Slide 1

SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK TIRHAU SINJE (Pycnoporus sanguineus) TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Shigella dysentriaeOlehSELVI SULISTIA NINGSIHH1A010041

Pembimbing UtamaDrs. Welly Darwis, M.S

Pembimbing PendampingDr. Morina Adfa, S.Si, M.Si

Penguji UtamaDr. Suryo Bantolo, S.Psi, M.Sc, Sp.S

Penguji PendampingDr. Maria Eka. PY

1Latar Belakang

IndonesiaObat tradisionalTirhau sinjeMasyarakat Desa Tanjung Ganti I , Kaur Data empirisPengujian Secara IlmiahAman dan efektif dalam praktek kedokteran dan pelayanan kesehatan formalDisentri2Apakah kandungan kimia yang terdapat dalam P. sanguienus ?Apakah ekstrak etanol P. sanguienus mempunyai aktivitas sebagai antibakteri terhadap E. coli dan S. dysenteriae?Berapakah konsentrasi yang efektif dari ekstrak P. sanguienus dalam menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan bakteri S. dysenteriae ?

Rumusan Masalah3H0: Tirhau sinje (P. sanguienus) tidak mempunyai kandungan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan S. dysenteriae.H1 : Tirhau sinje (P. sanguienus) mempunyai kandungan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan S. dysenteriae.H2: Tirhau sinje (P. sanguienus) mempunyai efek antibakteri yang sama dengan seftriakson terhadap bakteri E. coli dan kotrimoksazol terhadap bakteri S. dysenteriae.

Hipotesis4Menentukan kandungan kimia yang terdapat dalam P. sanguienusMenentukan aktivitas antibakteri ekstrak etanol P. sanguienus terhadap bakteri E. coli dan S. dysenteriae Menentukan konsentrasi yang efektif dari ekstrak P. sanguienus dalam menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dan S. dysenteriae

Tujuan Penelitian5Bagi peneliti

Bagi instansi terkait

Efektivitas ekstrak tirhau sinjeDaya hambat pertumbuhan E.coli dan S. dysentriaeterhadapEfektivitas ekstrak tirhau sinjeterhadapAcuan/ laporanManfaat PenelitianDaya hambat pertumbuhan E.coli dan S. dysentriae6Bagi Program Studi Pendidikan Dokter

Bagi Masyarakat

InformasiEfek yang ditimbulkan ekstrak thirau sinjeterhadapInformasi dan pengetahuanTanaman obat berkhasiat dan berguna dalam penatalaksanaan infeksi E.coli dan S. dysentriaeLanjutanDaya hambat pertumbuhan E.coli dan S. dysentriae7Metode Penelitian8

Waktu dan Tempat

Pada bulan Oktober Desember 2013

Di laboratorium Mikrobiologi FMIPA dan Laboratorium Mikrobiologi FKIK Universitas Bengkulu

9Alat dan Bahan

Alat :Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1)handscoon; 2) gelas ukur; 3) tabung reaksi; 4) rak tabung reaksi; 5) Erlenmeyer; 6) labu ukur; 7) corong kaca; 8) pipet tetes; 9) pinset; 10) kawat ose; 11) autoklaf; 12) shaker 13) rotary evaporator; 14) penangas air; 16) spuit 5 ml; 17) batang pengaduk; 18) refrigenerator; 19) aluminium foil; 20) kertas saring whatman 3m; 21) lampu spiritus; 22) pinset besar; 23) neraca digital; 24) penggaris milimeter besi; 25) kertas label; 26) plastik; 27) pisau; 28) kertas buram; 29) karet; 30) cawan petri; 31) lampu spritus; 32) penjepit tabung reaksi; 33) kain flanel

Bahan :thirau sinje yang diperoleh dari Desa Tanjung Ganti I Kecamatan Kelam Tengah Kabupaten Kaur Provinsi Bengkulu, etanol 96%, metanol 96%, air suling, kloroform, NH4OH, pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendroff, serbuk Mg, asam klorida, eter, etil asetat, pereaksi NaOH, asetat anhidrat, H2SO4, pereaksi besi (III) klorida, isolat S.dysentriae dan E.coli, nutrien broth (NB), nutrien agar (NA), (Salmonella Shigella Agar) SSA Tetrasiklin dan Kloramfenicol.

10Alat- alat yang digunakan

11Bahan- bahan yang digunakan

12Desain PenelitianEksperimenUji FitokimiaUji Anti bakteriMetode Difusi Cakram13Teknik Penyediaan BahanTirhau sinje di dapatkan di Desa Tanjung Ganti I, Kec. Kelam Tengah, KaurPelarut yang digunakan etanol 96%Bakteri E. coli dan S. dysentriae didapatkan dari LABKESDA 14Cara KerjaPensterilan peralatan

Suhu 121oC selama 15-20 menit

15Proses Ekstraksi Tirhau SinjeDi potong kecil-kecil

16SKRINING FITOKIMIA17Pemeriksaan Steroid/triterpenoid

15 tetes ekstrak sampel1 tetes asam sulfat pekat3 tetes anhidra asetatwarna merah, merah jambu atau ungu(triterpenoid), warna biru (steroid)

1810 ml akuadesditambahkan dengan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida.biru kehitaman atau hitam kehijauan (+) taninhasilPemeriksaan Tanin 21 gram ekstrak Diambil 2 ml 19Pemeriksaan Saponin30,5 gram ekstrak 10 menit terbentuk busa dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N saponin positif

10 ml air panas, didinginkan kemudian kocok selama 10 detik20Pemeriksaan Flavonoid43 ml ekstrak sampelLogam MgWarna merah tua sampai ungu (+) flavonoid0,5 mL HCl pekat21Pemeriksaan Alkaloid 53 ml ekstrak sampel5 ml HCL 2 MPereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner EndapanPutih (meyer), cokelat (wagner), dan merah jingga (Dragendorff).0,5 g NaCl

22

Pembuatan Media Tumbuh BakteriPembuatan media Nutrient Broth

4 gram serbuk NBDilarutkan dengan akuades sampai volume 500 mlDipanaskan dengan hot plate dan kemudian sterilisasi selama 15-20 menitGalur murni bakteri siap di masukan ke media23Pembuatan Larutan Seftriakson dan KotrimoksazolMasing masing seftriakson ditimbang 30 mg dan kotrimoksazol ditimbang 25 mgTambahkan aquades 100 mlKadar konsentrasi seftriakson 0,3mg/ml dan kotrimoksazol 0,25 mg/mlPipet 1 ml10 ml aquadesSeftriakson 30 g/ml dan Kotrimoksazol 25 g/ml24Pembuatan Suspensi E. coli dan S. dysenteriae serta Perhitungan Optical Density (OD)Ambil masing masing 2 ose koloni E. coli dan S. dysenteriae yg telah diremajakan pd media miringDimasukkan ke dalam masing masing 100 ml NBDi shaker 100 rpm selama 24 jamDilakukan pengukuran OD, untuk E. coli dgn spektrofotometer ( = 600nm), sedangkan S. dysenteriae ( = 625nm), Suspensi E. coli dan S. dysenteriae tsb diambil masukkan ke kuvet spektrofotometerNilai absorban yg muncul nilai OD suspensi Nilai OD suspensi disesuaikan dgn nilai OD standar E. coli = 0,6 dan S. dysenteriae = 0,125

Pembuatan Suspensi S. typhi dan Perhitungan Optical Density (OD)26Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)Konsentrasi larutan ekstrak tirhau sinje dibuat sebanyak 10 konsetrasi dimulai dari :10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% .

Kemudian dilihat daya hambatnya terhadap bakteri uji. Uji MIC ini dicari konsentrasi dengan daya hambat minimum dengan kategori kuat, namun jika tidak ada daya hambat dengan kategori kuat, maka diambil 70-80 % dari daya hambat terbaik.

27Proses Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)Metode double layer layer 1 NA padat, layer 2 NA padatNA padat 4 gr NA dilarutkan akuades sampai volume 200 ml tuang ke cawan petri biarkan memadat NA padat 2 gr NA dillarutkan akuades sampai volume 200 ml + 8 ml suspensi E. coli dgn OD standar biarkan memadatLetakkan cakram 3 buah pada 1 petriTeteskan ekstrak diatas cakram + sebanyak 7,5 lInkubasi selama 1x24 jamAmati zona hambat yang terbentukbesar zona hambat kategori lemah sedang dan kuatCari daya hambat terbaik hasilnya 70-80%28Proses Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)Metode double layer layer 1 SSA padat, layer 2 SSA padatSSA padat 12,6 gr SSA dilarutkan akuades sampai volume 200 ml tuang ke cawan petri biarkan memadat SSA padat 6,3 gr SSA dillarutkan akuades sampai volume 200 ml + 8 ml suspensi S. dysenteriae dgn OD standar biarkan memadatLetakkan cakram 3 buah pada 1 petriTeteskan ekstrak diatas cakram + sebanyak 7,5 lInkubasi selama 1x24 jamAmati zona hambat yang terbentukbesar zona hambat kategori lemah sedang dan kuatCari daya hambat terbaik hasilnya 70-80%29Uji Efektivitas AntibakteriSetelah mendapatkan nilai inhibitor concentration, maka dilakukan uji antibakteri. - Untuk uji antibakteri terdiri dari 5 perlakuan dan K+ dengan 6 kali pengulangan. terdapat 5 konsentrasi :K2, K3 < K4 > K5, K6 dan K1 = 0%Ket : K1 : kontrol (-)K4 : daya hambat terbaik hasilnya 70 80 %.Penurunan ke kiri dan kenaikan ke kanan sebesar 7,5 %

30Proses Uji Efektivitas Antibakteri Metode double layer layer 1 NA padat, layer 2 SSA padatNA padat 2,5 gr NA dilarutkan akuades sampai volume 125 ml tuang ke cawan petri biarkan memadat NA padat 1,25 gr NA dillarutkan akuades sampai volume 125 ml + 5ml suspensi S. dysenteriae dgn OD standar biarkan memadatLetakkan cakram 3 buah pada 1 petriTeteskan ekstrak diatas cakram + sebanyak 7,5lInkubasi selama 1x24 jamAmati dan ukur zona hambat yang terbentuk31Proses Uji Efektivitas Antibakteri Metode double layer layer 1 SSA padat, layer 2 SSA padatSSA padat 7,88 gr SSA dilarutkan akuades sampai volume 125 ml tuang ke cawan petri biarkan memadat SSA padat 3,94 gr SSA dillarutkan akuades sampai volume 125 ml + 5 ml suspensi S. dysenteriae dgn OD standar biarkan memadatLetakkan cakram 3 buah pada 1 petriTeteskan ekstrak diatas cakram + sebanyak 7,5lInkubasi selama 1x24 jamAmati dan ukur zona hambat yang terbentuk32Proses Uji Efektivitas Antibakteri

Zona hambatKertas CakramMedia tumbuh bakteri

33

Penghitungan Zona HambatNoDaerah hambatanKetentuan1> 20 mmSangat Kuat210 20 mmKuat3

5 10 mmSedang4< 5 mmLemahSumber : Stout T, dan Davis W. 1971. Disc Plate Methods of Microbiological Antibiotic Assay. Microbiology. 22 : 659-66534

Identifikasi VariabelVariabel bebas pada penelitian ini adalah penambahan berbagai variasi konsentrasi ekstrak-ekstrak tersebut pada inokulasi bakteri E.coli di nutrient agar dan S. dysentriae di SSA.

Variabel terikat pada penelitian ini adalah zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram pada perlakuan variasi konsentrasi ekstrak tersebut.35Analisis DataUntuk uji fitokimia dianalisis dengan metode deskriptif kualitatif.Untuk perlakuan uji antibakteri tanpa kombinasi digunakan metode ANOVA one way menggunakan rancangan acak lengkap.Kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan36HASIL DAN PEMBAHASAN37Hasil Ekstrak Tirhau SinjeDikering anginkanDidapatkan berat kering = 0,9 kg12 gramMaserasi membutuhkan 8 liter etanol 96% dilakukan selama 4 hariSebanyak 4 kgFiltrat hasil rotary dan water bath

38NoUji FitokimiaWarnaHasil1.Uji Alkaloid :DragendrofWagnerMeyer(Tidak ada endapan)Kuning kecoklatanCoklat mudaCoklat muda---2.FlavonoidMerah tua+3.TriterpenoidMerah keunguan+4.SteroidMerah keunguan-5.SaponinCoklat muda tidak berbusa-6.

TaninTidak ada perubahan warna menjadi hitam kehijauan-Hasil Uji Fitokimia39Hasil Uji FitokimiaHasil Uji Alkaloid (-)Hasil Uji Flavonoid (+)Hasil Uji Saponin (-)Hasil Uji Tanin (-)Hasil Uji Triterpenoid (+) dan Steroid (-)

40Setelah dilakukan uji MIC dengan mengukur diameter zona hambat di sekeliling kertas cakram pada media agar diperoleh 70-80% terbaik zona hambat bakteri Shigella dysenteriae yaitu konsentrasi 50% dengan diameter zona hambat (3 cm) dan bakteri Escherichia coli pada 60% dengan diameter zona hambat (1,887 cm) Uji Minimum Inhibitory Concentration41Hasil Optical Density (OD)BakteriOD (Optical Density)OD standarShigella dysenteriaeEscherichia coli0,50,60,10,642Hasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap E. coli Hasil Uji MIC yaitu 60% (K4) sebagai titik tengah dan dibuat variasi konsentrasi lebih besar dan lebih kecil dari K4 ( K4 ) dengan jarak 7,5%. Maka 5 konsentrasi baru yang digunakan untuk uji efektivitas adalah 45% (K2), 52,5% (K3), 60% (K4), 67,5% (K5), dan 75% (K6)PerlakuanRerata Zona Hambat (mm)Ketentuan (Davis Stout, 1971)K2 (45%)K3 (52,5%)K4 (60%)K5 (67,5%)K6 (75%)K1 (0%)K+ (antibiotik Seftriakson 30l/ml)0,77671,50002,94673,05674,94330,000013,7233LemahLemahLemahLemahLemah-Kuat43Hasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap E. coli 44Konsentrasi 45%Konsentrasi 52,5%Konsentrasi 60%Konsentrasi 67,5%Konsentrasi 75%Kontrol (+) SeftriaksonHasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap E. coli

45Analisis Data Uji Efektvitas Tirhau Sinje Terhadap Bakteri E. coliTabel Hasil Uji One Way Anova ekstrak tirhau sinje terhadap E. coliKeterangan :

* = Berbeda sangat nyata

H0 = Pemberian variasi konsentrasi tidak berbeda nyata antar perlakuan terhadap pertumbuhan bakteri E. coliH1 = Pemberian variasi konsentrasi berbeda sangat nyata antar perlakuan terhadap pertumbuhan bakteri E. coliSKJKDBKTF HitungF Tabel0,050,01Perlakuan675,7515135,15074,973*2,533,70Galat54,079301,803Total729,8313546Analisis Data Uji Efektvitas Tirhau Sinje Terhadap Bakteri E. coliTabel Hasil Uji Duncan ekstrak tirhau sinje terhadap E. coliSecara statistik konsentrasi tirhau sinje yang efektif dalam menghambat pertumbuhan E. coli adalah pada konsentrasi 75%.

HasilDuncanPerlakuanNSubset for alpha = 0.05Notasiabcd45%6.7767a52.5%61.50001.5000ab60%62.9467b67.5%63.0567b75%64.9433cK+613.7233dSig..358.0661.0001.000Means for groups in homogeneous subsets are displayed.c47Hasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap S.dysenteriaeHasil Uji MIC yaitu 50% (K4) sebagai titik tengah dan dibuat variasi konsentrasi lebih besar dan lebih kecil dari K4 ( K4 ) dengan jarak 7,5%. Maka 5 konsentrasi baru yang digunakan untuk uji efektivitas adalah 35% (K2), 42,5% (K3), 50% (K4), 67,5% (K5), dan 65% (K6)PerlakuanRerata Zona Hambat (mm)Ketentuan (Davis Stout, 1971)K2 (35%)K3 (42,5%)K4 (50%)K5 (57,5%)K6 (65%)K1 (0%)K+ (antibiotic kotrimoksazol 25l/ml)2,50005,22178,111710,165010,77830,000014,5550LemahSedangSedangKuatKuat-Kuat48Hasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap S. dysenteriae49Konsentrasi 35%Konsentrasi 42,5%Konsentrasi 50%Konsentrasi 57,5%Konsentrasi 65%Kontrol (+) KotrimoksazolHasil uji Efektivitas Antibakteri Tirhau sinje terhadap S. dysenteriae

50Analisis Data Uji Efektvitas Tirhau Sinje Terhadap Bakteri S. dysenteriaeTabel Hasil Uji One Way Anova ekstrak tirhau sinje terhadap S. dysenteriaeKeterangan :

* = Berbeda sangat nyata

H0 = Pemberian variasi konsentrasi tidak berbeda nyata antar perlakuan terhadap pertumbuhan bakteri S. dysenteriaeH1 = Pemberian variasi konsentrasi berbeda sangat nyata antar perlakuan terhadap pertumbuhan bakteri S. dysenteriaeSKJKDBKTF HitungF Tabel0,050,01Perlakuan549,0365109,80753,609*2,533,70Galat61,449302,048Total610,4853551Analisis Data Uji Efektvitas Tirhau Sinje Terhadap Bakteri S. dysenteriaeTabel Hasil Uji Duncan sekstrak tirhau sinje terhadap S. dysenteriaeSecara statistik konsentrasi tirhau sinje yang efektif dalam menghambat pertumbuhan S. dysenteriae adalah pada konsentrasi 57,5%.

HasilDuncanPerlakuanNSubset for alpha = 0.05Notasiabcde35%62.5000a42.5%65.2217b50%68.1117c57.5%610.165065%610.7783dK+614.5550eSig.1.0001.0001.000.4641.000d52Hasil pengujian fitokimia didapatkan bahwa tirhau sinje hanya memiliki kandungan flavonoid dan triterpenoid. Hasil uji didapatkan aktivitas antibakteri ekstrak tirhau sinje terhadap bakteri E. coli dan S. dysenteriae yang dibuktikan dengan terbentuknya zona hambat. Berdasarkan uji efektivitas ekstrak tirhau sinje terhadap bakteri S. dysenteriae dan E. coli yang telah dilakukan bahwa konsentrasi zona hambat yang efektif dalam menghambat E. coli yaitu konsentrasi 75% dikarenakan konsentrasi 75% ini berbeda nyata dengan konsentrasi ekstrak yang lain dan memberikan zona hambat terbesar.

Kesimpulan dan Saran53Sambungan KesimpulanSedangkan konsentrasi zona hambat yang efektif dalam menghambat S. dysenteriae yaitu konsentrasi 57,5% dikarenakan konsentrasi 57,5% tidak ada perbedaan yang nyata dengan konsentrasi ekstrak 65% dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. dysenteriae dan memiliki zona hambat terbesar. Makin besar konsentrasi ekstrak, maka semakin besar pula daya hambat yang ditimbulkan, dari keseluruhan perlakuan terjadi peningkatan diameter daya hambat setelah konsentrasi ekstrak ditingkatkan.

Kesimpulan dan Saran54SaranPerlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang pengaruh lama penyimpanan ekstrak tirhau sinje (P. sanguineus).Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui bahan aktif apa yang paling berperan sebagai antimikroba pada ekstrak tirhau sinje (P. sanguineus) serta mekanisme kerja bahan aktif antimikroba tersebut. Perlu dilakukan pengujian lanjut secara in vivo untuk diketahui efek pada hewan coba dan uji klinik sebelum digunakan sebagai alternatif pengobatan di masyarakat.

Kesimpulan dan Saran55TERIMA KASIH56