SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO … mx-aa-42-1987 calidad del agua-determinacion del numero mas probable (nmp) de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y escherichia

SECRETARIA DE COMERCIO

Y

FOMENTO INDUSTRIAL

NORMA MEXICANA

NMX-AA-42-1987

CALIDAD DEL AGUA DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES

FECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA.

WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLE NUMBER (NMP) OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS (THERMAL TOLERANTS), AND Escherichia coli PRESUMPTIVE.

DIRECCION GENERAL DE NORMAS

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PREFACIO En la elaboración de la presente norma participaron las siguientes instituciones: SECRETARIA DE DESARROLLO URBANO Y ECOLOGIA Instituto SEDUE. SECRETARIA DE SALUD SECRETARIA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRAULICOS SECRETARIA DE MARINA. Dirección General de Oceanografía Naval. DEPARTAMENTO DEL DISTRITO FEDERAL Dirección General de Reordenación Urbana y Protección Ecológica. Laboratorio Central de Control. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. Facultad de Química. PETROLEOS MEXICANOS CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DEL HIERRO Y EL ACERO. ASOCIACION MEXICANA CONTRA LA CONTAMINACION DEL AGUA Y EL AMBIENTE CELANESE MEXICANA, S.A. MERCK MEXICO, S.A.

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CALIDAD DEL AGUA-DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA.

WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLE NUMBER (NMP) OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS (THERMAL TOLERANTS), AND

Escherichia coli PRESUMPTIVE. 0 INTRODUCCION La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud publica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en le intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal. 1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION Esta Norma Mexicana establece un método para la detección y enumeración en agua de organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva (E. coli) mediante el cultivo en un medio liquido en tubos múltiples y él cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra. Este método es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad apreciable de materia en suspención. La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación del grupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte de una secuencia continua. El grado de confirmación con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y parcialmente de las razones para realizar el examen. En la practica, la detección de E. coli presuntiva, como se define en el punto 3.3 de esta norma, da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal.

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2 REFERENCIAS Esta norma se competa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes: NMX-Z-1 Sistema Internacional De Unidades (SI) NMX-BB-14 Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidrio usados en laboratorios. 3 DEFINICIONES Para propósitos de esta Norma Mexicana, se aplican las siguientes definiciones: 3.1 Organismos coliformes.- Organismos capaces de crecimiento aeróbico ya sea 308 ± 1k (35 ± 1°C) ó 310 ± 1k (37 ± 1°C) en un medio de cultivo líquido lactosado con producción de aciso y gas dentro de un periodo de 48 h. 3.2 Organismos coliformes fecales (termotolerantes). Organismos coliformes como se describe en 3.1 que tienen las mismas propiedades fermentativas a 317 ± 0.5k (44 ± 0.5°C). 3.3 Escherichia coli presuntiva (E. coli).- Organismos coliformes termotolerantes como se describe en 3.2 que también producen Indol a partir de tripofano a 317k (44°C). 4 PRINCIPIO El método se basa en la inoculación de alicuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo liquido conteniendo lactosa. Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación ya sea a 308 o 310k (35 o 37°C). Cada uno de los que muestran turbidez con producción de gas se resiembra en un medio confirmativo más selectivo y, cuando se busca E. coli presuntiva, en un medio en el que se pueda demostrar la producción de indel. Se lleva acabo la incubación de estos medios confirmativos basta por 48 horas ya sea 308 ó 310k (35 o 37°C) para la detección de organismos coliformes y a 317k (44°C) para organismos termotolerantes y E. coli. Mediante tablas estadísticas se lleva acabo él calculo del numero más probable (NMP) de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli que pueda estar presente en 100 cm3 de muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos.

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5 APARATOS Y EQUIPO Aparte de los equipos que se suministran estériles, el material de vidrio y el resto del equipo deben esterilizarse. 5.1 Incubadora capaz de mantener una temperatura de 308 ± 1k (35 + 1°C) ó 310 ± 1k (37 ± 1°C) y 317 ± 0.5k (44 ± 0.5°C). 5.2 Estufa capaz de mantener una temperatura de 453 a 473k (180 a 200°C). 5.3 Autoclave u olla de presión o con manómetro. 5.4 Potenciometro. 5.5 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g. 5.6 Pipetas serológicas. 5.7 Pipeteros de aluminio o acero inoxidable; se pueden sustituir con papel aluminio o papel Kraft. 5.8 Tubos de ensaye de cristal refractario de 15mm x 150 mm con tapón de baquelita, aluminio o algodón. 5.9 Frascos muestreadores, de vidrio resistente o cristal refractario de 125 cm3, con tapón de cristal esmerilado. 5.10 Tubos de fermentación (Durham). 5.11 Asas de inoculación. 5.12 Material común de laboratorio. 6 REACTIVOS. Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico a menos que se indique otra cosa. Cuando se especifique el uso de agua se debe entender agua destilada in vitro o agua desionizada libre de sustancias que pueden inhibir el crecimiento bacteriano en las condiciones de prueba.

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Para la preparación de los reactivos, las condiciones de esterilización deben ser 349k (121°C) y 0.098066 Mpa (1 kg/cm2) de presión manométrica durante 15 minutos. Los tubos de fermentación (Durham) no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. En caso de utilizar medios deshidratados, seguir las recomendaciones del fabricante para su preparación. 6.1. Utilizar uno de los siguientes medios de cultivo: 6.1.1. Caldo lauril triptosa (CLT). Medio de doble concentración: Triptosa 40.0g Lactosa 10.0g Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 5.5g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 5.5g Lauril sulfato de sodio 0.2g Agua para llevar a 1000cm3 Añadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y añadir el lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la formación de espuma. Ajustar a pH 6.8. Preparar medio de simple concentración diluyendo el medio de doble concentración con un volumen igual de agua. Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 53cm3 y el medio de doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3 Cada tubo o matraz deben contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min. 6.1.2.Caldo Mc Conkey. Medio doble de concentración: Sales biliares 10.0g Peptona 40.0g Lactosa 20.0g Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g Púrpura de brmocresol (1% v/v en solución Etanolica) 2cm3 Agua para llevar a 1000cm3

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Disolver, calentando, la peptona, el cloruro de sodio y las sales biliares en agua y almacenarlo a 277k (4°C) durante todo la noche. Filtrar mientras esta aun frío añadir la lactosa y disolver. Ajustar a pH 7.4 y añadir la púrpura de bromocresol. Preparar el medio de simple concentración disolviendo el de doble concentración con un volumen igual de agua o prepararlo usando la mitad de concentración de los ingredientes. Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5 cm3 y la doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3 en tubos o matraces conteniendo un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min. 6.1.3.Caldo lactosa. Medio de doble concentración: Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Extracto de carne 6.0g Agua para llevar a 1000cm3 Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que al terminar la esterilización sea de 6.7. Preparar el medio de simple concentración diluyendo el medio de doble concentración con un volumen igual de agua. Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5cm3 y la doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3, Cada tubo o matraz debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1k (121 ± 1°C) durante 15 min. Estos tres medios son de uso común en numerosos países la selectividad del Mc Conkey y del CLT depende respectivamente de la presencia de salas biliares y del agente de superficie activo, el laurilsulfato. El caldo lactosa no es un medio selectivo. 6.2 Utilizar uno o más de los siguientes medios confirmativos: 6.2.1 Medios para la producción de gas: 6.2.1.1 caldo bilis lactosa verde brillante: Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Bilis de buey (deshidratada) 20.0g Verde brillante (1% m/m en solución acuosa) 13cm3 Agua para llevar a 1000cm3

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Disolver la peptona en 500 cm3 de agua. Añadir los 20g de bilis de buey deshidratada disueltos en 200cm3 de agua; La solución debe tener un pH entre 7.0 y 7.5 Disolver con agua hasta un volumen aproximado de 975 cm3. Añadir la lactosa y ajustar el pH a 7.4. Añadir la solución verde brillante y aforar a 1000 cm3 con agua. Distribuir volúmenes de 5cm3 en tubos de ensaye conteniendo tubos de fermentación invertidos (Durham) y colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min. Nota 1. - Este medio no da resultados reproducibles en todos los casos y se recomienda comprobar sus propiedades inhibitorias antes de usarlo. 6.2.1.2 Medio EC: Triptosa o tripticasa 20.0g Lactosa 5.0g Mezcla de sales biliares 1.5g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 4.0g Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 1.5g Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g Agua para llevar a 1000cm3 Disolver los componentes por separado y agregarles agitando suavemente. El pH debe ser de 6.9 después de la esterilización. Antes de esterilizar, distribuir en tubos de fermentación con suficiente medio para que el tubo invertido quede cubierto cuando menos parcialmente Después de la esterilización. Como medio confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales se utilizan tanto el BLVB como el caldo EC. 6.2.2. Medio para la producción de indol: 6.2.2.1. Agua de triptona: Triptona 20.0g Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g Agua para llevar a 1000cm3 Disolver los componentes en agua y ajustar a pH. 7.5 distribuir en volúmenes de 5cm3 y colocar en autoclave a 308K (115°C) durante 10 min. NOTA 2. - La adición de 0.1% (m/m) de L ó DL- triptofano puede mejorar el funcionamiento del medio. 6.3.Reactivo de Kovacs para indol: 1,4 dimetilaminobenzaldehído

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(C6H4[H(CH3)2]CHO) 5.0g Alcohol amílico (CH3(CH2)4CH) libre de bases orgánicas 75cm3 Acido clorhídrico concentrado(HCL) 85cm3 Disolver el aldehido en el alcohol. Añadir el ácido concentrado con cuidado. Proteger de la luz y almacenar a 277K (4°C) NOTA 3. - El reactivo debe tener la coloración entre amarillo claro; algunas muestras de alcohol amilico son insatisfactorias y dan una coloración oscura con el aldehido. 6.4 Reactivo de oxidasa para la prueba de oxidasa: Clorihidrato de tetrametil-p-fenilendiamina 0.1g 10cm3 Este reactivo no es estable y debe prepararse para usarse en pequeñas cantidades cada vez que sea necesario. 6.5.1 Diluyentes: 6.5.1 Diluyente de peptona (0.1%) Peptona Agua para llevar a Disolver la peptona en aproximadamente 950cm3 de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1mol/L ó ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm3 con agua, distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394± 1K (121±1°C) 6.5.2 Solución salina de peptona: Peptona 1.0g Cloruro de sodio (NaCL) 8.5g Agua para llevar a 1000 cm3 Disolver los componentes hirviéndolos en aproximadamente 950cm3 de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1mol/L o ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm3 con agua, distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min. 6.5.3 Solución de Ringer: Cloruro de sodio (NaCL) 2.25g Cloruro de potasio (KCL) 0.105g

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Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) 0.12g Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.05g Agua para llevar a 1000 cm3 Disolver los componentes y dividirlos en volúmenes convenientes. Esterilizar en autoclave a 394K (181°C) durante 15min. 6.5.4 Solución amortiguadora de fosfato: Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 42.5mg Cloruro de magnesio(MgCL2) 190.0mg Agua para llevar a 1000 cm3 6.5.4.1 Solución de fosfato. Disolver 34g de fosfato en 500cm3 de agua. Ajustar a PH 7.2±0.5 con solución de hidróxido de sodio 1mol/L y aforar a 1000 cm3 con agua. 6.5.4.2 Solución de cloruro de magnesio. Disolver 38g de cloruro de magnesio en 1000cm3 de agua. Para usarla, añadir 1.25cm3 de solución de fosfato (6.5.4.1) y 5.0cm3 de solución de cloruro de magnesio (6.5.4.2) a 1000cm3 de agua. Distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min. 7 MUESTREO El procedimiento para la recolección de las muestras de agua para el análisis bacteriológico, depende del tipo de agua que se desee muestrear. Las muestras para el análisis bacteorológico, se deben tomar en frascos muostreadores que se hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado. En su interior colocar previo a la esterilización, 0.1cm3 de solución de tiosulfato de sodio al 1% con el propósito de inhibirla acción del cloro que puede contener la muestra, cubriendo además el tapón del frasco hasta el cuello con papel aluminio. 7.1.1 Muestreo en cuerpos receptores 7.1.1 Siempre que sea posible, llenar el frasco a 2/3 partes de su capacidad; una cantidad menor sería insuficiente, si fuera mayor, disminuiría el espacio de aire disponible, necesario para homogeneizar la muestra. Las muestras deben ser representativas del agua en el estudio y asimismo no deben contaminarse en forma alguna.

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7.1.2 El frasco donde se colecta la muestra no se debe destapar sino hasta el momento en el que se efectúe el muestreo. Al muestrear, se debe evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material contaminante. 7.1.3 El examen de la muestra colectada debe realizarse lo más pronto posible, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser inciertos. 7.1.4 El volumen de muestra suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, de preferencia debe ser de aproximadamente 100cm3. Es importante que todas las muestra estén acompañadas de datos completos y exactos de identificación y descripción. 7.1.5 El mecanismo de muestreo superficial es el siguiente: 7.1.5.1 Quitar el papel aluminio del cuello del frasco; Introducir el frasco aproximadamente 30 cm3 bajo la superficie del agua. 7.1.5.2 Destapar el frasco dentro del agua. La boca del envase debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente. Si no existe corriente, como en los embalses, crearla empujando el frasco horizontalmente, en dirección opuesta al movimiento de la mano. 7.1.5.3 Una vez que la muestra ocupe el volumen correspondiente del frasco (2/3 partes); tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella. 7.1.5.4 Si no es posible la recolección de muestras en las condiciones antes anunciadas; fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua. 7.1.6 Para tomar muestras profundas en lagos o embalses; usar aparatos especiales que

permitan destapar y tapar mecánicamente el frasco debajo de la superficie. 7.2 Muestreo en pozos y grifos. 7.2.1 Si el pozo está provisto de bomba de mano, bombear durante 5 min. , Para que el agua fluya libremente, antes de tomar la muestra. 7.2.2 Si el pozo esta dotado de bomba mecánica, tomar la muestra en una llave previamente flameada de la descarga, dejando que fluya el agua libremente 5min. antes de tomar la muestra. 7.2.3 A efectuar este muestreo, se deben flamear los bordes del frasco y tapón durante el tiempo que dura el muestreo. Esto se hace con objeto de mantener el máximo las condiciones de asepsia.

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7.2.4 Si no se cuenta con equipo de bombeo, tomar la muestra directamente del pozo por medio de un frasco estéril con lastre. En este caso se debe evitar la contaminación de la muestra por las notas superficiales. 7.2.5 Si se trata de tomar una muestra de un grifo del sistema de servicio, flamear el grifo y abrirlo completamente, dejando que el agua fluya por 2 ó 3 min. , O el tiempo suficiente para permitir la purga de la línea. 7.2.6 En el momento del muestreo, restringir el flujo de la llave para que se pueda llenar el frasco sin salpicaduras. 7.2.7 Las condiciones de asepsia deben ser las mismas que las enunciadas en el punto 7.2.3. 8. PRESERVACION Y ALMACENAMIENTO El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso debe exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis. Durante el período que transcurra del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 277K(4°C), con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos. 9. PROCEDIMIENTO 9.1 Pruebas presuntivas. 9.1.1 Preparación de la muestra e inoculación del medio Antes del examen, mezclar perfectamente la muestra agitándola vigorosamente para lograr una distribución uniforme de los microorganismos y, dependiendo de la naturaleza del agua y el contenido bacteriano esperado, hacer las diluciones necesarias en esta etapa. Utilizar series que constan de por lo menos tres diluciones: 10.0cm3, 1.0cm3 y 0.1cm3 ó bien1.0cm3, y 0.01cm3. Por cada dilución debe haber 3 ó 5 tubos. Para diluciones a 10 veces, poner 90 ó9 cm3 del diluyente en matraces o tubos de dilución esterilizados. Alternativamente, usar volúmenes de diluyente preesterilizado en botellas de tapón de rosca. Hacer una o más diluciones a 10 veces transfiriendo un volumen de la muestra de agua a 9 volúmenes de diluyente. Repetir estos pasos cuantas veces sea necesario. Preparar suficiente cantidad de cada dilución para todas las pruebas que se vayan a llevar a cabo con la muestra. Para diluciones diferentes a 10 veces ajustar el

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volumen de diluyente a la porción de prueba. Inocular los tubos conteniendo medios de aislamiento de doble concentración con porciones de prueba de un volumen mínimo de 5cm3. 9.1.2 Incubación de los tubos. Incubar los tubos inoculados ya sea a 308± 1K (35± 1°C) o 340± 1K(37±1°C) durante 48 horas. 9.1.3 Examen de los tubos Examinar los cultivos de los tubos después de un período de incubación de 18 a 24 horas y considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en los tubos internos invertidos (Durham) junto con producción de ácido si el medio de aislamiento contiene un indicador de pH. Reincubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos cambios y examinarlos nuevamente para detectar reaccionan positivas a las 48 horas. 9.2 Pruebas confirmativas. 9.2.1 Inoculación del medio. Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento que muestro un resultado positivo en uno o más tubos de medio confirmativo (6.2) para detectar la producción de gas e indol. NOTA 4: - Si se usa el medio más inhibitorio de caldo lactosa para aislar, resembrar en alguno de los dos medios confirmativos más selectivos, Caldo de Bilis Lactosa Verde Brillante o Caldo EC para efectuar la confirmación. 9.2.2 Incubación y examen. Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de 9.2.1 de Caldo Lactosa Verde Brillante o Caldo EC a 310K(37°C) y examinarlo para ver si hay producción de gas dentro de un período de 48 horas. Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes, incubar otro tubo de 9.2.1 de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante o Caldo EC a 317K (44°C) durante 24 horas para ver si hay producción de gas. Para confirmar la presencia de E. coli. Presuntiva, incubar un tubo de 9.2.1 de agua de triptona para detectar la formación de indol a 317L(44°C) durante 24 horas. Después añadir de 0.2 a0.3 cm3 de reactivo de Kovacs (6.3) el tubo de agua de triptona; El desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar suavemente de note la presencia de indol.

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NOTA 5.- La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se considera necesario. 9.3 Prueba de oxidasa Algunas bacterias existentes en el agua pueden conformarse a la definición de organismos coliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosa solamente a temperaturas inferiores a 310K (37°C). Por consiguientes dan resultados negativos a las pruebas confirmativas estándar para organismos coliformes y su presencia en agua usualmente no se considera significativa. Las especies de Aeromonas, que se encuentran naturalmente en el agua, tienen una temperatura óptima de crecimiento en el rango 303 a 308K (30 a 35°C), pero a pesar de ello son capaces de producir ácido y gas a partir de lactosa a 310K(37°C). Tienen poco significado para efectos sanitarios y se distinguen del grupo de los coliformes por una reacción de oxidasa positiva. 9.3.1 Llevar a cabo la prueba con subcultivos puros de los organismos fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue: -Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado (6.4) en un papel filtro en una caja de Petri. -Con una barra de vidrio o un asa de alambre de platino (no de nicromel), colocar parte del cultivo en el papel filtro preparado. -Considerar la aparición de u color azul marino purpúreo en un lapso de 10 segundos como una reacción positiva. NOTA 6. - En cada ocasión que se use el reactivo de oxidasa, llevar a cabo pruebas de control con cultivos de organismos que se sepa dan una reacción positiva (pseudomonas aeruginosa) y uno que de una reacción negativa (E, coli) en 100 cm3 de la muestra. 10 CALCULOS A partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios de aislamiento y confirmativo, calcular por referencia a las tablas estadísticas (ver tabla) el número más probable de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli presuntiva en 100 cm3 de la muestra. Cuando se emplean de dilución para hacerlo equivalente. En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los cálculos la siguiente ecuación:

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No. de tubos positivos x 100 Nmp/100cm3=_____________________________ Cm3 de muestra cm3 de muestra En tubos negativos x en todos los tubos.

TABLA 1 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con porciones de 1cm3 y con 5 porciones de 0.1 cm3.

No. de tubos con reacciones positivas

Límite confiable de 95%



5tubos con 10cm

5tubos con 1cm3

5tuboscon0.1cm3

Indice del NMP por 100cm3

Inte-rior

Supe-rior

5tubos con 10cm3

5tubos con 1cm3

5tubos con 0.1cm3

Indice del NMP POR 100cm3

Interior

Superior

0 0 0 <2 0 0 1 2 <0.5 7 4 2 1 26 9 78 0 1 0 2 <0.5 7 4 3 0 27 9 80 0 2 0 4 <0.5 11 4 3 1 33 11 93 4 4 0 34 12 93 1 0 0 2 <0.5 7 1 0 1 4 <0.5 11 5 0 0 23 7 70 1 1 0 4 <0.5 11 5 0 1 31 11 89 1 1 1 6 <0.5 15 5 0 2 43 15 110 12 2 0 6 <0.5 15 5 1 0 33 11 93 5 1 1 46 16 120 2 0 0 5 <0.5 13 5 1 2 63 21 150 2 0 1 7 1 17 2 1 0 7 1 17 5 2 0 49 17 130 2 1 1 9 2 21 5 2 1 70 23 170 2 2 0 9 2 21 5 2 2 94 28 220 2 3 0 12 3 28 5 3 0 79 25 190 5 3 1 110 31 250 3 0 0 8 1 19 5 3 2 140 37 340 3 0 1 11 2 25 3 1 0 11 2 25 5 3 3 180 44 500 3 1 1 14 4 34 5 4 0 130 35 300 3 2 0 14 4 34 5 4 1 170 43 490 3 2 1 17 5 46 5 4 2 220 57 700 3 3 0 17 5 46 5 4 3 280 90 850

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5 4 4 350 120 1,0004 0 0 13 3 31 5 5 0 240 68 750 4 0 1 17 5 46 5 5 1 350 120 1,0004 1 0 17 5 46 5 5 2 540 180 1,4004 1 1 21 7 63 5 5 3 920 300 3,2004 1 2 26 9 78 5 5 4 1600 640 5,8004 0 0 22 7 67 5 5 5 =<24

00

TABLA 2 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 1 tubo con porciones de 50 cm3 5 tubos con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 10cm3





1tubo con50cm3

5tuboscon 10cm3

5tubos con 1cm3


interior

Superior

1tubo con 50cm3

5tubos con 10cm3

5tubos con 1cm3

Indice del NMPpor 100cm3

Interior

Superior

0 0 0 <1 0 0 1 1 <0.5 4 1 2 1 7 1 17 0 0 2 2 <0.5 6 1 2 2 10 3 23 0 1 0 1 <0.5 4 1 2 3 12 3 28 0 1 1 2 <0.5 6 1 3 0 8 2 19 0 1 2 3 <0.5 8 1 3 1 11 3 26 0 2 0 2 <0.5 6 1 3 2 14 4 34 0 2 1 3 <0.5 8 1 3 3 18 5 53 0 2 2 4 <0.5 11 1 3 4 21 6 66 0 3 0 3 <0.5 8 1 4 0 13 4 31 0 3 1 5 <0.5 13 1 4 1 17 5 47 0 4 0 5 <0.5 13 1 4 2 22 7 69 1 0 0 1 <0.5 4 1 4 3 28 9 85 1 0 1 3 <0.5 8 1 4 4 35 12 100 1 0 2 4 <0.5 11 1 4 5 43 15 120 1 0 3 6 <0.5 15 1 5 0 24 8 75 1 1 0 3 <0.5 8 1 5 1 35 12 100 1 1 5 5 <0.5 13 1 5 2 54 18 140

NMX MX-AA-42-1987

1 1 7 7 1 17 1 5 3 92 27 220 1 1 9 9 2 21 1 5 4 160 39 450 1 2 5 5 <0.5 13 1 5 5 =>24

0

TABLA 3 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 50 cm3, 5 tubos

con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 1 cm3. No. de tubos con reacciones positivas




5tubos con50cm

5tubos con 10cm

5tubos con1cm3

Indice del NMP Por 100cm3

Inferior

Superior

5tubos con 50cm3

5tubos con10cm3

5tubos con 1cm3


Inferior

Superior

0 0 0 <1 0 0 1 1 <0.5 2 4 1 1 4 1 9 0 1 0 1 <0.5 2 4 1 2 4 1 9 0 1 1 1 <0.5 2 4 2 0 4 1 9 0 2 0 1 <0.5 2 4 2 1 4 1 9 0 3 0 1 <0.5 2 4 2 2 5 2 12 4 3 0 5 2 12 1 0 0 1 <0.5 2 1 0 1 1 <0.5 2 4 3 1 5 2 12 1 1 0 1 <0.5 2 4 3 2 6 2 14 1 1 1 1 <0.5 2 4 4 0 6 2 14 1 2 0 1 <0.5 2 4 4 1 7 3 17 1 2 1 2 <0.5 4 4 5 0 7 3 17 1 3 0 2 <0.5 4 4 5 1 8 3 19 2 0 0 1 <0.5 2 5 0 0 4 1 9 2 0 1 1 <0.5 2 5 0 1 4 1 9 2 1 0 1 <0.5 2 5 0 2 6 2 14 2 1 1 2 <0.5 4 5 1 0 5 2 12 2 2 0 2 <0.5 4 5 1 1 6 2 14 2 2 1 2 <0.5 4 5 1 2 7 3 17 2 3 0 2 <0.5 4 5 2 0 6 2 14 2 3 1 3 1 7 5 2 1 8 3 19 2 4 0 3 1 7 5 2 2 10 4 23 5 2 3 12 4 28 3 0 0 2 <0.5 4 3 0 1 2 <0.5 4 5 3 0 9 3 21 3 1 0 2 <0.5 4 5 3 1 11 4 26 3 1 1 2 <0.5 4 5 3 2 14 5 34 3 1 2 3 1 7

5 3 3 18 6 53

NMX MX-AA-42-1987

3 2 0 3 1 7 5 4 0 13 6 31 3 2 1 3 1 7 5 4 1 17 6 47 3 2 2 4 1 9 5 4 2 22 7 70 3 3 0 3 1 7 5 4 3 28 9 85 3 3 1 4 1 9 5 4 4 35 11 100 3 4 0 4 1 9 5 5 0 24 8 75 3 4 1 4 1 9 5 5 1 35 11 100 4 0 0 2 <0.5 4 5 5 2 54 18 140 4 0 1 3 1 7 5 5 3 92 27 220 4 0 2 3 1 7 5 5 4 160 39 420 4 1 0 3 1 7 5 5 5 =>240

TABLA 4 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 1 cm3 y 3 con porciones de 0.1 cm3.

No. de tubos con reacciones positivas Límite Confiable de 95%

3 tubos con cm3

3 tubos con 1cm3

3 tubos con 0.1 cm3

Indice Del NMP. Por cm3

Interior

Superior

NMX MX-AA-42-1987

0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3

0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3

<3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1,100 => 2,400

<0.5 <0.5 <0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 280 380 440 470 1,300 2,400 4,800

11. REPORTE DE LA PRUEBA El reporte de la prueba debe hacer referencia a esta norma y dar toda la información relevante, incluyendo a.. Todos los detalles necesarios para la identificación completa de la muestra. b. La técnica y medio de cultivo empleados. c. El tiempo, temperatura y condiciones de la incubación. d. Los resultados expresados conforme a lo que se describe en el punto 10

NMX MX-AA-42-1987

e. Cualquier suceso particular observado en el curso del análisis y cualquier operación no especificada en el método o considerada opcional que pueda haber influído en los resultados. 11 CONFIABILIDAD El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por su facilidad y economía. El resultado de esta prueba se expresa por el “número más probable” (NMP), pero debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probable densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada. La confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 cm3, no obstante, es una indicación importante para evaluar la calidad sanitaria del agua. 12 BIBLIOGRAFIA STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER. 15th edition. Paginas 794-805. 1980. 14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Esta norma concuerda parcialmente con el anteproyecto de norma ISO/DP 9308/2. Water quality- Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumtive Escherichia coli by the multiple tube (most probable number) method.

México, D.F. a 3 Junio de 1987 LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS

LIC. CONSUELO SAEZ PUEYO

NMX MX-AA-42-1987


Y

FOMENTO INDUSTRIAL

NORMA MEXICANA

NMX-AA-112-1995-SCFI

ANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM –

METODO DE PRUEBA.

WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.



PREFACIO En la elaboración de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones: - ASESORIA Y CONSULTORIA ECOLOGICA-REMMSA - ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA - BECTOR DICKINSON DE MEXICO - CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL - CONTROL DE CONTAMINACION DEL AGUA, S.A. DE C.V. - COMITÉ TECNICO DE NORMALIZACION NACIONAL DE PROTECCIÓN AL

AMBIENTE - DISEÑO HIDRAULICO Y TECNOLOGIA AMBIENTAL, S.A. DE C.V. - EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA EN

LA ZONA E CIVAC - F.J. SALCEDO Y COMPAÑÍA - INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO - INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Centro de investigación y de Estudios Avanzados. - INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC - JUNTA MUNICPAL DE AGUA Y SANAMIENTO DE CIUDAD JUAREZ

CHICHUAHUA - SECRETARIA DE MARINA

Dirección general de Oceanografía Naval. - SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA.

Comisión Nacional de Agua. Dirección general de Acuacultura. Instituto mexicano de Tecnología del agua. Instituto Nacional de Ecología.


INDICE DEL CONTENIDO Núm. del Capítulo 1. Objetivo 2. Campo de aplicación 3. Referencias 4. Definiciones 5. Muestreo 6. Principio 7. Reactivos y materiales 8. Aparatos 9. Preparación y acondicionamiento de la muestra 10. Procedimiento 11. Expresión de los resultados. 12. Informe de los resultados 13. Informe de la prueba 14. Bibliografía 15. Concordancia con normas internacionales. Apéndice A (informativo) Apéndice B (informativo)


ANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – METODO DE PRUEBA.

WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.

1 OBJETIVO. Esta Norma Mexicana establece el método para determinar la calidad del agua. Lixiviados y sedimentos mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando a la bacteria bioluminiscente marina Photobacterium phosphoreum. 2 CAMPO DE APLICACIÓN Esta Norma Mexicana es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos de agua dulce, salubre y/o marina, así como aguas residuales industriales, agrícolas o municipales, sustancias puras o combinadas, lixiviados y sedimentos. 3 REFERENCIAS Esta norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas y Norma Oficial Mexicana vigentes: NMX-AA-033 Aguas residuales – Muestreo. NMX-AA-007 Aguas – Determinación de temperatura. NMX-AA-008 Aguas – Determinación de pH. NMX-AA-014 Cuerpos receptores – Muestreo. NMZ-AA-087-SCFI Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphnia

mangna Straus (Crustacea – Cladocera) – Método de prueba. NOM-053-ECOL Que establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba de

extracción para determinar los constituyentes que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.


4 DEFINICIONES. Para fines de esta Norma Mexicana, se entiende por: 4.1. Agua desionizada. Es el agua que ha sido tratada para remover los iones en solución que presenta una conductividad menor o igual a 2µmhos/cm. 4.2. Agua destilada. Es el agua que ha sido evaporada y condensada en un aparato de destilación de vidrio borosilicato u otro material, para remover impurezas. 4.3. Agua intersticial. Es el agua que se encuentra ocupando un espacio entre las partículas del sediento. La cantidad de agua interstical se expresa como un porcentaje del sedimento húmedo en relación a su masa seca. 4.4. Agua marina. Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares al agua marina natural. 4.5. Agua de mar artificial. Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares al agua marina natural. 4.6. Aguas residuales. Son las aguas de composición variada provenientes de las descargas municipales, industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticas y en general de cualquiera otra. 4.7. Bioluminiscencia. Es el fenómeno por el cual, ciertos organismos vivos emiten luz como resultado de su actividad bioquímica. 4.8. Contaminante. Es toda materia o energía en cualesquiera de sus estados físicos y formas que al incorporarse o actuar en la atmósfera, agua suelo, flora, fauna o cualquier otro elemento natural, altere o modifique su composición o condición natural.


4.9. Concentración efectiva media (CE50) Es la concentración de sustancias puras, combinadas, cuerpos receptores, afluentes, lixiviados y sedimentos que reducen la intensidad de luz emitida por la bacteria photobecterium phosphoreum a un 50% 4.10. Cuerpos de agua. Son los mares, lagos, lagunas, estuarios, acuíferos, redes colectoras con excepción de los sistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal, ríos y sus efluentes directos o indirectos, permanentes o intermitentes, presas. Cuencas. Cauces, canales, embalses, cenotes, manantiales, y demás depósitos o corrientes de agua. 4.11. Descarga. Son las aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistema de drenaje y alcantarillado urbana o municipal, incluyéndose los procesos de infiltración e inyección. 4.12. Efecto agudo. Es aquél que se manifiesta como una respuesta inmediata de un organismo al tóxico o tóxicos a los que se ha sido expuesto. Usualmente produce inhibición de alguna función metabólica, inmovilidad o muerte. 4.13. Efluente. Es el agua u otro líquido que procede de un embalse, cuenca, procesos o planta de tratamiento. 4.14. Falso positivo. Es la reducción de luz detectada, causada por un factor o factores diferentes de la presencia de algún tóxico. 4.15. Liofilizado. Es el producto sometido a deshidración en condiciones de baja temperatura y alto vacío con el fin de conservarlo. 4.16. Lixiviado. Es el líquido proveniente de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre o percolación y que contienen, disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran en los mismos residuos.


4.17. Muestra simple o instantánea. Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen que resulte representativo de la descarga de aguas residuales, en el sitio y en el momento del muestreo. 4.18. Muestra compuesta. Es aquélla que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas en un efluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de las horas por día que opere el proceso generado de la descarga. 4.19. Photobacterium phosphoreum. Es la bacteria marina bioluminiscente, con forma bacilar, Gramm-negativa, anaerobia facultativa, halofílica, la cual posee un flagelo en uno de los polos. 4.20 Prueba de toxicidad (bioensayo de toxicidad). Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras o combinadas y aguas provenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto. 4.21. Reconstitución. Es la reactivación de la bacteria liofilizada por la adición de agua destilada. (rehidratación). 4.22. Salinidad Es el contenido de sales disueltas por litro. 4.23. Sedimento. Es el material particulado o granular que se deposita en el fondo de un cuerpo de agua, sistema de drenaje o alcantarillado urbano o municipal. 4.24. Sustancia pura. Es el elemento o conjunto de dos o más elementos combinados químicamente, que dan lugar a un compuesto con pureza no menor al 98%, por ejemplo: dicromato de potasio (K2Cr2O7), fenol (C6H5-OH), sulfato de zinc (ZnSO4). 4.25. Sustancia combinada. Es aquélla que se forma por la integración de dos o más compuestos en una proporción no mayor al 98% de cualquiera de ellos. Para fines de esta norma: aguas residuales, industriales, efluentes agrícolas, municipales, lixiviados y sedientos.


4.26. Tiempo de exposición. Es el período en el que se someten los organismos a las soluciones de prueba, en un bioensayo de toxicidad. 4.27. Tiempo de reconstitución bacteriano. Es el período en el que se lleva a cabo la rehidratación bacteriana y que comprende desde el momento en que la solución de reconstitución es vertida al liofilizado, hasta el instante en que es colocada en incubación a 5,5ºC y que no debe exceder de 10 s. 4.28. Toxicidad. Es el efecto que produce un tóxico. 4.29. Toxicidad aguda. Es el efecto medido por la reducción de luz de Photobacterium phosphoreum. Después de ser expuesta a un tóxico una sola vez durante un período corto no mayor a 30min. 4.30. Tóxico. Es cualquier sustancia pura o combinada que al entrar en contacto con un organismo, produce daños estructurales o alteraciones bioquímicas o fisiológicas e incluso la muerte; dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición. 4.31. Tóxico de referencia. Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad cuyo efecto en los organismos a determinadas concentraciones es conocido y por lo tanto, permite establecer el estado de respuesta de los mismos; así como, comparara los resultados intra e inter laboratorios. El uso de estos tóxicos, proporciona también una evaluación general de la precisión (estabilidad y reprocibilidad) del método a través del tiempo. 5. MUESTREO. El muestro tanto de cuerpos de agua como de efluentes industriales, agrícolas, municipales o urbanos, lixiviados y sedimentos, constituyen una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de la calidad del ambiente acuático. 5.1. Muestreo en efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos.


Se efectúan muestreos instantáneos de acuerdo a la tabla 1.

TABLA 1.- Muestras instantáneas requeridas para formar una muestra compuesta.

Intervalo para la obtención de muestras simples.

Horas pro día que opera el proceso generador de la descarga.

Número de muestras.

Mínimo H

Máximo h

Hasta 8h Más de 9h y hasta 12h Más de 12h y hasta 18h Más de 18h y hasta 24h

4 4 6 6

1,0 2,0 2,0 3,0

2 3 3 4

La integración de la muestra compuesta se efectúa de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-003 (ver 2 Referencias), tomándose las precauciones necesarias en cuanto a la preservación de las muestras simples, para la cual, cada una de éstas se debe mantener a 4ºC ± 2ºC hasta que sea integrada la muestra compuesta. Una vez concluido esto, dependiendo de cuando se realice el análisis, la muestra compuesta se debe almacenar y preservar de acuerdo al capítulo 9 de esta norma. 5.2. Muestreo en cuerpos de agua. El muestro se debe realizar de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-014 (VER 2 Referencias). Además de los parámetros fisicoquímicos básicos, considerados sólo para fines del reporte (pH, oxígeno disuelto, conductividad, temperatura de agua y aire), se deben registrar las siguientes características aparentes: - Olor - Color - Turbiedad - Presencia o ausencia de burbujas y espuma Las muestras simples o instantáneas se integran de acuerdo al inciso 4.17 de esta norma, siguiendo los ejemplos indicados en el inciso 13.1 de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 2 Referencias). 5.3. Muestreo en sedimentos. El muestreo de sedimentos se lleva a cabo utilizando una draga tipo Ekman o similar, o bien un nucleador, siempre que se realice en cuerpos de agua cuya profundidad sea igual o mayor a 50 cm. Si el muestreo se efectúa a profundidades menores a la anterior, se utiliza una pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte, o bien, puede realizarse muestreo directo, utilizando el recipiente de almacenamiento.


En cualquiera de los dos casos mencionados, la muestra que se considera para el análisis corresponde a la lámina superior de sedimento con un espesor de 3cm y mas húmeda aproximada de 200g. Al efectuar el muestreo, se recomienda considerar lo siguiente: - Cuando se realiza el muestreo en sedimentos limosos, se sugiere introducir

lentamente la draga o el nucleador para evitar remolinos y corrientes que suspendan el sedimento.

- Si el muestreo se realiza en un sedimento rocoso arenoso, pueden quedar atrapadas

rocas pequeñas entre las mandíbulas de la draga, impidiendo el cierre total de ésta, ocasionado pérdida de sedimento cuando se recupera; por lo cual. Se debe lanzar la draga tantas veces como sea necesario hasta obtener la cantidad de sedimento suficiente. De igual forma, si se utiliza un nucleador, quizá se requiera efectuar varios muestreos hasta obtener el sedimento necesario.

- Cuando el muestreo de sedimentos se realice en zonas de aguas someras (menor a

50 cm de profundidad), al utilizar la pala pequeña, se debe procurar sumergirla en dirección del flujo, y al llegar al fondo introducirla lentamente inclinando la pala en un ángulo aproximado de 45º, posteriormente arrastrar ésta, paralelamente al fondo hasta obtener una cantidad suficiente. En seguida, se debe elevar la pala en forma casi horizontal (paralela al fondo) muy lentamente, para evitar pérdida de sedimento.

Para todos los casos anteriores, la muestra colectada para el análisis se coloca en recipientes limpios de boca ancha de volumen mínimo de 250ml, de polietileno de alta densidad, con tapa o contratapa del mismo material. 5.3. Muestreo de lixiviados El muestreo de lixiviados se debe efectuar en los pozos de monitoreo de los sistemas de captación de los mismos, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL, (ver 2 Referencias). Para la colecta de la muestra, se deben tomar las preocupaciones necesarias utilizando el equipo de seguridad adecuado. Las muestras se deben colocar en recipientes limpios de 50 ml de polietileno e alta densidad con contratapa. 6. PRINCIPIO Este método se basa en la evolución del efecto que sustancias puras, combinadas, cuerpos receptores, efluentes, lixiviados y sedimentos pueden tener sobre la intensidad e la luz emitida por la bacteria Photobacterium phosphoreum en condiciones controladas de exposición.


7.- REACTIVOS Y MATERIALES. 7.1. Reactivos y soluciones. 7.1.1. Reactivos. 7.1.1.1. Fenol (C6H5-OH) Compuesto con una pureza superior o igual a 99%. 7.1.1.2. Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) Compuesto con una pureza superior o igual a 99% 7.1.1.3. Metanol (CH3OH) Grado plaguicida, para efectuar la extracción Soxhlet en la muestra testigo. 7.1.1.4. Acetona (C3H6O) 7.1.1.5. Acido nítico concentrado (HNO3) 7.1.1.6. Agua destilada, o en su defecto, agua con pureza equivalente. 7.1.1.7. Agua desionizada. 7.1.1.8. Cloruro de sodio (NaCL) 7.1.1.9. Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCL2.6H2O) 7.1.1.10. Cloruro de estrocio hexahidratado (SrCL2.6H2O) 7.1.1.11. Cloruro de potasio (KCL) 7.1.1.12. Bromuro de potasio (KBr) 7.1.1.13. Cloruro de calcio (CaCL2) anhidro 7.1.1.14. Sulfato de sodio decahidratado (NaSO4.10H2O) 7.1.1.15. Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 7.1.1.16. Floruro de sodio (NaF) 7.1.1.17. Acido borico (H3BO3)


7.1.2. Soluciones 7.1.2.1. Medio de reconstitución. Reactivo de agua destilada o similar no tóxica a la bacteria Photobacterium phosphoreum. 7.1.2.2. Medio de dilución para muestras de agua dulce. El mismo medio señalado en el inciso anterior agregado en una relación mas volumen (M/V) 2% de cloruro de sodio (NaCL). 7.1.2.3. Medio de dilución para muestras de agua salina o salobre. El medio de dilución debe ser agua de mar artificial preparada según el inciso 7.1.2.6. 7.1.2.4. Medio de dilución para fase sólida. Medio señalado en el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masa volumen (M/V) de 3,5%. En caso de muestras salinas o salobres, el medio de dilución es agua de mar artificial preparada como se indica en el inciso 7.1.2.6. 7.1.2.5. Solución de ajuste osmótico. Medio utilizado para el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masa volumen (M/V) de 22%. 7.1.2.6. Agua de mar artificial Se prepara con agua destilada o desionizada de acuerdo con la tabla 2, con una salinidad aproximada de 35, (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.16).

TABLA 2.- Reactivos utilizados en la preparación de agua de mar artificial

Solución A Solución B Sales Cantidad

(g) Sales Cantidad

(g) NaCL 23,90 NaSO4.10H2O 9,06 MgCL2.6H2O 10,83 NaHCO3 0.02 CaCL2 anhidro 1,15 NaF 0,003 SrCL2.6H2O 0,004 H2BO3 0,0003 KCL 0,682 Agua destilada 100 ml KBr 0,099 Agua destilada 856


La solución B se adiciona lentamente a la solución A, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. Después de 24h, filtrar la mezcla utilizando un filtro de membrana de 0,45 µm. 7.1.2.7. Agua marina. Libre de tóxicos, puede emplearse en sustitución de 7.1.2.6. 7.2. Materiales. 7.2.1. Material biológico. 7.2.1.1. Photobacterium phosphoreum la suspensión bacteriana debe ser utilizada a una concentración aproximada de 1 X 108 células/ml. Dado que los cultivos frescos son inherentemente variables, se debe utilizar un cultivo liofilizado con 2,0% de NaCL, 94% de sólidos de leche descremado y 4% de bacterias. Estas se deben preservar en forma liofilizada en un congelador a una temperatura entre –18ºC y –20ºC (bajo estas condiciones, el tiempo de caducidad de la bacteria es de un año). Cuando se hidratan, las bacterias comienzan inmediatamente a emitir luz, y pueden ser usadas en pruebas sin ningún tratamiento posterior. La cepa liofilizada aporta valores constantes de CE50 para tóxicos de referencia (ver inciso 10.3.3.). si la cepa se preserva por otros métodos o se utilizan cultivos frescos, su respuesta a tóxicos de referencia puede ser no reproducible (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.2). 7.2.2. Otros materiales. 7.2.2.1. Celdillas. Las celdillas de lectura deben ser compatibles con el luminómetro utilizado; tener capacidad para un volumen total de 3000µL-5000µL; de vidrio borosilicato y descabales. 7.2.2.2. Columnas filtradoras. Provista con un filtro de fibra de vidrio de 45µm. Utilizadas para extraer el sobrenadante de las muestras de sedimentos. 7.2.2.3. Micropipetas. Deben tener doble fase de aire, y capacidad para extraer volúmenes de 1000µL, 500µL, 250µL y 10µL. 7.2.2.4. Puntas para micropipetas. Deben ser estériles, de polipropileno y desechables.


7.2.2.5 Soporte de celdillas. Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, treinta celdillas en baño de recirculación o sistema de control de temperatura. El soporte debe prevenir que las celdillas se sumerjan en agua (el exceso de agua en la parte externa de las celdillas puede interferir con la lectura de luz de cada celdilla), así como tener buena transferencia de calor y resistencia a la corrosión; éste es necesario cuando se utilice un luminómetro sin pozos de celdilla con temperatura controlada. 7.2.2.6.Soporte de celdilla R Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, una celdilla en baño de recirculación o sistema de control de temperatura a 5,5ºC. Este soporte puede sumergir a la celdilla en agua y debe ser resistente a la corrosión. Si la celdilla no está inmersa en agua, éste debe cumplir con las especificaciones del material del soporte de celdillas, descrito en el inciso anterior. El soporte de celdillas es necesario cuando se utiliza un luminómetro sin bloque de incubación con temperatura controlada. 7.2.2.7.Soporte de tubos de ensaye. Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, al menos 30 tubos de ensaye descritos en el inciso 7.2.2.8., dentro del baño de recirculación o sistema de control de temperatura mencionado en el inciso 8.2. El material de construcción debe tener buena transferencia de calor y resistencia a la corrosión dentro del sistema de recirculación os sistema de control de temperatura. Este soporte es necesario para realización de la prueba en fase sólida. 7.2.2.8. Tubos de ensaye desechables, de vidrio borosilicato o policarbonato, con capacidad de 15 ml y 20mm de diámetro. Limpios. Se utilizan para la prueba en fase sólida 7.2.2.9. Equipo de seguridad Guantes, mascarillas, lentes de seguridad, botas de hule, etc. 7.2.2.10. Recipientes de muestreo de polietileno de alta densidad, de 50 ml y de 250mL (boca ancha), tapa o contratapa del mismo material. 7.2.2.11 Sistema de extracción (de acuerdo a lo indicado en el apéndice B) De capacidad mínima de 250 mL.


7.2.2.12. Paraflim 7.2.3. Lavado de material Todo el material que se utilice en el muestro y análisis (excepto celdillas y puntas de micropipeta) debe llevarse según el método descrito a continuación: - Lavar con detergente y enjuagar dos veces con agua de la llave. - Enjuagar con acetona (C3H6O). Dejar secar completamente. - Enjuagar con ácido nítico (HNO3) concentrado, eliminar el excedente. Enjuagar

abundantemente con agua desionizada, escurrir y dejar secar. Una vez lavado, proteger el material de polvo y otros factores. 8.- APARATOS. 8.1. Luminómetro. Debe ser capaz de detectar la luz emitida por photobacterium phosphoreum, a una longitud de onda de 490nm. 8.2. Baños de recirculación o sistemas de control de temperatura. Debe ser capaces de mantener una temperatura de 15º ± o,5ºC y 5,5ºC ± 0,5ºC. Los 3 equipos descritos pueden ser individuales o estar integrados en un sistema automatizado. 8.3. Congelador Debe ser capaz de mantener una temperatura de –20ºC ± 2ºC. 8.4. Refrigerador Debe ser capaz de mantener una temperatura de 4ºC ± 2ºC. 8.5 Parrilla magnética. Debe ser capaz de tener agitación continua durante 48h.


8.6. Parrilla de calentamiento para el sistema de extracción (ver Apéndice B) Debe ser capaz de mantener una temperatura entre 70ºC y 80ºC. 8.7. Centrífuga clínica o equivalente. Debe ser capaz de separar la fase sólida de la líquida. 8.8. Medidor de pH. El pH de las muestras se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-008, (ver 2 Referencias). 8.9. Ternómetro La temperatura se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-007, (ver 2 Referencias). 8.10. Salinómetro. Utilizado para determinar la salinidad de las muestras marinas y salobres. 8.11. Oxímetro. Para determinar el oxígeno disuelto de las muestras en campo. 8.12. Horno de secado o equivalente Debe ser capaz de mantener una temperatura de 100ºC. 8.13. Balanza analítica. Con sensibilidad mínima de 1mg. 9 PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS. 9.1. Preparación. En general, el contenido de salas de la muestra y del medio de dilución durante el análisis, debe ser de 2,0% (M/V) como cloruro de sodio (NaCL) para muestras de agua dulce y de 3,5% (M/V) para muestras de agua salobre y marina.


9.1.1. Preparación de muestras de agua dulce el contenido de sales de las muestras debe ajustarse a 2,0% de cloruro de sodio (NaCL) previo al análisis, lo cual es necesario par evitar la pérdida de bioluminiscencia de la bacteria debida al choque osmótico. Este ajuste se logra adicionando la cantidad adecuada de solución de ajuste osmótico descrita en el inciso 7.1.2.5. (1 parte de solución por 10 partes de muestra). Por ejemplo, supóngase que se tienen una muestra e agua dulce (0% de NaCL), se debe agregar 2,5ml de muestra y 0,25ml de solución de ajuste osmótico; o bien, adicionar NaCL sólido a la muestra (0,2g en 9,8ml de muestra). 9.1.2. Preparación de muestras de agua salubre. La salinidad de las muestras debe determinarse antes de ser analizadas, Si el contenido de sales está por debajo del 2,0%, debe ajustarse a este valor adicionado NaCL. Si el contenido de sales es mayor a 2,0%, se debe adicionar NaCL al medio de dilución hasta igualar la salinidad de la muestra. 9.1.3. Preparación de muestras de agua marina. El contenido de sales de las muestras es aproximadamente de 3,5%, por lo tanto, no se requiere ajuste osmótico. El diluyente de prueba debe ser agua de mar artificial o agua de mar carente de contaminación (ver incisos 7.1.2.6. y 7.1.2.7). 9.1.4. Preparación de muestras de agua interstical de sedimentos. Centrifugar el sedimento de cada muestra par separar la fase sólida de la fase líquida. Decantar cuidadosamente la fase líquida y emplearla par su preparación de acuerdo a los incisos 9.1.1., 9.1.2. y 9.1.3, según su procedencia. - En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce, se debe hacer la preparación

descrita en el inciso 9.1.1. - En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce salubre, se debe hacer la

preparación descrita en el inciso 9.1.2. - En muestras de sedimento de sistemas de agua marina, se debe realizar la

preparación descrita en el inciso 9.1.3.


9.1.5. Preparación de extractos acuosos de sedimentos. Homogeneizar la muestra de sedimento colectada, mezclar con el tipo de agua que corresponda al origen de la muestra en una relación 1:4 (M/V) utilizando un matraz Erlenmeyer. Agitar vigorosamente durante 60min en una parrilla magnética. Centrifugar la mezcla de 10 00r/min hasta obtener una separación completa de las dos fases. Utilizar el sobrenadante para el análisis. 9.1.6. Preparación muestra de sedimento para la prueba de fase sólida. 9.1.6.1. Muestra problema. Proceder a mezclar la muestra hasta homogeneizarla. Si es necesario, centrifugar a una velocidad adecuada para separar la fase sólida de la líquida. Psoteriormente eliminar el sobrenadante. 9.1.6.2. Muestra testigo. Efectuar una extracción (ver Apéndice B) exhaustiva (de 4h a 5h) empleando metanol, grado, grado plaguicidad. Recuperar el sedimento y evaporar el metanol remanente a temperatura ambiente, o utilizando un horno de secado a 40ºC. Para la muestra problema y testigo (ver incisos 9.1.6.1. y 9.1.6.2.), determinar la masa de 0,3g de sedimento o fase sólida en tubo de ensaye, agregar 3,000µl de medio de dilución para fase sólida, preparado según el inciso 7.1.2.4. para efectos de cálculo, considerar únicamente la masa seca de la muestra. 9.1.7. Preparación de la bacteria y desarrollo de la prueba.(ver figura 1, número 3) Sacar un frasco de bacteria liofilizada del congelador; de inmediato, vaciar en él, el medio de reconstitución contenida en la celdilla R (mantenida a 5,5ºC) y suspender. Estas acciones deben efectuarse rápidamente para evitar un efecto de choque osmótico a las bacterias. Transferir la mezcla nuevamente a la celdilla R (ahora RB), y continuar su incubación a 5,5ºC. Mezclar el contenido de dicha celdilla con una micropipeta. Esto implica la aspiración y eyección de la mezcla en la celdilla; repetir el mismo proceso 20 veces. 9.2. Acondicionamiento. Las muestras de agua, lixiviados y sedimentos se almacenan dependiendo del tiempo entre la toma y el inicio del análisis, es decir:


Si el análisis de la muestras se realiza dentro de las primeras 48h, se deben almacenar a 4ºC ± 2ºC, en los recipientes indicados en 7.2.2.10; deben ser llenados completamente, evitando dejar espacio entre la muestra y el tapón. Si el análisis se realiza después de 48h y hasta 12 días posteriores a la fecha de colecta, la temperatura de conservación debe ser de –10ºC Las muestras deben ser preservadas sin la adición de producto químico alguno. Antes de iniciar el análisis, las muestras deben ser descongeladas a temperatura ambiente; posteriormente, agitar para lograr la homogeneización, sin abrir el recipiente y dejar reposar 30min para alcanzar el equilibrio. Si el análisis se realiza después de 48h, se debe reportar el tiempo transcurrido entre la colecta y el análisis. Las muestras preservadas pro más de 12 días no son válidas para realizar pruebas de toxicidad. El tiempo cero, en una muestra compuesta, es el momento de la toma de la última colecta simple o instantánea. El tiempo final, es el momento en el que las bacterias reconstituidas entran en contacto con la muestra. 10.- PROCEDIMIENTO. La prueba de toxicidad aguda con photobacterium phosphoreum se realiza por duplicado utilizando cuatro diluciones (90%, 45%, 22,5 %, 11,25%), y un control por réplica. 10.1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre, marina,

lixiviados, agua interstical y extractos acuosas de sedimento, (ver figura 1) 10.1.1. Estabilizar el baño de recirculación o sistema automatizado a 15ºC ± 0,5ºC durante el análisis. 10.2.2. Colocar 5 celdillas (de la A1 a la A5) en los pozos de incubación del luminómetro o en el soporte de celdillas en el baño de recirculación o sistema de control de temperatura a 15ºC ± 0,5ºC. 10.1.3. Colocar 5 celdillas ® en el pozo de incubación del luminómetro o en el soporte de celdillas en un baño de recirculación o sistemas de control de temperatura a 5,5ºC. 10.1.4. Agregar a la celdilla R, la cantidad apropiada de medio de reconstitución para alcanzar una densidad bacteriana de 1 X 108 células/ml.


1.-Preparación de la muestra.

FIGURA1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre, marina, agua interstical, lixiviados y extracto acuoso de sedimentos


10.1.5. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuoso de sedimentos provenientes de sistemas de agua dulce y lixiviados. Agregar 1 000µl del medio de dilución (ver inciso 9.1.1) a las celdillas A1, A2, A3 Y A4 indicadas en 10.1.2. 10.1.6. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuosos de sedimentos, provenientes de sistemas de agua salobre o marinos y lixiviados. En caso de muestras salobres, adicionar 1 00µl a la celdillas A1, A2, A3 y A4 del medio de dilución que corresponda de acuerdo al inciso 9.1.2. en caso de muestras de agua marina, utilizar como diluyente agua de mar artificial o marina. 10.1.7. Agregar 2 750 µl de la muestra preparada según los incisos 9.1.1, 9.1.2. y 9.1.3.

para muestras de agua dulce, salobre y marina respectivamente, a la celdilla A5. 10.1.7.1. Efectuar una serie de 3 diluciones partiendo de la celdilla A5 y finalizando en A2, en un patrón de dilución 1:2, obteniéndose las concentraciones al 90%, 45%, 22,5% y 11,25%, que se preparan transfiriendo volúmenes de 1 000µL a cada celdilla. Posteriormente desechar de A2 1 000µL y 750 µL de A5 para uniformizar volúmenes. La celdilla A1 contienen sólo medio de dilución y es considerada control (ver figura 1 número 2). 10.1.8. En el caso de que los límites de confianza se localicen fuera de ± 15% del valor de CE50 obtenido (considerando un 95% de confiabilidad estadística), se debe repetir la prueba para obtener mayor precisión. Con la misma finalidad, también se puede elaborar una serie con un mayor número de diluciones utilizando factores como: 1:1,2 ó 1:1,25 ó 1:1,33. Para su elaboración se debe emplear un factor de dilución menor a 2, como puede ser: 1:1,2 ó 1:1,25 ó 1:1,33. 10.1.9. Adicionar con una micropipeta 10 µL de suspensión bacteriana (celdilla RB) a cada una de las celdillas de prueba (de la A1 a la A5) y agitar ligeramente para asegurar su correcta distribución en la solución. Inmediatamente poner en funcionamiento el cronómetro ajustado para indicar el tiempo a los 5min y 15min. 10.1.10. Calibración del luminómetro. Al sonar la primera alarma (5min), colocar la celdilla A1 (control) en el luminómetro y calibrar la lectura al 90% de la escala; posteriormente, registrar las lecturas de las celdillas A1 a la A5. 10.1.11. Realizar el procedimiento por duplicado de los incisos: 10.1.2. 10.1.5, 10.1.6., 10.1.7, 10.1.7.1, 10.1.9 y 10.1.1.10.


10.2. Prueba de fase sólida o sedimentos. La técnica para fase sólida o sedimentos. La técnica para fase sólida permita la medición del efecto de tóxicos fuertemente adheridos a partículas sólidas en suelos y sedimentos. Este procedimiento permite el contacto de la bacteria con el complejo tóxico-partícula sólida. Este procedimiento debe utilizarse en esta norma como una forma preliminar de evaluación de sedimentos, ya que el contacto de la partícula sólida con la bacteria siempre ocasiona reducción en la luminiscencia detectada aún cuando el sedimento no contenga tóxicos (respuesta falso positiva). Algunos de los factores que pueden producir este efecto son: - Adsorción de las bacterias a las partículas sólidas. - Efectos de sombra de las partículas en suspensión sobre la detección de

bioluminiscencia. - Floculación bacteriana. Por lo anterior, es necesario preparar una muestra testigo para cada muestra problema, de acuerdo al inciso 9.1.6. 10.2.1. Procedimiento 10.2.1.1. Preparación de la celdilla R proceder conforme a los incisos 10.1.3. y 10.1.4. 10.2.1.2. Desarrollo de la prueba (ver figura 2) este procedimiento debe realizarse tanto para la muestra problema como para la muestra testigo. Introducir 15 tubos de ensaye (denominados a1, b1 a b5 y c1 a c5) para fase sólida en el soporte de tubos de ensaye y colocarlos en la incubadora con baño de recirculación a 15ºC; agregar 1 500µL de medio de dilución para fase sólida (ver inciso 7.1.2.4.) en cada uno de los tubos, excepto en el tubo c5. Colocar en el tubo c5 la muestra preparada de acuerdo al inciso 9.1.6. cubrir con parafilm y agitar hasta obtener una suspensión homogénea (ver figura 2, paso 1).


Utilizar una pipeta de 1000µL a 5 000µL para mezclar y resuspender el contenido del tubo c5 llenando y vaciando la pipeta de 5 a 6 veces; mientras los sólidos están en suspensión transferir 1 500µL de éste al tubo c44; mezclar éste último. Transferir 1 500 µL del tubo c4 al c3, mezclar éste y repetir la operación hasta llegar al tubo a4. Posteriormente, descartar 1 500µL del tubo a4 para igualar volúmenes. Los tubos a1, a2 y a3 son controles. Esperar 10 min para alcanzar la uniformidad térmica (ver figura 2, Paso 2) Proceder conforme a lo indicado en el inciso 10.1.9. Poner en marcha un cronómetro de cuenta regresiva ajustado a 20 min, inmediatamente agregar 20µL de la suspensión bacteriana a cada uno de los 15 tubos en dirección a1 a a5, b1 ab5 y c1 a c5. Mezclar la muestra de cada tubo con una pipeta de 1 000 µL a 5 ... µL, succionando y vaciando ésta de 5 a 6 veces. Tres minutos antes de que termine la cuenta regresiva, insertar las columnas filtradoras en cada uno de los tubos, cuidando de que éstas no toquen el sobrenadante. Una vez transcurridos los 20min, empujar suavemente las columnas en la muestra, debiéndose detener antes de llegar al nivel superior de los sólidos sedimentados; posteriormente, transferir 500µL del filtrado de la columna a la celdilla correspondiente en el sopor te de celdillas, en la misma dirección indicada en el inciso anterior, ajustar el cronómetro al tiempo de prueba (5min). Tiempo total de exposición: 25min (ver figura 2, paso 3) Proceder según el inciso 10.1.10 con la celdilla A1 del soporte de celdillas.


FIGURA 2.- Procedimiento para preparar muestras de fase sólida o sedimentos.


Al sonar la alarma, colocar la celdilla A1, referida como control, en el luminometro y calibrar la lectura al 90%, posteriormente registrar las lecturas de las celdillas a1 a la c5. 10.2.2. Para el caso de muestras extremadamente tóxicas, tanto de agua como de sedimento, en las cuales no sea factible detectar bioluminiscencia, es indispensable preparar todas las diluciones necesarias, de acuerdo al inciso 10.2.3, para obtener el valor de CE50 consultar el capítulo 11 de esta norma. 10.2.3. Preparación de diluciones. Cualquier tren de diluciones puede funcionar; sin embargo, diluciones 1:10 son fáciles de efectuar. Par un volumen no mayor de las celdillas requeridas, se deben utilizar 250 µL de muestra y 2 250µL de medio de dilución para un volumen total de 2,5 µL. En caso de requerir diluciones mayores, preparar diluciones 1:1’’ y/ó 1:1 000. Para la obtención del resultado, se debe considerar el factor de dilución utilizado. 10.3. Evaluación de sensibilidad. El laboratorio que realice pruebas de toxicidad como photobacterium phosphoreum debe validar la sensibilidad del organismo utilizando cualquiera de los 2 tóxicos de referencia señalados en los incisos 10.3.3.1. y 10.3.3.2. de esta norma. Esto se debe llevar a cabo en cuando se presente alguno de los siguientes casos: - Se observen anomalías en la respuesta. - Se inicie el uso de un lote de bacterias. - Se inicie el análisis de un lote de muestras. 10.3.1. Los tóxicos de referencia deben tener como principales características la siguientes: - Amplio espectro tóxico. - Facilidad de obtención en forma pura - Alta solubilidad en agua - Persistencia y estabilidad en solución - Estabilidad en almacenamiento - Facilidad de cuantificación. 10.3.2. La sensibilidad de Photobacterium phosphoreum se evalúa mediante la determinación de la CE50, empleando concentraciones establecidas de alguno de los tóxicos de referencia sugeridos: fenol (C6H5-0H) y sulfato de zinc (ZnSO4). El método y las condiciones de prueba, deben ser los descritos en la presente norma, de acuerdo al inciso 10.1.


10.3.3. Tóxicos de referencia 10.3.3.1. Fenol (C6H5-OH) La CE50 que presenta este compuesto para Photobacterium phosphoreum se encuentra entre 13mg/L y 26mg/L a un tiempo de exposición de 5 min. Este tóxico produce un efecto claro y rápido. La solución patrón de fenol se prepara a una concentración de 100mg/L y se conserva en un frasco ámbar a 4ºC ± 2ºC de 3 meses a 4 meses. Realizar el análisis con el estándar de fenol con lecturas a tiempos de 5min y 10min. 10.3.3.2. Sulfato de zinc (ZNSO4) La CE50 que presenta este compuesto para Photobacterium phosphoreum se encuentra entre 5mg/L y 12mg/L, a un tiempo de exposición de 10min. La solución patrón de sulfato de zinc (ZNSO4) se prepara a una concentración de 100mg/L y se conserva en un frasco ámbar a 4ºC ± 2ºC de 3 meses a 4 meses. 10.3. Los valores de CE50 determinados experimentalmente para los tóxicos de referencia,

deben quedar dentro de los intervalos mencionados, en caso contrario, se tienen elementos para suponer cualquiera de las siguientes posibilidades:

- Condiciones inadecuadas de almacenamiento de la bacteria liofilizada, siendo las

principales, tiempo y temperatura. - Reconstitución inadecuada de la bacteria. - Uso de la bacteria después de 2h de haber sido reconstituida. - Posible contaminación de alguno de los reactivos o materiales utilizados en el

ensayo. - Falta de pericia del analista. 10.5. Los tóxicos de referencia usados en esta norma pueden ser sustituidos por cualquier otro, siempre y cuando cumplan con las características señaladas en el inciso 10.3.1.


11.- EXPRESION DE RESULTADOS. Al término de la prueba, la CE50, debe obtenerse mediante los siguientes cálculos: 11.1. Cálculo del valor de Gamma ( r ) para cada concentración.

rt=Itc/It) - 1 donde rt es la Gamma al tiempo de incubación (t) Itc es el nivel de luz (I) al tiempo de incubación (t) del control (c) It es el nivel de luz (I) al tiempo de incubación (t) para cada concentración de la muestra. 11.2. Graficar las Gammas contra la concentración de la muestra en papel para gráficas Log-Log (ver figura 3); interpolar a valor de Gamma igual a 1 para obtener la CE50 11.3. El procedimiento de fase sólida, se expresa a partir de la siguiente relación:

CE50R = CE50M – CE50T Siempre que: CE50M > CE50T Donde: CE50R es igual a la CE50 real obtenida para análisis en sedimentos; CE50M es igual a la CE50 de la muestra problema; CE50T es igual a la CE50 de la muestra testigo.



12. INFORME DE LA PRUEBA. El informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos: 12.1. Localización de la cuenca hidrológica. 12.2. Nombre del cuerpo de agua receptor. 12.3. Datos de afluentes como sigue: a) Si es efluente industrial, indicar los siguientes datos de la empresa: razón socia,

dirección, teléfono, que produce o fabrica, que materias primas utiliza, horario de operación.

b) Si es efluente urbano o municipal, indicar los siguientes datos: localización, nombre de la ciudad o municipio.

c) Si es efluente agrícola, indicar lo siguiente datos: localización, tipo(s) de cultivo(s) y en su caso, que fertilizante(s) se utiliza (n).

d) Si es efluente urbano o municipal, indicar los siguientes datos: localización, nombre de la ciudad o municipio

Para los casos descritos en b), c) y d), además se debe especificar lo siguiente: - Caudal promedio (m3/día); caudal promedio durante el muestro (m3/s); en caso de contar con sistemas de tratamiento, breve descripción del mismo; localización de puntos (s) de muestreo seleccionado (s); método de colecta usado; fecha, período y horario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestras(s) y el inicio del análisis; temperatura de la(s) muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo; responsable(s) del muestreo. 12.4. En el caso de pruebas en cuerpos receptores, se debe indicar lo siguiente: Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado; fecha, período y horario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo; responsables (s) del muestreo. 12.5. En el caso de pruebas en sedimento, se debe indicar: Profundidad; método utilizado para muestrear; tipo de sedimento aparente (limoso, rocoso, arenoso y cualquier otro); observaciones de campo; responsables (s) del muestreo. 12.6. En el caso de pruebas de lixiviados, se debe indicar: Razón social de la empresa; dirección; teléfono; que tipo(s) de residuo(s) se dispone(n); horario de colecta de las muestras. 12.7.Datos a registrar durante la prueba de toxicidad: Forma de almacenamiento y preservación de la(s) muestra(s); fecha del análisis; tipo de prueba realizada (en efluentes, cuerpos de agua, lixiviados y/o sedientos); datos


fisicoquímicos, en caso de análisis de agua, al inicio del análisis (pH, oxígeno disuelto y salinidad) y características aparentes (olor, color, turbiedad, presencia o ausencia de burbujas y espuma); registro de lectura al ajustar el luminómetro con celdilla control, Lectura al ajustar el luminómetro con celdilla control; lectura de emisión de luz de la bacteria en datos las celdillas de prueba a los tiempos de lectura establecidos; lectura de emisión de luz en las celdillas a los 5 min y 15min; cálculo del valor de Gamma ( r ) para cada concentración; cálculo de la CE50; responsable(s) prueba(s) de toxicidad. Si los análisis son par fase sólida, indicar: 12.7.1. Registro de lectura al ajustar el luminómetro con celdilla A1 Lectura de emisión en las celdillas restantes y valores de EE50M y CE50T 12.8.Análisis de resultados. Se deben dar las tablas y gráficas derivadas de la prueba de toxicidad, proveer los valores de CE50 de las pruebas de toxicidad con sus respectivos límites de confianza al 95%, así como las unidades de toxicidad obtenidas y método estadístico utilizado; discusión de resultados. 12.9.Datos adicionales: Indicar lo tóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CE50 obtenida y fecha de realización; responsables(s) de la realización de la prueba. 12.10. Conclusiones y recomendaciones. 12.11. Si se contrata a una empresa consultora, laboratorio o cualquier otro, que lleve a

cabo los análisis, indicar razón social, representante lega, dirección y teléfono. 13.- BIBLIOGRAFIA. 13.1. APHA, AWWA, WPCF, 1989. Standard Methods for the examination of water and

Wastewater. (Métodos para el análisis de agua y de aguas residuales) American Public health Association, Port City Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 10-200 p.± láminas.

13.2. Bulich, A.A. 1979. Use of luminescent Bacteria for Determining Toxicity in

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13.3. Bulinc, A.A. 1990. The Luminescent Bacteria Toxicity Test: its Potential as an in Vitro Alternative. (Prueba de toxicidad de la bacteria Luminiscente: su potencial como una alternativa in Vitro) Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 5: 71-71.

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Luminescent Bacteria Photobacterium phosphoreum. (Método de prueba biológica: Prueba de toxicidad utulizando la bacteria Luminiscente Photobacterium Phosporeum) EPS 1/RM/24. 61p.

13.9. Danilov, V.S., A. D. Ismailov and N. A. Baranova. 1985. The inhibition of bacterial

bioluminescence by xenobiotics. (Inhibición de la bioluminiscencia bacteriana por xenobióticos). Xenobiotica. Vol. 15 (4):271-276.

13.10. Dezwart, D. And W. Slooff. 1983 The Microtox as an Alternative Assay in the

Acute Tocity Assessment of Water Pollutants. (el Micotox como un ensayo alternativo del análisi de toxicidad aguda de contmainantes de agua). Aquatic. Toxicol. 4:129-138 pp.

13.11. DIN 38 412 Parte 34: Determination of the inhibitory effect of waster water on the

light emission of Photobacterium phosphoreum. (Test using preserved luminiscent bacteria) (Determinación del efecto inhibitorio de las aguas residuales sobre la emisión de luz de Photobacterium phosphoreum.-Prueba que utiliza una bacteria Luminiscente liofilizada)


13.12. Dutka, B. J., G. Bitton. 1986. Toxicity Testing Using Microorganisms. (Pruebas de toxicidad utilizando microorganismos) Vol. II. CRC Press, Inc. Florida . 202 p.

13.13. EPA, 1991. Mhetods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving

Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Método par medir la toxicidad aguda de efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y dulceacuícolos) EPA/600/4-90/027.

13.14. EPS, 1990. Guidance Document on Control of Toxicity Tests Precision Using

Reference Toxicants. (Guía para el control de la precisión en la prueba de toxicidad utilizando tóxicos de referencia) Report EPS 1/RM/12 Canadá.

13.15. Greene, J.C., W.E. Miller, M.K. Debacon, M. A. Long and C. L. Bartels, 1985. A

Comparison of Three Microbial Assay Procedures for Measuring Toxicity of Chemical Residues. (una comparación de tres procedimientos de ensayos microbionos para la evaluación de la toxicidad de residuos químicos). Arch. Environ. Contam. Toxicol., 14:659-667.

13.16. Kinne, o. 1971 Marine Ecology. (Ecología Marina). Volumen 1 Environmental

Factores Part. 2. Wiley Interscience. New Tork 13.17. Mallak, F.P. and R. L. Brunker. 1983 Determination of the Toxicity of Selected

Metalworking Fluid Preservatives by Use of the Microtox System and an In-Vitro Enzyme Assay. (Determinación de la toxicidad de preservativos selectos de fluidos de acabados metálicos) In B. J. Dutka and D. Liu (ed.), Toxicity screening procedures using bacterial systems. Toxicity Series, Vol. 1. Marcel Dekkar, New York. 65-76 pp.

13.18. McFeters, G.A., P. J. Bond, S. B. Olson and y. T. Tchan, 1983. A Comparison of

Microbial Bioassays for the Detection of Aquatic Toxicants. (comparación de los bioensayos microbianos para la detección de tóxicos en el agua) Water Res., 17 (12): 1757-1762.

13.19. O`Brien, T.A. and G.J. Bacher. 1990. Toxicity of Industrial and Domestic Complex

Effluents to three Australian Freshwater Orgamisms and the Microtox Bacteria. Aquatic Biology Sectio, Frescwater Fisheries Management Branch, Arthur Rylah Institute, Fisheries Division, department of Conservation Forests and Lands.

13.20. Pielou, E.C. 1969. An Introduction to Mathematical ecology. (Introducción a la

Ecología matemática) wiley Intersciencies John Wiley and Sons, New Tork. 13.21. SARH. 1992. Ley de Aguas Nacionales. Publicada en el Diario Oficial de la

Federación del 1 de diciembre de 1992. 13.22. SEDUE. 1988. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente.

Publicada en el Diario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988.


13.23. Stephan, C.E., 1977 Methods for calculation an LC50. (Métodos para el cálculo de la CL50) In: Mayer y J.L. Hamelind, (Eds.), Aquatic Toxicology and hazard Evaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania: 65-84 pp.

14.- CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES. Esta norma no concuerda con ninguna norma internacional por no existir referencia alguna al momento de su elaboración. (ver Apéndice a).

APENDICE A INFORMATIVO. Cabe señalar que para la elaboración de la presente Norma Mexicana, se llevó a cabo tomando como base investigación realizada a nivel nacional y con información consultada de normas extranjeras.

APENDICE B INFORMATIVO El sistema de extracción utilizado puede ser el Soxhlet o equivalente.

MÉXICO, D.F. A 6 marzo.1996 LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.

LIC. MA. EUGENIA BRACHO GONZALEZ.


Y

FOMENTO INDUSTRIAL

NORMA MEXICANA


ANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Artemia franciscana Kellogg (CRUSTACEA – ANOSTRACA) –

METODO DE PRUEBA.

WATER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Artemia franciscana Kellogg (CRUSTACEA-ANOSTRACA) – TEST METHOD.



PREFACIO En la elaboración de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones: - ASESORIA Y CONSULTORIA ECOLOGICA – REMMSA - ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA - BACTON DICKINSON DE MEXICO. - CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL - EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA EN

LA ZONA DE CIVAC. - F.J. SALCEDO Y COMPAÑÍA - INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO - INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Centro de Investigación y de Estudios Avanzados; Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

- INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC - JUNTA MUNICIPAL DE AGUA Y SANAMIENTO DE CIUDAD JUAREZ

CHIHUAHUA. - SECRETARIA DE MARINA

Dirección General de Oceanografía Naval - SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA.

Comisión Nacional de Agua; Dirección General de Acuacultura. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua; Instituto Nacional de Ecología, Instituto Nacional de la Pesca.

- UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO.


INDICE DEL CONTENIDO Núm. del Capítulo 1. Objetivo 2. Campo de aplicación 3. Referencias 4. Definiciones 5. Muestreo 6. Principio 7. Reactivos y materiales 8. Aparatos y/o instrumentos 9. Preparación y acondicionamiento de las muestras. 10. Procedimiento 11. Expresión de los resultados 12. Informe de la prueba 13. Bibliografía 14. Concordancia con normas internacionales.

Apéndice (informativo)


ANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Artemia franciscana Kellogg (CRUSTACEA – ANOSTRACA) – METODO DE PRUEBA.

WATER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Artemia franciscana

Kellogg (CRUSTACEA-ANOSTRACA) – TEST METHOD.

1 OBJETIVO Esta Norma Mexicana establece el método biológico para la evaluación d la calidad del agua mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando Artemia franciscana. 2 CAMPO DE APLICACION Esta Norma Mexicana es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos de agua salobres y marinos, así como aguas residuales industriales, municipales y agrícolas, lixiviados, sustancias puras o combinadas y extractos acuosos con salinidades mayores a diez. 3. REFERENCIAS. NMX-AA-007 Aguas – Determinación de la temperatura. NMX-AA-008 Aguas – Determinación del pH NMX-AA-087-SCFI Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphnia

magna. Straus (Crustacea-Cladocera) – Método de prueba. NOM-053-ECOL Que establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba de

extracción para determinar los constituyentes que hacen de un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.

4 DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma, se establecen las siguientes definiciones: 4.1. Agua de mar artificial Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares al agua marina.


4.2. Artemia franciscana (Kellogg, 1906) Organismo planctónico que en promedio mide de 8 mm a 12 mm de longitud en etapa adulta y 35 µm en la etapa naupliar. Con 42 cromosomas, de 1 a 3 cromocentro, diploides, furca con dos lóbulos, con varias setes y constricción basal. Presenta dimorfismo sexual: el macho tienen penes con espina; su segundo par de antenas bien desarrolladas, funciona como órgano présil para retener a la hembra; en cada antena lleva una protuberancia semiesférica; la hembra tiene un saco ovígero en la parte ventral, el cual, visto lateralmente, es puntiagudo. Generalmente habita en aguas salobres e hipersalinas, cuya concentración varía desde 5 g/L hasta 150 g/L. Es una especie originaria del continente americano, (ver figura 1).

FIGURA 1.- Artemia franciscana.

4.3. Clase crustácea Categoría taxonómica que agrupa a los organismos mandibulados, los cuales presentan exoesqueleto quitinoso con sales calcáreas, por lo que el caparazón a veces es muy duro. Tiene dos pares de apéndices prebucales que constituyen el primero y segundo par de antenas; al primer par también se le conoce como aténulas. El segundo par, aunque se encuentra antes de la boca, en su origen es postoral. Después de la boca, los crustáceos poseen numerosos pares de apéndices. Con excepción del primer par de antenas, todos los apéndices derivan de apéndices birramios. Durante su desarrollo, en general, presentan metamorfosis y un estado larval llamado “nauplio” (ver inciso 4.12) de tipo muy primitivo.


4.4. Concentración letal media (Cl50) Es la concentración de una sustancia (pura o combinada) o efluente, que en una prueba de toxicidad aguda, provoca un efecto letal en 50% de los organismos expuestos durante un tiempo determinado. 4.5. Cuerpos de agua. Son los mares, lagos, lagunas costeras, estuarios, acuíferos, ríos y sus efluentes directos o indirectos, permanentes o intermitentes, presas, cuencas, cauces, canales, embalses, cenotes, manantiales, y demás depósitos o corrientes de agua y redes colectoras, con excepción de los sistemas de drenajes y alcantarillado urbano y municipal. 4.6. Cuerpos receptores. Son todos los mencionados en el inciso 4.5. que reciban directa o indirectamente descargas. 4.7. Descarga. Aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistema de drenaje y alcantarillado urbano o municipal, incluyéndose los procesos de infiltración e inyección. 4.8. Efluente. Es el agua u otro líquido que procede de un embolse, cuenca, proceso o planta de tratamiento. 4.9. Inmovilidad. Es la incapacidad de los nauplios (ver inciso 4.12) para presentar algún movimiento apendicular, después de 10s de observación mediante la utilización de un microscopio estereoscópico. Este criterio se emplea en esta norma como un indicador de mortalidad de los organismos. 4.10. Lixiviado. Es el líquido proveniente de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre o perculación y que contiene, disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran en los mismos residuos. 4.11. Muestra simple o instantánea. Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga de aguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo.


4.12. Nauplio. Es la primera etapa de desarrollo de un crustáceo y abarca desde que emerge del huevo hasta la primera muda. El nauplio recién nacido tiene forma ovoide, mide en promedio 350 µm de longitud; su cuerpo muestra tres segmentos cefálicos y una región post mandibular no segmentada, un ojo naupliar y labrum amplio, debajo del cual se encuentra la boca. En el primer segmento cefálico lleva un par de antenas llamadas anténulas, colocadas una a cada lado del ojo naupliar; en el segundo segmento cefálico se ubica el segundo par de antenas que son apéndices birramios y funcionan como las primeras estructuras de locomoción; el tercer segmento, lleva las mandíbulas que también son birramiadas, (ver figura 2)

FIGURA 2. Nauplio 4.13. Orden anostraca. Categoría taxonómica que agrupa a organismos sin caparazón, ojos compuestos pedunculados, antenas prensibles bien desarrolladas en los machos y reducidas en las hembras, poseen de 11 a 19 pares de apéndices en el tronco. Sin apéndices postgeneitales. Rama furcal unisegmentada. Con metamorfosis en su desarrollo. Tienen la capacidad de tomar huevos resistentes llamados quistes. Las aberturas genitales de hembras y machos se localizan en un segmento que resulta de la fusión de los segmentos 12 y 13 del tronco. En la etapa de la reproducción, la hembra muestra una bolsa de la reproducción, la hembra muestra una bolsa de huevecillos (ovisaco), en la cara ventral de los primeros segmentos postgenitales.


4.14. Prueba de toxicidad (bioensayos de toxicidad) Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras o combinadas, lixiviados, extractos acuosos, aguas residuales industriales, municipales, agrícolas y aguas provenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto tóxico. 4.15. Quiste. Es un estado de desarrollo embrionario en etapa de gástrula, protegido por una cubierta constituida por tres estructuras; corión, membrana cuticular externa y cutícula embrionaria. Los quistes tienen una masa de 2,8µg a 4µg. Miden 200µm a 300µm y son de color marrón claro. Cuando están deshidratados tienen la apariencia de balones desinflados y al hidratarse se tornan esféricos. 4.16. Salinidad Es la cantidad total de materia sólida, en gramos, disuelta en 1 kg. de solución acuosa después de que todos los carbonatos se han convertido en óxidos, todos los bromuros y yoduros reemplazados por cloruros y toda la metería orgánica se ha oxidado. 4.17. Sedimento Material particulado o granular que se deposita en el fondo de un cuerpo de agua, sistema de drenaje y alcantarillado urbano o municipal. 4.18. Sustancia combinada. Es aquella que se forma por la integración de dos o más compuestos en una proporción no mayor al 98% de cualquiera de ellos. Para fines de esta norma las sustancias combinadas pueden ser de aguas; residuales industriales, municipales y agrícolas, lixiviados y extractos acuosos con salinidades mayores a diez. 4.19. Sustancia pura. Elemento o conjunto de dos o más elementos combinados químicamente, que dan lugar a un compuesto con pureza no menor al 98%, por ejemplo: dicromato de potasio (K2Cr2O7), fenol (CH6-OH), sulfato de zinc (ZnSO4).


4.20. Tiempo de exposición. Es el período en el que se someten los organismos a las soluciones de prueba, en un bioensayo de toxicidad. 4.21. Toxicidad aguda. Es el efecto letal que se produce después de exponer a los organismos prueba, a sustancias puras o combinadas una sola vez, durante un período corto. 4.22. Tóxico. Es cualquier sustancia pura o combinada que al entrar en contacto con un organismo, produce daños estructurales, alteraciones bioquímicas o fisiológicas o incluso la muerte, dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición. 4.23. Tóxico de referencia. Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad, cuyo efecto en los organismos, a determinadas concentraciones, es conocido y por lo tanto permite establecer el estado de respuesta de los organismos de prueba empleados, así como comparar los resultados intra e inter laboratorios. El uso de estos tóxico, proporciona también una evaluación general de la precisión (estabilidad y reproducibilidad del método a través del tiempo. 5 MUESTREO. El muestreo tanto de cuerpos de agua como de efluentes industriales, municipales y agrícolas, constituyen una parte integral y fundamental de cualquier programa de monitoreo de la calidad del agua, pues proporciona bases para la evaluación de propiedades y efectos potenciales del agua, sobre los organismos de ecosistema. 5.1. Muestreo en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuosos y lixiviados. Se toman muestras compuestas de dos litros (volumen total), en recipientes de plástico inerte o de vidrio borosilicato, los cuales deben ser llenados completamente y sellados. El número de muestras instantáneas o simples, necesarias para formar una muestra compuesta depende de las horas en que se opere el proceso generador de la descarga, como se especifica en la tabla 1.


TABLA 1 Muestras instantáneas requeridas para formar una muestra compuesta.

Intervalo para la obtención de muestras simples.

Horas por día en que se opera el proceso generador de la descarga.

Número de muestras

Mínimo Máximo Hasta 8 h Más de 8 h y hasta 12h Más de 12 y hasta 18h Más de 18h y hasta 24h

4 4 6 6

1,0 2,0 2,0 3,0

2,0 3,0 4,0 3,0

Para determinar el volumen de las muestras instantáneas o simples para la preparación de una muestra compuesta, se debe seguir el ejemplo del apéndice n de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias). 5.2. Muestreo en cuerpos de agua. Se debe establecer una red de muestreo que represente las condiciones del cuerpo receptor, las muestras deben ser simples y las muestras compuestas de 2L, colectadas en la misma forma que en el inciso 5.1. Deben registrarse los parámetros fisicoquímicos básicos (salinidad, pH, oxígeno disuelto y temperatura), anotando las siguientes características aparentes: - Olor - Color - Turbiedad - Presencia o ausencia de burbujas y espuma. 5.3. Muestreo de lixiviados el muestreo de lixiviados se debe efectuar en los pozos de monitoreo de los sistemas de captación de los mismos, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL, (ver 3 Referencias). Toda muestra debe colectarse en recipientes de plástico inerte o de vidrio borosilicato; éstos deben ser llenados completamente y sellados. Se deben tomar las medidas precautorias necesarias utilizado el equipo de seguridad adecuado (guantes de Látex, mascarillas, lentes protectores y cualquier otro)


5.4. Muestreo de sedimentos. El muestreo de sedimentos se lleva a acabo utilizando una draga Ekman o similar, o bien un nucleador, siempre que se realice en cuerpos de agua cuya profundidad sea igual o mayor a 50 cm. Si el muestreo se efectúa a profundidades menores a la anterior, se utiliza una pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte. En cualquiera de los dos casos mencionados, la muestra que se considera para el análisis corresponde a la lámina superior de sedimento con un espesor de 3 cm y masa húmeda aproximada de 2 Kg. Al efectuar el muestreo, se recomienda considerar lo siguiente: - Cuando se realiza el muestreo en sedimentos limosos, se sugiere introducir

lentamente la draga o el nucleador, para evitar remolinos y corrientes que suspendan el sedimento.

- Si el muestreo se realiza en un sedimento rocoso – arenoso, pueden quedar

atrapadas rocas pequeñas entre la mandíbulas de la draga, impidiendo el cierre adecuado de ésta, lo cual conduce a pérdidas de sedimento.

La draga o el nucleador deben lanzarse tantas veces como sea necesario hasta obtener la cantidad suficiente de sedimento. - Cuando se utilice la pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte, se debe

procurar sumergirla en dirección del flujo y, al llegar al fondo, introducirla lentamente inclinando la pala en un ángulo aproximado de 45º.

Posteriormente, arrastrar ésta paralelamente al fondo hasta obtener una cantidad suficiente. En seguida, se debe elevar la pala en forma casi horizontal (paralela al fondo) muy lentamente, para evitar pérdida de sedimento.

Para todos los casos anteriores, la muestra colectada para el análisis se coloca en bolsas de polietileno incoloras, las cuales deben quedar perfectamente cerradas, con objeto de proteger la acción de la luz solar. Este método se basa en la exposición controlada del crustáceo Artemia franciscana, a cuerpos de agua salobre o marino, sustancias puras o combinadas, cuya salinidad sea mayor a diez, para evaluar su efecto tóxico.


7 REACTIVOS Y MATERIALES. 7.1. Reactivos (grado analítico) - Acetona (C3H6O) - Acido bórico (H3BO3) - Acido nítrico (HNO3) - Agua destilada - Bicarbonato de sodio (NaHCO3) - Bromuro de potasio (KBr) - Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) - Cloruro de estroncio (SrCl2.6H2O) - Cloruro de magnesio (MgCl2.6H2O) - Cloruro de potasio (KCl) - Cloruro de sodio (NaCl ) - Fluoruro de sodio (NaF) - Lauril sulfato de sodio (Dodecil sulfato de sodio) (CH3) (CH2) 10CH2OSO3Na* - Sulfato de sodio (NaSO4.10H2O) NOTA 1.-*Reactivo empleado como tóxico de referencia. 7.2. Materiales. 7.2.1. De vidrio. - Caja de petri de 60 mm de diámetro y 12 mm de alto. - Embudo de separación de 125 ml. - Matraces aforados (diferentes capacidades) - Matraces Erlenmeyer (diferentes capacidades - Pipetas Pasteur con bulbo. - Pipetas volumétricas (diferentes capacidades) - Vaso de precipitado tipo Griffin de 30ml. 7.2.2. Material biológico. 7.2.2.1. Quistes de artemia franciscana. Se debe utilizar quistes como un máximo de 10% de humedad y garantizados por el proveedor. La condición de humedad debe mantenerse aún después de abierto el recipiente.


7.2.3. Otros materiales. - Bolsas de polietileno incoloras - Cubrebocas. - Detergente para uso en laboratorio. - Filtro de membrana de 0,45 µm. - Guantes de látex - Lentes protectores - Mascarillas - Pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte. - Propipetas - Recipientes de plástico inerte o de vidrio borosilicato - Soporte universal - Tamiz de luz de malla de nylon de 100µm - Tubo o manguera de plástico. 8 APARATOS Y/O INSTRUMENTOS. - Balanza analítica - Bomba de aire - Centrífuga refrigerada - Congelador - Droga tipo Ekman - Luxómetro - Microscopio estereoscópico. - Medidor de pH - Nucleador - Oxímetro - Parrilla magnética - Salinómetro, refractómetro o Densímetro. - Sistema de control de temperatura. - Termómetro. 9 PREPARACION Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS. Las muestras de agua (simples o instantáneas y compuestas), de lixiviados y de sedimentos, deben ser almacenadas, cuando se requiera, en el mismo recipiente donde fueron colectadas. Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC desde su colecta, y hasta 36 h y hasta 60 días posteriores a la fecha de colecta, se deben congelar a no más de –10ºC para evitar cambios debidos a la actividad microbiana, transformación química y/o pérdida de sustancias volátiles. Las pruebas de toxicidad realizadas fuera de estas condiciones, no son válidas.


Las muestras deben ser preservadas sin producto químico alguno. El tiempo cero, en una muestra compuesta, es el tiempo de la toma de la última colecta simple o instantánea. 10 PROCEDIMIENTO El área para pruebas de toxicidad debe ser exclusiva, con dimensiones mínimas de 6m2 y control de fotoperíodo (16 h Luz/8 h oscuridad). 10.1. Actividades previas en el laboratorio. Una vez que se conoce la fecha exacta en la que se debe llevar a cabo el bioensayo, se deben realizar las siguientes actividades: 10.1.1. Técnicas de eclosión de quistes de Artemia franciscana y obtención de nauplios. A un embudo de separación de 125 ml de capacidad, agregar 100ml de agua de mar artificial diluida. Establecer las condiciones que se mencionan en la tabla 2. Posteriormente, adicionar 100mg de quistes. TABLA 2.- Condiciones para llevar a cabo la eclosión de los quistes.

Parámetro Condiciones

Temperatura Luminosidad Salinidad Oxígeno disuelto Ph **

27ºC ± 3ºC 1 000 Luxes *

10 a 12 No menor al 80% de saturación

8,5 ± 0,5 NOTA 2. * Luxes se abrevia Lx NOTA 3 ** En caso necesario ajustar con bicarbonato de sodio. Aplicar aireación continua, mediante el uso de una manguera conectada a una bomba de aire la que, se introduce por la boca del embudo hasta el fondo para que los quistes se mantengan en movimiento y su distribución en el agua sea homogénea (ver figura 3). Procurar que la aireación sea moderada para no dañar los quistes. Exponer el embudo de separación a una fuente luminosa (luxómetro) colocada a una distancia tal que asegure que la iluminación incidente sea la requerida. Mantener la iluminación por lo menos durante 7h.


Si los quistes se mantienen durante 24h en las condiciones descritas, se obtiene la eficiencia de eclosión máxima. Posteriormente, suspender la aireación para que los nauplios se concentren en el fondo del embudo de separación; colectarlos en un tamiz de malla de nylon de 100 µm de abertura, abriendo la llave del embudo. Transferirlo a cajas de petri de 60 mm de diámetro y 12 mm de alto, donde deben permanecer hasta el inicio de la prueba. Con la ayuda de una pipeta Pasteur con bulbo, seleccionar los nauplios que presenten mayor movimiento. Para facilitar esta operación colocar una fuente luminosa por un lado de la caja de petri; aquellos nauplios que respondan más rápidamente al estímulo, son los indicados para utilizares en las pruebas de toxicidad.

FIGURA 3.-Equipo para eclosionar los quistes de Artemia franciscana.


10.2. Lavado de material. Todos los recipientes que entren en contacto con las muestras, deben lavarse perfectamente para eliminar residuos potencialmente tóxicos a los organismos de prueba, utilizando el método siguiente: 10.2.1. Lavar el material con detergente para uso en laboratorio y enjuagar dos veces con

agua de llave. 10.2.2. Enjuagar el material con ácido nítrico (HNO3) al 30% para eliminar residuos metálicos. Enjuagar con agua desionizada y escurrir. 10.2.3. Enjuagar con acetona (C3H6O) para eliminar residuos orgánicos. Enjuagar con agua desionizada y dejar secar completamente. Esta serie de lavados tienen que llevarse a cabo de 24h a 48h antes del bioensayo, protegiendo el material del polvo y otros factores. 10.2.4. Minutos antes de iniciar el bioensayo, enjuagar con agua de mar artificial los recipientes que van a contener a los organismos. 10.2.4.1. Preparación de agua de mar artificial El uso del agua de mar artificial es necesario para la prueba, ya que, tienen una composición química conocida y permite resultados reproducibles, su preparación debe efectuarse al menos con 72h de anticipación, cuidando que se efectúe tal y como se indica en la tabla 3, ya que de ello depende en gran parte la culminación exitosa de la prueba, (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.13.

TABLA 3.- Preparación de agua de mar artificial a una salinidad de 35

Solución A Solución B

Sales Cantidad (g) Sales Cantidad (g) NaCl 23,90 NaSO4.10H2O 9,06 MgCl 2.6H2O 10,83 NaHCO3 0,20 CaCl 2 anhidro 1,15 NaF 0,000 3 SrCl 2.6H2O 0,004 H3BO3 0,002 7 KCl 0,682 Agua destilada 100ml KBr 0,099 Agua destilada 856 ml

La solución B se adiciona lentamente a la solución a, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. Después de 24h, filtrar la mezcla utilizando un filtro de membrana de 0,45 µm.


Para comprobar la calidad óptima del agua de mar artificial, se deben colocar 10 nauplios en una muestra de 20ml, durante 24h; si al término del plazo no se registra mortalidad, el agua puede ser utilizada en la prueba. 10.3. Calibración de aparatos. Antes de cada prueba, se debe efectuar una calibración de aparatos (medidores de pH, oxígeno disuelto y de salinidad). 10.4. Preparación de extractos acuosos de sedimentos provenientes de ambientes salobres y marinos. Homogeneizar la muestra de sedimento colectada, mezclar con agua marina artificial en una relación 1:4 (masa/volumen) utilizando un matraz Erlenmeyer. Agitar vigorosamente durante 30 min utilizando una parrilla magnética. Centrifugar la mezcla a 10 000 r/min utilizando una centrífuga refrigerada hasta obtener una separación completa de las dos fases. Utilizar el sobrenadante para análisis. Repetir el procedimiento las veces necesarias hasta obtener el volumen de muestra suficiente para el análisis. 10.5. Período de prueba. Cuando la muestra llegue al laboratorio, se deben medir y anotar la salinidad, temperatura y el pH. Si el análisis no va a ser efectuado inmediatamente, mantener la muestra como se indica en el inciso 9 de esta norma, hasta que sea procesada. En caso de que la muestra llegue congelada al laboratorio, estos parámetros se determinan al inicio del bioensayo. La muestra debe descongelarse a temperatura ambiente. Las aguas provenientes de efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuosos y lixiviados, deben ser evaluadas a partir de una prueba exploratoria y una definitiva siempre que la salinidad sea igual o mayor que diez; en el análisis de sustancias puras solubles en agua se debe utilizar el mismo criterio. Para cuerpos de agua con salinidades mayores o iguales a diez, se realiza únicamente una prueba definitiva. 10.5.1. Prueba exploratoria en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuosos, lixiviados y sustancias puras. Esta prueba sirve para determinar si una muestra es tóxica o no, y en su caso, permite definir el intervalo de concentraciones que se deben aplicar en una prueba definitiva. En este bioensayo se prueban cinco concentraciones de la muestra: 100%, 50%, 25%, 12% y 6%, más un testigo, siguiendo los lineamientos de la tabla 4 de esta norma.


TABLA 4.-Condiciones de la prueba exploratoria con Artemia franciscana Kellogg

NOTA 4.- * Luxes se abrevia Lx. 10.5.2. Prueba definitiva en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos

acuosos lixiviados y sustancias puras.


El tiempo de exposición en la prueba definitiva es mayor que en la exploratorio; por lo tanto, la mortalidad pude incrementarse al final de la prueba y entonces la Cl 50 no necesariamente cae dentro del intervalo seleccionado. Debido a esto, al finalizar la prueba exploratoria se debe observar a los organismos que continúan vivos para determinar, de acuerdo al estado de afectación, el intervalo de concentraciones que va a ser usado en la prueba definitiva. Para la determinación del intervalo que debe ser usado en la prueba definitiva de estas muestras, se recomienda revisar los ejemplos de apéndice B de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias). Para la preparación de las diferentes diluciones, se debe contar con medidas de seguridad para evitar entrar en contacto directo con la muestras de agua residuales. Se recomienda utilizar propipetas, guantes de látex desechables y cubrebocas. 10.5.2.1. Condiciones para la prueba definitiva. En la tabla 5 de esta norma se agrupan las condiciones que deben observarse durante una prueba definitiva en muestras provenientes de efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuosos y lixiviados, así como en cuerpos de agua. 10.5.3. Prueba definitiva en cuerpos de agua. En esta prueba se deben preparar al menos, cinco concentraciones: 100%, 50%,25%, 12,5% y 6,25%, más el testigo, utilizando para ello pipetas volumétricas y matraces aforados de diferentes capacidades. NOTA 5.- Es las pruebas definitivas para efluentes y cuerpos de agua, se deben preparar al menos tres réplicas.


TABLA 5.- Condiciones de la prueba definitiva con Artemia franciscana Kellogg

NOTA 6.- * Luxes se abrevia Lx. 10.5.4. Evaluación de sensibilidad El laboratorio que realice pruebas de toxicidad debe validar la sensibilidad de la cepa de Artemia franciscana, realizando para ello, pruebas periódicas (se recomienda cada 2 meses), con el tóxico de referencia que se establece en el inciso 10.5.5.1. de esta norma. La sensibilidad del Artemia franciscana se evalúa mediante la determinación de la CL 50 en un bioensayo de 48h, aplicando concentraciones establecidas de tóxico de referencia. El método y las condiciones de prueba, deben ser los descritos en la presente norma.


10.5.5. Tóxicos de referencia. Los tóxicos de referencia deben cumplir con las siguientes características: - Amplio espectro tóxico. - Facilidad de obtención en forma pura - Alta solubilidad en agua - Persistencia y estabilidad en solución - Estabilidad en almacenamiento - Facilidad de cuantificación 10.5.5.1. El tóxico de referencia que se sugiere emplear en esta prueba es el lauril sulfato de sodio (dodecil sulfato de sodio) [(CH3)(CH2)10CH2OSO3Na], en las siguientes concentraciones: 2 mg/L, 4mg/L, 8mg/L, 16mg/L y 32mg/L. La Cl50 de referencia para este tóxico es de 16,6 mg/L ± 3,3 mg/L; el valor obtenido experimentalmente debe quedar dentro de este intervalo de confianza. En caso contrario, se recomienda no realizar más bioensayos con dicha cepa y sustituirla con una nueva para la prueba, la cual, también debe ser evaluada. 10.5.5.2. El tóxico de referencia descrito en esta norma puede ser sustituido por cualquier otro, siempre y cuando, cumpla con las características señaladas en el inciso 10.5.5. de esta norma, debiendo registrar el valor de CL 50 y el intervalo de confianza correspondiente. 10.6. Factores de variabilidad. Algunos de los factores de variabilidad pueden ser: - Manejo de los nauplios - Manejo del tóxico de referencia - Lavado de material - Pureza de los reactivos - Pericia y consistencia en las realización de las pruebas por parte de los analistas. 11 EXPRESION DE RESULTADOS. Para la obtención de la CL 50 se recomienda utilizar el Método de Unidades Probabilísticas “Probit” (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.12), el cual evalúa la relación concentración – respuesta de un contaminante sobre un organismo, medido en términos de su CL 50 y su precisión o intervalo de confianza de acuerdo a los lineamientos que se establecen en la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias).


11.1. Conteo de nauplios El conteo de nauplios inmóviles debe efectuarse a las 24h y 48h para el cálculo de CL 50. Si se tiene duda sobre la inmovilidad de los organismos, auxiliares de un microscopio estereoscópico. 11.2. Parámetros a evaluar. Durante la prueba, los parámetros fisicoquímicos (pH, temperatura, oxígeno disuelto y salinidad), se determinan al inicio y al término de la misma. Para fines de esta norma, el oxígeno disuelto y la salinidad se determinan mediante el empleo de un oxímetro y un salinómetro, densímetro o refractómetro respectivamente. La temperatura y el pH se determinan de acuerdo a la Normas Mexicanas NMX-AA-007 y NMZ-AA-008, (ver 3 Referencias). 12 INFORME DE LA PRUEBA. El informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos: 12.1. Cuenca hidrológica. 12.2. Nombre del cuerpo de agua receptor. 12.3. Si se trata de pruebas en efluentes, indicar 12.3.1. Responsable legal del efluente o descarga. 12.3.2. Si es efluente industrial: - Razón social de la empresa; dirección, teléfono, que produce; que materias primas

utiliza; horario de operación. 12.3.3. Si es efluente agrícola: - localización, tipo(s) de cultivo(s) y, en su caso, que fertilizante(s) y/o plaguicida(s)

se utiliza(n). 12.3.4. Si es efluente urbano o municipal - Localización, nombre de la ciudad o municipio. Para los casos descritos en los incisos 12.3.2, 13.3.3. y13.3.4, especificar además:


- Caudal promedio (m3/día); caudal promedio durante el muestreo (m3/s); en caso de contar con sistema de tratamiento, breve descripción del mismo, localización de punto(s) de muestreo seleccionado(s); método de colecta usado; fecha período y horario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) y el inicio del análisis; temperatura de la(s) muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo; responsable(s) del muestreo.

12.4. Si se trata de pruebas en cuerpos receptores, indicar: - Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado; fecha, período y

horario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo; responsables (s) del muestreo.

12.5 Datos a registrar durante la prueba de toxicidad; - Condiciones de almacenamiento y preservación de la(s) muestra(s); fecha de inicio

y término del análisis; tipo de prueba realizada (exploratoria y/o definitiva); datos fisicoquímicos al inicio del análisis (pH, oxígeno disuelto, salinidad, temperatura del agua) y características aparentes (color, olor, turbiedad, presencia o ausencia de burbujas y espuma); datos fisicoquímicos en las muestras al 100%, diluciones y testigo a las 24h y 48h de exposición (pH, oxígeno disuelto, salinidad, temperatura del agua) concentración(es) y/o definitiva(s) y la mortalidad o inmovilidad de los organismos prueba; responsable(s) de la realización de la(s) prueba(s) de toxicidad.

12.6. Análisis de resultados. - Tablas y gráfica(s) derivadas de la prueba de toxicidad, así como, anotaciones de las

observaciones diarias efectuadas en los organismos en cada concentración, incluyendo los testigos; indicar los valores de toxicidad obtenidos expresados en CL 50 (con su respectivos límites de confianza al 95%) y en unidades de toxicidad, método estadístico utilizado y discusión de resultados.

12.7. Datos adicionales: - Tóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CL 50 obtenida y fecha

de realización; responsable(s) de la realización de la prueba. 12.8. Conclusiones y recomendaciones. 12.9. Si se contrata a una empresa consultora, laboratorio, etc., para llevar a cabo los

análisis, indicar razón social, representante legal, dirección y teléfono.


13. BIBLIOGRAFIA 13.1. ABREU-GROBOIS, F.A. 1987. A review of the genetics of Artemia. (Una revisión

de la genética de Artemia) En: Artemia research and its Applications. Vol. 1. Morphology, Genetics, Strain Characterization, Toxicology. P. Sorgeloos; D.A. Bengston; W. Decleir and E. Jaspers (Eds.) Universal Press. Wetteren, Bélgica. Pp. 61-99

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México, d.f. pp. 14-15 13.6. CASTRO, M.J., De Lara A.R. 1991. Manual de Técnicas para el manejo de Quistes

de Artemia sp. UNAM. México. 47 pp. 13.7. CETESB, 1991 a Métodos de Avaliacáo de Toxicidade de Poluenes a Organismos

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13.8. CETESB, 1991 b. Procedimientos para utilizacáo de testes de toxicidade no controle

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13.9. CETESB, 1991 c. Implementacáo de testes de toxicidade no controle de efluentes

líquidos. (Implementación de pruebas de toxicidad en el control de efluentes líquidos) Serie Manuais. Sao Paulo, SP. Brasil, 7p.

13.10. EPA, 1991 Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving

Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Métodos para medir la toxicidad aguda de efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y dulceacuicolas) EPA/600-4-90/OZ7.

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diciembre de 1992. 13.15. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. Publicada en el

Diario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988. 13.16. LITCHFIELD, J.T.Jr. y F. Wilcoxon, 1949. A simplified method of evaluating dose

effect experiments. (Método simplificado para evaluar los efectos de las dosis en los experimentos) J. Pharm. Exp. Ther. 96:99-113.

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procedentes de dos salinas de México. Tesis de Licenciatura, UNAM Iztacala. México.

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membranes in encysted Artemia salina embryos during cryptobiosis and development. (Estructura del caparazón y membranas externas en el enquistamiento de los embriones de Artemia salina durante la criptobiosis y desarrollo). J. Ultrastruct. Res. 20:244-259.

13.20. PIELOU, E.C. 1969. An Introduction to Mathematical Ecology. (introducción a la

Ecología Matemática) Wiley Intersciencies John Wiley and Sons, Nueva York. 13.21. SAMOILOFF, M. 1984. Toxicity Testing of Sediments: Problems Trends, and

Solutions. (Pruebas de Toxicidad en Sedimentos: Problemas, Guías y Soluciones). Bioquest International, Inc., Winnipeg, Manitioba, Canadá. Pp. 143-159.

13.22. SORGELOOS, P. 1980. Life history of the brine shrimp Artemia (Ciclo de vida del

camarón de salmuera de Artemia.). p. XXI-XXIII. En : the brine shrimp Artemia. Vol. 1. Morphology, Genetics, Strain Characterization, Toxicology. P. Sorgeloos; D.A. Bengston; W. Decleir and E. Jaspers (Eds.) Universa Press. Wetteren, Bélgica.

13.23. STEPHAN, C.E. 1977. Methods for calculation an Lc50. (Métodos para el cálculo de

la CL 50) In: Mayer y J.L. Hamelink, (Eds.), Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania: 65-84.


13.24. VANHAECKE,P., PERSOONE, G., CLAUS, C. AND P. SORGELOOS. 1980. Researcha on the development of a short term standard toxicity test with Artemia nauplii. (Investigación sobre el desarrollo de una prueba de toxicidad estándar de corta duración con nauplios de Artemia). Pp. 263-285. En: G. Persoone; p. Sorgeloos; o. Roels y E. Jaspers. (Eds.) The Brine Shrimp. Artemia. Vol. 1. Morphology, Genetics, Radiobiology, Toxicology. Universa Press. Wetteren, Bélgica. 318 p.

13.25. VAZQUEZ, G. L. 1987. Zoología del phylum Arthropoda. Bravo, A. (Editor)

Editorial Interamericana. México, D.F. 174 pp. 14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES. Esta norma no concuerda con ninguna norma internacional por no existir referencia alguna al momento e su elaboración.

APENDICE INFORMATIVO. La elaboración de la presente Norma Mexicana se efectuó, tomando como base investigación realizada a nivel nacional y la información consultada de normas extranjeras.

MÉXICO, D.F. A 6 marzo.1996 LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.

LIC. MA. EUGENIA BRACHO GONZALEZ.

NMX-AA-102-SCFI-2006

CALIDAD DEL AGUA – DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES, ORGANISMOS COLIFORMES

TERMOTOLERANTES Y Escherichia coli PRESUNTIVA – MÉTODO DE FILTRACIÓN EN MEMBRANA (CANCELA A LA

NMX-AA-102-1987)

WATER QUALITY – DETECTION AND ENUMERATION OF COLIFORM ORGANISMS, THERMOTOLERANT COLIFORM

ORGANISMS AND PRESUMPTIVE Escherichia coli – MEMBRANE FILTRATION METHOD


PREFACIO En la elaboración de esta norma mexicana participaron las siguientes asociaciones, cámaras, dependencias, laboratorios privados, instituciones de educación superior e institutos de investigación: − CENTRO DE SERVICIOS QUIMICOS DE AGUASCALIENTES. − CENTRO NACIONAL DE METROLOGIA. − COMISION ESTATAL DE AGUA Y SANEAMIENTO. − COMISION FEDERAL DE ELECTRICIDAD. − COMISION NACIONAL DEL AGUA. − COMITÉ TÉCNICO DE NORMALIZACIÓN NACIONAL DE MEDIO

AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES − CORPORACION MEXICANA DE INVESTIGACION EN MATERIALES. − DIRECCION GENERAL DE NORMATIVIDAD Y APOYO TECNICO. − ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS I.P.N. − FISHER SCIENTIFIC MEXICANA S.A. DE C.V. (CASA ROCAS, S.A.) − GOBIERNO DEL DISTRITO FEDERAL

Dirección General de Construcción y Operación Hidráulica. − INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA. − INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO. − INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGIA. − INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES

MONTERREY. − LABORATORIO CONTROL QUIMICO/NOVAMANN, S.A. DE C.V. − LABORATORIO DE ECOLOGIA INDUSTRIAL, S.A. DE C.V.


− LABORATORIO DE PEMEX PERFORACION Y MANTENIMIENTO DE

POZOS. − LABORATORIO DE QUIMICA DEL MEDIO E INDUSTRIAL, S.A DE C.V. − LABORATORIO IDECA, S.A. DE C.V. − LABORATORIO QUIMICO INDUSTRIAL. − LABORATORIOS ABC QUIMICA, INVESTIGACION Y ANALISIS, S.A DE

C.V − MERCK- MEXICO, S.A. − PERKIN ELMER DE MEXICO, S.A. − PETROQUIMICA CANGREJERA, S.A. DE C.V. − PETROQUIMICA MORELOS, S.A DE C.V. − PETROQUIMICA PAJARITOS, S.A. DE C.V. − PROTECCION AMBIENTAL Y ECOLOGIA, S.A. DE C.V. − SECRETARIA DE SALUD. − SERVICIOS AMBIENTALES MULTIPLES E INGENIERIA, S.A. DE C.V. − SERVICIOS DE INGENIERIA Y CONSULTORIA AMBIENTAL. − SISTEMA INTERMUNICIPAL DE AGUA POTABLE Y ALCANTARILLADO. − UAM AZCAPOTZALCO. − UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MÉXICO. − UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.

Facultad de Química. Instituto de Geofísica. Instituto de Ingeniería.

− VARIAN, S.A. DE C.V.


PREFACIO Número de capítulo Página

0 Introducción 1

1 Objetivo y campo de aplicación 1

2 Referencias 2

3 Principio del método 2

4 Definiciones 3

5 Reactivos y patrones 5

6 Equipo y materiales 10

7 Recolección, preservación y almacenamiento de muestras 11

8 Control de calidad 11

9 Calibración 12

10 Procedimiento 12

11 Cálculos 15

12 Interferencias 17

13 Seguridad 17

14 Manejo de residuos 17

15 Bibliografía 18

16 Vigencia de esta norma 19

17 Concordancia con normas internacionales 19

NMX-AA-102-SCFI-2006 CDU: 628.163 CANCELA A LA NMX-AA-102-1987

CALIDAD DEL AGUA – DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES, ORGANISMOS COLIFORMES

TERMOTOLERANTES Y Escherichia coli PRESUNTIVA – MÉTODO DE FILTRACIÓN EN MEMBRANA (CANCELA A LA

NMX-AA-102-1987)

WATER QUALITY – DETECTION AND ENUMERATION OF COLIFORM ORGANISMS, THERMOTOLERANT COLIFORM

ORGANISMS AND PRESUMPTIVE Escherichia coli – MEMBRANE FILTRATION METHOD

0 INTRODUCCIÓN La presencia y extensión de la contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. El análisis de muestras de agua para determinar la presencia de miembros del grupo coliforme, que habitan normalmente en el intestino del hombre y otros animales de sangre caliente, da una indicación sensible de dicho tipo de contaminación. Dado que la capacidad de algunos miembros del grupo coliforme para sobrevivir en agua es limitada, sus números pueden emplearse también para estimar el grado de contaminación fecal. 1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta norma mexicana describe un método para la detección y enumeración de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia coli presuntiva (E. coli) en agua, después de una filtración a través de una membrana celulósica, su subsecuente cultivo en un medio diferencial lactosado y el cálculo de sus números en la muestra.

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Este método es aplicable a todo tipo de agua, exceptuando aguas salinas con altos contenidos de diatomeas o cuando números grandes de otros organismos puedan interferir con el crecimiento. La selección de las pruebas empleadas en la detección y confirmación de los grupos de organismos coliformes, incluyendo E. coli puede verse como parte de una secuencia continua. El grado de confirmación en una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y de las razones para llevar a cabo el examen. En la práctica, la detección en agua de E. coli presuntiva como se define en el punto 3.3 de esta norma da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal. 2 REFERENCIAS Esta norma mexicana se complementa con la siguiente norma oficial mexicana vigente o la que la sustituya: NOM-008-SCFI-2002 Sistema General de Unidades de Medida, publicada

en el Diario Oficial de la Federación el 27 de noviembre de 2002.

3 PRINCIPIO El método se basa en la filtración de una muestra directa o una alícuota de la muestra a través de una membrana de celulosa que retiene los organismos, colocando la membrana ya sea en un medio de cultivo selectivo de agar lactosado o en un cojinete absorbente saturado con un medio líquido lactosado. La membrana se incuba durante 24 h ya sea a 35°C – 37°C para la detección de organismos coliformes, o alternativamente a 44,0°C ± 1°C para la presencia de organismos coliformes termotolerantes. Se lleva a cabo la cuenta directa de las colonias características desarrolladas sobre la membrana, y algunas de estas colonias se resiembran para pruebas confirmativas para producción de gas e indol. Finalmente se hace el cálculo del número de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia coli presuntiva que pueden estar presentes en 100 mL de la muestra. El sistema de unidades utilizado en la presente norma debe cumplir con lo establecido en la norma oficial mexicana NOM-008-SCFI (ver 2 Referencias).

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4 DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma mexicana, se establecen las siguientes definiciones: 4.1 Aguas naturales Agua cruda, subterránea, de lluvia, de tormenta, de tormenta residual y superficial. 4.2 Aguas residuales Las aguas de composición variada provenientes de las descargas de usos municipales, industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticos y similares, así como la mezcla de ellas. 4.3 Bitácora Cuaderno de laboratorio debidamente foliado e identificado, en el cual los analistas anotan todos los datos de los procedimientos que siguen en el análisis de una muestra, así como todas las informaciones pertinentes y relevantes a su trabajo en el laboratorio. Es a partir de dichas bitácoras que los inspectores pueden reconstruir el proceso de análisis de una muestra tiempo después de que se llevó a cabo. 4.4 Blanco analítico o de reactivos Agua reactivo o matriz equivalente que no contiene, por adición deliberada, la presencia de ningún analíto o sustancia por determinar, pero que contiene los mismos disolventes, reactivos y se somete al mismo procedimiento analítico que la muestra problema. 4.5 Descarga Acción de verter, infiltrar, depositar o inyectar aguas residuales a un cuerpo receptor en forma continua, intermitente o fortuita, cuando éste es un bien del dominio público de la Nación. 4.6 Escherichia coli: presuntiva (E. coli) Bacilo Gram negativo , aeróbio o anaerobio facultativo no esporulado que se caracteriza por poseer la enzima beta- galactosidasa , se desarrolla a 44°C ± 0,1°C , fermenta la lactosa y el manitol produciendo ácido y gas , produce indol a partir del triptofano, es oxidasa negativo y no hidroliza la urea.

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4.7 Fermentación Oxidación aeróbica- anaerobica de compuestos por la acción enzimática de los microorganismos. 4.8 Filtro de membrana Técnica que se utiliza para determinar la cantidad de organismos presentes en un volumen de muestra determinado. 4.9 Medio selectivo Medio de cultivo sólido- líquido que contiene sustancias químicas específicas que permite el desarrollo de un grupo de organismos específicos, inhibiendo al mismo tiempo el desarrollo de otros. 4.10 Medios diferenciales Medio de cultivo sólido- líquido que contiene sustancias químicas específicas que permiten al observador diferenciar distintos tipos de organismos. 4.11 Muestra La que se tome en el punto de interés, de manera continua, en día normal de operación que refleje cuantitativa y cualitativamente el o los procesos más representativos de las actividades que generan la descarga, durante el tiempo necesario para completar cuando menos, un volumen suficiente para que se lleven a cabo los análisis necesarios para conocer su composición, aforando el caudal descargado en el sitio y en el momento de muestreo. 4.12 Organismo aerobio Organismo que requiere de oxígeno molecular para su desarrollo. 4.13 Organismo anaerobio Organismo que se desarrolla en ausencia de oxígeno molecular. 4.14 Organismo Anaerobio facultativo Organismo que se desarrolla tanto en condiciones aerobicas como anaerobicas.

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4.15 Organismos coliformes Comprende todos los bacilos aerobios o anaerobios facultativos Gram negativos , no esporulados que fermentan la lactosa a 35°C a 37°C con producción de gas y ácido en un periodo de 24 h a 48 h. 4.16 Organismos coliformes fecales (termotolerantes) Comprende todos los bacilos aerobios o anaerobios facultativos , Gram negativos , no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44ºC ± 1ºC en un plazo de 24 h. 4.17 Parámetro Variable que se utiliza como referencia para determinar la calidad del agua. 5 REACTIVOS Y PATRONES Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra cosa. Agua: Debe entenderse agua que cumpla con las siguientes características: a) Resistividad: megohm-cm a 25ºC: 0,2 Min.; b) Conductividad: µS /cm a 25ºC: 5,0 Máx.; c) pH: 5,0 a 8,0. En caso de utilizar medios deshidratados, seguir las recomendaciones del fabricante para su preparación y uso. 5.1 Diluyente. 5.1.1 Diluyente de peptona (0,1%): Peptona 1,0 g Agua para llevar a 1 000 mL Disolver la peptona en aproximadamente 950 mL de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1 mol/L ó ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1. Aforar a 1 000 mL con agua, distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min a una presión manométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg / cm

2).

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5.1.2 Solución salina de peptona: Peptona 1,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 8,5 g Agua para llevar a 1 000 mL Disolver los componentes hirviéndolos en aproximadamente 950 mL de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1 mol/L o ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1. LLevar a 1 000 mL con agua, distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min a una presión manométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg/Lcm

2).

5.1.3 Solución amortiguadora de fosfato: Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 42,5 mg Cloruro de magnesio (MgCl2) 190,0 mg Agua para llevar a 1 000 mL 5.1.3.1 Solución de fosfato: Disolver 34 g de fosfato en 500 mL de agua. Ajustar a pH 7,2 ± 0,5 con solución de hidróxido de sodio 1 mol/L y aforar a 1 000 mL con agua. 5.1.3.2 Solución de cloruro de magnesio: Disolver 38 g de cloruro de magnesio en 1 000 mL de agua. Para usarla, añadir 1,25 mL de solución de fosfato (6.1.4.1) y 5,0 mL de solución de cloruro de magnesio (6.1.4.2) a 1 000 mL de agua. Distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min a una presión manométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg/cm

2).

5.2 Medios de aislamiento Utilizar uno o más de los siguientes medios de cultivo ya sea en forma sólida como agar o bien como caldo para saturar cojinetes absorbentes: 5.2.1 Medio Endo para membrana Triptosa 10,0 g Tiopeptona 5,0 g Tripticasa (casitona) 5,0 g Extracto de levadura 1,5 g Lactosa 12,5 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 4,375 g

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Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 1,375 g Lauril sulfato de sodio (NaC12H25SO4) 0,05 g Desoxicolato de sodio 0,1 g Sulfito de sodio (Na2SO3) 2,1 g Fucsina básica 1,05 g Agua para llevar a 1 000 mL Disolver los componentes en agua conteniendo 20 mL de etanol 95% (v/v). Calentar a ebullición, quitar inmediatamente y enfriar a 45°C. No colocar en autoclave. El pH final debe ser de 7.1 a 7.3. Almacenar el medio a 4°C en la oscuridad y desechar el medio que no se haya usado después de 4 días. NOTA.- Este medio puede solidificarse adicionando de 1,2 % a 1,5 % (m/m) de

agar antes de hervirlo. 5.2.2 Agar LES Endo Extracto de levadura 1,2 g Tripticasa (casitona) 3,7 g Tiopeptona 3,7 g Triptosa 7,5 g Lactosa 9,4 g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 3,3 g Fosfato monobásico de potasio (KH2 PO4) 1,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 3,7 g Desoxicolato de sodio 0,1 g Lauril sulfato de sodio (NaC12 H25 SO4) 0,05 g Fucsina básica 0,8 g Agar 15,0 g Agua para llevar a 1 000 mL. Disolver los componentes en agua conteniendo 20 mL de etanol 95 % (v/v). Calentar a ebullición, enfriar y distribuir en volúmenes convenientes en cajas de Petri. No colocar en autoclave, almacenar el medio a 4°C en la oscuridad y desechar el medio que no se haya usado después de 2 semanas. 5.2.3 Medio MFC Triptosa 10,0 g Peptona proteosa No. 3 o polipeptona 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Lactosa 12,5 g Sales biliares No. 3 ó mezcla de sales biliares 1,5 g Azul anilina 0,1 g Agua para llevar a 1 000 mL

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Rehidratar en agua conteniendo 10 mL de ácido rosólico (aurina) (C19H14O3) al 1 % en NaOH 0,2 N. Calentar el medio hasta su punto de ebullición, quitar inmediatamente del calor enfriar y distribuir en volúmenes convenientes en cajas de Petri. No esterilizar en autoclave. El pH final debe ser 7.4 El medio debe almacenarse entre 2°C y 10°C y cualquier porción no utilizada debe desecharse después de 96 h. NOTAS: 1 Este medio puede solidificarse mediante la adición de 1,2 % al 5 % de

agar (m/m) antes de la ebullición. 2 El reactivo de ácido rosólico (C19H14O3) se descompondrá si se esteriliza

en autoclave. La solución patrón debe almacenarse en la oscuridad entre 2°C y 10°C y debe desecharse después de 2 semanas, o antes si su color cambia de rojo oscuro o café oscuro.

5.3 Medios confirmativos. Utilizar uno o más de los siguientes: 5.3.1 Medio para la producción de gas. Agua de lactosa peptona. Peptona 10,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Lactosa 10,0 g Rojo de fenol (0.4% m/m en solución acuosa) 2,5 mL (o indicador de Andrade) (10 mL) Agua para llevar a 1 000 mL Disolver los componentes en agua y ajustar a pH 7,5. Añadir el indicador de rojo de fenol y distribuir en volúmenes de 5 mL en tubos conteniendo tubos de fermentación invertidos (Durham). Alternativamente, ajustar el pH entre 6,8 y 7,0 y añadir el indicador de Andrade. Colocar en autoclave a 110°C durante 10 min o poner a vapor durante 20 min diarios por 3 días sucesivos. Probar la esterilidad por incubación a 37°C durante 24 h. 5.3.2 Medio para la producción de indol Agua de triptona.

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Algunas peptonas que dan resultados satisfactorios a 37° no son satisfactorias para la prueba de indol a 44°C. Se ha encontrado que la triptona es satisfactoria y por lo tanto se recomienda. Triptona 20,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Agua para llevar a 1 000 mL Disolver los componentes en agua y ajustar a pH 7,5. Distribuir en volúmenes de 5 mL y colocar en autoclave a 115°C durante 10 min. 5.3.3 Medio del tubo único tanto para la producción de gas como de indol Caldo lauril triptosa manitol con triptofano. Triptosa 20,0 g Manitol 5,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Fosfato dibásico de potasio (K2 HPO4) 2,75 g Fosfato monobásico de potasio (KH2 PO4) 2,75 g Lauril sulfato de sodio (NaC12 H25 SO4) 0,1 g L (-) triptofano 0,2 g Agua 1 000 mL Añadir la triptosa, el cloruro de sodio, el manitol, los fosfatos y el triptofano al agua y calentar para disolver. Añadir el lauril sulfato de sodio y mezclar suavemente para evitar la formación de espuma. Ajustar a pH 6,8 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 5 mL en tubos conteniendo un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave a 115°C durante 10 min (en caso de utilizar medio de cultivo comercial siga las instrucciones del fabricante). 5.4 Reactivos 5.4.1 Reactivo de Kovacs para indol Paradimetilaminobenzaldehído ((CH3)2NC6H4CHO) 5,0 g Alcohol amílico (CH3(CH2)4OH) (libre de bases orgánicas) 75 mL Acido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL Acido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL Disolver el aldehído en el alcohol. Añadir con cuidado el ácido concentrado. Proteger de la luz y almacenar a 4°C.

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NOTAS: 1. El reactivo debe tener un color de amarillo claro a café claro; algunas

muestras de alcohol amílico no son satisfactorias y dan un color oscuro con el aldehído.

2. También se puede utilizar reactivo de Erlich comercial para la

determinación de Indol 5.4.2 Reactivo de oxidasa para la prueba de oxidasa Clorhidratado de tetrametil-p-fenilendiamina 0,1 g Agua para llevar a 1 000 mL Este reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para utilizarlo en pequeñas cantidades cada vez que se necesite. 6 EQUIPOS Y MATERALES 6.1 Equipos Aparte de los equipos que se suministran estériles, el material de vidrio y el resto del equipo deben esterilizarse. 6.1.1. Horno de aire caliente para esterilización con calor seco. 6.1.2. Autoclave. 6.1.3. Incubador o baño de agua, controlado termostáticamente a 35°C –

37°C. 6.1.4. Incubador o baño de agua, controlado termostáticamente a 44°C ± 0.1

°C. 6.1.5. Medidor de pH. 6.1.6. Campana de Flujo Laminar (Opcional). 6.1.7. Equipo para filtración con membrana. 6.1.8. Bomba o sistema de vacío.

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6.2 Materiales 6.2.1 Membranas filtrantes estériles de aproximadamente 47 mm de diámetro,

con características de filtración equivalentes a un tamaño de diámetro nominal de poro de 0,45 µm.

6.2.2 Pinzas de bordes lisos, para manejar las membranas. 6.2.3 Frascos muestreadores , de vidrio resistente o cristal refractario de 125

mL ó 250 mL., con tapón de cristal esmerilado o tapa de rosca de baquelita, frascos de plástico desechables con tapón de rosca estériles ó, o bolsa de recolección de plástico estériles.

6.2.4 Material común de laboratorio. 6.2.5 Tubos de fermentación (tipo Duham). 6.2.6 Asas de inoculación. 7 RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE

MUESTRAS El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su recolección, es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis se incide dentro de las seis horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso debe exceder de 24 h. Durante el periodo que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 4°C. Con objeto de inhibir la reproducción bacteriana. 8 CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio que utilice este método está obligado a operar un programa de control de calidad (CC) formal. 8.1 Es obligatorio para el laboratorio mantener los siguientes registros: - Los nombres, títulos, direcciones y número de teléfono de los analistas

que ejecutaron los análisis y el encargado de control de calidad que verificó los análisis.

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- Las bitácoras manuscritas del analista y del equipo en los que se

contengan los siguientes datos:

a) Identificación de la muestra b) Fecha del análisis d) Cantidad de muestra utilizada e) Número de muestras de control de calidad analizadas f) Trazabilidad de las calibraciones de los instrumentos de medición g) Evidencia de la aceptación o rechazo de los resultados h) Además el laboratorio debe mantener la información original

reportada por los equipos en disquetes o en otros respaldos de información, de tal forma que permita a un evaluador externo reconstruir cada determinación mediante el seguimiento de la información desde la recepción de la muestra hasta el resultado final.

9 CALIBRACIÓN Se debe contar con la calibración de los equipos y materiales siguientes 9.1 Balanza granataria y/o analítica. 10 PROCEDIMIENTO 10.1 Selección del volumen de muestra Seleccionar un volumen de muestra tal o una dilución del mismo que dé menos de aproximadamente 100 colonias en una membrana de 47 mm ó 50 mm de diámetro. Para trabajo rutinario se recomienda una muestra de 100 mL. Cuando se espere un contenido alto de bacterias, puede tomarse una muestra más pequeña (20 mL); pero se recomienda poner en el embudo previamente 50 mL de agua de dilución estéril. 10.2 Filtración Colocar las bases en la unidad filtrante y en ambiente, colocar la membrana con ayuda de las pinzas estériles. La cuadrícula de la membrana debe quedar visible.

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Colocar el embudo con cuidado y sujetarlo. Agitar vigorosamente la muestra, verter en el embudo y filtrar con ayuda del vacío. Enjuagar con agua de dilución estéril. 10.3 Transferencia de la membrana. Después del último enjuague y terminada la filtración, quitar el embudo y con ayuda de la pinza estéril, levantar la membrana y sobreponerla, ya sea en: a) Una caja de Petri con medio de agar. b) Un cojinete absorbente estéril saturado previamente con medio líquido

en una caja de Petri. Asegúrese que no hay burbujas de aires atrapado entre la membrana y el medio. Para diferentes volúmenes de la misma muestra, puede reutilizarse el equipo de filtración sin desinfectarlo, siempre y cuando se filtren primero las diluciones más altas. Para filtrar otra muestra, usar otro tipo equipo de filtración o bien desinfectar el equipo. 10.4 Incubación Invertir las cajas de Petri y colocarlas en una incubadora o baño de agua según sea el caso. Las cajas que contienen membranas en cojinetes absorbentes deben colocarse siempre en recipientes herméticos para evitar la desecación del medio. Para aislar los organismos Coliformes Totales. Incubar una membrana ya sea 35°C - 37°C o entre 18 h y 24 h; para aislar los organismos termotolerantes; incubar la otra membrana a 44°C ± 1°C entre 18 h y 24 h. El mismo tipo de medio generalmente puede usarse para ambas membranas, pero utilizar el medio MFC solamente a 44 ± 1°C y los medios Endo y LES Endo a 35°C ó 37°C. 10.5 Examen de las membranas Después de la incubación, las cajas o membranas deben examinarse inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarse entre 4°C y 5°C durante períodos cortos, siempre y cuando esto no afecte la apariencia de las colonias. 10.5.1 Organismos coliformes Examinar las membranas y contar como organismos coliformes presuntivos todas las colonias, independientemente del tamaño que muestren, que tengan las siguientes características después de su incubación a 35°C ó 37°C:

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- En caldo o agar Endo (6.2.1): Un color rojo obscuro con brillo metálico

verde - dorado. - En agar LES Endo (6.2.2): Un color rojo obscuro con brillo metálico

verde - dorado. 10.5.2 Considerar como organismos coliformes termotolerantes presuntivos

todas las colonias que muestren, después de incubación a 44°C ± 1°C, las mismas características coloniales que se describen anteriormente (10.5.1). Si se usa medio MFC (6.2.3), las colonias serán de color azul.

10.6 Es importante hacer notar que las cuentas de colonias en membranas a

36°C ± 1°C y a 44°C ± 1°C son solamente resultados de coliformes presuntivos. Dado que no se detecta la producción de gas, hay también un supuesto adicional de que los organismos que forman las colonias pueden producir gas. Para el análisis de agua cruda o parcialmente tratada, esto puede ser suficiente, pero para agua potable es importante llevar a cabo las pruebas confirmativas.

10.6.1 Resembrado, incubación y examen. Para confirmar los resultados de la membrana, resembrar cada colonia (10.5.1) o un número representativo de ellas (una por tubo de fermentación) en agua lactosa Peptona (6.3.1) e incubar a 36°C ±1°C durante 48 h: la producción de gas durante este período confirma la presencia de organismos coliformes. Para organismos coliformes termotolerantes y E. coli presuntiva en membranas, ya sea que hayan sido incubadas a 44°C ±1°C ó 36°C ±1°C, resembrar cada colonia (10.5.1) o un número representativo de ellas (una por tubo), en agua lactosa peptona y agua triptona e incubarlos a 44°C ±1°C durante 24 h. La producción de gas en agua lactona peptona confirma la presencia de organismos coliformes termotolerantes y el desarrollo de un color rojo en la superficie del cultivo en agua de triptona después de la adición de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs (5.4.1) confirma la presencia de E. coli presuntiva. NOTAS: 1 El uso de caldo de lauril triptosa manitol con triptofano permite analizar

tanto la producción de gas como de indol en un solo tubo. 2 La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia

satisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden llevarse a cabo mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se considera necesario.

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3 El uso de caldo EC (con tubo de fermentación) se puede utilizar como

prueba confirmaiva para E. Coli 10.7 Prueba de oxidasa Las bacterias encontradas en el agua pueden cumplir con algunas características bioquímicas de organismos coliformes en muchos aspectos, pero pueden producir gas a partir de lactosa solamente a temperaturas inferiores a 37°C. Por consiguiente, dar resultados negativos en las pruebas confirmativas estándar para organismos coliformes y su presencia en agua usualmente no se considera significativa. Las especies de Aeromonas, que se encuentran naturalmente en el agua, tienen una temperatura óptima de crecimiento en el rango de 30 a 35°C pero a pesar de ello pueden producir ácido y gas a partir de lactosa a 37°C. Tienen poco significado como indicadores de contaminación fecal y se distinguen del grupo coliforme por una reacción de oxidasa positiva. 10.7.1 Llevar a cabo la prueba de oxidasa con subcultivos puros de

organismos fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue:

- Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa (6.4.2), recientemente

preparado, en un papel filtro en una caja de Petri. (o en su caso utilizar reactivo comercial)

- Con una varilla de vidrio o una asa de inoculación de platino (no de

nicromel), transferir un poco del crecimiento al papel filtro preparado. - Considerar la aparición de un color azul obscuro purpúreo dentro de un

período de 10 s como una reacción positiva. NOTA.- En cada ocasión en la que se utilice el reactivo de oxidasa, llevar a cabo

pruebas de control con cultivos de organismos que se sepa dan una reacción positiva (Pseudomona aeruginosa) y uno que dé una reacción negativa (E. coli).

11 CÁLCULOS A partir del número de colonias características contadas en las membranas y tomando en cuenta los resultados de las pruebas confirmativas, calcular el número de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia coli presuntiva presentes en 1 100 mL de la muestra, expresando el resultado como unidades formadoras de colonias en un volumen de referencia especificado en la muestra (generalmente 100 mL ó 1 mL) de acuerdo con la siguiente fórmula:

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muestradefiltradoVolumenreferenciadevolumencontadascoliformesColonias

referenciadeVolumentotalescoliformesColonias ×

=

que puede expresarse como:

( ) ( ) ( ) snnn

is V

FVnFVnFVnN

C+++

= ∑K222111

donde: Cs es el número de unidades formadoras de colonias en el volumen de

referencia Vs de la muestra. ∑Ni es la suma de las colonias en todas las cajas o membranas contadas

filtradas/siembras de dilución F1. n1 es el número de cajas contadas para una dilución particular F1. V1 es el volumen de dilución de la muestra F1 en la placa i. F1 es la dilución usada para la porción de muestra V1 (F = 1 una muestra

no diluida, F es 0,1 para una dilusión a 10 veces, etc.). Vs es el volumen de referencia seleccionado para expresar la

concentración de los microorganismos en la muestra. NOTA.- La cuenta final así obtenida es el promedio ponderado de las cuentas

de cada una de las placas. 11.1 Reporte de la prueba El reporte de la prueba debe hacer referencia a esta norma y dar toda la información relevante, incluyendo: a) Todos los detalles necesarios para la identificación completa de la

muestra; b) La técnica y medios de cultivo empleados; c) El tiempo, temperatura y condiciones de incubación; d) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el punto

10.

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e) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis y

cualquier operación no especificada en el método o considerada opcional que pueda haber influido en los resultados.

12 NTERFERENCIAS Colocar en el material de muestreo, previo a la esterilización, 0.1 mL de solución de tiosulfato de sodio al 10% en el caso de agua residual con el propósito de inhibir la acción del cloro que puede contener la muestra. 13 SEGURIDAD 13.1 Este método puede no mencionar todas las precauciones de seguridad

asociadas con su uso. El laboratorio es responsable de mantener un ambiente seguro y un archivo de las normas de seguridad respecto a la exposición y manejo seguro de las substancias químicas especificadas en éste método. Debe tenerse un archivo de referencia de las hojas de información de seguridad el cual debe estar disponible a todo el personal involucrado en estos análisis.

13.2 Los ácidos y bases concentradas empleadas en este método pueden

causar severas quemaduras e irritaciones en la piel, por lo que debe utilizarse ropa protectora tal como batas, guantes y lentes de seguridad cuando se manejan estos compuestos químicos, por lo que se deben prepararse en campana de extracción.

14 MANEJO DE RESIDUOS Es la responsabilidad del laboratorio cumplir con todos los reglamentos federales, estatales y locales referente al manejo de residuos, particularmente las reglas de identificación, almacenamiento y disposición de residuos peligrosos. 14.1 Cada laboratorio debe contemplar dentro de su programa de Control de

Calidad el destino final de los residuos generados durante la determinación

14.2 Los desechos ácidos se deben neutralizar para su posterior desecho 14.3 Todas las muestras que cumplan con la norma de descarga a

alcantarillado pueden descargarse en mismo sistema

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15 BIBLIOGRAFÍA NOM-001-SEMARNAT-1996 Que establece los límites máximos permisibles de

contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 6 de enero de 1997.

NOM-031-ECOL-1993 Que establece los límites máximos permisibles de

contaminantes en las descargas de aguas residuales provenientes de la industria, actividades agroindustriales de servicios y el tratamiento de aguas residuales a los sistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de octubre de 1993.

NMX-AA-003-1980 Aguas residuales muestreo. Declaratoria de

vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 25 de marzo de 1980.

NMX-AA-008-SCFI-2000 Análisis de agua - Determinación del pH - Método

de prueba. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de diciembre de 2000.

NMX-AA-014-1980 Cuerpos receptores muestreo. Declaratoria de

vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 5 de septiembre de 1980.

NMX-AA-089/01-1986 Protección al ambiente - Calidad del agua -

Vocabulario - Parte 1. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 15 de julio de 1986.

NMX-AA-102-1987 Calidad del agua - Detección y enumeración de

organismos coliformes, termotolerantes y escherichia coli presuntiva - Método de filtración en membrana. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 28 de agosto de 1987.

NMX-AA-115-SCFI-2001 Análisis de agua - Criterios generales para el

control de la calidad de resultados analíticos. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 17 de abril de 2001.

NMX-AA-102-SCFI-2006 19/19

NMX-AA-116-SCFI-2001 Análisis de agua - Guía de solicitud para la

presentación de métodos alternos. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 17 de abril de 2001.

NMX-BB-014-1973 Clasificación y tamaños nominales para utensilios

de vidrio, usados en laboratorio. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 24 de agosto de 1973.

ISO 9308/1 Water quality - Detection and enumeration of

coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli by the membrane filtration method

Procedimiento Obligatorio para el Muestreo de Descargas.- Artículo 278-B de la Ley Federal de Derechos.- 1997. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20a edición, 1998. Criterios Ecológicos de Calidad del Agua, publicados en el Diario Oficial de la Federación el 13 de diciembre de 1989. 16 VIGENCIA DE ESTA NORMA La presente norma entrará en vigor 60 días naturales después de la publicación de esta declaratoria de vigencia en el Diario Oficial de la Federación. 17 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Esta norma mexicana es equivalente a la norma internacional ISO 9308/1.

México D.F., a

MIGUEL AGUILAR ROMO DIRECTOR GENERAL

RCG/OMF/DLR.


Y

FOMENTO INDUSTRIAL

NORMA MEXICANA


ANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Daphnia magna Status (Crustacea – Cladecera) – METODO DE

PRUEBA

WATRER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Daphania

magna Stratus (Crustacea – Cladocera) – TEST METHOD



PREFACIO En la elaboración de esta Norma Mexicana, participaron las siguientes instituciones y empresas: - ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA - BECTON DICKSON DE MEXICO - CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE LA CELULOSA Y PAPEL - CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA HULERA - COMITÉ TECNICO DE NORMALIZACION NACIONAL DE PROTECCION AL

AMBIENTE - CONFEDERACION NACIONAL GANADERA - EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA EN

LA ZONA DEL CIVAC - F . .J. SALCEDO Y COMPAÑÍA - INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas - INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC - JUNTA MUNICIPAL DE AGUA Y SANEAMIENTO DE CIUDAD JUAREZ,

CHIHUAHUA - PETROLEOS MEXICANOS

Gerencia de Protección ambiental - SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO INDUSTRIAL

Dirección General de Promoción y Operación Minera

- SECRETARIA DE MARINA Comisión Nacional de Aguas Dirección General de Acuacultura; Instituto Mexicano de Tecnología del Agua; Instituto Nacional de la Ecología; Instituto Nacional de la Pesca.

- UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

Facultad de Medicina


- UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Unidad Iztapalapa - UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

Facultad de Estudios Superiores - Cuatitlán


INDICE DEL CONTENIDO Capítulo 1 Objetivo 2 Campo de Aplicación 3 Referencias 4 Definiciones 5 Muestreo 6 Principio 7 Reactivos y materiales 8 Aparatos 9 Preparación y acondicionamiento de la muestra 10 Procedimiento 11 Expresión de los resultados 12 Informe de la prueba 13 Apéndices A Como formar una muestra compuesta – Ejemplo B Determinación del intervalo de concentraciones – Ejemplos C Determinación del intervalo de concentraciones – Ejemplos 14 Bibliografía 15 Concordancia con normas internacionales Apéndice (informativo)


ANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Daphnia magna Status (Crustacea – Cladecera) – METODO DE PRUEBA

WATRER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Daphania magna Stratus (Crustacea – Cladocera) – TEST METHOD

1 OBJETIVO La presente Norma Mexicana establece el método para el análisis biológico de calidad del agua mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando al organismo dulceacuíola Daphnia magna Stratus 1820 (Crustacea – Cladocera). 2 CAMPO DE APLICACIÓN Este método es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos de agua dulce, así como aguas residuales industriales, efluentes agrícolas, municipales y sustancias puras combinadas o lixiviados. 3 REFERENCIAS Esta norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes: NMX-AA-003 Aguas residuales – Muestreo. NMX-AA-007 Aguas – Determinación de la temperatura. NMX-AA-008 Aguas – Determinación del Ph. NMX-AA-014 Cuerpos receptores – Muestreo. NMX-AA-072 Análisis de agua - Determinación de la dureza – Método del E.D.T.A.

(Acido etilen diamino tetra – acético). NMX-AA-093 Protección al ambiente – Contaminación del agua – Determinación de la conductividad eléctrica.


4 DEFINICIONES Para los propósitos de esta Norma Mexicana se establecen las siguientes definiciones: 4.1 Aclimatación Es la adaptación fisiológica a un nivel particular de una o más variables ambientales. El término es generalmente referido al control en condiciones de laboratorio. 4.2 Agua desionizada Es el agua que ha sido tratado para remover los iones de la solución para obtener una conductividad menor o igual a 2 µmhos/cm. 4.3 Agua de dilución El agua natural o reconstituida que por las características óptimas que presenta para la sobrevivencia y reproducción y reproducción de los organismos usados en pruebas de toxicidad, es utilizada para preparar las diferentes diluciones o concentraciones efectuadas durante una prueba, sea ésta exploratoria o definitiva. 4.4 Agua reconstituida Es el agua desionizada o destilada con reactivos químicos adicionales. El resultado es agua dulce sintética libre de contaminantes y con características deseables de Ph y dureza. Se prepara con sales inorgánicas que se adicionan en la cantidad requerida por el organismo prueba. 4.5 Aguas residuales Son las aguas de composición variada provenientes de las descargas municipales, industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticas y en general de cualquier otra. 4.6 Cladocera Es el orden taxonómico al que pertenecen las comúnmente llamadas “pulgas de agua”. Las valvas del caparazón de los organismos cubren solamente el tronco y los apéndices. 4.7 Concentración letal (Cl) Es la concentración de una sustancia (pura o combinada), o efluente que produce la muerte del organismo.


4.8 Concentración letal media (Cl50) Es la concentración de una sustancia (pura o combinada), o efluente que origina un efecto letal en el 50% de los organismos expuestos. 4.9 Contaminante Es toda materia o energía en cualesquiera de sus estados físicos y formas que al incorporarse o actuar en la atmósfera, agua, suelo, flora, fauna o cualquier elemento natural, altere o modifique su composición y condición natural. 4.10 Cuerpos de agua Son los lagos, lagunas costeras, estuarios, acuíferos, redes colectoras, con excepción de los sistemas de drenaje y alcantarillado urbano y municipal, ríos y sus afluentes directos o indirectos, permanentes o intermitentes, presas, cuencas, cauces, canales, embalses, cenotes, manantiales y demás depósitos o corrientes de agua. 4.11 Dáfnido Es el nombre castellanizado que reciben los organismos del género Daphnia conocidos como ”pulga de agua”. 4.12 Daphnia magna Es un microcrustáceo del orden Cladocera de 1 mm a 1, 5 mm de longitud los neonatos, y de 4 mm a 6 mm los adultos (ambos, visibles a simple vista). Es un representante importante de las comunidades dulceacuícolas con gran sensibilidad a una amplia gama de compuestos tóxicos, siendo ésta una de las características principales para que sea usado internacionalmente en pruebas de toxicidad. Asimismo, su ciclo de vida corto y fácil cultivo en laboratorio, permite realizar pruebas rápidas y económicas (ver figura 1). 4.13 Descarga Aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistema de drenaje y alcantarillado urbano y municipal, incluyéndose los procesos de infiltración e inyección. 4.14 Ecosistema acuático Es la unidad funcional básica de interacción de los organismos vivos entre sí y de estos con el ambiente acuático en un espacio y tiempo determinado.


4.15 Efecto agudo Es aquel que se manifiesta en una respuesta inmediata (en invertebrados acuáticos se habla comúnmente de 24 h a 48 h) del organismo al tóxico o tóxicos a los que ha sido expuesto. Usualmente produce inmovilidad o muerte. 4.16 Efecto agudo Es la respuesta a un estímulo que se produce durante una gran parte del ciclo de vida del organismo expuesto, generalmente se manifiesta en su crecimiento y reproducción. 4.17 Efluente Es el agua u otro líquido que procede de un embalse, cuenca, proceso o planta de tratamiento. 4.18 Fotoperíodo Es la duración de iluminación y obscuridad en un lapso de 24 h. 4.19 Inmovilidad Es la incapacidad de los dáfoidos para mover sus antenas natatorias (ver figura 1). Después de 10 s de haberlos separado con una pipeta Pasteur de punta recortada y expuesto a la luz blanca de una lampara de 60 W a una distancia de 10 cm. Este criterio se emplea en esta Norma Mexicana en caso de que se tenga duda de la muerte de los organismos. 4.20 Lixiviado Es el líquido provenientes de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre o percolación y que contiene disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran en los mismos residuos. Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga de aguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo.


4.21 Muestra simple o instantánea Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga de aguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo. 4.22Muestra compuesta Es aquella que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas en un efluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de las horas por día que opere el proceso generador de la descarga. 4.23Neonatos Son los dáfnidos de 1 mm a 1.5 mm de longitud y edad menor a 24 h utilizados en pruebas de toxicidad.


4.24 Prueba de toxicidad (bioensayos de toxicidad) Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras, combinadas y aguas provenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto. 4.25 Tiempo de exposición Es el período al que se someten los organismos a las soluciones de prueba en un bioensayo de toxicidad. 4.26 Toxicidad Es el efecto adverso que procede un tóxico. 4.27 Toxicidad aguda Es el efecto letal que se produce después de exponer a los organismos prueba a sustancias (puras o combinadas) o efluentes una sola vez, durante un período corto. Para Daphnia maga es de 48 h. 4.28 Tóxico Es cualquier sustancia (pura do combinada) o efluente que al entrar en contacto con el organismo produzca daños estructúrale, alteraciones bioquímicas o fisiológicas o incluso la muerte, dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición. 4.29 Tóxico de referencia Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad, cuyo efecto en los organismos a determinadas concentraciones es conocido, y por lo tanto, permite establecer el estado de respuesta de los organismos de prueba empleados, así como comparar los resultados intra e inter laboratorios . El uso de estos tóxicos, proporciona también una evaluación general de la precisión (estabilidad y respetabilidad) del método a través del tiempo. 4.30 Toxicología acuática Es el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos adversos producidos por productos químicos y materiales antropogénicos sobre los organismos acuáticos. 5 Muestreo El muestreo tanto de cuerpos de aguas como de efluentes industriales, agrícolas, municipales y / o urbanos y lixiviados, constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de monitoreo de la calidad del agua, pues proporciona bases para la


evaluación de propiedades y efectos potenciales del agua, sobre los organismos del ecosistema. 5.1 Muestreo en efluentes industriales, agrícolas municipales y urbanos Se toman muestras compuestas de dos litros, (volumen total) en recipientes de polipropileno o de vidrio borisilicato, de acuerdo como se especifica en la tabla1. TABLA 1.- Muestras instantáneas requeridas para formar un muestra compuesta Horas por día que Opera el proceso Generador de la descarga

Número de muestras Intervalo para la Obtención de muestras simples

Mínimo (h) Máximo (h) Hasta 8 h Más de 8 h y hasta 12 h Más de 12 h y hasta 18 h Más de 18 h y hasta 24 h

4 4 6 6

1,0 2,0 2,0 3,0 2,0 3,0 3,0 4,0

Con el fin de hacer explícito qué volumen de las muestras simples provenientes de efluentes es necesario para la preparación de una muestra compuesta, se presenta un ejemplo en el Apéndice A. 5.2 Muestreo en cuerpos de agua El muestreo se debe llevar a cabo tomando una muestra compuesta, se presenta un e un ejemplo en el Apéndice A. El muestreo se debe llevar a cabo tomando una muestra instantánea o simple de dos litros, siguiendo los lineamientos descritos en la NMX-AA-014 (ver 3 Referencias). Además deben tomarse en consideración los parámetros fisico-químicos básicos (pH, oxígeno disuelto, conductividad y temperatura de agua y aire), registrando las siguientes características aparentes: - Olor - Color - Turbiedad - Presencia o ausencia de burbujas y espuma


6 PRINCIPIO Este método se basa en la exposición controlada del crustáceo del orden Cladocera (Daphnia magna) a cuerpos de agua, sustancias puras, combinadas o efluentes y lixiviados para evaluar el efecto que producen en dicho organismo. 7 REACTIVOS Y MATERIALES 7.1 Reactivos (grado analítico) - Acido bórico (H3BO3) - Acido etilen diamino tetra-acético (EDTA) * - Acido nítrico (HNO3) al 30% - Acido sulfúrico concentrado (H2SO4) - Acetona (C3H6O) - Agua destilada o desionizada (H2SO4) - Bicarbonato de sodio (NaHCO3) - Cloruro de calcio (CaCl2-2H2O) - Cloruro de manganeso (MnCl24H2O) - Cloruro de potasio (KCl) - Cloruro de sodio (NaCl) - Dodecil sulfato de sodio (SDS) ** - Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) - Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) - Hidróxido de potasio (KOH) - Nitrato de cobalto Co (NO3)2-6H2O - Nitrato de sodio NaNO3 - Oxido de molibdeno (MoO3) - Selenito de sodio (Na2SeO3) - Sulfato de calcio (CaSO4-2H2O) - Sulfato de cobre (CuSO4-5H2O) - Sulfato ferroso (FeSO4-7H2O) - Sulfato de magnesio (MgSO4-7H2O) - Sulfato de zinc (ZnSO4-7H2O) 7.2 Materiales - Cajas petri - Cubrebocas - Detergente - Frascos ámbar con tapón de plástico - Frascos de boca ancha de 1000 ml - Garrafón de vidrio de 20 L - Guantes de látex desechables - Matraces Erlenmeyer de 1000 ml


- Matraces volumétricos de diferentes capacidades - Pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml y 10 ml - Pipetas Pasteur con punta recortada - Pipetas volumétricas de diferentes capacidades - Probetas graduadas de 100 ml - Propipetas - Recipientes de polietileno, polipropileno o de vidrio borosilicato de 2 L - Vasos de precipitados tipo Griffin de 150 ml NOTA 1- * El E.D.T.A. debe ser valorado. NOTA 2- ** Reactivo utilizado como tóxico de referencias. 8 APARATOS - Agitador magnético - Autoclave - Balanza analítica - Cámara de Neubauer - Centrífuga - Conductímetro - Congelador (-28ºC) - Controlador de fotoperíodo “Timer” - Luxómetro - Microscopio óptico - Oxímetro - Potenciómetro - Refrigerador (de 0ºC a 4ºC) - Termómetro 9 PREPARACION Y ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA Las muestras, tanto simples o instantáneas como compuestas deben ser almacenadas en recipientes limpios de polietileno, polipropileno o de vidrio borosilicato; éstos deben ser llenados totalmente y sellados. Los envases no deben ser reutilizados. Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC hasta su llegada al laboratorio. A menos que las pruebas de toxicidad se efectúen 6 h posteriores a la colecta, y hasta 36 h, se deben mantener a 4 ºC ± 2ºC. Después de 36 h y hasta 60 días posteriores a la fecha de colecta, se deben congelar a –28ºC (utilizando un congelador) para evitar cambios debidos a la actividad microbiana, transformación química y/o perdida de sustancias volátiles.


Las muestras que se considera válido para el inicio del bioensayo depende de la forma en la que se preserva con ningún producto químico. El tiempo que se considera válido para el inicio del bioensayo depende de la forma en la que la que se preserve la muestra, es decir: - Hasta 36 h, las muestras mantenidas a temperatura ambiente. - Hasta 36 h, las muestras mantenidas a 4ºC ± 2ºC. - Hasta 60 días, las muestras que sean congeladas a –28ºC. Las muestras preservadas por más de 60 días no deben ser usadas para realizar pruebas de toxicidad. El tiempo cero, en una muestra compuesta es el tiempo de la toma de la muestra compuesta, es el tiempo de la ultima colecta simple o instantánea. El tiempo final considerado para la validez de la prueba, es el momento en el que los recipientes de prueba. 10 PROCEDIMIENTO 10.1 Actividades previas en el laboratorio Una vez que se conoce la fecha exacta en la que se debe llevar a cabo el bioensayo, se deben llevar a cabo el bioensayo, se deben realizar las siguientes actividades, con la finalidad de iniciar la prueba en el preciso momento en que la muestra arribe al laboratorio. 10.2 Condiciones ambientales para el cultivo de Daphnia magna Para la instalación de un cultivo de Daphnia magna, se debe contar con un área mínima de 6 m², que debe estar libre de sustancias tóxicas (gases, vapores, cualquier otra.) que puedan entrar en contacto directo con los cultivos. Esta debe tener los aditamentos necesarios para mantener una temperatura entre 18ºC y 22ºC, y fotoperíodo de 16 h luz/8h obscuridad, utilizando un termómetro y un controlador de fotoperíodo “Timer” respectivamente. A continuación se establecen las condiciones que deben contemplarse para tener en último estado al cladócero Daphnia magna:


10.2.1 Iluminación Es necesario mantener constante la intensidad de luz en el área donde se encuentren los organismos, ya que los cambios en la intensidad provocan que naden hacia la superficie y queden atrapadas al no poder romper la tensión superficial del agua. Para la iluminación del cultivo deben utilizarse lámparas fluorescentes “luz de día” que proporcionen una luminosidad a los cultivos de 600 luces * a 1000 luxes, medida con un luxómetro ; asimismo mantener un fotoperíodo de 16 h luz/8 h obscuridad. • luxes se abrevia lx. 10.2.2 Temperatura Mantener la temperatura del agua de los cultivos a 20ºC ± 2ºC. 10.2.3 Oxígeno disuelto Los niveles del oxígeno disuelto se deben mantener por arriba de 3 mg/L, esto se logra renovando completamente el medio de cultivo una vez por semana. 10.2.4 pH Es necesario que los valores de pH se mantengan en un intervalo de 7,5 a 8,5. 10.2.5 Conductividad Es indispensable que sea mantenida entre 250 µmhos/cm y 600µmhos/cm. 10.2.6 Dureza total Es necesario que se encuentre entre 160 mg/L y 180 mg/L de carbonato de calcio (CaCO3). 10.3 Condiciones para el cultivo y mantenimiento de los organismos El cuidado que se debe tener con los organismos en cultivo, es una de las tareas que van a conducir a que se tenga un lote controlado de dáfnidos cuya densidad no debe ser mayor de 15 organismos/L de agua reconstituida. Cada lote debe ser iniciado con neonatos de menos de 24 h de nacidos en estado óptimo, colocándolos en recipientes de boca ancha de 1L. Una vez transcurridos loa 7 días, se ha alcanzado la madurez sexual; del séptimo al noveno día, se presenta la primera progenie o descendencia; una vez que se ha dado ésta, cada 2 días ó 3 días se obtienen descendencias sucesivas a partir del mismo adulto.


El cuidado del cultivo conlleva los siguientes aspectos: 10.3.1 Recambio de agua El agua de cultivo, después de un tiempo determinado, va a perder su características iniciales debido a la materia orgánica acumulada, producto de los desechos de los organismos y de residuos alimenticios; por ende, debe ser renovada completamente una vez por semana . 10.3.2 Limpieza Todos los recipientes usados en los cultivos, deben ser limpiados al menos dos veces por semana para evitar problemas de acumulación excesiva de microorganismos (los dáfnidos, dentro de su dieta toleran cierto número de bacterias, sin embargo una cantidad excesiva puede ocasionarles problemas serios). 10.3.3 Alimentación La calidad de la dieta alimenticia es uno de los aspectos considerados como importantes dentro del cultivo de los organismos, ya que de ello depende la sobrevivencia y tasa reproductiva óptima de los dáfnidos. El alimento está constituido por cualquiera de las siguientes tres especies de microalgas verdes: Chlorella vulgaris, Ankistrodemus falcactus y Scenedesmus incrassatulus. La alimentación se realiza hasta 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes, por ejemplo). La cantidad de alimento suministrada a la Daphnia cada tercer día debe ser de 0, 4 células/ml, 1,3 células/ml de Ankistrodemus vulgaris, Scenedesmus incrassatulus y Chlorella vulgaris, respectivamente, utilizando pipetas graduadas de 1ml, 5 ml ó 10ml. El conteó de las células algales se efectúa con la ayuda de una cámara de Neubauer o hematócimetro (ver capítulo 14 inciso 14.2). Las microalgas se separan del medio del cultivo antes de ser suministradas como alimento. La separación se hace por configuración, filtración o sedimentación. Las microalgas concentradas se conservan en obscuridad y refrigeración a 4ºC ± 2ºC en frascos ámbar, utilizándose como alimento inmediatamente y hasta por un período máximo de 2 semanas, después del cual debe desecharse cualquier remanente y emplear un nuevo concentrado. Para el cultivo de las microalgas verdes se emplea el medio de cultivo Bold Basal descrito en la tabla 2.


TABLA 2.- Medio de cultivo Bold Basal Reactivo Concentración NaNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O K2HPO4 KH2PO4 NaCl FeSO4.7H2O H2SO4.conc. H3BO3 E.D.T.A. KOH ZnSO4.7H2O MnCl2.4H2O MoO3 CuSO4.5H2O Co(NO3) 2.6H2O

250 25 75 75 175 25

4, 98 0, 001** 11, 42

50 31

8, 82 1, 44 0, 71 1, 57 0, 49

NOTA 3 - * En agua destilada o desionizada. NOTA 4 - ** ml/L. Una vez preparado el medio se esteriliza en autoclave durante 15 min a 1, 01 kg/cm². 10.4 Selección de organismos de prueba Veinticuatro horas antes de iniciar la prueba deben ser seleccionadas las hembras grávidas que se esperan tengan sus neonatos en ese lapso; deben ser colocadas en agua reconstituida se elabora de acuerdo a la técnica descrita en el inciso 10.5.5.1. Aproximadamente 1 h antes de iniciar la prueba, se deben separar los neonatos de los recipientes que contienen a las madres, utilizando una pipeta Pasteur con la punta recortada. De esta manera se garantiza que los neonatos utilizados en las pruebas de toxicidad tengan menos de 24 h de edad. Los organismos capturados deben ser colocados en pequeñas cajas petri antes de ser finalmente transferidos a las diluciones correspondientes. Este criterio de selección es válido sólo para neonatos de la segunda a la octava progenie. 10.5 Lavado de material y cristalería Todos los recipientes que entren en contacto con las muestras que van a ser usadas en el muestreo, deben lavarse perfectamente para evitar que contengan residuos potencialmente tóxicos a los organismos de prueba, utilizando el método que se describe a continuación:


10.5.1 Lavar el material con detergente y enjuagar dos veces con agua de la llave. 10.5.2 Enjuagar el material con ácido nítrico (HN3) al as30 % para eliminar

residuos metálicos. Enjuagar con agua desionizada escurrir. 10.5.3 Enjuagar con acetona (C3 H6 O) para eliminar residuos orgánicos . Enjuagar con agua desionizada. Dejar secar completamente. Esta serie de lavado tienen que llevarse a cabo de 24 h a 48 h antes del bioensayo, protegiendo el material de polvo y otros factores. 10.5.4 Enjuagar perfectamente con agua reconstituida. 10.5.5 Minutos antes de iniciar el bioensayo, enjuagar los recipientes que van a contener a los organismos con agua reconstituida. El uso del agua reconstituida es necesario porque: - Es de composición química conocida. - Permite resultados reproducibles. - Permite crecimiento y reproducción adecuada. Para Daphnia magna se utiliza agua reconstituida cuya dureza sea de 160 mg/L a 180 mg/L y el pH entre 7,5 y 8,5 . Su preparación debe efectuarse al menos con 72 h de anticipación, cuidando que se efectúe tal y como se indica en el punto siguiente, ya que de ello depende en gran parte tanto el cultivo óptimo de los organismos como la culminación exitosa de la prueba. 10.5.5.1 Preparación Colocar 19 L de agua destilada o desionizada en un garrafón de vidrio de 20 L perfectamente limpio. Cualquiera que sea el tipo de agua seleccionado, debe utilizarse durante todo el proceso y cada vez que se realice la prueba. Asimismo, es necesario indicarlo en los resultados. Agregar 2,4 g de sulfato de magnesio (MgSO4) ; 3,48 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 0,16 g de cloruro de potasio (KCl) al recipiente en el orden respectivo. Agregar 2,4 g de sulfato de calcio (CaSO4 – 2H2O) a 1000 ml de agua destilada o desionizada en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml. Colocar la solución sobre un agitador magnético hasta que el sulfato de calcio (CaSO4 – 2H2O) esté completamente disuelto. Adicionar a los 19 L preparados con anterioridad y mezclar perfectamente. Adicionar 20 µg de selenito de sodio (Na2SeO3). Airar por lo menos 24 h.


Para detectar la calidad óptima del agua reconstituida, se debe colocar durante 24 h a 10 neonatos en una muestra de 100 ml; sí al término del se registra mortalidad el agua puede ser utilizada en el cultivo y/o en la prueba. 10.6 Calibración de aparatos, preparación y valoración de reactivos utilizados en

análisis químicos Se debe efectuar una calibración de aparatos (potenciómetro, oxímetro y conductímetro) y la preparación y valoración del E.D.T.A (Acido etilien diamino ultra-acético) 0,01 M en base a la NMX-AA-072 (ver 3 Referencias). 10.7 Período de prueba Cuando la muestra llegue al laboratorio, se debe medir y anotar la temperatura, el pH y conductividad. Sí el análisis no va a ser efectuado inmediatamente, mantener la muestra de acuerdo al inciso 9 de esta Norma Mexicana hasta que sea procesada. En caso de que la muestra llegue congelada al laboratorio, estos parámetros se determinan al inciso del bioensayo. La muestra debe congelarse a temperatura ambiente. Las aguas provenientes de efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos, deben ser evaluados a partir de una prueba exploratoria y una definitiva. Para cuerpos de agua únicamente se realiza una prueba definitiva. 10.7.1 Prueba exploratoria en efluentes industriales, agrícolas, municipales y

urbanos Esta prueba sirve para determinar si un efluente es tóxico o no, y en su caso, permite definir al intervalo de concentraciones que se deben aplicar en una prueba definitiva. En este bioensayo se prueban cinco concentraciones del efluente: 100 %, 50 %, 25 %, 12 % y 6 %, más un testigo, siguiéndose los lineamientos de la tabla 3 de esta Norma Mexicana. TABLAS 3.- Condiciones de la prueba exploratoria con Daphnia magna.

Condiciones Tipo de prueba Estática sin renovación de la

Solución de prueba Duración 24 h Luminosidad 600 luxes* - 1000 luxes Fotoperíodo 16 h luz/ 8 h oscuridad Volumen de los recipientes de prueba (vasos de precipitado tipo Griffin)

150 ml

Volumen de agua reconstituida 50 ml Edad de los organismos Menos de 24 h Número de réplicas 2


Número de organismos de réplica 10 Aireación de los recipientes de prueba No Agua de dilución Reconstituida dura Temperatura 20ºC ± 2ºC Alimentación No Volumen total de muestra por prueba 100 ml Respuesta evaluada Inmovilidad Criterio de aceptación de la prueba Sobrevivencia mayor o igual a 90 %

en testigos NOTA 5 – Para la presentación de las muestras al 100 % y de los testigos, se pueden utilizar probetas graduadas de 100 ml. * luxes se abrevia lx. 10.7.2 Prueba definitiva en efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos Una vez registradas las observaciones obtenidas en la prueba exploratoria, se determina el intervalo de concentraciones que debe ser usado en la prueba definitiva. El tiempo de exposición en la prueba definitiva es mayor que en la exploratoria; por lo tanto, la mortalidad puede incrementarse al final de la aprueba y entonces la CL50 no cae dentro del intervalo seleccionado. Al finalizar la prueba exploratoria, se deben efectuar observaciones a los organismos que continúan vivos para determinar de acuerdo al estado de afectación, si es adecuado o no modificar el intervalo seleccionado en la prueba definitiva (ver Capitulo 13 inciso 13.2). 10.7.3 Prueba definitiva en cuerpos de agua El número mínimo de diluciones que deba realizarse en esta prueba es de 4 y la muestra al 100 %. Estas se efectúan considerando un factor de dilución de 0,5, utilizando para ello probetas graduadas de 50 ml y 100 ml, y pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml y 10 ml de acuerdo a las diluciones, de tal forma que se obtenga la siguiente serie de concentraciones: 100 %, 50 %, 25 % y 6,25 % ; además por supuesto , el testigo. En las pruebas definitivas para efluentes y cuerpos de agua, se deben preparar al menos 3 réplicas. El conteo de inmovilidad debe efectuarse cada 24 h para calcular la CL50 a 24 h y 48 h (ver capítulo 4 inciso 4.19).


10.8 Parámetros a evaluar durante la prueba Los parámetros fisicoquímicos que comúnmente se evalúan en un bioensayo, están contenidos en las normas indicadas en el punto 3 de está Norma Mexicana. Durante la prueba, los parámetros fisicoquímicos se determinan al inicio y al término de la prueba en una serie de las réplicas (diluciones y muestra al 100 %) y en un testigo. Para fin de esta Norma Mexicana, el oxígeno disuelto se determina mediante el empleo de un oxímetro. En la tabla 4 de esta Norma Mexicana se agrupan las condiciones que deben observarse durante una prueba definitiva en muestras provenientes de efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos, así como en cuerpos de agua . 10.9 Evaluación de sensibilidad Se debe elaborar un programa de control de calidad en el laboratorio que realice pruebas de toxicidad , para garantizar que se puedan realizar comparaciones de resultados intra e inter laboratorios . Para evaluar la sensibilidad del organismo de prueba (Daphnia magna), se utiliza el tóxico de referencia que se establecen en el inciso 10.9.3 de esta Norma Mexicana. 10.9.1 Los tóxicos de referencia tienen como principales características las

siguientes: - Amplio espectro tóxico. - Facilidad de obtención en forma pura. - Alta solubilidad en agua. - Persistencia y estabilidad en solución. - Estabilidad en Almacenamiento. - Facilidad de cuantificación, 10.9.2 La sensibilidad de Daphnia magna se evalúa mediante la determinación de la

CL50 en un bioensayo de 48 h, aplicando concentraciones establecidas del tóxico de referencia. El método y las condiciones de prueba deben ser los descritos en la presente Norma Mexicana.

10.9.3 El tóxico de referencia que se debe emplear en esta prueba es el dodecil sulfato de sodio (SDS), en las siguientes concentraciones: 2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L, 16 mg/L y 32 mg/L. La CL50 de referencia para este tóxico es de 14,5 mg/L + 4,5 mg/L. La CL50 sea mayor o menor que dicho intervalo. Siendo necesario revisar los posibles factores de variabilidad, tales como:


TABLA 4.- Condiciones de la prueba definitiva con Daphnia magna

Condiciones Tipo de prueba Estática sin renovación de la prueba Duración 48 h Luminosidad 600 luxes * - 1000 luxes Fotoperíodo 16 h luz / 8 h oscuridad Volumen de los recipientes de prueba (vasos de precipitado tipo Griffin)

150 ml

Volumen total (agua reconstituida más Muestra)

100 ml

Edad de los organismos Menos de 24 h Número de réplicas por concentración 3 Número de organismos por réplica 10 Aireación de los recipientes de prueba No Agua de dilución Reconstituida dura Temperatura 20ºC ± 2ºC Alimentación No Respuesta evaluada Inmovilidad a 24 h y 48 h Criterio de aceptación de la prueba Sobrevivencia mayor o igual al 90 % en los

Testigos NOTA 6 – Las diferentes concentraciones que se preparen en las pruebas exploratorias y formales deben realizarse utilizando pipetas y/o matraces volumétricos de diferentes capacidades, excluyendo sólo a las muestras al 100 % y a los testigos. * luxes se abrevia lx. 10.9.3.1 Método de cultivo mantenimiento de los organismos de prueba. 10.9.3.2 Edad y estado de salud de los organismos. 10.9.3.3 Manejo de los neonatos. 10.9.3.4 Pericia y consistencia en la realización de las pruebas por parte de los

analistas. 10.9.4 Una vez que se han revisado minuciosamente los factores mencionados y

que se han descartado a los dos últimos como los responsables de la modificación de la sensibilidad del lote de Daphnia magna empleado, se debe revisar el método de cultivo . En caso extremo, se recomienda no realizar más bioensayos con dicho lote y sustituirlo con uno nuevo para la prueba el cual también debe ser evaluado.


10.9.5 El tóxico de referencia descrito en esta Norma Mexicana puede ser sustituido por cualquier otro, siempre y cuando cumpla con las características señaladas en el inciso 10.9.1 de esta norma.

11 EXPRESION DE RESULTADOS Para la obtención de la CL50 (concentración letal media) se recomienda utilizar el “Método de Unidades Probabilisticas” “Probit” (ver Capítulo 14 inciso 14.12), el cual evalúa la relación concentración respuesta de un contaminante sobre un organismo, medido en términos de su CL50 y su precisión o intervalo de confianza de acuerdo a los lineamientos que se establecen a continuación: 11.1 Método Probit El método Probit, también conocido como “Método de Unidades Probabilísticas” es utilizado para evaluar la relación dosis respuesta de un contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. 11.1.1 Determinación de la concentración letal media (CL50) La obtención de la CL50 se realiza por el Método Probil , cuya secuencia se explica a continuación, y en el Apéndice C se desarrolla un ejemplo. 11.2 Paso 1 Preparar una tabla con los siguientes datos: 11.2.1 Concentración del efluente usado en la prueba (%) 11.2.2 Logro de la concentración de efluente (X) 11.2.3 Número de organismos por concentración (N) 11.2.4 Mortalidad observada por concentración (r) 11.2.5 Porcentaje de mortalidad por concentración (P) 11.2.6 Probit empírico (EP) 11.2.7 Probit calculado (CP) 11.3 Paso 2 Los incisos 11.2.1 al 11.2.5 del paso 1, son abtenidos directamente de los resultados del bioensayo. 11.4 Paso 3 El valor de probit empírico se obtiene de tabla 5, a partir del 5 % de mortalidad por concentración.


11.5 Paso 4 Graficar en papel el Loy10 de las concentraciones en el eje “X” y los Probit empíricos en el eje “Y” (ver Capítulo 13 inciso 13.3). 11.6 Paso 5 Efectuarse el ajuste de la recta por el “método de mínimos cuadrados”, utilizando la ecuación de la recta que se describe a continuación: Y=mX + b TABLA 5.- Relación de % de mortalidad / Probit empírico % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 % 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 a 7,33 7,373 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09 NOTA 7 – a Valores entre 99 y 99.7 Una vez finalizado esto, trazar una recta perpendicular al eje “Y” exactamente en el valor de Probit igual a 5 . En el punto de intersección con la recta ajustada, proyectar hacia el eje “X” para obtener el Log10 de la CL50. Una vez obtenido el valor de Log10 de la CL50, determinar la CL50, mediante la siguiente relación: CL50 = Antilog10 X (en Y = 5) 11.7 Paso 6 Pasos a seguir en la determinación del error patrón. 11.7.1 Determinar “S”, que esta definido como el intervalo de incremento de Log10

de la concentración (X) por unidad de incremento en el Probit Empírico (EP) y tiene la siguiente relación:


X2 - X1 S =

CP2 - CP1 Donde : X2 y X1 son los valores más bajos y más altos respectivamente obtenidos a

partir de la concentración en Log10 (X): CP1 y CP2 son los valores más bajos y más altos respectivamente obtenidos a

partir del Probit calculado (CP). 11.7.2 Paso 7 Determinar el error patrón del Log10 CL50, preparando una tabla con los siguientes datos: 11.7.2.1 Logaritmo de la concentración (X) 11.7.2.2 Número de organismos en cada concentración (Nn) 11.7.2.3 Probit calculado (CP) 11.7.2.4 Factor ponderado (w), obtenido a partir de la tabla 6 considerando los

valores de Probit calculado (CP) 11.7.2.5 Productos : Nw, NwX y NwX2 11.7.2.6 Sumatorias : Nw, NwX y NwX2 TABLA 6 .- Factor ponderado (w) para el cálculo de Probit (CP) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0,001 0,001 0,001 0,002 0,002 0,003 0,005 0,006 0,008 0,01 2 0,015 0,019 0,025 0,031 0,040 0,050 0,062 0,076 0,092 0,11 3 0,131 0,154 0,180 0,208 0,238 0,269 0,302 0,336 0,370 0,40 4 0,439 0,471 0,503 0,532 0,558 0,581 0,601 0,616 0,627 0,63 5 0,637 0,634 0,627 0,616 0,601 0,581 0,558 0,532 0,503 0,47 6 0,439 0,405 0,370 0,336 0,302 0,269 0,238 0, 208 0,180 0,15 7 0,131 0,110 0,092 0,076 0,062 0,050 0,040 0,031 0,025 0,01 8 0,015 0,011 0,008 0,008 0,005 0,003 0,002 0,002 0,001 0,00 Una vez obtenido el factor ponderado (w) y calculados los productos: Nw, NwX, NwX2 y sumatorias, obtener el error patrón (ESLog10) de la CL50 utilizando la siguiente relación: 1 ∑Nw(m-z)2 SLog10CL50 = S2[(___________+ ___________________________)] 0,5

∑Nw ∑Nw(∑NwX2) – ((∑NwX)2

donde :


ESLog10 es el error patrón de la CL50; S es el intervalo de incremento; m es el pendinte obtenida por mínimos cuadrados : NwX Z es igual a __________ Nw 11.8 El intervalo de confianza de la CL50 esta dado por la siguiente relación :

IC CL50 = (CL50) (ESLog10CL50) (Log 10) 11.9 Las unidades de tenacidad aguda se obtienen a partir de la siguiente relación

1 U.T.a = ------------- x 100

CL50 Donde : U.T.a es la unidad de toxicidad aguda; CL50 es la concentración teórica que origina el 50 % de mortalidad de organismos

expuestos con la muestra evaluada. 12 INFORME DE LA PRUEBA El informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos: - Cuenca hidrológica. - Nombre del cuerpo de agua receptor. - Sí se trata de pruebas en efluentes indicar:

1) Responsable legal del efluente. 2) Sí es efluente industrial:

Razón social de la empresa; dirección teléfono; que produce; que materias primas utiliza; horario de operación.

3) Sí es efluente agrícola:


Localización, tipo(s) de cultivo (s) y en su caso que fertilizante(s) se utiliza(n).

4) Sí es efluente urbano o municipal: Localización, nombre de la ciudad o municipio.

Para los caso descritos en 2), 3) y 4), especificar además: Caudal promedio (m3/día): caudal promedio durante el muestreo (m3/s) ; en caso de contar con sistema de tratamiento. Breve descripción del mismo; localización de punto (s) de muestreo seleccionado(s); método de colecta usado; fecha, período y horario de colecta usado; fecha, período y horario de colecta usado. tiempo transcurrido entre l a última toma de muestras (s) y el inicio del análisis; temperatura de la(s) muestras al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo: responsable(s) del muestreo. - Si se trata de prueba de cuerpos receptores, indicar: Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado, fecha, período y horario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) al recibirse en el campo; responsable(s) del muestreo. - Datos a registrar durante la prueba de toxicidad; Forma de almacenamiento y preservación de lata(s) muestra(s), fecha de inicio y término del análisis ; tipo de prueba realizada (exploratoria y o definitiva) ; datos fisicoquímicos al inicio del análisis (pH, oxígeno disuelto, conductividad, temperatura de agua y aire) y características aparentes (olor, color, turbiedad, presencia o ausencia de burbujas y espuma) ; datos fisicoquímicos en las muestras al 100%, diluciones y testigos a las 24 h y 48 h de tiempo de exposición (pH, oxígeno disuelto, conductividad, dureza total y temperatura de agua y aire); concentración (es) utilizada(s) en la(s) prueba(s) exploratoria(s) y/o definitiva(s) y la mortalidad o inmovilidad de los organismos prueba; responsable(s) de la realización de la(s) prueba(s) de toxicidad. - Análisis de resultados Tablas y gráficas derivadas de la prueba de toxicidad, así como las anotaciones de la observaciones diarias efectuada en lo organismos en cada concentración, incluyendo los testigos; proveer los valores de CL50 de las pruebas de toxicidad con sus respectivos límites de confianza al 95 %, así como las unidades de toxicidad obtenidas y método estadístico utilizado; discusión de resultados. - Datos adicionales Tóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CL50 obtenida y fecha de realización: responsable(s) de la realización de la prueba. - Conclusiones y recomendaciones


- Sí se contrata una empresa consultora, laboratorio o cualquier otro que lleve a cabo

el análisis, indicar razón social, representante legal, dirección y teléfono. 13 APENDICES 13.1Apéndice A Como formar una muestra compuesta – Ejemplo Sí el proceso generador de la descarga “X” funciona por 15 h ; entonces, de acuerdo a la tabla 1 se tienen que tomar cuatro muestras simples para formar una compuesta. Se deben tomar precauciones cuando se lleve a cabo el muestreo, utilizando cubrebocas y guantes de látex desechables. Suponer que la hora de toma de la muestra simple y el caudal correspondiente se lleva a cabo de acuerdo a la tabla 7. TABLA 7.- Horario y caudal hipotético del muestreo simple o instantáneo Número de muestra simple o Instantánea

Hora de la toma de la Muestra simple (h)

Caudal de la descarga (m3)

1 9 32 2 12 13 3 15 8 4 18 3 TOTAL 56 La proporción de muestra que debe ser tomada del caudal para cada tiempo se obtiene a partir de la siguiente relación:

(Ctx) (100) %Mtx = _______________

C1 Donde: %Mtx es el por ciento (%) de muestra al tiempo “x”; Ctx es el caudal al tiempo “x” en metros cúbicos (m3): CT es el caudal total en metros cúbicos (m3). Sustituyendo: Si Ct1 = 32 m3


(32m3) (100) %Mt1 = _____________ = 57,14 % 56 m3 Si Ct2 = 13 m3 (13m3) (100) %Mt2 = ______________ = 23,21 % 56 m3 Si Ct3 = 8 m3 %Mt3 = (8m3) (100) ____________ = 14,28 % 56 m3 Si Ct4 = 3 m3 (3m3) (100) %Mt4 = _____________ = 5,35 % 56 m3 Por lo tanto, el volumen que corresponde a cada muestra simple considerando que el volumen total es de dos litros, se calcula a partir de la siguiente relación: Vtx = (20) (%Mtx) Donde: Vtx es el volumen de muestra al tiempo “x” en mililitros (ml). Sustituyendo: Si %Mt1 = 57,14 % Vt1 = 20(57,14 %) = 1143 ml Si %Mt2 = 23,21 % Vt2 = 20(23,21 %) = 464 ml Si Mt3 = 14,28 % Vt3 = 20(14,28 % ) = 286 ml Si %Mt4 = 5,35 %


Vt4 = 20 (5,35 %) = 107 ml Entonces : ∑Vt = 2000 ml 13.2 Apéndice B Determinación del intervalo de concentraciones – Ejemplos Ejemplo 1: Suponer que al final de la prueba exploratoria, se obtienen las siguientes mortalidades: TABLA 8 .- Relación hipotética de concentración/ % de mortalidad

Concentración (%) Mortalidad (%) 6,25 0,00 12,50 5,00 25,00 10,00 50,00 30,00 100,00 70,00

NOTA 8 - % Mortalidad A 0 inmovilidad x 100 B Donde : A es el número de organismos muertos por concentración : B es el número de organismos expuestos por concentración. En este caso, la CL50 teórica a 24 h (tiempo de exposición que dura la prueba exploratoria) está entre la concentración al 50% y al 100 % por lo cual es factible seleccionar para la prueba formal , cinco concentraciones entre 50% y 100% sin embargo, aquí es importante considerar lo siguiente: - Estado que presentan los organismos al final de la prueba exploratoria en la concentración al 50 % . esto es si los organismos, diferencia de los testigos (los cuales, en condiciones normales tienden a moverse activamente por toda la columna de agua ), mueven muy lentamente su segundo par de antenas y además permanecen en el fondo o en la superficie, seguramente a las 48 h van a estar completamente inmóviles.


En este caso, es erróneo seleccionar para la prueba definitiva, al 50 % como la concentración mínima, ya que es más adecuado utilizar valores todavía menores . por ejemplo 40 % y 30 %. Por otro lado, en caso de que los organismos a la concentración 6,25 % de este ejemplo, presenten una movilidad similar a la del testigo, es adecuado utilizar ésta, como concentración mínima. Ejemplo 2: Suponer ahora, que al final de la prueba exploratoria se obtienen los siguientes valores de mortalidad: TABLA 9 .- Relación hipotética de concentración/ % de mortalidad

:Concentración (%) Mortalidad (%) 6,25 0,00 12,50 80,00 25,00 100,00 50,00 100,00 100,00 100,00

En este caso, como se puede apreciar se tiene un efluente extremadamente tóxico ya que 12, 5 % del mismo ocasiona una mortalidad del 80 % en los organismos expuestos. En este sentido y al igual que el ejemplo1 de este apartado, teóricamente se tiene que seleccionar para la prueba definitiva a 6,25 % y 12, 5% como las concentraciones mínima y máxima respectivamente (ya que la finalidad de la prueba es obtener la CL50, la cual esta definida como la concentración en este caso de un efluente, que origina un efecto letal en el 50 % de los organismos expuestos) sin embargo, y para el caso de este ejemplo, si los organismos en la concentración al 6,25% presentan un movimiento similar al de los testigos, es adecuado considerar a este como el valor mínimo durante la prueba definitiva, en caso contrario dos concentraciones menores a esta (tal vez 1,0 % y 0,5 %) pueden ser utilizadas en la prueba definitiva. Del mismo modo, se tiene que observar detenidamente a los organismos que quedan vivos en la concentración al 12,5 %, ya que si se encuentran muy afectados esto es, en él fondo y con movimientos apenas perceptibles, es adecuado que en la prueba definitiva se consideraran concentraciones todavía menores a esta (por ejemplo 5,5 y 10 %). Ejemplo 3: Suponer que al final de la prueba exploratoria no se observa mortalidad en ninguna de las concentraciones como se muestra en la siguiente Tabla:


TABLA 10 .- Relación hipotética de concentración / % de mortalidad

Concentración (%) Mortalidad (%) 6,25 0,00 12,50 0,00 25,00 0,00 50,00 0,00 100,00 0,00

En este ejemplo, el efluente presenta un efecto agudo no detectado después de 24 h de exposición de los organismos de prueba. En este caso de que los organismos sea similar al del testigo, se debe extender la prueba a un tiempo de 48 h. En caso de que los organismos a pesar de no estar inmóviles, si presentan cierto grado de afectación (el cual, para fácil identificación debe ser comparado con los testigos ) en cualquier concentración , excepto en la muestra al 100 %, debe observarse en cual de ellas se evidencia la afectación y a partir de esa, considerar el valor máximo que debe ser preparado para la prueba definitiva. NOTA 9 – Para la preparación de las diferentes diluciones, se debe contar con medidas de seguridad para evitar entrar en contacto directo con las muestras de aguas residuales . se recomienda utilizar propipetas, guantes de látex desechables y cubrebocas. 13.3 Apéndice C Determinación de la CL50 por el método de Probit – Ejemplo Suponer que al finalizar una prueba de toxicidad, se obtienen los siguientes datos: TABLA 11.- Resultados de toxicidad

% Concentración en volumen

No. Organismos Expuestos por Concentración

No. Organismos Muertos por Concentración

% Mortalidad por concentración

100 30 24 80 50 30 18 60 25 30 12 40 12,5 30 6 20 6,25 30 3 10


NOTA 10 – En caso de que la muestra sea sustancia tóxica específica (por ejemplo, dicromato de potasio K2Cr2O7), en vez de anotar el por ciento (%) de la concentración de la sustancia en mg/L o ml/L, en caso de tóxicos sólidos o líquidos respectivamente. NOTA 11- Número total de organismos por dilución es igual a 30 (3 réplicas con 10 organismos en cada uno). - Realizando los pasos 1, 2, 3 (ver Capítulo 11 inciso 11.2, 11.3 y 11.4), se construye

la siguiente tabla. TABLA 12 .- Datos de toxicidad para el Método Probit

Conc. % Log 10

Conc.(X) No. De Org. (N)

Mortalidad Observada (r)

% Mortalidad (P)

Probit empírico (EP)

Probit calculado (Y)

100 2, 0 30 24 80 5,84 5,81 50 1,698 30 18 60 5,25 5,27 25 1,397 30 12 40 4,75 4,74 12,5 1,096 30 6 20 4,6 4,21 6,25 0,795 30 3 10 3,72 0,67

- Paso 4 Se construye la gráfica (ver figura 2 ). - Paso 5 Se realiza el ajuste de la recta y se obtiene para el ejemplo, que, el Log de la CL50 es de 1, 54, por medio del siguiente procedimiento: CL50 = Antilog10 X ( en Y =5 ) Simplificando: Log CL50 = 1,54 Por lo tanto:


FIGURA 2 .- Representación gráfica del Método Probit CL50 = Antilog 1, 54 CL50 = 34,67 % El valor de 34,67% presenta la concentración teórica a la cual se detecta el 50% de mortalidad en los organismos expuestos. - Paso 6 Intervalo de incremento 2 - 0,795

S = --------------------- = 0,563 0 5,81 - 3,67 - Paso 7


Determinación del error patrón. Se construye la siguiente tabla con los datos señalados en el inciso 11.7.2. TABLA 13 .- Error patrón del Log CL50 Log10 Conc. (X)

No. Org . (N)

Probit calc. (CP)

Fact. Pond (w)

Producto (Nw)

Producto (NwX)

Producto (NwX2)

2,0 30 5,81 0,503 15,09 30,18 60,36 1,698 30 5,27 0,616 18,48 31,37 53,28 1,397 30 4,74 0,616 18,48 25,82 36,06 1,096 30 4, 21 0,503 15,09 16,54 18,12 0,795 30 3,67 0,336 10,08 8,02 6,37 Sumatorias SUM (Nw)

= 77,2 SUM (NwX) = 11,93

SUM (NwX2 = 174,20

El error patrón se determina por la siguiente formula : 1 ∑Nw (m – z )2 ESLog 10 CL50 = S2[ (_________ + _________________________) ] 0.5 ∑Nw ∑Nw (∑NwX2) – (∑NwX)2 donde : S = 0, 563 0 m = 1, 769 Nw = 77, 22 NwX = 111, 93 NwX2 = 174, 20 Nwx 111,93 Z = -------- = ------------ = 1,450 Nw 77,22 Sustituyendo: 1 77,22 (1,769 – 1,450)2 ESLog10 CL50 = 0,317 0[(--------------) + (---------------------------------------) ] 0.5 77,22 77,22 (174,20) – 15528,32 7, 857 984 42 = 0,3170 [0,317 0 +---------------------------------] 0.5 923, 404 = 0,317 0 [(0,0214598 )] 0.5


= 0,3170(0,146 491 6 ) 0.5 = 0,0464378 Para determinar el intervalo de confianza se sustituyen los valores correspondientes en la siguiente relación : IC CL50 = ( CL50) (ESLog10CL50 ) (log10) Sustituyendo : IC CL50 = (34,67%) (0,0464378 ) (2,302 5 ) = 3,707 0 % Por lo tanto la CL50 obtenida para el ejemplo, con el intervalo (95 % de confiabilidad estadística) correspondiente es: CL50 = 34,675% ± 3,7070% Las unidades de toxicidad son: Sustituyendo: (ver Capítulo 11 inciso 11.9) 1 U.T.a. =--------- x 100 = 2,88 34,67 Por lo tanto en este ejemplo se obtuvieron 2,88 unidades de toxicidad aguda. 14 BIBLIOGRAFIA 14.1 Anderson, B.G., 1944. The toxicity thresholds of various substances found in industrial wastes as determined by the use of Daphnia magna . (La toxicidad de varias sustancias encintradas en desechos industriales determinadas por el uso de Daphnia magna ) Sewage Works J. 16 : 1140-1156. 14.2 APHA, AWNA, WPCF, 1987 . Standard Methosds para el análisis del agua

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Organismos Aqúaticos . (Métodos de evaluación de toxicidad de contaminantes en organismos acuáticos) Sao Paulo, SP . Brasil . s.p.

14.5 CETESB, 1991 a . Procedimientos para utilizacao de testes de toxicidades no controle de efluentes líquidos . (Procedimientos para la utilización de pruebas de toxicidad en el control de efluentes líquidos) Serie Manulas . Sao Paulo, SP . Brasil, 17 p . 14.7 CETESB, 1991 b . Implementacao de testes de toxicidade no controle de efluentes líquidos . (Implementación de pruebas de toxicidad en el control de efluentes líquidos) Serie Manuals . Sao Paulo, SP. Brasil, 7 p. 14.8 Environment Canada, 1990 . Biological Test Method : Reference Method for Determining Acute Lethality of Effluentents to Daphnia magna . (Método de referencia para determinar la letalidad aguda de efluentes con Daphnia magna ) EPS 1/RM/14. 18 pp. 14.9 EPA, 1991 . Methods for Mesuaring the Acute Toxicity of efluentes and Receiving Waters to Freswater and Marine Organismo. (Métodos para medir la toxicidad aguda de efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y deulceacuícolas) EPA/600/4-90/DZ7. 14.10 EPS, 1990 . Guidance Document on control of Toxicity Test Precisión Using Reference Toxicicants . (Guía para el control de la precisión en la prueba de toxicidad utilizando tóxicos de referencia )Report EPS 1/RM/15 Canada. 14.11 Finney, D. J ., 1971 . Probit analysis . (Análisis Probit) 3ª. Ed. Cambridge University Press, Londres. 333 pp. 14.12 Goulden, C.E. Y L .L . Henry, 1987 . Instrucciones para el cultivo de Daphnia para pruebas de Toxicidad . Guía de Trabajo . Academy of Natural Sciencies . Filadelfia . Pensilavania E. U .A . 13 pp. 14.13 ISO 6341, 1982 a Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Crustácea – Cladocera). (Calidad del agua - Determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magan Straus) ISO/6341-1982 (E). 14.14 Lewis , P . A . y W. B. Horning, 1988 . “A Short – Term Chronic Toxicity Test Using Daphnia magna” (Pruebas de toxicidad crónica a corto plazo utilizando Daphnia magna). Aquatic Toxicology and Hazard Assessment : 10 th Volume, ASTM, STP 1971 – w .J .Adams, G . A. Chapman, and W . G. Landis, Eds ., American Society for Testing and Materials, Filadelfia : 508 – 555.


14.15 Litchfield, J . T . Jr. Y F. Wilcoxon, 1949. A aimplified method of evaluating dose effect experiments . (Método simplificado para evaluar los efectos de la dosis en los experimentos) J. Pharm . Exp . Ther . 96 : -113. 14.16 Needham, J. G ., P . S .Galtssoff, F. E . Lutz y P. S. Welch, 1937. Cultura Methods for Invertebrate Animals . (Métodos de cultivo en invertebrados) Cumstock Publ . Co. Reprinted by Dover Publ ., Inc ., Nueva York. 14.17 Pennak, R . W ., 1978. Fresh Water Invertebrates of the United States . (Invertebrados dulceacuícolas de los Estados Unidos de América) 2ª ed ., John Wiley and Sons, Nueva York, 365 – 367 pp. 14.18 Pielou, E . C . 1969 . An Introduction to Mathermatical Ecology . (Introducción a la Ecología Matemática) Wiley Interscies John Wiley and Sons , Nueva York. 14.19 Ley de Aguas Nacionales . Publucada en el Diario Oficial de la Federación del 1 de Diciembre de 1992. 14.20 Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente . Publicada en el Diario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988. 14.21 Stephan, C . E ., 1977. Methods for calculating an LC50 .(Métodos para el cálculo de la CL50) In : Mayer y J .L Hamelink, (Eds.), Acuatic Toxicology and Hazard Evaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania: 65 – 84. 14.22 NOM-008-SCFI-1998 Sistema General de Unidades de Medida. 15 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Esta Norma concuerda parcialmente con la norma internacional ISO 6341, ver apéndice informativo. APENDICE INFORMATIVO Cabe mencionar que la presente norma ha sido complementada con normas de otros países e investigación realizada a nivel nacional.


México, D . F ., a 14 de noviembre de 1995.

LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS

LIC. MARIA EUGENIA BRACHO GONZALEZ.


ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE HUEVOS DE HELMINTO - MÉTODO DE PRUEBA

ANALYSIS OF WATER - DETERMINATION OF HELMINTH EGGS - TEST METHOD

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P R E F A C I O En la elaboración de la presente norma mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones: - ASOCIACIÓN NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUÍMICA, A.C. Dirección General. - ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODUCTORES DE REFRESCOS Y AGUAS

CARBONATADAS Dirección Técnica. - CÁMARA DE LA INDUSTRIA DE TRANSFORMACIÓN DE NUEVO LEÓN Instituto para la Protección Ambiental - Dirección General. - CÁMARA MINERA DE MÉXICO Comisión de Ecología y Recursos Naturales. - CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE ACEITES, GRASAS Y JABONES Gerencia de Ecología, Normas y Salud. - CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DEL HIERRO Y DEL ACERO Instituto Mexicano del Hierro y el Acero. - CÁMARA NACIONAL DEL CEMENTO - COLEGIO DE INGENIEROS MECÁNICOS Y ELECTRICISTAS Coordinación del Comité Nacional Permanente de Peritos de Riesgo Ambiental. - COMISIÓN FEDERAL DE ELECTRICIDAD Gerencia de Protección Ambiental. - COMISIÓN NACIONAL DEL AGUA Gerencia de Saneamiento y Calidad del Agua. - COMITÉ TÉCNICO DE NORMALIZACIÓN NACIONAL DE PROTECCIÓN AL AMBIENTE - CONFEDERACIÓN DE CÁMARAS INDUSTRIALES Comisión de Ecología.


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- CONFEDERACIÓN PATRONAL DE LA REPÚBLICA MEXICANA Comisión Nacional de Ecología. - DEPARTAMENTO DEL DISTRITO FEDERAL Subdirección de Verificación y Control de la Contaminación. - INSTITUTO MEXICANO DEL PETRÓLEO - INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Académia de Ingeniería Sanitaria; Centro de Investigación y Estudios Avanzados. - INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY Dirección General. - PETRÓLEOS MEXICANOS Exploración y Producción-Subgerencia de Normatividad y Promoción; Refinación-Gerencia de Protección Ambiental y Seguridad Industrial; Dirección de Gas y Petroquímica Básica; Dirección Corporativa de Administración. - PROCURADURÍA FEDERAL DE PROTECCIÓN AL AMBIENTE Dirección General de Verificación al Ordenamiento Ecológico. - SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y DESARROLLO RURAL . Dirección General de Agricultura. - SECRETARÍA DE COMUNICACIONES Y TRANSPORTES Dirección General de Transporte Terrestre Federal. - SECRETARÍA DE ECOLOGÍA DEL ESTADO DE MÉXICO Dirección General de Normatividad y Apoyo Técnico. - SECRETARÍA DE ENERGÍA Dirección de Seguridad y Protección al Ambiente. - SECRETARÍA DE GOBERNACIÓN Dirección General de Protección Civil. - SECRETARÍA DE MARINA Dirección de Protección al Medio Ambiente. - SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA Subsecretaría de Recursos Naturales.


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- SECRETARÍA DE SALUD Dirección General de Salud Ambiental. - SECRETARÍA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL Subdirección de la Unidad de Estructuración de Normas. - UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO - UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA Coordinación de Investigación. - UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Centro de Ciencias de la Atmósfera; Coordinación de Investigación Científica; Facultad de Ingenieria-Laboratorio de Control de Emisiones.


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ÍNDICE DEL CONTENIDO Número de capítulo Página 0 Introducción 1 1 Objetivo y campo de aplicación 1 2 Referencias 2 3 Definiciones 2 4 Principio 3 5 Muestreo 4 6 Reactivos y materiales 4 7 Aparatos 5 8 Preparación y acondicionamiento de la muestra 5 9 Procedimiento 5 10 Expresión de resultados 9 11 Informe de la prueba 11 12 Bibliografía 11 13 Concordancia con normas internacionales 12



CDU543.3.062

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ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE HUEVOS DE HELMINTO - MÉTODO DE PRUEBA

ANALYSIS OF WATER - DETERMINATION OF HELMINTH EGGS - TEST METHOD

O INTRODUCCIÓN Ante la escasez de recursos hídricos, la explosión demográfica y el desarrollo industrial, la utilización de aguas residuales es una importante alternativa como fuente adicional de suministro, particularmente para riego agrícola. Sin embargo, dicha actividad tiene implicaciones negativas desde el punto de vista sanitario, ya que representa un riesgo a la salud de los trabajadores agrícolas y de los consumidores de los productos, en especial cuando se trata de aquéllos que se consumen crudos como las hortalizas. Los helmintos representan un elevado riesgo a la salud humana debido a que sus diversos estadíos infecciosos (huevos embrionados o larvas) son altamente persistentes en el agua contaminada. Así, el agua constituye un vehículo directo o indirecto de diseminación de helmintos, aun cuando se encuentren en bajas concentraciones, dando lugar a enfermedades gastrointestinales, sobre todo cuando ésta se emplea para el riego de cultivos. 1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta norma mexicana establece el método para la detección y enumeración de huevos de helminto en aguas residuales y lodos, con el fin de evaluar la calidad del agua y la eficiencia de los sistemas de tratamiento de la misma. Esta norma mexicana es aplicable para la evaluación de la calidad del agua residual cruda y tratada.

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2 REFERENCIAS Para la correcta aplicación de esta norma se deben consultar las siguientes normas oficiales mexicanas y normas mexicanas vigentes o las que las sustituyan: NOM-001-ECOL-1996 Que establece los límites máximos permisibles de

contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 6 de enero de 1997.

NOM-003-ECOL-1997 Que establece los límites máximos permisibles de

contaminantes para las aguas residuales tratadas que se reusen en servicios al público, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 21 de septiembre de 1998.

NMX-AA-003-1980 Aguas residuales - Muestreo. Declaratoria de vigencia

publicada en el Diario Oficial de la Federación el 25 de marzo de 1980.

NMX-BB-014-1973 Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidrio

usados en laboratorio. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 24 de agosto de 1973.

NMX-CC-013-1992 Criterios generales para la operación de los laboratorios de

pruebas. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 25 de junio de 1992.

3 DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma se establecen las siguientes definiciones: 3.1 Aguas residuales Son las aguas de composición variada provenientes de las descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier otro uso, así como la mezcla de ellas. 3.2 Coagulación Es la adición de compuestos químicos para alterar el estado físico de los sólidos coloidales o suspendidos, a fin de facilitar su remoción por sedimentación o filtración. 3.3 Filtración Es la remoción de las partículas suspendidas de un líquido que fluye a través de un medio de porosidad adecuada.

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3.4 Flotación Es la técnica de concentración donde las partículas de interés permanecen en la superficie de la solución cuya densidad es mayor. Por ejemplo, la densidad de huevos de helminto se encuentra entre 1,05 y 1,18, y la de los líquidos de flotación se sitúa entre 1,1 y 1,4. 3.5 Helmintos Término designado a un amplio grupo de organismos que incluye a todos los gusanos parásitos (de humanos, animales y vegetales) y de vida libre, con forma y tamaños variados. Poseen órganos diferenciados, y sus ciclos de vida comprenden la producción de huevos o larvas, infecciosas o no y la alternancia compleja de generaciones que incluye hasta tres huéspedes diferentes. 3.6 Método bifásico Es la técnica de concentración que utiliza la combinación de dos reactivos no miscibles entre sí, y donde las partículas (huevos y detritus) se orientan en función de su balance hidrofílico-lipofílico. 3.7 Sedimentación Es el proceso físico de separación entre dos fases debido a la diferencia de sus densidades. 4 PRINCIPIO Este método de análisis se basa en la diferencia de densidades entre los huevos de helminto, las demás sustancias presentes en las aguas residuales, y las que se agregan para permitir la separación. El método comprende los procesos de coagulación, sedimentación, flotación, decantación y la técnica bifásica para recuperar los huevos de helminto y efectuar el conteo.

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5 MUESTREO El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de la calidad del agua, por lo cual, éste debe efectuarse como se menciona a continuación y de acuerdo a lo establecido en las normas mexicanas NMX-AA-003 y NMX-BB-014 (ver 2 Referencias): 5.1 Preparar garrafones de plástico inerte de 8 L, previamente desinfectados

con hipoclorito de sodio al 10 % (NaClO). 5.2 Lavarlos con agua potable a chorro y enjuagarlos varias veces con agua

destilada. 5.3 Se toman muestras de 5 L (volumen total), en estos garrafones de plástico

inerte, los cuales deben ser cerrados y sellados. 6 REACTIVOS Y MATERIALES 6.1 Reactivos (grado analítico) - Ácido sulfúrico (H2SO4); - Alcohol etílico (C2H5OH); - Agua destilada; - Cloruro de sodio (NaCl); - Éter etílico; - Formaldehído al 4 %; - Hipoclorito de sodio (NaClO) (no aplica grado analítico), y - Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O). 6.2 Materiales - Aplicadores de madera; - Barras magnéticas; - Bulbo de goma; - Espátula; - Garrafones de plástico inerte con paredes lisas y transparentes de 8 L de

capacidad; - Gradillas para tubos de centrífuga de 50 ml; - Guantes de látex; - Mascarilla contra gases y vapores; - Matraz Kitazato; - Pipetas de 10 ml de plástico; - Probetas graduadas de 50 ml y de 1 000 ml; - Recipientes de plástico inerte con paredes lisas y transparentes de 2 000 ml y

4 000 ml de capacidad;

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- Tamiz de 160 µm (micras) de poro; - Tubos de centrífuga de 200 ml, 450 ml o de mayor volumen según sea la

capacidad máxima de la centrífuga; - Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml, y - Vasos de precipitados de 1 000 ml. NOTA- Los materiales utilizados deben cumplir con lo establecido en la norma mexicana NMX-BB-014 (ver 2 Referencias). 7 APARATOS - Agitador de tubos, con control de velocidad y adaptable a diversos tubos; - Balanza granataria; - Balanza analítica; - Bomba de vacío con control de velocidad de succión; - Campana de extracción; - Celda de Sedgwich-Rafter o cámara de conteo de Doncaster o cámara de

Neubauer; - Centrífuga. Capaz de mantener los intervalos de operación de 1 000 r/min a

3 000 r/min o su equivalente en g; - Densímetro (Hidrómetro). Capaz de mantener el intervalo de medición de 1,0 g/ml

a 1,4 g/ml, y temperatura de operación de 0ºC a 4ºC; - Incubadora; - Microscopio óptico. Equipado para hacer iluminación campo claro (Köheler), con

aumento de 10 a 100x y platina móvil (opcional); - Parrilla con agitación magnética, y - Refrigerador. 8 PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA 8.1 Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC hasta su

llegada al laboratorio. 8.2 La muestra debe procesarse dentro de las 48 h después de su toma, o en

caso contrario, debe fijarse con 10 ml de formaldehído al 4 %, o bien, preservarse en refrigeración para realizar su análisis antes de 2 meses.

9 PROCEDIMIENTO Los siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

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9.1 Preparación de soluciones 9.1.1 Solución de sulfato de zinc (ZnSO4) con gravedad específica de 1,3 Disolver 800 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) en 1 000 ml de agua destilada; mezclar en la parrilla magnética hasta homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro. Ajustar la densidad a 1,3 agregando sulfato de zinc o agua destilada, según sea el caso. 9.1.2 Solución de alcohol-ácido. Homogeneizar 650 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1 N, con 350 ml de alcohol etílico. Almacenar la solución en un recipiente hermético. 9.2 Calibración de aparatos Todos los equipos utilizados deben ser calibrados con patrones certificados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante. 9.3 Seguridad Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubreboca para evitar cualquier riesgo de infección. Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y después del ensayo. Cuando se efectúe la agitación de las soluciones con éter, ésta se debe realizar en sitios ventilados o dentro de la campana de extracción, y considerar su inflamabilidad. Evitar el contacto con los ojos, piel o ropa, ya que es un reactivo sumamente tóxico.

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9.4 Manejo de residuos Todo material desechado debe ser previamente esterilizado o desinfectado con hipoclorito de sodio al 10%. 9.5 Concentración y separación de los huevos de helminto La recuperación de los huevos de helminto de la muestra se debe realizar efectuando los siguientes pasos: a) Dejar reposar la muestra al menos 3 h o toda la noche o centrifugar a 400

g de 3 min a 5 min. b) Aspirar y desechar el sobrenadante por vacío y sin agitar, si la

sedimentación (separación) se realizó por centrifugación, decantar lentamente. Filtrar el sedimento en el tamiz de 160 µm de poro. Lavar el tamiz con 5 L de agua (potable o destilada), y recuperar el agua de lavado junto con el sedimento filtrado.

c) Colocar el filtrado y el agua de enjuague en el garrafón de 8 L donde

originalmente se encontraba la muestra o en los recipientes utilizados en la centrifugación.

d) Dejar reposar la muestra al menos 3 h o toda la noche o centrifugar a 400

g de 3 min a 5 min. e) Aspirar con cuidado el sobrenadante al máximo y desecharlo. Depositar el

sedimento en los recipientes para la centrífuga. Enjuagar 3 veces el garrafón perfectamente con poca agua destilada, y colocar en los recipientes para centrifugación.

f) Centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min. g) Decantar nuevamente el sobrenadante por vacío. Asegurarse que en el

fondo del recipiente exista la pastilla; en caso contrario, centrifugar nuevamente. Resuspender la pastilla en 150 ml de la solución de sulfato de zinc (ZnSO4). Homogeneizar la pastilla con el agitador de tubos o con un aplicador de madera.

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h) Una vez más, centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min, y recuperar el

sobrenadante virtiéndolo en un recipìente de plástico de 2 000 ml. Diluir cuando menos en 1 000 ml de agua destilada, y dejar sedimentar al menos 3 h, o toda la noche o centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min.

i) Aspirar con cuidado y al máximo el sobrenadante por vacío, y resuspender

el sedimento por agitación, utilizando poca agua destilada. Vertir la suspensión resultante en un tubo de centrífuga de 200 ml, incluyendo el agua de enjuague del recipiente y centrifugar a 480 g durante 3 min.

j) Decantar nuevamente el sobrenadante y resuspender la pastilla con agua

destilada en un tubo de 50 ml y centrifugar a 480 g durante 3 min. k) Decantar nuevamente el sobrenadante por vacío y resuspender la pastilla

en 15 ml de la solución de alcohol-ácido por medio de un agitador de tubos, y agregar 10 ml de éter. Agitar suavemente y de vez en cuando destapar cuidadosamente los tubos para dejar escapar el gas que se desprenda. Por seguridad realizar en sitios ventilados utilizando la mascarilla o en la campana de extracción

l) Centrifugar una última vez a 660 g durante 3 min. m) Aspirar al máximo el sobrenadante, dejando menos de 1 ml del mismo y

evitando la pérdida de la pastilla; homogeneizar la pastilla, y proceder a la cuantificación. Por seguridad realizar en sitios ventilados utilizando la mascarilla o en la campana de extracción.

9.6 Cuantificación de los huevos de helminto a) Para evitar la sobreposición de las estructuras y el detritus no eliminado,

repartir la muestra en volúmenes de 0,5 ml a 1,0 ml, con el fin de facilitar la lectura.

b) Distribuir cada uno en una celda de Sedgwich-Rafter, o bien, en una

cámara de conteo de Doncaster o cámara Neubauer.

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c) Identificar visualmente una a una las estructuras, anotando los generos

identificadas con ayuda de la figura 1. 10 EXPRESIÓN DE RESULTADOS 10.1 Cálculos Para determinar las revoluciones por minuto (rev/min) de la centrifuga, se utiliza la fórmula siguiente:

rev/min = √Kg/r donde: g es la fuerza relativa de la centrifugación; K es la constante cuyo valor es 89,456, y r es el radio de la centrifuga en centímetros (cm). La fórmula para calcular g es la siguiente:

g = r(rev/min)/K 10.2 Expresar el resultado en número de huevecillos por litro, tomando en

consideración la expresión en cálculos, o bien expresar el número de huevos contados y el volumen analizado:

HL H5=

donde: H es el número de huevos leídos en la muestra; HL es el número de huevos por litro, y 5 es el volumen de la muestra. 10.2 Interferencias La sobreposición de estructuras y/o detritus no eliminado en el sedimento, puede dificultar su lectura. En tal caso, es importante dividir el volumen en las alícuotas que se consideren necesarias. La falta de experiencia en la identificación de especies es también un elemento decisivo en el conteo y sobreconteo.

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FIGURA 1.- Especies de huevos de helminto

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11 INFORME DE LA PRUEBA El informe de la prueba debe incluir lo siguiente: - Todos los detalles necesarios para la identificación completa de la muestra; - Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el punto 10, y - Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como

cualquier operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.

12 BIBLIOGRAFÍA 12.1 NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida, publicada en

el Diario Oficial de la Federación el 14 de octubre de 1993. 12.2 Ayres, R. M., A Practical Guide for the Enumeration of Intestinal Helmints in

Raw Wastewater and Effluent from Waste Stabilization Ponds. (Guía práctica para la enumeración de helmintos intestinales en aguas residuales y efluentes provenientes de estanques residuales de estabilización). Leeds University Departament of Civil Engineering.1989, 19 pp.

12.3 CETESB, Sâo Paulo, Helmintos e Protozoarios Patôgenicos Contagem de

Ovos e Cistos en Amostras Ambientais (Helmintos y protozoarios patógenos presentes en huevos y quistes en muestras ambientales). 1989, 33 pp.

12.4 Cifuentes, E., U. Blumenthal, P. G. Ruiz y S. Bennett. Health Impact

Evaluation of Wastewater Use in Mexico. (Evaluación del impacto en la salud de las aguas residuales utilizadas en México) Public Healt Rev. 1991/92 19:243-250.

12.5 De León, R., P. Ch. Gerba y B. J. Rose, Manual de Vigilancia de Parásitos en

el Agua. Universidad de Arizona EEUU. 1988, 48 pp. 12.6 Instituto Nacional de Referencias Epidemiológicas (INDRE), Diagnóstico

Parasitológico. 1993, Capítulo IV-6, 1-43 p.

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12.7 Jiménez, B. y C. Maya, Evaluación de las diversas técnicas para la detección

de los huevos de helminto, y selección de una para conformar la NMX correspondiente. Instituto de Ingeniería, UNAM, México, 1996.

12.8 Lamothe, R. y P. L. García, Helmintos del Hombre en México-Tratamiento y

Profilaxis. Edit. AGT, 1988, 25-98 pp. 12.9 Martínez, B. M., Manual de Parasitología Médica. Edit. La Prensa Médica

Mexicana, 1986, 183-316 p. 12.10 Organización Mundial de la Salud, Guías para la calidad del agua potable.

1995, Vol. 1, 2a. Edic., España. 12.11 Satchwell, G. M., An Adaptation of Concentration Technique for the

Enumeration of Parasitic Helminth Eggs from Sewage Sludge (Adaptación de la técnica de Concentración para la enumeración de huevos de helminto parásitos provenientes de lodos residuales). Water Res. 1986, 20:813-816.

12.12 Schwartzbrod, J., L. Stien, K. Bouhoum y B. Baleux., Impacto del Tratamiento

de Agua Residual sobre Huevos de Helminto. Water Sc. Techn. 1989, 21:295-297.

13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Esta norma mexicana no equivale a ninguna norma internacional por no existir referencia alguna al momento de su elaboración.

MÉXICO, D.F. A LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.

CARMEN QUINTANILLA MADERO. JADS/LFVO/DLR/mrg.

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SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO … mx-aa-42-1987 calidad del agua-determinacion del numero mas probable (nmp) de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y escherichia