Kor. J. Microbiol. Biotechnol.

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Sebekia benihana에서 Streptomyces coelicolor SCO4967 유전자 도입을 통한

하이드록실 사이클로스포린 A의 생전환

김현범1·이미진1·한규범2·김응수1*

1인하대학교 생물공학과, 2차바이오&디오스텍 바이오 의약연구소

Improvement of Cyclosporin A Hydroxylation in Sebekia benihana by Conjugational Transfer of Strep-

tomyces coelicolor SCO4967, a Secondary Metabolite Regulatory Gene. Kim, Hyun-Bum1, Mi-Jin Lee1,

Kyuboem Han2, and Eung-Soo Kim1*. 1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 402-751, Korea, 2CHA BIO & DIOSTECH Bio Pharmaceutical Research Institute, Daejeon 305-811, Korea − Actino-

mycetes are Gram-positive soil bacteria and one of the most important industrial microorganisms due to supe-

rior biosynthetic capabilities of many valuable secondary metabolites as well as production of various

valuable bioconversion enzymes. Among them are cytochrome P450 hydroxylase (CYP), which are hemopro-

teins encoded by a super family of genes, are universally distributed in most of the organisms from all biolog-

ical kingdoms. Actinomycetes are a rich source of soluble CYP enzymes, which play critical roles in the

bioactivation and detoxification of a wide variety of metabolite biosynthesis and xenobiotic transformation.

Cyclosporin A (CyA), one of the most commonly-prescribed immunosuppressive drugs, was previously

reported to be hydroxylated at the position of 4th N-methyl leucine by a rare actinomycetes called Sebekia

benihana, leading to display different biological activity spectrum such as loss of immunosuppressive activi-

ties yet retaining hair growth-stimulating side effect. In order to improve this regio-selective CyA hydroxyla-

tion in S. benihana, previously-identified several secondary metabolite up-regulatory genes from Streptomyces

coelicolor and S. avermitilis were heterologously overexpressed in S. benihana using an ermE*promoter-con-

taining Streptomyces integrative expression vector. Among tested, SCO4967 encoding a conserved hypotheti-

cal protein significantly stimulated region-specific CyA hydroxylation in S. benihana, implying that some

common regulatory systems functioning in both biosynthesis and bioconversion of secondary metabolite

might be present in different actinomycetes species.

Key words: Streptomyces, Sebekia benihana, cyclosporin, hydroxylation, secondary metabolite, regulatory gene

서 론

방선균은 주위 환경 변화에 따라 다양한 형태적 분화를

나타내는 대표적인 그램 양성 토양 미생물로서, 항암제, 항

생제 등의 가치 있는 생리활성 물질의 생산과 다양한 효소

들의 생전환, 독성물질의 분해 능력이 탁월한 대표적인 산

업 미생물이다[2, 20]. 특히 Sebekia benihana는 다양한 이

차대사산물의 생전환능이 탁월한 희소방선균으로서, 모넨신,

나이저리신, 사이클로스포린 A(Cyclosporin A: CyA)과 같

은 유용 생리활성물질의 특정위치를 하이드록실레이션 시키

는 것으로 밝혀졌다[5, 23, 32]. 이러한 생리활성물질의 구

조적 변형은 특정 화합물의 독성을 약화시키거나 부작용 활

성을 변화시키는 것으로 확인되었는데, 기존 연구를 통해 모

든 생물계의 다양한 생물 종에 분포되어 있는 철단백질인 사

이토크롬P450 하이드록실레이즈(CYP) 효소가 이러한 생전

환 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다[28].

CyA는 가장 광범위하게 적용되는 면역억제제로서 11개의

아미노산으로 구성된 사이클릭 펩타이드로서, 곰팡이

Tolypocladium inflatum에 의하여 생합성 된다[8, 27]. 이는

S. benihana에 존재할 것으로 추정되는 특정 CYP에 의하여

4번째 아미노산인 N-methyl leucine이 하이드록실레이션 되

어 주 활성인 면역억제 효과는 현저히 감소하고 부차적인 활

성인 발모 촉진 기능은 그대로 유지하는 CyA 유도체 화합

물로 전이되는 것으로 보고됨으로써, S. benihana 생전환 기

반의 CyA 유도체를 이용한 발모촉진제 개발 가능성이 제기

되었다(Fig. 1)[17]. 특히 본 연구진은 유전체 라이브러리 제

작 및 CYP-특이적인 PCR 스크리닝 전략을 통해 다수의

CYP 유전자가 S. benihana 유전체 내에 존재함을 확인하였

고, 이들 중 일부 CYP 유전자는 이종 숙주 발현기법을 통

해 CyA 하이드록실레이션에 직간접적으로 관여함을 규명하

*Corresponding author

Tel: 82-32-860-8318, Fax: 82-32-872-4046

E-mail: eungsoo@inha.ac.kr

476 KIM et al.

였다[22, 23]. 최근 유전체, 전사체, 단백질체 수준의 분석 방

법인 오믹스 기법을 통하여 산업적으로 유용하게 개량된 미

생물 균주의 다양한 유전체 돌연변이를 분자수준에서 비교-

분석할 수 있는 전략이 개발됨으로써, 이를 이용한 항생제 고

생산성에 관여하는 신규 방선균 유래 글로벌 조절유전자들이

다수 선별되었다[14, 15, 18]. 따라서 본 연구에서는, 이러한

방선균 오믹스 기법으로 이차대사산물의 생산성을 향상시킨

다고 밝혀진 Streptomyces avermitilis와 S. coelicolor 유래

글로벌 조절유전자들을 Streptomyces 삽입발현벡터인

ermE*pSET 벡터에 클로닝한 후 이 유전자들을 conjugation

을 통해 S. benihana에 도입함으로써, 궁극적으로 방선균의

이차대사산물의 생산에 관여하는 글로벌 조절시스템과 S.

benihana의 CyA 생전환 조절네트워크 간의 상관관계를 규

명하고, 또한 재조합 S. benihana 균주를 이용한 CyA의 생

전환 향상 가능성도 확인하고자 하였다.

본 연구에서 사용된 균주는 희소방선균인 Sebekia benihana

KCTC 9610으로 Korean Collection for Type Cultures

(KCTC, Korea)로부터 구입하였다. GSMY(glucose 0.7%,

yeast extract 0.45%, malt extract 0.5%, soluble starch

0.75%, and calcium carbonate 0.005%) 배지에서 배양하여

CyA의 4번째 아미노산인 N-methyl leucine이 하이드록실레

이션된 CyA(4OH-CyA)로의 생전환율을 확인하였고, RARE3

(glucose 1%, yeast extract 0.4%, malt extract 1%, peptone

0.2%, MgCl2·6H2O 0.359%, glycerol 0.5%) 배지에서 배양

하여 conjugation을 실시하였으며 두 배지 모두 28oC, 200

rpm에서 배양하였다[12]. 모든 E. coli는 37°C에서 Luria

broth(tryptone 1%, yeast 0.5%, NaCl 0.5%, glucose 0.1%)

또는 Luria agar(tryptone 0.5%, yeast 0.5%, NaCl 0.5%,

agar 1.5%) 배지에서 배양하였고 필요한 경우 항생제를 첨

가하였다[16]. E. coli DH5α와 Streptomyces 삽입발현벡터

인 ermE*pSET은 기존에 보고된 분자생물학 실험방법에 따

라 클로닝이 진행되었고, E. coli ET12567/pUZ8002는 대장

균과 방선균의 이종 숙주간 conjugation에 사용되었다[4, 16,

29].

클로닝에 사용된 유전자들은 본 연구진이 선행연구로 수

행한 DNA 마이크로어레이 분석으로 선별된 S. avermitilis

유래의 항생물질 생산성 향상에 관여하는 조절유전자인

SAV0213, SAV3818과 S. coelicolor 유래의 SCO3824,

SCO4967, SCO5147, SCO6269 등 총 6종이다[7, 14, 15,

19]. SAV0213은 putative RNA polymerase ECF-subfamily

sigma factor로서 S. avermitilis에서 구충제인 avermectin의

생산성 향상에 관여한다[7]. SAV3818은 putative TetR-

family transcriptional regulator로서 S. avermitilis에서 aver-

mectin의 생산성의 증가에는 관여하지만[7], 이와는 대조적

으로 일부 TetR-family 유전자들은 efflux pumps, osmotic

stress 등의 기능을 통하여 항생물질의 생합성 감소에 영향

을 미치기도 한다[24]. In silico Streptomyces genome 데이

터베이스 분석(http://streptomyces.org.uk/) 결과 SCO3824는

efflux pump 작용을 통한 항생제 저항성을 갖는 putative

ABC-transporter ATP-binding component를 암호화하는 것

이 확인되었다[9, 30, 31]. 또한 SCO4967은 conserved

hypothetical protein으로서 S. coelicolor에서 항생물질인

actinorhodin 생산성을 향상시킬 뿐만이니라, S. peucetius에

서도 항암물질인 doxorubicin의 전구물질인 aklavinone의 생

산성을 증가시키는 것으로 확인되었다[19]. 특히 이 SCO4967

유전자 서열의 연관성 분석을 통하여 Mycobacterium tuber-

culosis의 deacetylase 기능을 하는 mshB 유전자, amidase

기능을 하는 mca 유전자와도 높은 유사성이 있음을 확인하

였고[21], M. smegmatis에서 이 유전자를 제거함으로써 항

산화 작용과 해독작용에 관여하는 mycothiol의 생산성 감소

함도 확인되었다[25, 26]. SCO5147은 putative ECF(Extra

Cytoplasmic Function) - subfamily sigma factor로서, 정확

한 작용기작에 대해서는 아직 규명되지 않았지만, 대부분의

ECF sigma factor들이 RNA polymerase에 결합하여 특정

유전자의 전사를 촉진시킴을 감안할 때, 이차대사산물 생합

성에 관여하는 특정 유전자를 조절할 것으로 추정된다[11].

특히 SCO5147의 과발현은 S. coelicolor가 생산하는 항생물

질인 actinorhodin과 S. peucetius이 생산하는 항암물질인

doxorubicin의 생산성 증가를 유도시킴이 확인되었고, DNA

마이크로어레이 분석을 통하여 고생산성 산업균주에서

SCO5147 전사량이 확연히 증가함도 확인되었다[1, 3, 15].

SCO6269는 전자전달체에 포함된 putative oxidoredu-

ctase beta-subunit을 암호화하며 aromatic ring을 유도하는

역할을 한다[6, 10, 13].

앞서 언급한 총 6종의 유전자, SAV0213, SAV3818,

SCO3824, SCO4967, SCO5147, SCO6269은 각각 S.

Fig. 1. Bioconversion of regio-selective CyA hydroxylation at 4th N-methyl leucine by CYPs in S. benihana.

IMPROVED CYCLOSPORIN A HYDROXYLATION BY STREPTOMYCES REGULATORY GENES 477

avermitilis와 S. coelicolor의 유전체로부터 Table 1의 프라

이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 이를 pGEM-T easy

vector(Progema, U.S.A.)에 클로닝 한 뒤 유전자서열을 확인

하였다. 그리고 강력한 프로모터인 ermE* 프로모터가 존재

하는 발현벡터 pSET152의 BamHI, XbaI 제한효소 부위를

이용하여 재조합 발현벡터 p0213, p3818, p3824, p4967,

p5147, p6269를 제작하였다(Fig. 2A). 각각의 재조합 발현벡

터를 E. coli ET12567/pUZ8002로 도입한 후 이종 숙주간

conjugation 방법을 이용하여 S. benihana내로 전달하였다.

두 균주 혼합액을 Modified ISP4(soluble starch 1%, dipo-

tassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate USP 0.1%,

sodium chloride 0.1%, ammonim sulfate 0.2%, calcium car-

bonate 0.2%, ferrous sulfate 0.0001%, manganous chloride

0.0001%, zinc sulfate 0.0001%, tryptone 0.15%, yeast

extract 0.05%, agar 2%) 배지에 도말 한 후 16~20시간을

배양하여 apramycin(40 µg/mL)과 nalidixic acid(20 µg/

mL)를 이용하여 선별 하였다. 이 과정에서 얻은 콜로니들을

같은 농도의 apramycin과 nalidixic acid가 포함된 GSMY

agar 배지에 접종하여 항생제 저항성 콜로니를 확인하였고,

이를 apramycin이 포함된 GSMY agar 배지에 다시 한번 옮

겨 배양함으로써 조절유전자가 재조합된 항생제 저항성 단

일콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 GSMY broth 배

지에서 배양하여 genomic DNA를 추출한 후 프라이머

check F(5’-CTGCGCCGATGGTTTCTACA-3’), check R(5’-

TGCAGCTGGCACGACAGG-3’)을 이용하여 PCR을 수행

한 결과 p0213, p3818, p3824, p4967, p5147, p6269에서

각각 1534 bp, 1587 bp, 2043 bp, 1883 bp, 1639 bp, 1977

bp 크기의 밴드를 확인함으로써 조절유전자가 삽입된 재조

합 S. benihana 균주를 확보하였다(Fig. 2B).

CyA 생전환율의 분석을 위하여 pSET152 공벡터만 삽입

되어 있는 S. benihana와 조절유전자가 클로닝되어 있는

pSET152 벡터가 삽입되어 있는 S. benihana를 GSMY

broth 배지 30 mL에 1.0×107 CFU/mL의 포자를 접종하여

Table 1. The sequences of PCR primer pairs for the amplification of S. avermitilis SAV genes and S. coelicolor SCO genes.

Gene Proposed function Primer sequences (5'-3')

SAV0213 Putative RNA polymerase ECF-subfamily sigma factorF-GGATCCGTTGGCCCGCGTAAGGA

R-TCTAGAACCCACATCGAAGCCCT

SAV3818 Putative TetR-family transcriptional regulator F-GGATCCATTTGCAGTCGGCCGAAT

R-TCTAGATATGACAGGAATTGAGCC

SCO3824 Putative ABC-transporter ATP-binding component F-GGATCCGGAATCGTGATCGCATGCAT

R-TCTAGAGAGAGATCCTTGTTCTCGCT

SCO4967 Conserved hypothetical protein F-GGATCCCCCGATTCGGTCACTATAGA

R-TCTAGAATCACCGCGAACACGATGAA

SCO5147 Putative ECF-subfamily sigma factor F-GGATCCTGGCTATGGTAGGGGCTC

R-TCTAGAGTGTCCCTCGGGCTCAGG

SCO6269 Putative oxidoreductase beta-subunitF-GGATCCTACAACCAGGTCAACGGCAT

R-TCTAGACCAGGGAACATGGGATTAAC

Fig. 2. (A) Cloning of regulatory target genes into Streptomyces

expression vector, ermE*pSET152. (B) PCR with the DNA sam-

ples of five-day-old S. benihana GSMY liquid cultures. Lane M,

1 kb size marker; lane 1, wild type (no amplification); lane 2, p0213

(1.5 kb); lane 3, p3818 (1.6 kb); lane 4, p3824 (2.0 kb); lane 5,

p4967 (1.9 kb); lane 6, p5147 (1.6 kb); lane 7, p6269 (2.0 kb).

478 KIM et al.

30oC, 230 rpm에서 3일간 배양하여 세포가 충분히 자라도

록 하였다. 배양액에 최종농도가 100 mg/L가 되도록 CyA

를 첨가하고 7 mL의 샘플을 취하여 -20oC에서 보관한 뒤 3

일 더 배양하여 7 mL의 샘플을 취하였다. 준비된 샘플과 같

은 부피의 ethyl acetate를 혼합하여 30oC, 230 rpm에서

overnight 한 후 원심분리하여(8,500 rpm) cell을 침전시키고

상층액 3 mL을 evaporation하여 ethyl acetate를 제거하고

이를 다시 500 µL의 메탄올에 현탁하여 HPLC 분석을 위

한 샘플을 확보하였다. 모든 실험은 triplicate으로 진행하였

으며 HPLC 분석조건은 다음과 같다. 컬럼은 C18 column

(250×4.6 mm, GRACE)을 이용하였고 이동상은 25% metha-

nol(buffer A)과 100% acetonitrile(buffer B)를 혼합하여 사

용하였다. Binary Gradient의 buffer A와 buffer B의 비율은

0-4분은 60% : 40%, 4-20분은 39% : 61%, 20-30분은 60% :

40%로 설정하였으며, column의 온도는 70oC를 유지하였고

detection은 210 nm, flow rate는 1 mL/분으로 설정하였다

[22].

HPLC에 의한 스펙트럼 패턴 분석을 통하여 17분에서

CyA, 13분에서 하이드록실레이션된 CyA가 확인되었다. 17

분과 13분 이외의 시간대에서 나타나는 스펙트럼은 CyA가

detection 되는 210 nm 파장을 통해 CyA와는 다른 패턴임

을 확인하였고, 13분에 나타난 peak의 샘플을 취하여 mass

를 확인한 결과 4-OH CyA임을 확인하였다(Fig. 3A)[22,

23]. pSET152 공벡터만 삽입되어 있는 S. benihana를 기준

으로, 조절유전자가 클로닝 되어있는 pSET152 벡터가 삽입

되어 있는 S. benihana의 하이드록실레이션 생전환율은 평

균적으로 p0213에서 11% 감소, p3818에서 73% 감소,

p4967에서 51% 증가, p5147에서 4% 감소, p6269에서20%

감소됨을 확인하였다(Fig. 3B). 항생물질 생산을 증가시키는

역할을 하는 것으로 알려진 6개의 조절유전자 중에서

Fig. 3. (A) HPLC chromatograms of CyA and hydroxylated CyA. (B) Relative bioconversion yield of CyA hydroxylation. SCO4967

heterologous overexpression in S. benihana resulted in about 50% more CyA hydroxylation.

IMPROVED CYCLOSPORIN A HYDROXYLATION BY STREPTOMYCES REGULATORY GENES 479

SCO4967만이 CyA의 생전환율 증가에 영향을 미치는 것을

확인하였고, 나머지 5개의 조절유전자들은 SAV3818에서 비

교적 크게 감소한 것을 제외하고는 pSET152공벡터 재조합

S. benihana에 비하여 생전환율에서 큰 차이를 보이지 않았

다. 이러한 결과는, 대부분의 Streptomyces 이차대사산물의

생산성을 향상시키는 조절유전자는 다른 속의 희소방선균 S.

benihana에 의한 대사체 생전환 과정에는 영향을 주지 않는

것으로 추정되며, 다만 SCO4967과 같은 특정 Streptomyces

조절유전자만이 효과적으로 이종숙주에서 발현되어 50% 이

상의 CyA 생전환의 증가를 유도하는 것으로 사료된다.

SCO4967은 conserved hypothetical protein을 암호화하는

유전자로 그 기능은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, S.

coelicolor와 S. avermitilis 균주에서의 마이크로어레이 결과

를 통해 확인된 바와 같이 이들 유전자에 의해 균주의 대사

활성에 관여하는 유전자들의 발현이 증가되므로 S. benihana

에서 이종발현 될 경우 균주 내에서 사이클로스포린 생전환

에 관여하는 특정 CYP 유전자 발현이 증가함으로써 CyA

생전환율이 증가하였을 것으로 추정된다. 이로부터 희소방

선균 S. benihana 내에서 방선균 이차대사산물 조절유전자

를 이종발현하여 CyA 생전환이 향상된 재조합 균주를 확보

함으로써, 유전정보가 부족한 대부분의 희소방선균에서 S.

coelicolor와 같은 모델 균주에서의 오믹스 결과로 선별된

유용 유전자 도입을 통한 효율적인 생전환 개량균주를 확보

할 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgment

This work was supported by the 21C Frontier Micro-

bial Genomics and Applications Center Program, Ministry

of Education, Science & Technology, Republic of Korea.

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(Received Aug. 3, 2010/Accepted Oct. 7, 2010)