Patógenos virales entéricos en sistemas agrícolas y su relación con aguas residuales

Univ. Eduardo Aguirre Mazzi

Índice de contenidos:

1. Introducción: La contaminación fecal ambiental asociada a descargas urbanas y virus

entéricos

2. Riesgos asociados a la reutilización de aguas residuales para prácticas agrícolas

3. Indicadores virales para el monitoreo de la calidad microbiológica aguas y alimentos

3.1. Detección de patógenos virales entéricos en aguas residuales

3.2. Detección de patógenos virales entéricos en muestras de alimentos

4. Rastreo de las fuentes microbianas

5. Análisis de riesgos asociados a virus entéricos en relación al consumo de alimentos

irrigados con aguas residuales

6. Virus entéricos importantes como indicadores de contaminación fecal y riesgo a la

salud publica

6.1. Adenovirus

6.2. Norovirus

6.3. Rotavirus

6.4. Enterovirus

6.5. Virus de hepatitis A

7. Bacteriofagos indicadores de contaminación fecal, y virus entericos

8. Conclusiones

Patógenos virales entéricos en sistemas agrícolas y su relación con aguas residuales

1. Introducción: La contaminación fecal ambiental asociada a descargas urbanas y

virus entéricos

Gran número de patógenos humanos microbianos están presentes en las aguas residuales

urbanas y deben ser considerados contaminantes ambientales. Los virus, junto con

bacterias y protozoarios presentes en el intestino o en la orina son transportados y

dispersados por el sistema de alcantarillado. Y a pesar de que la gran mayoría de los

patógenos pueden ser removidos por el tratamiento de aguas servidas muchos de ellos

pueden ser descargados de los efluentes post-tratamiento (Bofill-Mas et al. 2013).

A pesar de las estrategias para aumentar la calidad microbiológica del agua, los virus

humanos siguen siendo diseminados a través de las descargas de aguas tratadas y no

tratadas hacia los sistemas pluviales, aguas costeras, y también, aguas reusadas para

irrigación en la producción de alimentos (Cantalupo et al. 2011; Ng et al. 2012).

En países de bajos recursos la falta de higiene y sistemas de santificación tiene un impacto

muy importante en la salud de la población y la carga de enfermedades transmitidas por

el agua (Kiulia et al. 2010). Las infecciones entéricas son causales de más de 2 millones de

muertes cada año, principalmente en los infantes en países que están en vías de

desarrollo (Ng et al. 2012).

Alrededor de 100 tipos de virus patógenos pueden ser excretados al ambiente en las

heces de animales y humanos (Fong & Lipp 2005). Los virus entéricos son excretados en

grandes cantidades, por ejemplo pacientes que sufren de gastroenteritis o hepatitis

pueden llegar a excretar de 105 a 1011 partículas virales por gramo de heces (Bosch 1998;

Fong & Lipp 2005).

Los virus entéricos son usualmente transmitidos por la vía fecal oral, e infectan y se

replican en el tracto gastrointestinal del huésped. Los grupos de virus entéricos más

estudiados pertenecen a las familias virales Picornaviridae (ej.: enterovirus, hepatitis A),

Adenoviridae, Caliciviridae (ej.: norovirus, astrovirus, sapovirus) y Reoviridae (ej.:

rotavirus) (Fong & Lipp 2005).

A pesar de que las infecciones de virus entéricos están principalmente asociadas con

diarrea y gastroenteritis en humanos, pueden ser causales de infecciones respiratorias,

conjuntivitis, hepatitis y otras enfermedades de alta mortalidad como meningitis aséptica,

encefalitis y parálisis en pacientes inmunodeprimidos (Fong & Lipp 2005; Vecchia et al.

2012).

Muchos virus que son trasmitidos por la vía fecal oral producen infecciones subclínicas en

solo una pequeña proporción de la población, sin embargo algunos de los virus dan lugar a

condiciones peligrosas para la vida. El desarrollo de la enfermedad depende en gran

medida de la dosis infectiva del agente viral, la edad, el estado de salud, el estado

inmunológico y nutricional de los individuos (embarazo, presencia de otras infecciones o

enfermedades), así también de la disponibilidad de cuidados médicos adecuados (Bofill-

Mas et al. 2013).

La contaminación fecal es de gran interés en salud en lo que concierne al ambiente, agua y

comida. (Bofill-Mas et al. 2013). El agua para beber contaminada, junto con inadecuados

recursos de agua para higiene personal así también con prácticas de sanitizacion pobres,

son las principales causas de los estimados 4 billones de casos de diarrea que se dan

anualmente. En los países en vías de desarrollo se ha estimado que ocurren cerca de 2.5

millones de decesos en niños menores de 5 años a causa de las enfermedades diarreicas

(Clansen et al. 2004)

Las aguas residuales urbanas se caracterizan por contener heces y orina de humanos así

también como de animales domesticados y salvajes, como los perros y ratones (Ng et al.

2012). Los virus están asociados con los desechos biológicos depositados en las aguas

residuales así también con las especies que crecen en esos ambientes. (Cantalupo et al.

2011). Los estudios en aguas residuales hasta ahora se han enfocado muy frecuentemente

en monitorear patógenos virales ya conocidos y en especial los poliovirus (Ng et al. 2012).

Las aguas residuales representan la afluencia de la sociedad, y los patógenos que son

excretados en ellas reflejan las infecciones que pueden estar circulando en la población

humana de una determinada región o localidad (Cantalupo et al. 2011; Ng et al. 2012), y

podrían incluir aquellas que son transmitidas por agua o por alimentos contaminados

(Cantalupo et al. 2011).

Los virus entéricos pueden estar presentes en el ambiente acuático de manera natural o

más comúnmente son introducidos a través de actividades humanas como la descarga de

aguas residuales y sistemas sépticos, o descargas de actividad agrícola entre otras (Fong &

Lipp 2005)

Los virus entéricos pueden ser transmitidos por comida, agua, fomites y contacto

humano-humano, y además de causar enfermedades agudas tienen bajas dosis de

infección (Espinosa et al. 2009), pueden sobrevivir en ambiente hasta meses bajo

condiciones adecuadas (Carducci et al. 2009). Y toleran fluctuaciones de las condiciones

ambientales por todas las razones mencionadas los virus entéricos son considerados

importantes patógenos en tema de salud pública, y deben ser incluidos en evaluaciones y

estudios de calidad de aguas residuales y alimentos. (Hamilton et al. 2006; Espinosa et al.

2009). Se estima que el riesgo de infección cuando se consumen virus en agua potable es

10 a 10,000 veces mayor que para las bacterias patogénicas en la misma dosis de

exposición (Bosch 1998; Fong & Lipp 2005).

Las aguas tanto subterráneas como superficiales están sujetas a contaminación fecal que

proviene de diferentes fuentes, entre estas se incluyen los efluentes plantas de

tratamiento de aguas residuales, lavado de la tierra desde áreas urbanas, agrícolas o

naturales, y los lixiviados de vertederos sanitarios. (Abbaszadega 2001)

En Bolivia las enfermedades diarreicas son la principal causa de morbilidad y mortalidad

en niños menores de 5 años, dándose un estimado de 5,000 casos y 7,900 muertes al año

y una prevalencia del 30%. Además las enfermedades diarreicas también son una causa

importante de malnutrición, debido a que las mismas inhiben el consumo normal de

alimentos y la asimilación de los nutrientes. La malnutrición puede tener consecuencias

tales como crecimiento físico y desarrollo cognitivo impedido, menor resistencia a las

infecciones y potencialmente desordenes gastrointestinales a largo plazo. (Clansen et al.

2004).

2. Riesgos asociados a la reutilización de aguas residuales para prácticas agrícolas

El agua es un recurso imprescindible para el desarrollo económico y el bienestar social. Se

estima que la generación de los productos necesarios para la alimentación diaria de una

persona requiere de 3,000 L de agua. La irrigación para fines agrícolas representa tan solo

10% del agua en uso, sin embargo es la actividad de mayor consumo de agua dulce del

planeta (Silva et al. 2008).

Los humanos pueden estar expuestos a los virus entéricos a través de varias rutas: ostras

crecidas en aguas contaminadas, comida proveniente de cultivos irrigados y/o fertilizados

con aguas residuales, aguas recreacionales contaminadas con aguas residuales, agua

potable contaminada y otros (Bosch 1998). El reusó de las aguas de desecho urbano para

la agricultura o para propósitos ambientales puede también contaminar el suelo y otros

ambientes (Carducci et al. 2009).

Varios factores como el crecimiento acelerado de la población; la contaminación de los

cuerpos de agua superficial y subterránea; la distribución desigual del recurso hídrico y los

cada vez más severos periodos secos; han forzado a los agricultores a buscar nuevas

fuentes de abastecimiento de agua. Las aguas residuales se consideran una fuente

adicional para satisfacer la demanda del recurso (Silva et al. 2008).

En general se desconoce la forma como los alimentos se han producido. Sin embargo, se

estima que el 10% de los cultivos del mundo son irrigados con aguas residuales no

tratadas. A pesar de que esta es una práctica oculta y sancionada en un gran número de

países, muchos agricultores, utilizan las aguas residuales porque, además de los beneficios

de su uso, son libres de costo y son abundantes, aun durante la época de sequias (Silva et

al. 2008).

Por ejemplo, en Bolivia la gran mayoría de la población, obtiene alimentos en diferentes

mercados, donde las hortalizas llegan de distintas regiones rurales aledañas a la ciudad.

En varias áreas rurales de la ciudad de La Paz dichas hortalizas son regadas con aguas del

río Choqueyapu, caracterizado por transportar gran carga de desechos fecales. (Muñoz &

Laura 2005)

La disposición directa de las aguas residuales sin tratamiento en el suelo y en los cuerpos

de agua es una de las prácticas más comunes. Sin embargo la calidad de estas aguas

puede generar problemas de salud pública, ya que los patógenos pueden ser

transportados por las excretas y las aguas residuales crudas (Silva et al. 2008). La tabla 1

muestra 1 resumen de algunos peligros y vías de exposición a patógenos asociados al uso

de aguas negras en la agricultura.

Tabla 1: ejemplos de peligro patógenos relacionados a excretas (PRE) y rutas de

exposición asociadas con el uso de aguas residuales y excreciones en la agricultura.

Peligro PRE Ruta de exposición

comentarios

Bacteria (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella spp., Shigella spp.)

ContactoConsumo

Bacterias mueren más rápido en los cultivos respecto a otros patógenos (ej: helmintos)Pueden sobrevivir en el ambiente lo suficiente para causar riesgo a la salud publicaDesinfección, lavado, y cocinado son importantes medidas de protección a la salud

Helmintos transmitidos por suelo (Ascaris, Ancylostoma, Necator, Hymenolepis, Strongyloides, Toxocara, Trichuris, Taenia spp.)

ContactoConsumo

Constituyen el mayor riesgo en agriculturaLos huevos pueden sobrevivir en el ambiente por largo tiempo

Protozoarios (Giardia, Cyclospora, Cryptosporidium, Entamoeba spp.)

ContactoConsumo

Encontrados en vegetales irrigados con aguas residuales, en el punto de cosecha y también en los mercadosPueden sobrevivir suficientes para causar riesgo a la salud pública.

Viruses (virus de hepatitis A y E ,adenovirus, rotavirus, norovirus)

ContactoConsumo

Los virus están en grandes cantidades en el agua residual y las excretasAlgunos tipos sobreviven en el ambiente largo tiempoContaminación de cultivos ha llevado a brotes de enfermedades

(Extraido de: WHO 2006)

3. Indicadores virales para el monitoreo de la calidad microbiológica aguas y

alimentos

Para evaluar la calidad microbiológica del agua y también de la comida se puede usar:

organismos índice (cuya presencia señala la posible ocurrencia de organismos patógenos

similares), y/o organismos indicadores (cuya presencia representa un falla que afecta al

producto final) (Bofill-Mas et al. 2013) Los controles de contaminación microbiana

normalmente requeridos por ejemplo por las regulaciones europeas, se limitan al

monitoreo biológico basado en parámetros bacterianos como Escherichia coli (EC),

enterococos (E) y Salmonellae (S). A pesar de que estas bacterias son indicadores de

contaminación fecal y pueden funcionar indirectamente como indicadores de riesgo viral,

no están correlacionados con la presencia de virus entéricos ni con su reducción en el

ambiente. (Carducci et al. 2009)

Sin embargo los indicadores microbiológicos clásicos principalmente bacterias, han sido

ampliamente cuestionados en su rol como microorganismos índice de la ocurrencia y

concentración de agentes patógenos como virus y quistes de protozoarios. Entre las

razones que llevaron a este cuestionamiento están las siguientes: (i) las bacterias

indicadoras son más sensibles al proceso de tratamiento y a la luz del sol respecto a los

virus (ii) la fuente fecal no es la única (iii) las bacterias tienen la habilidad de multiplicarse

en algunos ambientes, (iv) No es posible identificar la fuente de contaminación fecal, (v)

Su presencia tiene baja correlación con la presencia de otros patógenos (Bofill-Mas 2013).

Los indicadores bacterianos clásicos podrían fallar al predecir el riesgo de patógenos

sustentados por las aguas incluyendo los virus. Por ejemplo en los resultados de varios

estudios realizados en la costa superior del golfo de Texas (U.S) se detectó la presencia de

Enterovirus en aguas recreacionales, donde el 43% de las veces que fueron consideradas

microbiológicamente aceptables según los estándares de coliformes totales, y en un 44%

cuando fueron juzgadas según coliformes fecales. Los enterovirus fueron de igual forma

detectables en el 35% de las veces que las aguas fueron consideradas aceptables para

cosecha de ostras (Gerba et al. 1979).

Otro ejemplo de esto fue observado en un sistema acuático en Alemania, donde se vio

que a pesar de que parámetros microbiológicos como EC, E, y Colifagos mostraron valores

aceptables de calidad de agua, todavía la presencia de virus como EV y HAdV fue

detectable, indicando que estas aguas superficiales pueden ser una potencial fuente de

infecciones entéricas virales (Pusch et al. 2005)

En general los virus que son transmitidos por vía de comida contaminada o agua son

estables debido a que carecen de envolturas lipídicas que hacen a los virus más

vulnerables a los agentes ambientales (Bofill-Mas et al. 2013). En Italia Carducci et al.

(2009) realizaron un trabajo monitoreando la presencia de HAdV antes y después de una

planta de tratamiento a través de qPCR (quantitative PCR). No se observó variaciones

significativas en cuanto al conteo de DNA de HAdV, en las aguas de influente y del

efluente de la planta. Lo que confirma la ya reportada alta resistencia a tratamientos de

desinfección.

En al ambiente los virus pueden sobrevivir largo tiempo bajo un amplio rango de pH (3 a

10). Se ha visto que los virus pueden mantenerse infectivos por un periodo de 120 días en

aguas residuales y cuerpos de agua dulce, y en agua de mar sobreviven hasta 130 días.

También el en el suelo, a temperaturas de 20°C a 30°C, los virus pueden sobrevivir

periodos de hasta 100 días (Fong & Lipp 2005).

Debido a la especificidad y requerimiento obligatorio de huésped para reproducirse, los

patógenos virales parecen ser una de las herramientas más prometedoras para

determinar las fuentes de contaminación fecal en los ambientes, y podrían usarse en

conjunto con indicadores bacterianos para mejorar las vigilancias de salud pública (Fong &

Lipp 2005). Sin embargo el muestreo para el análisis virológico no necesariamente debe

seguir el mismo enfoque que se utiliza para las bacterias debido al bajo nivel de

contaminación con virus, y a que la complejidad y costo de los ensayos de detección viral

son mayores (Bosch et al. 2011).

Los virus entéricos muestran un gran potencial para ser usados como indicadores de

calidad de aguas para evaluar el riesgo asociado a la trasmisión, así también para

identificar las fuentes dominantes de contaminación fecal ambiental (Fong & Lipp 2005).

Es entonces por todo ello que la agencia de protección ambiental de los Estados Unidos

(EPA) considera al grupo de virus entéricos como el indicador más confiable y significativo

para el monitoreo ambiental (Kiulia et al. 2010).

La evaluación de la calidad virológica del agua está limitada por varios problemas al

detectar o cuantificar la presencia de los virus en muestras ambientales. Algunos de estos

problemas son: Alta variabilidad genética y pequeño tamaño de las partículas virales,

bajas concentraciones de virus en el agua ambiental, la tendencia de los virus de adsorber

para suspender material particulado, y por último mencionamos la presencia en las aguas

de sustancias que pueden interferir con los procesos de análisis (Carducci et al. 2009).

El escoger parámetros adecuados y útiles que deben ser evaluados se ve complicado

debido, al gran número de especies virales potencialmente presentes, la variabilidad de

las cepas circulante en la población, y a la diferente significancia de análisis cuantitativos y

cualitativos (Carducci et al. 2009). Desde un punto de vista epidemiológico los patógenos

virales más relevantes que se hallan en aguas son: virus de hepatitis E, virus de hepatitis A,

y los virus de gastroenteritis que incluye a los rotavirus, calicivirus, astrovirus y adenovirus

entéricos. Sin embargo el monitoreo de la mayoría de estos virus a la vez no es práctico,

por lo cual se deben escoger ciertos microorganismos que puedan ser indicadores (Bosch

1998).

3.1 Detección de patógenos virales entéricos en aguas residuales

Los pasos básicos para el análisis virológico de muestras de aguas son: el muestreo, la

concentración, descontaminación/remoción de inhibidores, y detección de virus

específicos, la concentración de la muestra es un paso muy importante ya que en general

los virus están en muy bajas concentraciones (Bosch 2011).

Una buen método de concentración debería cumplir con ciertos requerimientos: debe ser

técnicamente simple y rápido, debe proveer alta recuperación de virus, debe ser

adecuado para un amplio rango de virus entéricos, debe proveer pequeños volúmenes de

concentrado y debe ser económicamente accesible (Bosch 2011).

Hasta el momento todos los procedimientos disponibles se evaluaron usando muestras

inoculadas con virus conocidos, se sabe que la eficiencia en estas condiciones es mucha

mayor que la eficiencia en condiciones naturales, y además ningún procedimiento

existente se ha probado con todos los grupos de virus de interés medico (Bosch 2011).

La mayoría de los procedimientos de concentraciones y extracción de los virus hacen uso

de las propiedades de las partículas proteínicas virales. Algunas estructuras confieren a los

virus en el ambiente acuático las propiedades de un coloide hidrofílico de naturaleza

anfótera, cuya carga eléctrica varía en función de pH y la fuerza iónica del ambiente. Por

ello los virus pueden ser adsorbidos o liberados de diferentes sustratos cargados

dependiendo el pH (Bosch 2011).

Para evaluar grandes volúmenes de agua los mejores métodos son aquellos basados en la

adsorción de virus en una superficie sólida, de la cual los virus son eluidos en un volumen

más pequeño. Otros métodos como la precipitación con los polietilenglicoles (PEG) o la

liofilización pueden ser usados para la concentración directa de los virus en medios

altamente contaminados, como en aguas residuales, donde este método ayuda a

remover sustancias inhibidoras de la RT-PCR (Bosch 2011)

3.2 Detección de patógenos virales entéricos en muestras de alimentos

El consumo de vegetales incluyendo diferentes tipos de ensaladas y cebollas verdes, ha

sido asociado con hepatitis y gastroenteritis viral. La importancia de las enfermedades

virales trasmitidas por los alimentos está incrementando en los últimos años. y

particularmente se enfoca los análisis de riesgo en frutas y vegetales que no son cocinados

antes de ser consumidos (Butot et al. 2007).

Las superficies de vegetales y frutas como bayas son propensos a ser contaminados a

través de agua residual o subterránea contaminadas, o durante el proceso de

manipulación (cosecha, empaquetamiento, preparación) (Cheong et al. 2009)

Para monitorear la presencia de los virus entéricos en los alimentos es necesario

desarrollar métodos para recuperar virus a partir de una variedad de productos frescos.

Una estrategia muy usada consiste en eluir los virus a partir de la superficie de la comida

ya que se asume que las muestras naturalmente contaminadas cargan los virus solo en la

superficie. (Butot et al. 2007). Sin embargo Chancelor et al. (2007) propusieron un nuevo

mecanismo de contaminación, ya que se encontró partículas de virus de hepatitis A,

atrapadas intracelularmente a lo largo de las raíces de las cebollas, la viabilidad de estas

partículas no fue evaluada en este trabajo.

Entre las estrategias utilizadas para la concentración de virus las más utilizadas son

inmunoconcentración, precipitación con PEG, ultrafiltración y ultracentrifugación. Este

paso es considerado crítico por la misma razón que para el análisis virológico de aguas

residuales -la baja concentración de virus-. La eficacia de los métodos depende

principalmente en el método de extracción que se use después para el análisis y también

el tipo de matriz (Butot et al. 2007). El método más utilizado para frutas suaves y

vegetales de ensalada consiste en eluir los virus con agitación y luego la recuperación o

concentración usando la precipitación PEG/NaCl (Bosch 2011).

Respecto a la eficacia de la técnica de detección en alimentos pueden existir diferencias

incluso a nivel de las cepas virales, estas diferencias puede deberse a las estabilidades

diferenciales en condiciones de sequedad, y diferentes capacidades de unión de las

partículas virales en las superficies de los alimentos, así también como la resistencia del

virus a los pH bajos. Se ha demostrado que los virus exhiben diferentes patrones de unión

a las superficies dependiendo de sus puntos isoeléctricos, lo que nos sugiere que el uso de

una solución de elución con un pH particular podría generar la recuperación selectiva de

un tipo o grupo particular de virus (Butot et al. 2007)

A continuación del tratamiento inicial de la muestras todas las matrices de comida son

procesadas utilizando algún protocolo de extracción de ácidos nucleicos seguido de la

amplificación por RT-PCR/PCR. Un método recomendado por su alta sensibilidad para

detectar bajos niveles de virus en el ambiente es el de Boom et al. (1990) y modificados, la

alta sensibilidad de este método lo hace también susceptible a la contaminación cruzada

(falsos positivos), la interferencia de sustancias inhibidoras en la matriz puede generar

falsos negativos. (Bosch 2011) Una buena manera de lidiar con los inhibidores de la PCR

en un extracto de RNA es el de realizar diluciones del mismo, sin embargo esto puede ir en

detrimento del límite de detección. (Butot et al. 2007).

Los controles negativos deben incluirse y consisten en una muestra negativa conocida que

debe ser procesada durante todo el proceso de análisis. El control de inhibición de RT-

PCR/PCR sirve para evaluar la presencia de inhibidores potencialmente presentes en la

matriz, y consiste en comparar la amplificación de un molde de RNA externo añadido al

material de prueba y el pozo control. Juntos los controles generan información de los

aspectos del ensayo, y son usados para determinar la aceptabilidad de las pruebas en

función de los criterios de calidad (Bosch 2011).

Respecto a los procedimientos de muestreo para alimentos o productos frescos existen

ciertas preguntas que pueden surgir y se deben considerar: i) ¿Es un peso particular de

fruta o vegetal representativo?; ii) ¿Es un ítem (ej.: una lechuga por parcela)

representativo?; iii) ¿Es una hoja de lechuga o repollo representativo, y si lo es cual hoja?;

iv) ¿Debería la comida ser analizada entera o molida?; v) ¿Será una muestras suficiente o

debería realizarse el test por triplicado? (Bosch et al. 2011).

Muy poca información existe en los manuales de la USEPA o de CEN/ISO respecto al

muestreo de comida para análisis virológico. Los métodos deben tener alta sensibilidad y

especificidad, y respecto al tamaño muestral debería ser representativo de toda la parcela

o el cultivo. Aunque en muchas situaciones aspectos de logística y económicos pueden

limitar la obtención de una muestra estadísticamente significativa (Bosch et al. 2011).

Muchos de los métodos publicados que están en desarrollo utilizan alrededor de 10 g –

100 g de frutas o vegetales para la detección viral. Sin embargo no se discute acerca de

cuantas muestras de este tamaño deben tomarse de un cultivo, parcela, camión de carga

u otros para tener una muestra estadísticamente representativa. Los procesos de

muestreo también pueden variar de acuerdo a la cantidad de muestra, estacionalidad,

precipitación y cantidad de contaminación probable que se considera (Bosch et al. 2011).

La detección de virus dentro de un cultivo podría potencialmente ser un indicador de altos

niveles de contaminación externa y ser significante ya que estos virus podrían no ser

removidos o inactivados por lavados o la radiación UV. Muestrear alimentos que han sido

implicados en brotes deberían enfocarse en analizar particularmente los lotes consumidos

(Bosch et al. 2011).

4. Rastreo de las fuentes microbianas

El rastreo de las fuentes microbiana o MST (Microbial source tracking), juega un rol

importante viabilizando manejos efectivos y estrategias de remediación. El MST incluye

una variedad de metodologías cuyo objetivo es el de identificar, y en algunos casos

cuantificar, las fuentes dominantes de contaminación fecal en el ambiente, o recursos

acuáticos. Entre las técnicas moleculares, la amplificación de ácidos nucleicos es una

técnica sensible y rápida, para el estudio de patógenos específicos incluyendo cepas

emergentes e indicadoras (Bofil-Mas et al. 2013).

El PCR puede ser usado para amplificar, acidos nucleicos asociados con patógenos que

pueden estar presentes en bajos números en muestras de agua. El PCR debe ser capaz de

detectar los virus después de la concentración de grandes volúmenes de agua (100 a

1,500 litros). Esto puede lograrse por ejemplo por un método de adsorción en filtro y

elución, lo que resulta en un concentrado de microbios, y solidos orgánicos y disueltos.

Los compuestos como el ácido húmico pueden interferir con la reacción enzimática del

ensayo de PCR (Abbaszadega 2001).

Las ventajas del PCR son numerosas, por ejemplo comparado con las técnicas que

incluyen cultivos celulares para la detección de virus, el tiempo de detección se puede

reducir de semanas o días a horas. Los costos iniciales y también los de operación son

menores para el PCR que las técnicas de cultivo celular. El PCR además puede usarse para

detectar algún patógeno específico en el agua (Abbaszadega 2001). La PCR además

permite la detección de agentes no cultivables (Carducci et al. 2009).

Por otro lado el PCR no puede usarse para detectar el estado infeccioso del patógeno (ej:

en Giardia y Criptosporidium), solo se puede ver la presencia o ausencia del DNA de algún

patógeno especifico o el RNA si se acopla el PCR a una reversotrascripción (RT-PCR)

(Abbaszadega 2001). La PCR no se puede usar para evaluar la viabilidad viral, lo que puede

conducirnos por ejemplo a subestimar la efectividad de los tratamientos de aguas

residuales. (Carducci et al. 2009).

Los dos diferentes métodos de detección microbiana, el PCR y el cultivo celular, pueden

presentar diferentes resultados para un mismo caso y es por eso que se debe tener

cuidado al interpretar los mismos. Es importante considerar que el PCR es solo un

indicativo de la presencia de los ácidos nucleicos virales o parasitarios y no

necesariamente indica la presencia de las partículas virales o quistes infectivos. Por tanto

el resultado del PCR debería interpretarse como indicativo de la posibilidad de transporte

de los patógenos en el acuífero y riesgo potencial de enfermedad, más que un problema

de salud pública absoluto (Abbaszadega 2001).

Los indicadores de contaminación fecal que dependen de cultivo (Enterococos, coliformes

y bacteriofagos) en general no difieren tanto de las técnicas moleculares (PCR). Sin

embargo la PCR puede tener mayor sensibilidad para detectar la presencia de

contaminación viral respecto al método de cultivo (conteo de unidades formadoras de

placa) (Abbaszadega 2001).

5. Análisis de riesgos asociados a virus entéricos en relación al consumo de

alimentos irrigados con aguas residuales

La evaluación de riesgos asociados a los suministros de agua es importante cuando se

trata de establecer juicios respecto al nivel de seguridad requerida en diferentes

alternativas y múltiples rutas de exposición. Esto es aún más importante en países en

desarrollo donde los patógenos son transmitidos por varias rutas (Howard et al. 2006).

A lo largo del mundo se estima que 20 millones de hectáreas de cultivos son irrigadas con

aguas residuales crudas, tratadas, y/o parcialmente diluidas. Las tasas de contaminación

de las muestras ambientales tienden a ser tan bajas que los tamaños muestrales

requeridos para tener significancia estadística no son fácilmente alcanzados. Una

aproximación más pragmática es la generación de modelos probabilísticos, y en el

contexto de la salud humana en relación a microorganismos esta metodología se

denomina: “Evaluación de riesgo microbiano cuantitativo” (QMRA, por sus siglas en inglés,

Quantitative microbial risk assessment) y sirve para determinar los órdenes de magnitud

del riesgo asociado con escenarios específicos (Hamilton et al. 2006).

QMRA es una técnica que se desarrolló para calcular la carga de la enfermedad de un

patógeno particular. Y la mayor tarea del QMRA es el de realizar una evaluación de la

exposición, análisis dosis respuesta, y caracterización del riesgo. Para capturar y comparar

varios patrones de distintos patógenos (Howard et al. 2006). Un primer paso importante

para determinar la seguridad del reúso de agua residual para la horticultura es el de

considerar un escenario del peor caso que es el de asumir que, los vegetales irrigados se

consumen crudos y sin pelar (Hamilton et al. 2006).

El QMRA está típicamente limitado a un agente causal particular de una enfermedad o

síntoma particular, lograr completar un QMRA para cada patógeno implicaría gran

esfuerzo e inversión de tiempo, y además actualmente no existe información disponible

para muchos de los patógenos. Para lidiar con esto la OMS (2004) recomienda utilizar un

grupo de “patógenos referencia”. Estos son aquellos cuya severidad de impacto y

persistencia en el ambiente sea tal que su control provea cierta confianza de que

patógenos similares también estén siendo controlados (Howard et al. 2006).

El modelamiento de QMRA usualmente incluye técnicas de simulación de Monte Carlo

que ayuden a definir la incertidumbre y variabilidad en las distribuciones de frecuencias.

Otros métodos más simples utilizando estimaciones puntuales pueden usarse, y estos

últimos son útiles especialmente para patógenos en países en desarrollo, donde la

limitada información obliga a que los modelos QMRA estén basados en la ocurrencia de

organismos indicadores, que a su vez requiere que se hagan ciertas asunciones acerca de

la relación del organismo indicador y el patógeno de interés per se (Howard et al. 2006).

Para que los QMRA ganen aceptación y puedan ser usados en países en desarrollo, deben

proponerse en formas simples y accesibles. Howart et al. (2006) describen una forma de

QMRA simplificada y exitosa para evaluar suministros de agua potable, pozos y agua

almacenada en las viviendas en Kampala, Uganda.

6. Virus entéricos importantes como indicadores de contaminación fecal y riesgo a

la salud publica

Los virus entéricos más comúnmente encontrados en las heces humanas pertenecen a

más de 140 tipos, de los cuales los adenovirus humanos (HAdV), norovirus genotipos I y II

(NoV ggI y ggII), rotavirus (RV), enterovirus (EV), virus de hepatitis A (HAV) (Carducci et al.

2009), virus de hepatitis E (HEV), reovirus (Abbaszadega 2001), y poliomavirus humanos

(HPyV) (Bofill-Mas et al. 2013), son los más frecuentemente detectados en el ambiente y

en aguas residuales urbanas.( Carducci et al. 2009; Bofill-Mas et al. 2013).

De estos virus los HAdVs y los HPyVs se caracterizan por ser detectados en todas las areas

geográficas a lo largo del año, a diferencia de los EVs, NoVs, RVs, HAVs, virus de hepatitis E

(HEVs) y astrovirus (AstV), que tienen prevalencias variables a lo largo de diferentes áreas

geográficas y/o periodos del año (Bofill-Mas et al. 2013).

6.1 Adenovirus

Los adenovirus son comúnmente encontrados en ambientes acuáticos y ya se los ha

postulado como indicadores virales (Sedmak et al. 2005), varios estudios han demostrado

que los adenovirus humanos (HAdV) se mantienen estables frente a condiciones de estrés

ambiental, como radiación UV, temperatura, concentraciones de cloro, y variaciones de

pH, incluyendo procedimientos de tratamiento de aguas residuales (Carducci et al. 2009).

La mayoría de los vertebrados son infectados por especies de adenivirus, la familia

adenoviridae está dividida clásicamente en dos géneros: Mastadenovirus (en mamíferos) y

Aviadenovirus (en aves). Dos nuevos géneros fueron reconocidos Atadenovirus y

Siadenovirus. El género Mastadenovirus actualmente contiene 51 adenovirus humanos

(HAd), 5 porcinos (PAV), 6 serotipos ovinos (OAV), y varios bovinos (BAV) divididos en dos

subgrupos (I y II)

Algunos estudios muestran que los HAd son más prevalentes y estables que los

enterovirus en muestras ambientales de áreas geográficas divergentes. Además son

excretados largos periodos de tiempo por lo que se los ha propuesto como organismos

indicadores de la calidad del agua y alimentos. (Maluquer de Motes et al 2004)

Se estima que los AdV son 60 veces más resistentes a la radiación UV que los virus de RNA,

como enterovirus o el virus de hepatitis A. esta diferencia podría deberse a que son virus

de doble cadena de DNA, y el DNA no dañado podría servir como molde para la reparación

con las enzimas del huésped, además estos virus tienen altos peso molecular los que

puede incrementar su resistencia al UV (Fong & Lipp 2005).

Se ha propuesto el uso de lo HAdV como índices moleculares de contaminación de

alimentos como ostras, ya que su presencia en alimentos y aguas residuales muestra

correlación con la presencia de enterovirus y de virus de hepatitis A, así también con

bacteriófagos específicos de humanos (ej.: HSP40) como los que infectan a Bacteroides

fragilis (Fong & Lipp 2005).

6.2 Norovirus

Junto con hepatitis A los Norovirus son las mayores causas de gastroenteritis asociada a

alimentos a lo largo del mundo, son un grupo diverso de virus de RNA pertenecientes a la

familia Caliciviridae, y pueen clasificarse en 5 genogrupos (GGI hasta GGV). (Rutjes et al.

2006).

La transmisión ocurre a travez decontacto persona-persona, y a travez de agua o

alimentos contaminados. La mayoría de los ítems de alimentos asociados a los brotes de

Norovirus se consumen crudos, o no se cocinan, como por ejemplo, ostras, frutas,

ensaladas, sándwiches y otros que representan altos riesgos de infección si estan

contaminados (Rutjes et al. 2006).

Estos alimentos en general son contaminados a través del contacto con superficies

contaminadas con aguas residuales o por el manejo inadeacuado por parte de agricultores

o vendedores infectados. Hasta el momento la investigación epidemiologica de los brotes

se ve limitada debido a la ausencia de un modelo animal, o sistema de cultivo celular para

Norovirus, tal es el caso para hepatitis A. sin embargo pueden ser detectados por métodos

de PCR (Rutjes et al. 2006).

6.3 Rotavirus

Los RV son responsables de gastroenteritis severa en humanos y animales a ha sido

implicadas en brotes de gastroenteritis transmitida por aguas en muchos países. (Carducci

et al. 2009). La diarrea aguda rotaviral es de especial incidencia en niños pequeños. El

rotavirus del grupo A ha sido identificado como agente causal de brotes trasnmitidos por

aguas en humanos (Abbaszadega 2001). De hecho los RV son la principal causa de diarrea

infantil, y se dice que a los 5 años virtualmente todos los niños ya han sufrido infección

por este virus (Kiulia et al. 2010)

Estos virus tienen un genoma segmentado que consiste en 11 segmentos de RNA doble

cadena. Los segmentos son los que designan especificidad a los subgrupos y serotipo, y

estos han sido secuenciados para muchas cepas y serotipos (Abbaszadega 2001).

Una de las caracteristicas mas importantes de los rotavirus es su baja dosis infective, por

ejemplo se estima que la probabilidad de infeccion de la expocicion a un rotavirus es 31%,

es decir que no mas de 1 PFU se require para causar infeccion en el 1% de adultos sanos

sin anticuerpos para el virus (Fong & Lipp 2005).

6.4 Enterovirus

Los enterovirus (ej: poliovirus, coxsackie A y B y echovirus) pueden causar una variedad de

enfermedades desde gastroenteritis hasta miocarditis y meningitis aséptica. (Abbaszadega

2001). La presencia de EVs se ha documentado en gran número de estudios, tanto en

aguas residuales tratadas y no tratadas, así también en lodos. (Abbaszadega 2001;

Carducci et al. 2009). Debido a su frecuente detección y ya que son fácilmente cultivables

se los ha considerado como parámetro de referencia viral en las regulaciones de agua

bebible Italianas, sin embargo no son considerados un parámetro mandatorio. (Carducci

et al. 2009)

Los Enterovirus estan incuidos en las regulaciones de la Union Europea como un

parámetro para evaluar la contaminacion viral de un cuerpo de agua, ya que son fáciles de

cuantificar por conteo de PFUs y la cepa vacuna tien altas prevalencias en ambiente

acuáticos (Fong & Lipp 2005). La presencia de EV ambientales se considera una situación

de riesgo a la salud pública ya que pueden ser transmitidos por la vía fecal-oral a través de

aguas contaminadas, y bastan un pequeño número de virus para iniciar infección en

humanos (Abbaszadega 2001).

Los EV tienen un diámetro de aproximadamente de 27nm y su genoma se compone de un

RNA simple cadena de polaridad positiva de aroximadamente 7400 pb (Abbaszadega

2001). Alrededor del 70% (62 serotipos) han sido asociados con enfermedades humanas y

un 30% con infecciones animales. Existe una tendencia al incremento del pico de las

infecciones enterovirales en verano y al inicio del otoño, que coincide con el aumento de

las actividades recreacionales relacionadas al agua (Fong & Lipp 2005)

6.5 Virus de hepatitis A

Los HAV son la principal causa de hepatitis aguda a lo largo del mundo y su transmisión

sustentada por agua ha sido muy bien documentada. La organización mundial de la salud

(OMS) considera los HAV como patógenos de referencia para el análisis de riesgo

relacionado a aguas potables. (Carducci et al. 2009). Además se los considera importantes

virus transmitidos por el agua debido a la severidad de la enfermedad que pueden causar,

en individuos susceptibles (Abbaszadega 2001). El virus HAV es dispersado de persona a

persona por la ruta fecal-oral y es causal de hepatitis aguda que puede llevar a desarrollar

ictericia y en ciertos casos fallo hepático (Tallon et al. 2008). En el agua, aguas residuales y

sedimentos, los HAV pueden sobrevivir por más de 4 meses a una temperatura de 5 y 25°C

(Abbaszadega 2001).

El uso de vacuna del virus de Hepatitis A tuvo un efecto positivo en la incidencia de la

enfermedad en los Estados Unidos , por ejemplo en este país el año 1995 se registró

30,000 casos mientras que el año 2005 tan solo 4,488 casos se registraron, la vacuna se

administra aproximadamente desde el año 1998. Los brotes de HAV son comúnmente

estudiados usando tests serológicos para la IgM anti-HAV para identificar casos y para

análisis epidemiológicos para evaluar factores potenciales de rriesgos. El análisis

filogenético para determinar la fuente de exposición que puede resultar en infecciones

asociadas a la trasmisión por vía acuática es raro (Tallon et al. 2008).

A lo largo del mundo y periódicamente existen brotes de HAV. Y se sabe que el agua y los

alimentos contaminados son los principales vehículos. En los Estados Unidos menos del

10% de los casos de hepatitis A están asociadas a la trasmisión por medio de alimentos,

sin embargo esto basta para causar sustanciales perdidas en el ámbito de la industria

alimentaria y la sociedad. Los alimentos que están implicados en tales brotes incluyen

vegetales, frutas, sándwiches, productos diarios, productos cocinados, ensaladas, y ostras

de mar (Bidawid et al. 2000).

7. Bacteriofagos indicadores de contaminación fecal, y virus entericos

Los bacteriófagos son buenos candidatos como indicadores de la presencia de virus

entéricos de interés en salud pública en el ambiente. Algunos de los fagos son capaces de

infectar bacterias que se hallan en la microflora intestinal de humanos, por lo que también

pueden ser excretados en las heces y llegar al sistema de agua residual (Leclerc el al.

2006).

Estos indicadores deben cumplir con ciertas características: especificidad: ocurren

consistentemente y exclusivamente en heces humanas y aguas residuales; no se

multiplican en el ambiente y no hay una fuente ambiental de los mismos; sensibilidad:

están presentes en altos números en muestras ambientales; sobreviven en el ambiente y

resisten procesos de tratamiento de igual manera que los virus entéricos (Leclerc el al.

2006).

Los grupos de bacteriófagos que han sido propuestos como indicadores de virus entéricos

son: colifagos somáticos, Colifagos “Male-specific” (MS) o colifagos FRNA, y los fagos que

infectan a Bacteroides fragilis. Sin embargo existen ciertas desventajas de usar los fagos

como indicadores de contaminación fecal y virus entéricos, una de ellas es la falta de

especificidad por un huésped bacterial. Por ejemplo los fagos FRNA son específicos de E.

coli, pero igual pueden atacar multiplex otras bacterias coliformes y enterobacterias

(Leclerc el al. 2006).

Sin embargo los colifagos pueden considerarse indicadores de los indicadores ya que en

algunos casos su presencia o conteos están correlacionados con parámetros

microbiológicos como conteo de coliformes y presencia de otros virus entéricos como

enterovirus, y se pueden usar de manera complementaria en estudios de calidad

microbiológica de alimentos, agua (Leclerc el al. 2006; Espinosa et al. 2009)

8. Conclusiones

Los virus entéricos son importantes patógenos frecuentemente aislados de aguas

influenciadas directa o indirectamente por contaminación fecal, y pueden estar asociados

a brotes transmitidos por agua o alimentos contaminados. La reutilización de aguas

residuales para la irrigación de cultivos agrícolas es una potencial fuente de contaminación

de la matriz ambiental (suelo) y los vegetales irrigados, de los cuales algunos son

consumidos crudos (acelga, lechuga, repollo, frutas, etc) . Ya que indicadores virales no

suelen estar correlacionados con otros indicadores microbiológicos, la detección directa

de los patógenos virales debe analizarse para garantizar mejor protección a la salud

pública.

La identificación de virus basándose en la amplificación por PCR, puede servir para

caracterizar las fuentes de contaminación en el ambiente acuático y ambientes asociados,

para así planificar estrategias costo-efectivas de remediación. Para validar el uso de los

virus para hallar las fuentes de contaminación, se requieren estudiar la prevalencia y

distribución de los virus específicos animales o humanos en el ambiente.

Referencias bibliográficas

1. Abbaszadega M. 2001. Advanced Detection Of Viruses And Protozoan Parasites In Water. Reviews In

Biology And Biotechnology Vol.1, No 2, May 2001. Pp. 21-26

2. Bidawid S, Farber J M, & S A Sattar. 2000. Contamination Of Foods By Food Handlers: Experiments On

Hepatitis A Virus Transfer To Food And Its Interruption. Applied And Environmental Microbiology 08/2000;

66(7):2759-63

3. BOFILL-MAS S, PINA S, & R GIRONES. 2000. Documenting The Epidemiologic Patterns Of Polyomaviruses

In Human Populations By Studying Their Presence In Urban Sewage. APPLIED AND ENVIRONMENTAL

MICROBIOLOGY, Jan. 2000, P. 238–245

4. Bofill-Mas S, Rusiñol M, Fernandez-Cassi J, Carratalà A, Hundesa A, & R Girones. 2013. Quantification

Of Human And Animal Viruses To Differentiate The Origin Of The Fecal Contamination Present In

Environmental Samples. Hindawi Publishing Corporation Biomed Research International Volume 2013,

Article ID 192089, 11 Pages

5. Boom R, Sol C. J. A.,Salimans M M M, Jansen C L, Wertheim-Van Dillen Pme, & J. Van Der Noordaa. .

1990. Rapid And Simple Method For Purification Of Nucleic Acids Journal Of Clinical

Microbiology, Mar. 1990, P. 495-503 0095-1137/90/030495-09$02.00/0

6. Bosch A. 1998. Human Enteric Viruses In The Water Environment: A Minireview. INTERNATL MICROBIOL

(1998) 1:191–196

7. Bosch A. 2011. Norovirus And Hepatitis A Virus In Shellfish, Soft Fruits And Water "In Rapid Detection,

Identification, And Quantification Of Foodborne Pathogens, March 2011, 466 P. Ed. By J. Hoorfar, 2011 ASM

Press

8. Bosch A., Sánchez G, Abbaszadegan M, Carducci A, Guix S, Le Guyader F S, Netshikweta R, Pintó R M, Van Der

Poel W H M, Rutjes S, Sano D, Taylor M B, Van Zyl W B, Rodríguez-Lázaro D, Kovač K & J Sellwood

2011. Analytical Methods For Virus Detection In Water And Food Food Analytical

Methods, March 2011, Volume 4, Number 1, Pages 4-12,

9. Butel J. S & J. A. Lednicky. 1999. Cell And Molecular Biology Of Simian Virus 40: Implications For Human

Infectious And Disease. J. Natl. Cancer Inst. 91:119–134.

10. Butot S, Putallaz T & G Sánchez 2007. Procedure For Rapid Concentration And Detection Of Enteric

Viruses From Berries And Vegetables Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73(1):186.

11. Cantalupo P G, Calgua B, Zhao G, Hundesa A, Wier A D, Katz J P, Grabe M, Hendrix R W, Girones R, Wang D,

& J M Pipasa. 2011. Raw Sewage Harbors Diverse Viral Populations. Mbio 2(5):E00180-11.

12. Carducci R A, Battistini R & M Verani. 2009. Viral Removal By Wastewater Treatment: Monitoringof

Indicators And Pathogens. Food Environ Virol (2009) 1:85–91

13. Chancellor D D, Tyagi S, Bazaco M C, Bacvinskas S, Chancellor M B, Dato V M, & F De Miguel. 2006.

Green Onions: Potential Mechanism For Hepatitis A Contamination. J. Food Prot. 69:1468–1472.

14. Cheong S, Lee C, Song S W, Choi W C, Lee C H & S J Kim. 2009. Enteric Viruses In Raw Vegetables And

Groudwater Used For Irrigation In South Korea. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75(24):7745.

15. Clasen T F, Brown J, Collin S, Suntura O, & S Cairncross. 2004. Reducing Diarrhea Through The Use Of

Household-Based Ceramic Water Filters: A Randomized, Controlled Trial In Rural Bolivia.

16. Espinosa A C, Arias C F, Sánchez-Colón S & M Mazari-Hiriart .2009. Comparative Study Of Enteric Viruses,

Coliphages And Indicator Bacteria For Evaluating Water Quality In A Tropical High-Altitude System

Environmental Health 2009, 8:49

17. Fong TT & E K Lipp 2005. "Enteric Viruses Of Humans And Animals In Aquatic Environments : Health Risks,

Detection, And Potential Water Quality Assessment Tools" Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005, 69(2):357

18. Gerba C P, Goyal S M, Labelle S M, Cech I, & G F Bodgan. 1979. Failure Of Indicator Bacteria To Reflect The

Occurrence Of Enteroviruses In Marine Waters,” American Journal Of Public. Health, Vol. 69, No. 11, Pp. 1116–

1119, 1979.

19. Griffin J S, Plummer J D, & S C Long. 2008. Torque Teno Virus: An Improved Indicator For Viral Pathogens

In Drinking Waters. Virology Journal 2008, 5:112

20. Hamilton A J, Stagnitti F, Premier R, Boland AM & G Hale 2006. Quantitative Microbial Risk Assessment

Models For Consumption Of Raw Vegetables Irrigated With Reclaimed Water APPLIED AND ENVIRONMENTAL

MICROBIOLOGY, May 2006, P. 3284–3290 Vol. 72, No. 5

21. Howard G, Pedley S & S Tibatemwa 2006. Quantitative Microbial Risk Assessment To Estimate Health

Risks Attributable To Water Supply: Can The Technique Be Applied In Developing Countries With Limited Data?

Journal Of Water And Health, 04.1. 2006.

22. Kiulia N M, Netshikweta R, Page N A, Van Zyl W A, Kiraithe M M, Nyachieo A, Mwenda J M & M B Taylor.

2010. The Detection Of Enteric Viruses In Selected Urban And Rural River Water And Sewage In

Kenya, With Special Reference To Rotaviruses. Journal Of Applied Microbiology 109 (2010) 818–828

23. Leclerc H, Edberg S, Pierzo V & JM Delattre 2006. Bacteriophages As Indicators Of Enteric Viruses And

Public Health Risk In Groundwaters Journal Of Food Protection, Vol. 69, No. 8, 2006, Pages 1949–1956

24. Maluquer De Motes C, Clemente-Casares P, Hundesa A, Martín M, & R Girones. 2004. Detection Of Bovine

And Porcine Adenoviruses For Tracing The Source Of Fecal Contamination Appl. Environ. Microbiol. 2004,

70(3):1448.

25. Muñoz O, V, & N Laura. 2008. High Contamination Whit Enteroparasites Of Vegetables Expedited In

The Markets Of The City La Paz, Bolivia. BIOFARBO V.16 N.1 La Paz Dic. 2008

26. Ng T F F, Marine R, Wang C, Simmonds P, Kapusinszky B, Bodhidatta L, Oderinde B S, Wommack K E, & E

Delwarta. 2012. High Variety Of Known And New RNA And DNA Viruses Of Diverse Origins In

Untreated Sewage.Journal Of Virology ,November 2012, Volume 86, Number 22, P. 12161–12175.

27. Pusch D, Oh D Y, Wolf S, Dumke R, Schröter-Bobsin U, Höhne M, Röske I, & E Schreier.2006. Detection Of

Enteric Viruses And Bacterial Indicators In German Environmental Waters. Archives Of Virology, May 2005,

Volume 150, Issue 5, Pp 929-947

28. Rutjes S A, Lodder-Verschoor F, Van Der Poel W H M, Van Duijnhoven, & A M De Roda Husman 2006.

Detection Of Noroviruses In Foods: A Study On Virus Extraction Procedures In Foods Implicated In

Outbreaks Of Human Gastroenteritis Journal Of Food Protection, Vol. 69, No. 8, 2006, Pages 1949–1956

29. Sedmak G, Bina D, Macdonald J, & L Couillard. 2005. Nine-Year Study Of The Occurrence Of Culturable

Viruses In Source Water For Two Drinking Water Treatment Plants And The Influent And Effluent Of A

Wastewater Treatment Plant In Milwaukee, Wisconsin (August 1994 Through July 2003). APPLIED AND

ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb. 2005, P. 1042–1050

30. Silva J, Torres P Y C Madera. 2008. Domestic Wastewater Reuse In Agriculture. A Review. Agronomía

Colombiana 26(2), 347-359, 2008

31. Tallon L A, Love D C, Moore S S , & M D Sobsey.2008. Recovery And Sequence Analysis Of Hepatitis A Virus

From Springwater Implicated In An Outbreak Of Acute Viral Hepatitis . APPLIED AND ENVIRONMENTAL

MICROBIOLOGY, Oct. 2008, P. 6158–6160

32. Vecchia AD., Fleck JD, Kluge M, Comerlato, J, Bergamaschi B, Luz RB, Arantes TS, Silva JVS, Thewes MR & FR

Spilki 2012. Assessment Of Enteric Viruses In A Sewage Treatment Plant Located In Porto Alegre,

Southern Brazil Braz. J. Biol., 2012, Vol. 72, No. 4, P. 839-846

33. WHO (World Health Organization). 2006. Guidelines For The Safe Use Of Wastewater Excreta And

Greywater. Vol. 2. Wastewater Use In Agriculture. 191 P.