ScreeningScreening vrozených vrozených vývojových vad v graviditěvývojových vad v graviditě

MUDr. Marta Kalousová, Ph.D.Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky a Ústav lékařské biochemie

1.LF UK a VFN Praha

ScreeningScreening vrozených vývojových vrozených vývojových vad v graviditěvad v graviditě

• Standard – II.trimestr• Doporučeno – I. a II.trimestr• Ideál – integrovaný screening

ScreeningScreening vrozených vývojových vrozených vývojových vad v graviditěvad v graviditě

I.trimestr• stanovení specifického těhotenského

proteinu PAPP-A (pregnancy-associatedplasma protein A)

• stanovení volné β podjednotky hCG - freeβ-hCG (?)

• UZ vyšetření plodu – nuchálnítranslucence (NT), přítomnost nosní kůstky

ScreeningScreening vrozených vývojových vrozených vývojových vad v graviditěvad v graviditě

II.trimestr• hCG• AFP• (nekonjugovaný estriol) – triple test• UZ vyšetření plodu – k přesnému určení

gestačního stáří

double test

Doporučení České společnosti klinické biochemie, Doporučení České společnosti klinické biochemie, RL pro klinickou biochemii MZ ČR a České RL pro klinickou biochemii MZ ČR a České společnosti nukleární medicíny pro úspěšné společnosti nukleární medicíny pro úspěšné

provádění imunoanalytického provádění imunoanalytického screeninguscreeningu VVV vVVV v II. II. trimestru těhotenstvítrimestru těhotenství

• Počty vyšetření – min. 1500 nebo návaznost• SLP, předpokládá se účast v EQA• Doporučení 2 analytů - AFP, hCG• UZ k určení délky gravidity• Výsledky uvádět vždy v MoM• Riziko hodnocené programem

Doporučení České společnosti klinické biochemie, Doporučení České společnosti klinické biochemie, RL pro klinickou biochemii MZ ČR a České RL pro klinickou biochemii MZ ČR a České společnosti nukleární medicíny pro úspěšné společnosti nukleární medicíny pro úspěšné

provádění imunoanalytického provádění imunoanalytického screeninguscreeningu VVV vVVV v II. II. trimestru těhotenstvítrimestru těhotenství

• Stanovení AFP a ACh v plodové vodě nebo možnost odeslat

• Spolupráce s gynekology a genetiky• Databáze pracovišť zabývajících se scr.VVV• Seminář pro laboratoře provádějící screening –

obvykle na imunochemických pracovních dnech

IntegrIntegrovanýovaný testtest ((WaldWald 9999))

1/ PAPP-A ( 9.- 11. týden) 2/ NT ( 11.-13. týden) I.fáze

3/ Druhý trimestr (15.-18. týden)double nebo triple test II.fáze

Integrovaný testIntegrovaný test

I. trimestr• stanovení PAPP-A• UZ určení délky

těhotenství• změření NT• předběžné hodnocení

ošetřujícím lékařem

II. trimestr• stanovení AFP• stanovení hCG

• kombinované hodnocení spolu s výsledky z I. trimestru

MarkeryMarkery –– stanovenístanovení

• Vyjadřování absolutní koncetrace v mateřském séru

• Vyjadřování koncetrace v MoM (násobky mediánu), naměřené výsledky musí být před přepočtem na MoMvždy korigovány na hmotnost matky (zřeďovací prostor)!

• Nutno používát stejnou diagnostickou soupravu, rozdíly při stanovení různými soupravami až 100 %!!!

• Významný vliv nepřesností stanovení na výsledekbiochemického screeningu (u imunochemických metod běžně intraassay do 10%, při použití technologie TRACE významné zpřesnění – variabilita 1-2%)

Produkce Produkce onkofetálníchonkofetálních antigenů antigenů fetoplacentárnífetoplacentární jednotkou v průběhu jednotkou v průběhu

těhotenstvítěhotenství

týden10 20 30 40

produkované množstvíOF Ag

hCGAFP

SP1

Lidský Lidský choriovýchoriový gonadotropingonadotropin((hCGhCG))

• Glykoprotein produkovaný synciciotrofoblastemplacenty, udržuje funkci žlutého tělíska (produkce steroidních hormonů)

• Mh 36 700, α a β subjednotka, α subjednotkajako u LH, FSH a TSH. β subjednotka (145 AMK) je podobná u hCH a LH, liší se ve 24 AMK.

• Fyziologický výskyt: těhotenství (testy na graviditu)

• Patologický výskyt: nádory vycházející z choriové tkáně – trofoblastická nemoc (chorioCAa mola), germinální nádory testes a ovarií, vzácněji u jiných lokalizací.

Lidský Lidský choriovýchoriový gonadotropingonadotropin((hCGhCG))

„free“β-hCG

β core

β core – vylučuje se močí, je velmi stabilní, lze jej využít pro screening v II.trimestru

Odbourávání a štěpení Odbourávání a štěpení hCGhCG• Intaktní hCG – mh 36700• Naštěpení hCG (nicked) – rozštěpená 1 peptidová vazba

v β subjednotce – neaktivní• Odstraněný C-terminální segment v nhCG• Volná α-subjednotka• Volná β-subjednotka (intaktní nebo naštěpená)• Volná naštěpená β-subjednotka bez terminálního C-

segmentu• Střední část β-subjednotky (β-subunit core fragment) –

přechází snadno do moči a tvoří hlavní část produktůodbourávání hCG v moči.Většina Ab používaných pro detekci hCG v moči s tímto fragmentem nereaguje! (pokud by byly vhodné Ab → zvýšení citlivosti testů na dg gravidity)

→ různé produkty odbourávání hCG a různé Ab pro detekci (rozdíly mezi různými dg soupravami až 100%) → nestřídat soupravy ani od stejného výrobce!!!

Nejčastěji stanovované Nejčastěji stanovované hCGhCG• „Total“ hCG – nejčastěji pomocí polyklonálních

antisér, stačí pro dg těhotenství• β-hCG – „specifické“ hCG – nutné pro nádorovou dg• „free“β-hCG - náročné z hlediska preanalytiky (rozpad

hCG ve vzorku zvláště při vyšší teplotě a zvýšení „free“β-hCG )

• β-core hCG – vhodný pro stanovení v moči, nenívhodný pro konec I.trimestru, kdy je produkce hCG tak vysoká, že se nestačí odbourávat na β-core hCG a vylučuje se jen částečně naštěpená molekula hCG

• Hyperglykosylované („kyselé“) hCG –charakteristické pro nezralou placentu na zač. těhotenství a pro chorioCA. Dle některých studií ve zvýšené míře v moči žen s plodem postiženýcm m.Down.

hCGhCG

0.1 1 10 Log MoM

norma

Edwards Down

Alfa Alfa ––11--fetoproteinfetoprotein (AFP)(AFP)

• Glykoprotein, mh 64 600, 2.2% sacharidů, pI 4.7, značná část sekvenční homologie s albuminem

• Funkce: vazba estrogenů, transport mastných kyselin, imunosupresivní účinky

• Fyziologická produkce: žloutkový váček a fetálníjátra

• Patologická produkce: nádory jater, germinálnínádory testes a ovarií, méně často GIT a jiných lokalizací v těhotenství zvýšen v séru matky u defektů neurální trubice, omfalokély, spont.abortu

AFPAFP

0.1 1 10 Log MoM

Down

norma

Edwards

Hodnocení výsledků Hodnocení výsledků biochemického screeningu VVV v biochemického screeningu VVV v

graviditě graviditě –– „likelyhood ratio“„likelyhood ratio“(Knight and Palomaki. J Clin Immunoassay 1990)

0.2 1 5MS AFP MoM

Hodnotí se poměr délky úseček

/→ riziko

Down normál

Hodnocení Hodnocení atypieatypie ((atypicalityatypicality) ) výsledků biochemického výsledků biochemického

screeninguscreeningu VVV v graviditěVVV v graviditě(Wright et al. Ann Clin Biochem 1993)

0-0.3 0.3

0

-0.3

0.3

→ Log (MoM AFP).10-1

→Lo

g (M

oMhC

G).1

0-1

NTD

Downgemini

(trimini)Down ?

Mahalanobisovadistance –vzdálenost od středu (norma)

zdravý

Edwards

EstriolEstriol v krvi v průběhu v krvi v průběhu těhotentvítěhotentví• V průběhu těhotenství se zvyšuje• Z celkového estriolu jsou asi 2/3 vázány na

bílkoviny, v játrech se konjuguje (sulfonát, glukuronát) a vylučuje se hlavně močí (dříve se stanovovalo množství za 24 hod)

• T.č. se stanovuje imunochemicky v séru (RIA, FPIA) jeho volná nekonjugovaná část – využívá se pro monitorování funkce placenty(produkován placentou z dehydroepiandrosteronu, prekursoru testosteronu, ne hydroxylycí estradiolujako u netěhotných)

• Dříve součást screeningu VVV ve 2.trimestru

PAPPsPAPPs –– pregnancypregnancy--associatedassociatedplasma plasma proteinsproteins

• Popsány Linem et al. v r. 1973, byly detekovány pomocí králičího antiséra proti těhotenské plasmě z 2.a 3. trimestru (pool), které bylo vysycenoplasmou netěhotných žen, při imunoelektroforeseněkolik precipitačních linií, označeny A, B, C a D

• PAPP-D - jediný PAPP, kde známa fyziol. fce, totožné s hPL (lidský placentární laktogen, přesněji lidský choriový somatomammotropin, hCS), jejich stanovení není imunochemickýmimetodami možné

PAPPPAPP--AA• Glykoprotein, mh 750 000, pI 4.4, elfo α2 (způsobeno

obsahem kys. sialové), maximum na konci 3.trimestru, biol. poločas po porodu 3-4 dny

• Metaloproteinasa závislá na zinku (patří do metzincinové superrodiny metaloproteinas), štěpíIGFBP-4, 2 a 5 (insulin like grown factor bindingprotein), uvolněny jsou IGF, které hrají roli při regulaci lokálních proliferačních reakcí – reprodukční pochody, hojení ran, aterosklerosa

• V těhotentví snížen u chromozomálních aberací(m.Down) pouze v I.trimestru!, na konci těhotenství zvýšen u preeklampsie a snížen u hrozícího potratu

• Nový marker akutního koronárního syndromu

PAPPPAPP--BB• mh 1 000 000, pI 4.8, elfo pohyblivost β1• Maximální hodnoty na konci 3.trimestru, poločas

po porodu <1 den

PAPPPAPP--A a PAPPA a PAPP--B v průběhu B v průběhu těhotenství a po porodutěhotenství a po porodu

měsíce těhotenství dny po porodu4 10 3 127 6 9

PAPP-A

PAPP-B

PAPPPAPP--C (SP1)C (SP1)TrofoblastTrofoblast--specifický specifický ββ--11--globulinglobulin

• Heterogenní glykoprotein, má několik molekulárních variant, nejvíce zastoupená složka má mh 80-120 000, pI 3.8-4.1, asi 30% sacharidů

• Funkce: zatím neznámá, má imunosupresivnívlastnosti, část. strukturální homologie s CEA

• Fyziologický výskyt: v těhotenství – produkován synciciotrofoblastem do oběhu matky (podobně jako hCG), biol. poločas po porodu 1-2 dny

• Patologický výskyt: mola hydatidosa, germinálnínádoryv těhotenství zvýšení u m.Down, snížení u IUGR, spont. abortu

Stavy komplikující či Stavy komplikující či znemožňující výpočet rizika VVVznemožňující výpočet rizika VVV

• chorioCA a mola hydatidosa – vysoké hCG a SP1, často snížení či zvýšení AFP – imituje m-Down či gemini

• Redukce počtu plodů při vícečetném těhotenství po IVF - často extrémně zvýšené AFP a hCG, hodnoty se rychle mění.

• Vícečetné těhotenství – často není zvýšení BCH markerů symetrické, může imitovat NTD či m.Down

• Zamlklý potrat či intrauterinní smrt plodu – zpoč. mohou být hodnoty BCH markerů značně zvýšené, později klesají

• Darované vejce – zpravidla od mladší dárkyně –komplikace při výpočtu – hmotnostní korekce na nositelku, věková na biologickou matku

Pozitivní nálezyPozitivní nálezy

• optimální nastavení FPR (false positivity rate) –při riziku 1:300 a vyšším doporučena genetická konzultace

• M.Down – double test – do 5% pozitivních nálezů

triple test – u RIA stanovení uE3 více než 6% pozitivních nálezů

• NTD - u všech laboratoří do 3% pozitivníchnálezů

• M.Edwards - u všech laboratoří do 2% pozitivních nálezů

Integrovaný testIntegrovaný test

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

Fale š ná pozitiv ita (%)

Det

ekce

(%)

Triple te s t

Double te s t

Inte grovaný te s t

Inte grovaný te s t - PAPP-A, NT, AFP, hCG