PROTOCOLO COLIFORMES TOTALES Y FECALES

7/24/2019 PROTOCOLO COLIFORMES TOTALES Y FECALES

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Calidad de Agua

Protocolo de Prctica: Determinacin de

Coliformes totales por el mtodo de tubos

mltiples

Catedrtico

PhD. Guadalupe Hernndez Eugenio

Presenta:

Barrales Fernndez Christell

Corts Soriano Isa

Lucas Jacobo Jetzahel

Torrez Lpez Osmar

Chapingo, Edo. Mex. A 18 de octubre de 2015

P o s t g r a d o e n I n g e n i e r a A g r c o l a y U s o

I n t e g r a l d e l A g u a


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IntroduccinEl agua es un recurso natural imprescindible para la sociedad y se utiliza en casi

todas las actividades que el hombre realiza. No obstante, en la actualidad existen

severos problemas de escasez y contaminacin del agua. As mismo, el agua puede

ser uno de los principales transmisores de enfermedades entricas si se llegara a

consumir en estado contaminado; entre los microorganismos indicadores del agua

potable, se pueden encontrar las bacterias del grupo coliforme, perteneciendo a este

grupo, gneros como: Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp y

Citrobacter spp; los cuales, generalmente se pueden encontrar en la capa superficial

del agua o en los sedimentos de fondo. El rpido aumento de la densidad

poblacional y el crecimiento industrial hace necesario e indispensable tratar las

aguas residuales para que, de esta manera puedan servir para los diferentes usos,considerndola como un recurso adicional (NOM-127-SSA1-1994, 1994, OMS,

1998).

Las aguas residuales, poseen una composicin altamente compleja, debido a la

incorporacin al agua de contaminantes como microorganismos, desechos

qumicos e industriales y de otros tipos. En consecuencia, se requiere una variedad

de procesos de tratamiento para separar los diversos contaminantes que con

seguridad se encontrarn (NOM-001-ECOL-1996, 1997, Valdezet al., 2003).

Los microorganismos indicadores contemplados por la Norma Oficial Mexicana

NOM-127-SSA1-1994, "Salud ambiental, agua para uso y consumo humano y

por la NOM-001-ECOL-1996 son dos: organismos coliformes totales y organismos

coliformes fecales.

Los microorganismos coliformes son un grupo de especies bacterianas que tienen

ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como

indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Los agentes patgenos

transmitidos por el agua constituyen un problema mundial que demanda un control

urgente mediante la implementacin de medidas de proteccin ambiental a fin de

evitar el incremento de las enfermedades relacionadas con la calidad del agua Los

microorganismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios


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o anaerobios facultativos, y fermentan la lactosa a 35 C con la produccin de cido

y gas. El grupo de los microorganismos coliformes es el ms ampliamente utilizado

en la microbiologa como indicador de prcticas higinicas inadecuadas (Edberget

al., 2000, Fenget al., 2002).

Los organismos coliformes son capaces de formar aerbicamente colonias en un

medio de cultivo lactosado selectivo y diferencial, con produccin de cido y

aldehdo dentro de un periodo de 24 h, en este grupo se incluyen bacterias como la

Escherichia, Klebsiella, Enterobacterm Serratiam Citrobacter, Salmonella y Shigella.

Tambin incluye organismos coliformes termotolerantes (coliformes fecales) los

cuales tiene las mismas propiedades Se utiliza la E. coli como indicador, para

identificar coliformes en alimentos y agua, como indicador de la presencia de este

coliforme (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Fenget al., 2002)

La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas

selectivas o diferenciales (Edberget al., 2000).

ObjetivoCuantificar los coliformes totales en una muestra de agua residual, mediante el

mtodo de tubos mltiples.

Fundamento terico

Aguas residuales

Se consideran Aguas Residuales a los lquidos que han sido utilizados en las

actividades diarias de una ciudad (domsticas, comerciales, industriales y de

servicios) y que ahora estn contaminadas con sustancias fecales, orina,

procedentes de desechos orgnicos de origen antropognica, animales, adems de

residuos procedentes de la actividad industrial. Comnmente las aguas residuales

suelen clasificarse como (NOM-001-ECOL-1996, 1997, NOM-003-SEMARNAT-

1997, 1997, Valdezet al., 2003):


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Aguas Residuales Municipales. Residuos lquidos transportados por el

alcantarillado de una ciudad o poblacin y tratados en una planta de

tratamiento municipal.

Aguas Residuales Industriales. Las Aguas Residuales provenientes de las

descargas de Industrias de Manufactura.

Otra forma de denominar a las Aguas Residuales es en base al contenido de

contaminantes que esta porta, as se conocen como (Valdezet al., 2003):

Aguas negras a las Aguas Residuales provenientes de inodoros, es decir,

aquellas que transportan excrementos humanos y orina, ricas en slidos

suspendidos, nitrgeno y coliformes fecales

Aguas grises a las Aguas Residuales provenientes de tinas, duchas,lavamanos y lavadoras, que aportan slidos suspendidos, fosfatos, grasas y

coliformes fecales, esto es, aguas residuales domsticas, excluyendo las de

los inodoros.

Aguas negras industriales a la mezcla de las aguas negras de una industria

en combinacin con las aguas residuales de sus descargas. Los

contaminantes provenientes de la descarga estn en funcin del proceso

industrial, y tienen la mayora de ellos efectos nocivos a la salud si no existe

un control de la descarga.

Coliformes

El trmino "coliformes" fue acuado para describir este grupo de bacterias entricas.

Coliformes no es una clasificacin taxonmica sino ms bien una definicin de

trabajo utilizado para describir un grupo de bacterias Gram-negativas, anaerbicas

facultativas con forma de varilla que fermenta la lactosa para producir cido y gas

dentro de 48 horas a 35 C. La mayora de los coliformes pueden encontrarse en

la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados

especialmente en las heces, por ejemplo, Escherichia coli (Edberg et al., 2000, Feng

et al., 2002).

La Escherichia coli, es conocida originalmente como Bacterium coli comuna, fue

identificado en 1885 por el pediatra alemn, Theodor Escherich. Se encuentra


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ampliamente distribuida en el intestino de los seres humanos y animales de sangre

caliente y es el anaerobio facultativo predominante en el intestino y parte de la flora

intestinal esenciales que mantiene la fisiologa del husped sano. E. coli es un

miembro de la familia Enterobacteriaceae, que incluye muchos gneros, incluyendo

patgenos conocidos, tales como Salmonella, Shigella y Yersinia. Aunque la

mayora de las cepas de E. colino se consideran patgenos, pueden ser patgenos

oportunistas que causan infecciones en huspedes inmunocomprometidos.

Tambin hay cepas patgenas de E. coli que cuando se ingiere, causa

enfermedades gastrointestinales en los seres humanos sanos. Por esta razn, su

presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo ms

ampliamente utilizado en la microbiologa de alimentos como indicador de prcticas

higinicas inadecuadas (Edberget al., 2000, Fenget al., 2002).

Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre

coliformes totales y coliformes fecales. El grupo de coliformes fecales se compone

principalmente de E. coli, pero algunos otros entricos tales como Klebsiellatambin

puede fermentar la lactosa a estas temperaturas y, por tanto, ser considerado como

coliformes fecales. La inclusin de Klebsiella spp en la definicin de trabajo de

coliformes fecales disminuy la correlacin de este grupo con la contaminacin

fecal. Como resultado, la E. coliha resurgido como un indicador, en parte facilitadopor la introduccin de nuevos mtodos que pueden identificar rpidamente E. coli

(Fenget al., 2002).

Mtodos de determinacin

En 1892, Shardinger propuso el uso de E. colicomo indicador de contaminacin

fecal. Esto se basa en la premisa de que E. colies abundante en las heces humanas

y animales, y por lo general no se encuentran en otros lugares. Adems, dado que

puede ser fcilmente detectado por su capacidad para fermentar la glucosa, es elms sencillo de aislar de otros patgenos gastrointestinales conocidos. Por lo tanto,

la presencia de E. coli en los alimentos o el agua se acept como indicativo de

contaminacin fecal reciente y la posible presencia de agentes patgenos en stas

(Edberget al., 2000, Fenget al., 2002).


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En 1914, el Servicio de Salud Pblica de Estados Unidos adopt la enumeracin de

coliformes como un estndar ms conveniente de importancia sanitaria. Aunque

coliformes eran fciles de detectar, su asociacin con la contaminacin fecal era

cuestionable porque algunos coliformes se encuentran naturalmente en muestras

ambientales. Esto condujo a la introduccin de los coliformes fecales como indicador

de la contaminacin. Coliformes fecales, primero definido sobre la base de las obras

de Eijkman es un subconjunto de coliformes totales que crece y fermenta la lactosa

a temperatura de incubacin elevada, por lo tanto, se hace referencia tambin a los

coliformes termotolerantes (Fenget al., 2002).

Los lmites permisibles de coliformes para una muestra de agua, se deben ajustar

a lo establecido por las normas, las cuales establecen que organismos coliformes

totales, el lmite permisible es de 2 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por

cada 100 mL; mientras que de organismos coliformes fecales debe de ser cero

(NOM-127-SSA1-1994, 1994).

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la

fabricacin de los alimentos.

La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque supresencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.

Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del equipo.

La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes reas del

procesamiento de alimentos.

Dentro de los mtodos ms comunes para la cuantificacin de coliformes destacan

el nmero ms probable (NMP) y por unidades formadoras de colonias; sin

embargo, este ltimo se realiza a partir del NMP (Marielarenaet al., 1995, Guzmnet al., 2004).

La determinacin del NMP de bacterias coliformes en una muestra se hace a partir

de la tcnica de tubos mltiples, en la cual volmenes decrecientes de la muestra

(diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en un medio de cultivo


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adecuado. La combinacin de los resultados positivos y negativos es usada en la

determinacin del NMP (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Guzmnet al., 2004).

El mtodo consta de tres etapas: prueba presuntiva, prueba confirmativa y prueba

complementaria. La prueba presuntiva consiste en colocar volmenes determinadosde muestra en una serie de tubos conteniendo caldo lauril triptosa y son inoculados

a 350.5C duran 24-48 horas. En esta prueba presuntiva la actividad metablica

de las bacterias es estimulada vigorosamente y ocurre una seleccin inicial de

organismos que fermentan la lactosa con produccin de gas. La formacin de gas

de 350.5C dentro de las 24 a 48 horas, constituye una prueba presuntiva no debe

usarse rutinariamente sin confirmacin para anlisis de agua y aguas residuales

(NOM-127-SSA1-1994, 1994).

De acuerdo al objetivo del estudio, en algunos casos se puede usar la prueba

presuntiva sin confirmacin, o en los casos en que exmenes anteriores indican que

los resultados de la prueba presuntiva son comparables a la prueba confirmativa

(NOM-127-SSA1-1994, 1994).

La prueba confirmativa consiste en transferir todos los tubos positivos de la prueba

presuntiva a tubos conteniendo caldo lactosado verde brillante bilis 2% y son

incubados durante 24-48 horas a 350.5C. Esta prueba reduce la posibilidad deresultados falsos gas-positivos que pueden ocurrir por las actividades metablicas

de los organismos formadores de esporas o por la produccin sinergstica de gas

debido a que algunas cepas bacterianas no pueden, individualmente, producirlo a

partir de la fermentacin de la lactosa. El caldo lactosado verde brillante bilis

contiene agentes selectivos e inhibidores que suprimen el desarrollo de todos los

organismos no coliformes. La produccin de gas a 35C despus de las 24-48 horas

constituye una prueba confirmativa positiva (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Fenget

al., 2002, Herreraet al., 2005).

La prueba complementaria consiste en transferir por inoculacin en estras, las

bacterias a partir de los tubos de caldo lactosado verde brillante bilis positivos, a

placas de Agar Endo o Agar Eosina Azul de Metileno (EAM), luego son incubadas

a 350.5C durante 242 horas. Se consideran positivas las colonias tpicas que


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son nucleadas con o sin brillo metlico y las colonias a tpicas que son opacas,

anucleadas, mucoides y de color rosado. Colonias tpicas y atpicas son transferidas

a tubos con caldo lauril triptosa y tubos con agar inclinado. Ser prueba

complementaria positiva cuando haya produccin de gas a partir de la fermentacin

de la lactosa y por el examen microscpico, sea demostrada la presencia de bacilos

Gram-negativos no esporulados, en las bacterias desarrolladas en el agar inclinado

(NOM-127-SSA1-1994, 1994, NOM-001-ECOL-1996, 1997,Edberget al., 2000).

Esta prueba se aplica en el examen de muestras de agua, si los resultados son

aplicados en el control de la calidad del agua potable. Tambin se recomienda

cuando existe alguna duda sobre la validez de la prueba confirmativa.

Equipo, materiales y reactivosREACTIVOS

Alcohol etlico 95%

Triptosa

Fosfato dipotsico K2HPO4

Fosfato monopotsico KH2PO4

Cloruro de sodio

Lauril sulfato de sodio

Agua destilada

Peptona

Lactosa

Bilis de buey deshidratada

Eosina

Azul de metileno

Verde brillante

Extracto de carne

Sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O)

Cristal violeta

Oxalato de amonio


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Yoduro de potasio (KI)

Cristales de yodo

Safranina

Agar

Acetona

SOLUCIONES

Caldo Lauril Trptosa: pesar 20 g de triptosa, 5 g de lactosa, 2.75 g de fosfato

dipotsico K2HPO4, 2.75 g fosfato monopotsico KH2PO4, 5 g de NaCl, 0.1 g

de lauril sulfato de sodio, diluir en 1 litro de agua. Ajustar el pH a 6.80.1.

Esterilizar.

Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%. Pesar 10 g de peptona, 10 g delactosa, 20 g de bilis de buey deshidratada, 0.0133 g de verde brillante. Se

diluyen en 1 litro de agua destilada y se ajusta el pH a 7.20.2. Esterilizar.

Agar Eosina Azul de Metileno (EAM). Pesar 10 g de peptona, 10 g de lactosa,

2 g de fosfato dipotsico K2HPO4, 0.4 g de agar, 0.065 g de azul metileno, 1

L de agua destilada. Se disuelve el medio en un poco de agua calentndolo

y agitndolo, se afora a 1 L y se esteriliza, se vaca en las cajas Petri (15 mL).

Agar nutritivo: Pesar 5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 15 g de agar.Se disuelve calentndolo y agitndolo frecuentemente hasta 1 L. vaciar en

volmenes de 6 a 7 mL en tubos de ensaye de 12x120 mm. Esterilizar a

121C durante 15 min. Sacar de la autoclave y colocar en posicin inclinada

hasta que el medio se solidifique.

Agua de dilucin: Para solucin Stock A. Pesar 34 g de fosfato monopotsico

KH2PO4 y disolver en 500 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.2 con

NaOH 1 N y completar el volumen a 1 L con agua destilada. Para solucin

Stock B. Pesar 50 g de sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O) y disolver el 1 L

de agua. Para el agua de dilucin, agregar 1.25 mL de la solucin Stock A de

fosfato monopotsico y 5 mL de la solucin Stock B de sulfato de magnesio

a 1 L de agua destilada

Reactivos para la coloracin de Gram:


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o Solucin de cristal violeta: Disolver 2 g de cristal violeta en 20 mL de

alcohol etlico a 95% y filtrar en papel grueso o algodn. Disolver 0.2

g de oxalato de amonio en 20 mL de agua destilada. Mezclar estas

soluciones en partes iguales.

o Solucin de Lugol: Disolver 2 g de yoduro de potasio (KI) en 5 mL de

agua destilada. Agregar 1 g de cristales de yodo a la solucin de

yoduro de potasio y agitar hasta que el yodo se disuelva. Agregar 295

mL de agua destilada y agitar.

o Solucin de Safranina: disolver 2.5 g de safranina en 100 mL de

alcohol etlico 95%. Diluir 10 mL de solucin stock de Safranina en 90

mL de agua destilada.

o Alcohol acetona. Mezclar alcohol etlico 95% y acetona en partesiguales.

MATERIAL Y EQUIPO

Mechero

Propipeta

Gradilla

Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)

Lentes de seguridad

Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodn

Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodn

Pipetas Pasteur estriles

Asa bacteriolgica

Portaobjetos

Microscopio ptico

Termmetro calibrado

Bao de agua a 44.5 0,1C.

Incubadora a 35 2,0Ca.

Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca

Autoclave


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Potencimetro

Cajas Petri

Tubos de 22x175 mm.

Tubos de 16x150 mm.

Tubos de ensaye

Gradilla para tubos de ensaye

Matraz Erlenmeyer 250 mL

Matraz Erlenmeyer 500 mL

Matraz Erlenmeyer 1 L.

Algodn

Papel aluminio

Lminas porta objeto

Papel filtro

Matraz quitazato

Bomba de vaco

Procedimiento

Prueba presuntiva de coliformes

Para la preparacin del medio de cultivo para la prueba presuntiva de muestras deagua, se preparan las diluciones del caldo lauril sulfato de sodio. Se agitan las

muestras y se transfieren en volmenes de acuerdo a la Cuadro 1, completando el

volumen con caldo de lauril de sodio, y se incuban a 355C, se examinan los tubos

a las 24 horas y se observa si hay formacin de gas, mediante el desplazamiento

del medio en la campana de Durhman, en caso contrario, incubar 24 h ms.

Despus de incubar se registran como positivos aquellos tubos en donde se observe

turbidez (crecimiento) y produccin de gas.

Cuadro 1. Diluciones necesarias para el anlisis presuntivo de coliformes

Inculo(mL)

Cantidad demedio portubo (mL)

Volumen demedio msinculo (mL)

Caldo lauriltriptosarequerido (g/L)

Concentracin

1 10 11 35.6 1x10 10 20 71.2 2x


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10 20 30 53.4 1.5x20 10 30 106.8 3x100 50 150 106.8 3x100 35 135 124.6 3.5x100 20 120 142.4 4x

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a tubos que contienen caldo de bilis verde brillante (brilla), con campana

de Durhman. Agitar suavemente para homogenizar la mezcla, y se incuban a

352C durante 24 a 48 horas (Figura 1).

Se registran como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez

(crecimiento) y produccin de gas despus del periodo de incubacin, mediante lairradiacin de luz UV.

Figura 1. Dilucin de la muestra para anlisis de coliformes totales y fecales


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Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales

Se transfieren de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo de la prueba presuntiva a tubos

con caldo EC, se agitan suavemente y se incuban a 44.50.1C en incubadora o a

bao de agua con circulacin durante 24 a 48 horas. Se registran como positivos

todos los tubos en donde se haya observado crecimiento y produccin de gas

(fluorescencia) despus de un periodo de incubacin; mediante la irradiacin de los

tubos con una fuente de luz UV.

Prueba complementaria para coliformes totales

Para el control de calidad para coliformes totales, se inoculan tubos de caldo EC

una cepa de E. colicomo control positivo y una de Enterobacter aerogenescomo

control negativo e incubar junto con las muestras.

a) Prueba confirmativa para Echerichia coli: se toma una asada de cada uno de

los tubos positivos de EC y se siembra por estra cruzada en agar azul de

metileno para su aislamiento. Se incuban las placas invertidas a 35C por 18

a 24 horas. Se seleccionan las placas con las morfologas microscpicas de

E. colide cada una de las colonias formadas y se incuban a 35C por 18-24

horas, se hace un frotis y se tien por Gram para observar al microscopio la

presencia de bacilos o cocobacilos Gram-negativos.

Preparacin de la coloracin de Gram

Se limpia bien una lmina de vidrio, para librarla de cualquier traza de pelcula

oleosa. Se coloca una gota de agua destilada sobre la lmina. Con un asa de

inoculacin colectar una pequea cantidad del crecimiento bacteriano en la

superficie del agar inclinado y suspenderla en la gota de agua, con la punta del asa

de inoculacin esparcir sobre la lmina de manera que forme una pelcula bien

delgada. Fijar la suspensin pasando la lmina tres veces sobre la llama, cubrir la

suspensin fijada, con solucin de cristal violeta, durante un minuto. Remover el

exceso de cristal violeta de la lmina, lavndola brevemente con agua corriente;

cubrir con solucin Lugol durante un minuto, decolorar utilizando una solucin de

alcohol-acetona (1:1).


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Clculos

Para prueba presuntiva:

Se debern revisar los tubos a las 24 y 48 horas y ver en la tabla No. 1 y Si el total

de tubos son negativos: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA

DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos

tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn convenientemente

y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA. Los resultados se

expresan de la siguiente manera, para el caso de coliformes totales, expresar como:

+

=

Para prueba confirmativa:

A partir del nmero de tubos que dan reacciones positivas en los medios de

aislamiento y confirmativo, calcular por referencia a las tablas estadsticas (Cuadro

2, Cuadro 3) el nmero ms probable de organismos coliformes, organismos

coliformes termotolerantes y E. colipresuntiva en 100 cm3de la muestra. Cuando

se emplean de dilucin para hacerlo equivalente. En caso de no encontrar en los

cuadros la combinacin de tubos adecuada, emplear para los clculos la siguiente

ecuacin:

100 3=

. 100

3 3

Cuadro 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias

combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20

mL de muestra de agua o hielo.

No. De tubospositivos

NMP/100 mL

95% de lmite de confianza

(aproximado)Inferior Superior

0


15/16

5 >8.0 4.0 Infinito

Cuadro 3. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias

combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10

mL de muestra de agua o hielo.

No. De tubospositivos

NMP/100 mL

95% de lmite de confianza(aproximado)

Inferior Superior

0 23.0 13.5 Infinito

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