.

En cuanto al contenido de sólidos totales, el comportamiento exhibe un aumento con el tiempo, demostrandoque la mezcla contiene una mayor cantidad de proteína disuelta, la cual es la que queda tras la evaporación del

http://mach7.bluehill.com/proteinc/tutorial/sdspage.html

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agua. Cabe resaltar que la variación en los porcentajes de sólidos totales no presenta una gran variación,teniendo un rango de valores entre 4 y 5%.

Figura 1.Resultados de tamaño de partícula (a) y sólidos totales (b) en prueba de solubilidad de proteína de soya

3.2 Seguimiento del pH

En primer lugar, se realizaron las mediciones de pH para las diferentes concentraciones, para cada tiempo,cuyos resultados se muestran en Figura 2.

Figura 2. Comportamiento del pH de las muestras a cada tiempo

En la Figura 2. se observa que el pH tiende a disminuir conforme el tiempo aumenta, para todas lasconcentraciones. Sin embargo, al revisar las barras de error, se evidencia que la mayoría de éstas se alcanzan asuperponer, con lo cual es posible afirmar que la concentración no tiene un efecto significativo en la variacióndel pH, a excepción de la concentración 0% Leche bovina, que se aleja de las demás concentraciones con elmayor pH inicial. En consecuencia, la soya presenta la fermentación más lenta, si se comparan los valoresobtenidos para todas las muestras tras 7 horas.

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Tiempo (h)

100% Alpina

80% Alpina

50% Alpina

20% Alpina

0% Alpina

4,200%

4,400%

4,600%

4,800%

5,000%

5,200%

0 20 40 60

Porc

enta

je d

e ST

Tiempo (min)

(b)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 15 30 45 60

Tam

año

de p

artíc

ula

(um

)

Tiempo (min)

D[3,2]

D[4,3]

(a)

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Este comportamiento negativo responde a la actividad bacteriana, la cual a su vez se desarrolla de acuerdo a lacurva de crecimiento de microorganismos. De esta forma, entre las primeras 2-3 horas se evidencia unadisminución lenta del pH, correspondiente a una fase de adaptación por parte de las bacterias. A partir de latercera hora, las bacterias empiezan a crecer exponencialmente, con lo que la cantidad de ácido láctico aumentay, de esta forma, los valores de pH disminuyen rápidamente.

3.3Potencial Z de las diferentes leches

La prueba del potencial Z tiene como finalidad estudiar la estabilidad de la muestra a estudiar, en cuanto a larepulsión de las partículas presentes en la mezcla, teniendo en cuenta que a mayor valor absoluto de potencial,la estabilidad será mayor. Para el caso de las proteínas, el pH en el cual el potencial Z y en consecuencia la carganeta de las proteínas es igual a cero, se denomina punto isoeléctrico. Es en este punto donde se presenta lamayor agregación y decantación de las proteínas. (Zapata, 2011)

Figura 3. Variación del potencial Z para (a) Leche de soya (b) Leche bovina y del Tamaño de partícula para (c) Leche de soya(d) Leche bovina a diferentes pHs

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

4 5 6 7

Pote

ncia

l Z (m

V)

pH

(a)

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

4 5 6 7

Pote

ncia

l Z (m

V)

pH

(b)

0

5

10

1 10 100 1000

Resu

ltado

s %

Tamaño de partícula (um)

(c)

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100

Resu

ltado

s %


(d)

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Al analizar la leche de soya a diferentes pHs (Figura 3 (a)), se observa, en primer lugar, que el potencial Z es cero(punto isoeléctrico, pI) a un pH aproximadamente de 4.8, según la regresión. Es decir, que la mayor agregación yen consecuencia, los mayores tamaños de partícula se deben situar alrededor de este valor, lo cual se confirmaen la distribución de tamaño de partícula, donde los mayores tamaños se ubican en un pH entre 4.5 y 5 (Figura 3(c)). Este valor es similar con lo reportado en la literatura para las proteínas más importantes de la soya(Glicinina: pI=4.64; β-Conglicinina: pI=4.9) (Amigo, 2007). Adicionalmente, es importante señalar que la muestracon mayor estabilidad es la de pH=7, ya que presenta un valor de potencial cercano a -20 mV. Lo anterior podríacontribuir a la presencia y formación de agregados fuertes en las muestras de la hora 0 para las mezclas consoya, tal como se verá a continuación.

Por otro lado, la leche bovina presenta un punto isoeléctrico alrededor de 4.4 (Figura 3 (b)), el cual se encuentraentre los mayores tamaños de partícula, al observar la distribución correspondiente (Figura 3 (d)). Este valor seaproxima a los puntos isoeléctricos que se encuentran en la literatura, siendo 4.6, 4.2-4.5 y 5.2, para lascaseínas, α-Lactoalbúminas y β-Lactoglobulinas, respectivamente (Alais, 2003). En cuanto a la estabilidad, lamuestra con un pH=7 se aproxima levemente a la estabilidad, sin embargo, no alcanza a llegar a valores dondeésta sería mayor, con lo cual es posible afirmar que la leche de soya es más estable que la leche bovina.

3.4 Distribución tamaño de partícula

En relación con el estudio del tamaño de partícula (Figura 4), se evidencia que, para los cinco niveles deconcentración, el tamaño de partícula aumenta respecto al tiempo de fermentación, lo que obedece a laformación de agregados a causa de la disminución del pH hasta valores cercanos al punto isoeléctrico de lasproteínas tanto de la leche bovina, como de la soya, cercanos al pH 4.6, tal como se mencionóanteriormente.Sin embargo, es importante notar que a medida que aumenta la cantidad de soya en la mezcla,para el tiempo de 0 horas se presentan poblaciones de tamaño de partícula tanto menores (0.1 – 2 μm), comomayores (10 – 100 μm). Lo anterior responde a agregados preliminares a la fermentación, presentes en lamezcla con tamaños de partícula semejantes a los correspondientes a la proteína de la soya sólida. Éstapresenta una distribución similar a las mezclas de 3 horas en adelante, donde las distribuciones comprenden losmayores tamaños de partícula ( D [3,2]>10 μm; D[4,3]> 50 μm). Teniendo en cuenta que la leche de soya sesomete a un proceso deautoclave a 121°C, se lleva a agitación y sonicación, dichos procedimientos lograndestruir una proporción de tales agregados, dando lugar a la presencia de una población de tamaños menores.En estudios preliminares, se afirma que la desnaturalización de las proteínas por calor es usualmente unrequisito para la formación de geles de soya (Renkema, 2003). En ese sentido, es posible afirmar que eltratamiento térmico favorece la presencia de la población de agregados con tamaños de partícula grande, loscuales al disminuir la temperatura se mantienen.

Al comparar los valores de pH, así como los tamaños de partícula en las muestras de 7 horas (Figura 5), esposible observar que no se define una tendencia clara para ninguno de los dos casos. No obstante, si se tienenen cuenta los diámetros promedio tanto de la muestra 100% leche bovina y 0% leche bovina, es claro que elyogur a partir de leche bovina tiene un tamaño de partícula de aproximadamente la mitad que el yogur a basede 100% leche de soya. Lo anterior está estrechamente relacionado con el pH final (Figura 2.), que correspondepara la muestra 100% leche de soya a 4.72, valor que se encuentra muy cercano al punto isoeléctrico de las

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proteínas de la soya, mientras el pH final para la muestra de 100% leche bovina ha sobrepasado el pHisoeléctrico y la agregación es ciertamente menor, a medida que se aleja de dicho punto.

Figura 4. Seguimiento del tamaño de partícula (a) 100% (b) 80% (c)50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100

Resu

ltado

s %


(a)

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100

Resu

ltado

s %


(b)

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100

Resu

ltado

s %


(c)

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100

Resu

ltado

s %


(d)

0

5

10

15

20

0,1 1 10 100 1000

Resu

ltado

s %


(e)

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Figura 5.Tamaño de partícula para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación

De esta forma, si bien las muestras de los extremos presentan un comportamiento acorde con la distribución detamaño de partícula y los valores finales de pH, el comportamiento de las concentraciones intermedias nopuede ser explicado a partir de estas medidas, por lo cual se recurre a una explicación desde el punto de vistamorfológico, donde las estructuras de ambos tipos de proteínas juegan un papel importante y podrían contribuira una organización aleatoria de las matrices, respecto a sus estructuras, para las muestras con mezcla de ambasleches.

3.5Microscopía electrónica de barrido y óptica

SEM

El estudio morfológico de las muestras para cada concentración demuestra la formación de agregados enrelación con el tiempo de fermentación, tal como se observa en la Figura 6. De acuerdo a lo anterior, es posibleconfirmar los resultados presentados en el Mastersizer para cada uno de los niveles de concentración.

Ahora bien, si se observa formación de agregados no sólo a lo largo del tiempo de fermentación para cadaconcentración, sino a lo largo de las concentraciones para las 7 horas, se encuentra una gran diferenciamorfológica de agregados. Para las muestras donde prevalece la leche bovina, las estructuras se tornan másgranulosas y porosas, mientras que las muestras con mayor cantidad de soya presentan una estructura similar auna red o malla, con una apariencia más tupida. Esta estructura parece contar con una mayor resistencia ante laruptura, siendo plausible en el análisis del Mastersizer, donde la agitación pretende romper la macroestructurade leche de soya y las partículas que se analizan corresponden a porciones de la malla fuerte que se haformado.

La morfología de las matrices estudiadas está estrechamente vinculada, en el caso de la leche bovina, con lapresencia del aminoácido prolina, lo cual implica que las caseínas carezcan de estructuras secundarias yterciarias estables (Holt, 1993).

0

10

20

30

40

50

60

70

100% 80% 50% 20% 0%

Diám

etro

(um

)

Porcentaje Leche bovina

D [3,2]

D [4,3]

15

Figura 6.Imágenes de microscopio electrónico de barrido con aumento 2000x. Ancho de imagen: 131 μm.(a) 100% (b) 80% (c)50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina

Lo anterior podría explicar que la estructura de dicha proteína presente una conformación más abierta. Encuanto a la leche de soya, es importante mencionar que en las proteínas presentes existen enlaces covalentes(puentes disulfuro) responsables, en mayor medida, de la estabilidad, el ensamble y el fortalecimiento de losgeles formados (Renkema, 2003). A diferencia de las proteínas de la soya, en la caseína no abundan los enlacesde disulfuro, por lo cual, la estructura es más frágil. Adicionalmente, se ha encontrado que la curvatura de laestructura tiene gran incidencia en el rompimiento de esta última (Renkema, 2001). Siendo ambas matricesagregadas, para el caso de la soya, ésta presenta una estructura más recta y plana, mientras la leche

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

15



(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

15



(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

16

bovinaresulta más curva. En ese orden de ideas, la estructura curva de la leche bovina se romperá porplegamiento, mientras la plana lo hará por estiramiento, demandando una mayor cantidad de energía y, enconsecuencia, la estructura será más resistente. Cabe anotar que dichas afirmaciones se presentan comoposibles razonamientos, a partir de estudios semejantes aplicados a ambos tipos de leches.

Microscopio Óptico

Siguiendo con el análisis morfológico llevado a cabo con el microscopio electrónico de barrido,se muestran losresultados obtenidos con el microscopio óptico para las diferentes mezclas.

Figura 7.Imágenes de microscopio óptico paramezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina. Aumento de1000x. Barra de 10µm.

Los resultados obtenidos, muestran la agregación para cada una de las mezclas. En tiempo igual a 0 se observanlos cultivos de bacterias y una evolución en el tiempo. Para un tiempo de fermentación igual a 7 horas, seevidencia una diferencia significativa entre los agregados formados por la muestra de 100% y 0% leche bovina.

(b)

(a)

(d)

(e)

(c)

17

3.6 Caracterización reológica

Por medio de una prueba de flujo estacionaria (Viscosidad vs. Velocidad de corte) para las diferentes mezclas endistintos tiempos de fermentación, fue posible observar una evolución en la viscosidad del fluido: viscosidadesbajas para horas iniciales, y valores de viscosidad altos para horas finales de fermentación, evidenciando así laagregaciónde proteínas (Figura 8). Se observa una agregación a partir de la dos horas para 100% de leche bovina,mientras que para 0% la agregación se presenta desde las 5 horas.

Además, existe una diferencia significativa en la existencia de tixotropía en la muestra de 100% leche bovina y0% leche bovina a las 7 horas de fermentación. La primera presenta tixotropía, mientras que la segunda no. Estevalor fue hallado por medio del área entre las curvas de subida y de bajada de un reograma de Esfuerzo vsVelocidad de corte, los resultados se muestran en la Figura 9. Dicho comportamiento se debe a que la estructuraformada en la muestra de 0% es tan fuerte que no puede ser destruida por la velocidad de cortea la que fuesometida. Una posible explicación, se basa en que se tiene una estructura más fuerte por la gran cantidad deenlaces disulfuro existentes en la leche de soya, responsables del fortalecimiento de los geles formadosy ademásde la existencia de una curvatura tal, que su deformación se presenta por estiramiento.

Por otro lado, al comparar los valores de la viscosidad para la fermentación de todas las mezclas en un tiempo de7 horas, se observa un comportamiento creciente a medida que aumenta la cantidad de soya en dichasmezclas(Figura10); esta tendenciaestá fuertemente ligada a la relación del peso molecular de las proteínas de unpolímero con el incremento de su viscosidad y de la resistencia a la ruptura de agregados. De esta forma, al tenerla proteína de soya pesos moleculares mayores a los de la proteína de la leche bovina (caseínasmayoritariamente), la viscosidad será mayor para mezclas con más soya.

18

Figura 8. Curvas de flujo: Viscosidad vs. Velocidad de corte para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c)50% (d) 20% (e) 0% Lechebovina a diferentes horas de fermentación.

0,001

0,01

0,1

1

1 10 100

Visc

osid

ad (P

a*S)

Velocidad de corte (1/s)

0,001

0,01

0,1

1

1 10 100

Visc

osid

ad (P

a*S)


0,001

0,01

0,1

1

10

1

Visc

osid

ad (P

a*S)

18


100 1000Velocidad de corte (1/s)

(a)

0,001

0,01

0,1

1

1 10 100

Visc

osid

ad (P

a*S)



(c)

0,001

0,01

0,1

1

10

1 10 100

Visc

osid

ad (P

a*S)


1 10 100 1000Velocidad de corte (1/s)

(e)

18



(b)


(d)

19

Figura9. Viscosidad para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación

Figura 10. Tixotropía de las mezclas de leche bovina a las 7 horas de fermentación

3.7 Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo

La espectroscopia infrarroja fue empleada para todas las mezclas a diferentes tiempos de fermentación en unrango de 1100 a 2500 nm. Las bandas de absorbancia observadas se presentaron a una longitud de onda de 1150nm correspondiente al enlace O-H, asociado con agua, 1500 y 1800 nm, correspondientes al enlace C-H, asociadocon aminoácidos.

Los resultados permiten observaruna evolución en el tiempo para cada mezcla, por lo que se evidencia elfenómeno de agregación en todas éstas (Figura 11). Al igual que lo reportado mediante el análisis reológico, seobserva una agregación a partir de las dos horas para la muestra de 100% de leche bovina, mientras que para lade 0%, se presenta desde las 5 horas.

En la Figura 11 (f), se muestra la comparación para un tiempo de fermentación de 7 horas entre las diferentesmezclas, se observa el mismo comportamiento y un solapamiento entre éstas, indicando que no hay unadiferencia significativa y que las estructuras formadas en las mezclas no pueden ser explicadas por formación orompimiento de enlaces C-H y O-H presentes, razón por la cual se le daría mayor importancia a enlaces débiles,que no se evidencian a partir de este tipo de técnicas.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

100% 80% 50% 20% 0%

Visc

osid

ad (P

a*s)

% Leche BovinaVelocidad de corte: 1 s^(-1) Velocidad de corte: 500 s^(-1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

100% 80% 50% 20% 0%

Txot

ropí

a (P

a*s-

1)

% Leche Bovina

20

Figura 11.NIR de mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina, a diferentes horas de fermentación y (f)detodas las mezclas a las 7 horas de fermentación

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia

Longitud de onda (nm)

0 hrs2 hrs3 hrs5 hrs7 hrs(a)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia


0 hrs2 hrs3 hrs5 hrs7 hrs(b)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia


0 hrs2 hrs3 hrs5 hrs7 hrs(c)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia


0 hrs2 hrs3 hrs5 hrs7 hrs

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia


0 hrs2 hrs3 hrs5 hrs7 hrs(e)

11,11,21,31,41,51,61,71,81,9

2

1000 1500 2000 2500

Abso

rban

cia


100% leche bovina80% leche bovina50% leche bovina20% leche bovina0% leche bovina(f)

(c)

(d)

21

3.8 Estudio electroforético

Los resultados para la electroforesis permitieron identificar las proteínas existentes en cada una de las mezclas,sin embargo, no existen diferencias a través del tiempo para cada una de éstas, lo que indica que las proteínas semantienen a lo largo de la fermentación. Además de lo anterior, se pudo corroborar que las proteínas presentesen la soya tienen un peso molecular mayor a las presentes en la leche bovina. Lasproteínas de soya másabundantes son las globulinas, glicinina (11S) y conglicinina (7S). Por otro lado, la proteína que abunda en laleche bovina es la caseína (más de 80%).

Figura 12. Gel de electroforesis para mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina

(a) (b)

(c) (d)

(e)

22

Para estudios posteriores se sugiere realizar este tipo de análisis para muestras centrifugadas, con lo cual sepodría evidenciar el tipo de proteínas que abundan en cada una de las fases separadas, obteniendo un análisismás profundo de la presencia de proteínas en agregados solubles y no solubles.

4. Conclusiones

El presente estudio demostró que existe un efecto significativo de la proteína de soya en la caracterizaciónmacroscópica, microscópica y molecular de las mezclas de leche bovina y leche de soya. Lo anterior responde alas diferentes formas de agregación de cada una de las matrices, la cual se presenta por las fermentaciones quellevan las muestras hasta pHs cercanos a los puntos isoeléctricos de las proteínas.

La agregación de las proteínas, por su parte, influye en la morfología final de las muestras, presentando gránulosy mallas, en la lecha bovina y de soya, respectivamente, lo cual a su vez tiene un efecto significativo en lareología y el tamaño de partícula final de las muestras. En consecuencia, las mezclas con mayor cantidad de soyaevidencian un comportamiento más viscoso mayor, como respuesta a una estructura más fuerte.

La espectroscopia infrarroja revela el mismo comportamiento y los mismos picos de absorción para todas lasmuestras al cabo de las 7 horas de fermentación, por lo cual los enlaces C-H y O-H presentes en éstas, no puedenser usados para explicar las estructuras de las proteínas.

Por medio de la electroforesis, fue posible identificar las proteínas existentes en cada mezcla, sin embargo, no seobserva un cambio de agregación en el tiempo.

En este sentido, el presente trabajo sugiere que la agregación individual de las proteínas influye, en gran medida,sobre la agregación de las muestras de ambas leches. No obstante, para trabajos futuros se propone realizar unanálisis molecular más profundo de las mezclas, con el fin de evaluar la existencia de interacciones entre ambasproteínas y, así entender más detalladamente si éstas tienen un papel importante sobre la estructura final.

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ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS DE LECHE Y SOYA Y