REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Clujmutageni chimici şi realizarea selecţiei in vitro pentru depistarea unor linii tolerante la ionii de Al+. 5 Pentru prelevarea de meristeme

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINǍ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALǍ FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Ing. DANIELA CAMELIA MARELE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Influenţa mutagenă in vitro a unor agenţi chimici în vederea obţinerii de mutaţii utile pentru procesul

de ameliorare la soia (Glycine max (L.) Merril)

Conducător ştiinţific:

Prof. univ. dr. SAVATTI MIRCEA

CLUJ-NAPOCA

2009

3

Rezumatul tezei de doctorat

Majoritatea studiilor efectuate timp de un secol în domeniul vitroculturilor vegetale

au servit la elucidarea mai multor aspecte privind regenerarea, creşterea, organogeneza,

embriogeneza somatică ş.a., a unor structuri tisulare sau a unor tipuri celulare, în funcţie de

compoziţia mediului de cultură şi a condiţiilor ecofiziologice din recipientele de cultură şi

a camerei de creştere. Există, însă, încă, numeroase necunoscute cu privire la unii factori

implicaţi în morfogeneză (în special la nivel celular şi molecular), precum şi referitor la

transmiterea şi a informaţiei genetice nou dobândite.

Culturile in vitro au găsit într-un timp foarte scurt numeroase aplicaţii practice în

ameliorarea numeroaselor specii de cultură, implicit la soia, privind multiplicarea

genotipurilor valoroase, propagarea stocurilor libere de viroze, conservarea resurselor

genetice ş.a. În plus, variaţia genetică manifestată de plantele regenerate în cultura in vitro

(variabilitatea somaclonală), sau cea obţinută prin mutageneză indusă, a putut şi este

folosită în obţinerea de genotipuri valoroase.

Pornind de la aceste constatări ne-am străduit ca pe lângă sintetizarea rezultatelor

pro- şi contra, privind problema multiplicării şi creării de mutaţii in vitro la soia, să

încercăm să elaborăm propriile noastre păreri în cadrul tezei de doctorat: “Influenţa

mutagenă in vitro a unor agenţi chimici în vederea obţinerii de mutaţii utile pentru

procesul de ameliorare la soia (Glycine max (L.) Merril)”.

În abordarea acestui subiect s-a urmărit elucidarea unor aspecte privind

posibilităţile de regenerare şi multiplicare in vitro la soia, crearea de variabilitate genetică

şi selecţia mutantelor de soia, in vitro.

În scopul celor menţionate, abordarea noastră se referă la unele aspecte majore care

să evidenţieze următoarele:

- optimizarea protocolului pentru organogeneza directă a cultivarelor de soia;

- implicarea unor citochinine în morfogeneza in vitro la soia;

- capacitatea de regenerare in vitro a unor tipuri de explante de naturǎ diferitǎ la soia;

- reacţia genotipurilor de soia, in vitro, în culturile de meristeme şi calus;

- inducerea de mutaţii in vitro la soia, folosind agenţi mutageni chimici (DES, DMS şi

EMS);

- relaţia dintre tratamentul mutagen şi frecvenţa aberaţiilor cromozomale;

4

- utilizarea selecţiei in vitro pentru evidenţierea unor genotipuri de soia tolerante la ionii de

aluminiu (Al+);

- detectarea polimorfismului la mutantele de soia utilizând markeri RAPD.

Pe parcursul elaborării tezei de doctorat ne-am străduit să dăm un răspuns cât mai

plauzibil elucidării aspectelor luate în studiu, corelând datele proprii cu multiplele sugestii

oferite de literatura de specialitate.

Prin natura sa biologică, plantă autogamă, dar cu posibilităţi de multiplicare

vegetativă, metodologia de lucru adoptată conferă posibilitatea decelării formelor biologice

ale multiplicării genotipurilor de soia, in vitro şi adaptarea neoplantulelor la efectul

mutagen al agenţilor chimici.

Crearea de variabilitate genetică prin utilizarea factorilor mutageni capabili să

amplifice frecvenţa mutaţiilor in vitro, în cazul soiei este destul de puţin menţionată în

literatura de specialitate.

Regenerarea şi oragnogeneza in vitro la unele specii de plante constituie o condiţie

esenţială pentru reuşita multiplicării plantelor respective pe cale vegetativă. Procesele de

morfogeneză şi organogeneză se realizează sub influenţa factorilor endogeni şi exogeni.

Conţinutul endogen de hormoni, tipul acestora, precum şi echipamentul enzimatic sunt

factori cu rol de reglare a regenerării. Natura fitohormonilor utilizaţi precum şi

concentraţia lor, diferenţele balanţelor hormonale au un rol important în procesele de

organogeneză.

Materialul biologic utilizat a fost constituit din trei genotipuri autohtone soia,

Diamant, Perla şi Agat, create la SCDA Turda.

Cercetările efectuate, în perioada 2006-2008, au fost realizate în Laboratorul de

biotehnologii a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca.

Asupra materialului biologic menţionat, ne-am îndreptat atenţia privind:

optimizarea protocolului privind implicaţiile unor citochinine în morfogeneza in vitro la

soia, capacitatea de regenerare a unor tipuri de explante, de naturǎ diferitǎ ş.a., aspecte

urmărite în prima etapă a cercetărilor. Pe baza observaţiilor efectuate s-a trecut la a doua

etapă a studiilor noastre, cu privire la crearea variabilităţii genetice la soia, utilizând factori

mutageni chimici şi realizarea selecţiei in vitro pentru depistarea unor linii tolerante la ionii

de Al+.

5

Pentru prelevarea de meristeme şi inocularea acestora pe mediul de cultură în

vederea iniţierii unor culturi in vitro corespunzătoare au fost utilizate, şi cu scopul de a le

verifica eficienţa, trei medii de bază, Murashige-Skoog (MS), Gamborg (B5) şi

Lindsmaier-Skoog (LS), (vezi tabelul 1). Tabelul 1

Experienţele realizate pentru optimizarea unui protocol pentru organogeneza directă a meristemelor de soia Layout of the experiments carried out to optimize a protocol for direct organogenesis of soybean meristems

Varianta

Experiment Sursa explantelor Explant source

Cultivarul Cultivars

Mediul şi regulatori de creştere Media and plant growth regulators

I

Meristeme tulpinale şi coronare Stem and crown meristems

Diamant Perla Agat

B5 (0,2 mg/l ANA) B5 (0,2 mg/l AIA +0,2 mg/l 2iP); la 30 zile transferate pe acelaşi mediu at 30 days transferred to the same medium LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K la 30 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 30 days transferred to RL

II Meristeme tulpinale Stem meristems

Diamant Perla Agat

MS (fără regulator de creştere-plant growth regulator free);la 15 zile transferate pe acelaşi mediu at 15 days transferred to the same medium LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL

III Meristeme tulpinale Stem meristems

Diamant Perla Agat

MS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K; la 15 zile transferate pe MS (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to MS (0.2 mg/l AIA) LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K) la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL

IV Meristeme tulpinale Stem meristems

Diamant Perla Agat

LS (0.003; 0.004; 0.005 mg/l PIC şi 0.5; 1.0 mg/l K) la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL

Legendǎ: MS = Murashige-Skoog ; B5 = Gamborg şi colab.;LS = Linsmaier-Skoog

Pentru inducerea de mutaţii in vitro, s-a utilizat un protocol similar celui folosit la

multiplicarea in vitro, adăugănd în mediul de cultură trei mutageni chimici, dietilsulfat

(DES), dimetilsulfat (DMS) în câte două concentraţii 0,2 şi 2,0 ppm şi etilmetansulfonat

(EMS) în trei concentraţii (0,3; 1,0; 2,0), (vezi tabelul 2).

Perioada tratamentului a fost condiţionată de capacitatea de absorbţie a

mutagenului de către materialul biologic tratat. După 24 de ore materialul biologic a fost

trecut pe mediu de cultură proaspăt, identic cu cel al variantei martor (mt).

6

Tabelul 2

Compoziţia mediului de cultură la Glycine max (L) Merril în vederea inducerii mutagenezei chimice Culture medium composition on Glycine max (L) Merril to induce chemical mutagenesis

Varianta Variant

Concentraţia agentului mutagen Mutagen agent concentration

(ppm)

Conţinutul în mediu Content in medium

(mg/l)

MS (1962) + chinetină 10 M (martor) (control)

AIA 0,5 MS (1962) + chinetină 10

AIA 0,5 DE1 0,2 DE 2

MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DE2 2 DE 2

MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DM1 0,2 DM 0,2

MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DM2 2 DM 0,2

0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS1

2,0 DM 0,2 0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS2 2,0 DM 0,2 0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS3 2,0 DM 0,2

Culturile in vitro au găsit numeroase aplicaţii practice în ameliorarea multor specii

de cultură, printre care multiplicarea genotipurilor valoroase, propagarea stocurilor libere

de viroze, conservarea resurselor genetice, crearea variabilităţii genetice ş.a.

Pornind de la dezideratele de mai sus, înaite de a aborda aspectele creării

variabilităţii genetice la soia prin mutageneză in vitro, s-a testat modul de comportare a

genotipurilor de soia, la nivelul culturilor in vitro.

7

Optimizarea protocolului în vederea organogenezei directe a meristemelor de soia a

urmărit evidenţierea comportamentului genotipurilor, sursa de explant, mediile de cultură

(MS, B5 şi LS) şi combinaţia regulatorilor de creştere, în patru variante (vezi tabelul 3). Tabelul 3

Mediul MURASHIGE-SKOOG (MS), 1962 MURASHIGE-SKOOG medium (MS), 1962

A. Soluţia de MACROELEMENTE/MACROELEMENTS solution

Concentraţia în soluţia normală Concentration in normal

solution

Soluţia STOC concentrată de 10 ori STOCK solution 10 times concentrated

mg/l mM g/l mg/1000 ml NH4NO3 1650 20,6 16,5 16.500 K NO3 1900 18,8 19,0 19.000 CaCl2 x 2H2O 440 30 Se prepară separat soluţia stoc 15 g/100 ml MgSO4x 7 H2O 370 1,5 3,7 3700 KH2 PO4 170 1,25 1,7 1700

B. Soluţia de MICROELEMENTE/MICROELEMENTS solution


solution


mg/l mM mg/100 ml mg/1000 ml H3BO3 6,2 100 6200 620 Mn SO4x 4H2O 22,3 100 22300 2230 ZnSO4x 7 H2O 8,6 30 8600 860 NaMoO4x 2H2O 0,25 1,0 250 25 CuSO4x 5H2O 0,025 0,1 25 2,5 CaCl x 6 H2O 0,025 0,1 25 2,5 KI 0,83 5 Se prepară separat soluţia Stoc 75 mg/100 ml

C. VITAMINE/VITAMINS solution


solution


mg/l mg/100 ml Acid nicotinic/Nicotinic acid 0,5 50 Piridoxină HCl/Piridoxine 0,5 50 Tiamină HCl/Tiamine 0,1 10 Mezo-inozitol/Mesoinositol 100 10000 D. Soluţia FeEDTA 40 Se prepară separat soluţia stoc FeSO4×7H2O 27,8 5,57 Na2EDTA 37,3 7,45 E. Soluţia de aminoacizi: Glicina/Glycine 2 F. Soluţii de REGULATORI DE CREŞTERE/GROWTH REGULATOR solution AIA/IAA 1 – 30 50,0 Chinetină/Kinetin 0,04 - 10 21,5 G. Zaharoză/Sucrose 30% H. Difco Bacto 9 Agar 10 g/l

8

S-au utilizat organe vegetative, meristeme tulpinale şi coronare, supuse

dezinfecţiei prin scufundare în etanol 70% (2’) şi în hipoclorit de sodiu 2% (7’) cu o

picătură de Tween 20/100 ml.

Observaţiile efectuate la 15, 30 şi 60 de zile de cultură au evidenţiat faptul că pe

mediul de cultură B5, suplimentat cu ANA ca sursă de auxină s-a format calus (varianta I).

Toate celelalte combinaţii de mediu şi regulatori de creştere au favorizat o creştere normală

a vitroplantulelor fără formare de calus.

S-a evidenţiat faptul că procesele de organogeneză la soia, se diferenţiază în funcţie

de sursa de explant, mediile de cultură şi combinaţia regulatorilor de creştere. Acest fapt

este reflectat de diferenţa dintre soiurile Diamant şi Perla pe de o parte, şi Agat pe de altă

parte (vezi tabelul 4). Tabelul 4

Talia lăstarilor (mm) dezvoltaţi din meristeme crescute pe mediile B5 (0,2 mg/l IAA+0.2 mg/l 2iP) şi LS (0.004 mg/l PIC+1.0 mg/l K) după 30 de zile de cultură (Varianta I)

Height (mm) of shoots developed from meristems grown on media B5 (0,2 mg/l IAA+0.2 mg/l 2iP) and LS (0.004 mg/l PIC+1.0 mg/l K) after 30 days of culture (Experiment I)

Cultivarul Cultivar

Meristeme tulpinale Stem meristems

Meristeme coronare Crown meristems

B5 LS B5 LS Diamant 5,0 5,8 5,9 8,6 Perla 4,4 5,0 5,6 ns 6,2 ns Agat 6,7 * 7,2 * 7,6 * 10,4 * Media

Average 5,4 6,0 6,4 8,4

DL 5% LSD 5% 0,51 0,63 0,54 0,76

Cultivarul Cultivar ns *

Mediul Medium ns *

Cult.×Mediu Cult.×Medium ns *

media a 3 cultivare în 3 repetiţii pe cultivar ; average of 3 cultivars, 3 replicates per cultivar ns - diferenţă nesemnificativă ; ns indicates non-significant differences * - diferenţă semnificativă (DL 5%) ; * - indicates significant differences (LSD 5%)

Compararea mediilor de cultură MS şi LS, cu acelaşi nivel al regulatorilor de

creştere, sub aspectul formării neoplantulelor, evidenţiază uşoara superioritate a mediului

LS, comparativ cu MS, cu diferenţe nesemnificative la nivelul parametrilor observaţi,

creând certitudinea că utilizarea celor două medii de cultură este propice pentru

multiplicarea in vitro a soiei (vezi tabelele 5,6).

9

Tabelul 5

Compararea mediului de cultură MS (fără regulator de creştere) şi LS (0.004 mg/l PIC+ 1,0 mg/l K pentru 15 zile, RL+0.2 mg/l AIA după 15 zile) după 60 de zile de cultură (Varianta II)

Comparison of media MS (plant growth regulators free) and LS (0.004 mg/l PIC+ 1,0 mg/l K, for 15 days, RL+0.2 mg/l IAA afterward) after 60 days of culture (Experiment II)

Cultivarul Cultivar

Număr de lăstari/meristem

Number of shoots/meristem

Număr de rădăcini/meristem

Number of roots/meristem

Înălţime (mm)

Height

Diamant Perla Agat Media MS ; Average MS Media LS ;Average LS

5,6 5,0 5,8 5,5 6,6

1,7 1,1 2,3 1,7 3,7

2,6 1,8 2,6 2,3 3,2

Media generală ; General average 6,0 2,7 2,5

Semnificaţia Signification Cultivarul Cultivar * * ns Mediul Medium * ns ns Cult.×Mediu Cult.×Medium ns ns ns DL 5% LSD 5% Cultivarul Cultivar 0,82 1,00 - Mediu Medium 0,53 - -

Tabelul 6

Compararea mediului de cultură MS şi LS cu acelaşi nivel de regulatori de creştere după 60 de zile de cultură (variantele III-IV)

Comparison of media MS and LS with similar levels of plant growth regulators after 60 days of culture (Experiments III-IV)

Cultivarul Cultivar

Număr de lăstari/meristem

Number of shoots/meristem

Număr de rădăcini/meristem

Number of roots/meristem

Înălţime (mm)

Height

MS LS MS LS MS LS Diamant Perla Agat Media Average

5,4 5,2 5,6

5,4

5,0 5,0 5,3

5,1

2,1 2,3 2,4

2,3

2,0 2,0 2,3

2,1

26,3 26,4 27,2

26,6

26,1 26,0 25,5

25,9

Semnificaţia Signification Cultivarul Cultivar * * ns Mediul Medium - ns ns Cult.×Mediu Cult.×Medium ns ns ns

DL 5% LSD 5% 0,63 1,26 1,00 Cultivarul Cultivar Mediu Medium 0,60 - -

Pentru completarea unor aspecte ale studiului anterior s-a încercat să se

aprofundeze rolul a două citochinine, benziladenina (BA) şi 2-izopentil-adenina (PiP)

asupra evoluţiei plantulelor de soia, obţinute in vitro din apex, nod, boboc floral şi pǎstǎi

juvenile, sub aspectul regenerării şi organogenezei lor (vezi tabelele 7, 8).

10

Tabelul 7 Mediile de bază folosite în cultura de soia

Composition of aseptic media in plant regeneration in soybean

Elemente (mg/l) Elements

Regenerare Regeneration

Multiplicare Multiplication

Macroelemente Macroelements MS MS

Microelemente Microelements MS MS

FeEDTA MS MS Mezo-inozitol Mezo-inozitum 100 mg 100 mg

Tiamină Tiamine 0,5 1,0

Piridoxină Pyridoxine 0,5 1,0

Acid nicotinic Nicotinic acid 0,5 1,0

Zaharoză Sucrose 30 g/l 30 g/l

Agar 7 g/l 7 g/l Sulfat de adenină (AdSO4) Adenin sulfat 40 g/l 80 mg/l

pH 5,7 5,7 MS – mediu de bază după Murashige-Skoog, 1962 MS - basal medium after Murashige-Skoog, 1962

Tabelul 8

Balanţa hormonală experimentală în cazul explantelor de soia Experimental hormonal balance for soybean meristems

Varianta Variant

Mediul de bază Basal

medium

Citochinine Cytokinines

Concentraţia Concentration

(mg/l)

Auxina Auxines

Concentraţia Concentration

(mg/l)

Adaosul Addition AdSO4 (mg/l)

Bonificare Bonus

T0 MS - - - - 40 xx

T1 MS BAP 1,0 ANA 0,5 40 xxxx

T2 MS BAP 2,0 ANA 1,0 80 xxxxx

T3 MS 2iP 1,0 ANA 0,5 40 xxxx

T4 MS 2iP 2,0 ANA 1,0 80 xxxxx

S-a constatat că apexul este capabil să regenereze plante complet formate şi cu

rădăcină. Comparativ, din nod şi boboc floral se formează mai puţine neoplantule (vezi

tabelul 9).

11

Tabelul 9

Morfogeneza in vitro a explantelor de soia, cultivate pe medii cu benzilaminopurinǎ (BAP) şi 2 izopentil-adenină (2iP)

In vitro morphogenesis of soybean explants, cultivated on media with benzylaminopurine (BAP) and 2 izopentyl-adenine (2iP)

Varianta Variant

Explant Expant

% de regenerare

Regeneration percentage

Nr. de plante No of plants

Înălţimea Height (cm)

Nr. de rădăcini

No of roots

Lungime rădăcini Roots length

Alte tipuri de ţesuturi

Other types of tissues

T0 80 1 1,5 1-2 2,5 - T1 85 2 1,0 3 2,5 - T2 90 5 1,1 5 2,0 - T3 90 2 1,3 3 2,5 - T4

Apex Apex

94 3 1,1 8 2,0 - T0 70 2 1,0 2 1,8 - T1 80 8 0,7 4 1,0 - T2 70 6 0,8 - - calus (50%) T3 82 9 1,0 5 1,5 - T4

Nod Node

88 6 0,9 - - calus (30%) T0 57 3 0,8 2 1,0 - T1 60 8 1,8 5 1,0 - T2 50 14 0,8 2 0,4 calus T3 61 10 1,5 5 0,6 - T4

Boboc Bud

50 16 0,5 5 0,5 calus T0 82 6 0,9 3 1,0 - T1 86 12 1,2 4 1,0 calus T2 93 14 1,5 3 0,5 - T3 93 10 1,6 5 0,5 - T4

Pǎstaie juvenilǎ Juvenile

pod 97 18 0,8 5 0,5 -

Efectele fito-fiziologice ale citochininelor pot fi rezumate, în funcţie de

concentraţie şi tipul acestora, ca facilitând formarea de muguraşi şi de tulpiniţe

(caulogeneză), fiind antagoniste, de regulă rizogenezei.

Am fost interesaţi de capacitatea regenerativă in vitro a cultivarelor de soia, în

funcţie de organele donatoare de explante ale plantei, natura acestora şi mediul de cultură

utilizat. Acest aspect a fost urmărit pe patru medii abreviate (T1 şi T4) care au evidenţiat

faptul că pe mediul T1 explantele provenite din nod au un procent de regenerare de 94%,

formând însă din fiecare nod 1-2 neoplantule cu un început de sistem radicular. Spre

deosebire de mediul T4, numărul plantelor pe nod este mai mic, dar au o rizogeneză

puternică (vezi tabelul 9). Se constată că evoluţia apexurilor este mai bună sub aspectul

multiplicării, decât a nodurilor şi a bobocului floral, dar cu o viabilitate mai scăzută. Cele

mai bune rezultate sub aspectul regenerǎrii, a numǎrului de plantule şi a rizogenezei se

realizeazǎ la nivelul explantelor recoltate din pǎstǎi juvenile.

12

Concluzionând cele de mai sus, se poate considera că există o strânsă corelaţie între

mediul de cultură şi aportul regulatorilor de creştere şi procesele de organogeneză şi

rizogeneză, influenţate într-o măsură mai mică de organele donatoare. Contrar acestei

situaţii, doar în cazul apexului se constată o influenţă asupra rizogenezei in vitro.

După cum s-a mai menţionat, iniţierea culturilor de ţesuturi in vitro necesită

formarea unui mediu de bază cu o anumită formulă minerală, care să suporte şi să

stimuleze o diviziune celulară rapidă a explantului meristematic. Formula minerală este

suplimentată cu auxine şi citochinine pentru a iniţia sau bloca organogeneza radicelelor sau

lăstarilor. În experienţele noastre s-au utilizat pentru eficientizarea mediilor de cultură

auxine şi citochinine. Auxinele utilizate pentru inducerea diviziunii celulare şi a

rizogenezei au fost acidul indolilacetic (AIA), acidul indolilbutiric (AIB) şi acidul alfa-

naftilacetic (ANA) în concentraţie de 0,5-2,0 mg/l. Citochininele de sinteză utilizate au

fost kinetina (K) (6-furfuril-aminopurina) şi BAP (6-benzil-aminopurina).

Pentru a evidenţia modul lor de acţiune, pe un mediu de cultură Murashige-Skoog

s-a acţionat cu hormoni de creştere individuali şi apoi prin utilizarea mai multora în mediul

de cultură de bază s-a urmărit contribuţia fiecăruia asupra neoformării de plantule in vitro.

Reacţia cultivarelor la influenţa AIA (acidul β-indoliacetic), marchează rezultate

asemănătoare, în procesul de organogeneză, cu AIB, cu diferenţa că indicii optimi în

procesele de rizogeneză şi calusogeneză se evidenţiază la concentraţia de 1,0-1,5 mg/l. În

cazul rizogenezei s-au obţinut rezultate pozitive la o concentraţie de 1,5-2,0 mg/l la toate

cultivarele de soia (vezi tabelul 10).

13

Tabelul 10

Influenţa acidului indolilacetic (AIA) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale

Influence of indole-acetic acid (IAA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme

Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis Cultivarul

Cultivar

AIA/ IAA

(mg/l) Fără dezvoltare No development

Calusogeneză Calusogenesis

Rizogeneză Risogenesis

Caulogeneză Caulogenesis

0,0 100,0 0 0 0 0,5 85 7 15 0 1,0 68 12 23 0 1,5 60 16 36 0 2,0 73 6 30 0 3,0 80 6 12 0

Diamant

% 73,2 9,4 23,2 0 0,0 100,0 0 0 0 0,5 73 10 20 0 1,0 61 16 27 0 1,5 65 9 36 0 2,0 51 12 30 0 3,0 84 3 15 0

Perla

% 66,8 10,0 25,6 0,0 100,0 0 0 0 0,5 59 16 32 0 1,0 36 17 41 0 1,5 39 12 46 0 2,0 50 8 38 0 3,0 68 2 10 0

Agat

% 50,4 11,0 33,4

X /genotip 63,5 10,2 27,4 0

Introducerea acidului β-indolilbutiric (AIB) în mediul de cultură influenţează

organogeneza la nivelul concentraţiilor de 1,0-2,0 mg/l (vezi tabelul 11).

Organogeneza, indiferent de cultivar, se reflectă mai ales asupra procesului de

rizogeneză la nivelul concentraţiilor de 0,5-2,0 mg/l. Sub aspectul calusogenezei se

constată diferenţieri genotipice; cultivarul Diamant manifestă o tendinţă sporită spre acest

fenomen, comparativ cu soiurile Perla şi Agat, situaţie inversă însă sub aspectul

caulogenezei.

14

Tabelul 11

Influenţa acidului indolilbutiric (AIB) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale

Influence of indole butyric acid (IBA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme

Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis

Cultivarul Cultivar

AIB/IBA (mg/l)

Fără dezvoltare

No development




0,0 100,0 0 0 0 0,5 50 10 27 0 1,0 55 12 23 2 1,5 55 9 36 6 2,0 45 10 32 4 3,0 65 3 14 0

Diamant

% 54 6,80 26,8 2,40 0,0 100,0 0 0 0 0,5 73 3 25 3 1,0 75 3 26 5 1,5 60 6 36 5 2,0 70 5 32 5 3,0 82 2 7 0

Perla

% 72,0 3,80 25,2 3,60 0,0 100,0 0 0 0 0,5 65 0 26 3 1,0 66 0 30 4 1,5 60 3 31 8 2,0 69 3 36 7 3,0 80 0 12 2

Agat

% 68,0 1,20 27,0 4,80

X /genotip 64,7 3,93 26,4 3,60

Spre deosebire de cele două auxine menţionate (AIA şi AIB), se constată că acidul

n-naftilacetic (ANA) are o influenţă pozitivă mai ales asupra calusogenezei (vezi tabelul

12). În cazul soiului Diamant se realizează un procent mediu de 54,2% caulogeneză,

evident superioară rezultatelor obţinute de cultivarele Perla şi Agat.

15

Tabelul 12

Influenţa acidului naftilacetic (ANA) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale

Influence of naphthaleneacetic acid (NAA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme

Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis Cultivarul

Cultivar ANA/NAA

(mg/l) Fără dezvoltare No

development




0,0 100,0 0 0 0 0,5 26 56 55 0 1,0 26 64 70 3 1,5 30 68 66 6 2,0 38 65 60 2 3,0 46 18 19 0

Diamant

% 33,2 54,2 54,0 2,2 0,0 100,0 0 0 0 0,5 23 40 63 0 1,0 32 42 60 7 1,5 30 42 68 3 2,0 30 36 53 3 3,0 49 12 20 1

Perla

% 32,8 34,4 52,8 2,8 0,0 100,0 0 0 0 0,5 30 55 50 1 1,0 36 65 50 3 1,5 42 78 46 9 2,0 48 70 45 3 3,0 56 15 21 2

Agat

% 42,4 46,6 42,4 3,6

X /genotip 36,1 48,4 49,7 2,9

Analizând efectele auxinelor artificiale asupra organogenezei soiei, se constată

reacţii diferenţiate condiţionate de genotip. De aici, ipoteza că procesul de multiplicare in

vitro trebuie individualizat, în sensul că fiecare cultivar îşi are un specific al reacţiei faţă de

activitatea hormonală, din structura mediilor de cultură.

Influenţa chinetinei (K) are un efect marcant asupra caulogenezei, la concentraţia

de 1,5-2,0 mg/l (vezi tabelul 6.11). Spre deosebire de auxinele menţionate anterior,

chinetina (K) nu are efecte rizogene, influenţând calusogeneza şi în special caulogeneza. O

creştere a concentraţie de la 0,5 la 2,0 mg/l are un efect marcant asupra fenomenului de

caulogeneză la soiul Agat.

Benzilaminopurina (BAP) evidenţiază practic acelaşi efect cu cel obţinut în cazul

utilizării chinetinei (K), cu efecte majore asupra caulogenezei, apoi a calusogenezei, şi mai

puţin asupra rizogenezei (vezi tabelul 13).

16

Tabelul 13

Influenţa chinetinei (K) şi a benzilaminopurinei (BAP )asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale

Influence of kinetin (K)and of benzylamino purine (BAP on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme

Evoluţia organogenezei %

Fără dezvoltare Calusogeneză Rizogeneză Caulogeneză

Cultivarul Concentraţia

chinetinei (mg /l)

K BAP K BAP K BAP K BAP 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 40 70 31 18 0 0 53 18 1,0 40 68 44 20 0 2 61 45 1,5 46 48 44 21 2 3 63 51 2,0 36 39 35 16 1 2 52 36 3,0 39 75 30 7 0 0 48 16

Diamant

% 40,2 60,0 36,8 16,4 0,6 1,4 54,6 33,2 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 43 61 38 12 0 0 50 20 1,0 40 76 38 22 1 0 63 50 1,5 32 70 53 22 1 2 60 46 2,0 28 62 36 17 1 3 50 32 3,0 36 76 29 8 0 0 42 9

Perla

% 35,8 69,0 38,8 16,2 0,6 1,0 53,0 31,4 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 25 60 41 20 1 0 58 17 1,0 20 60 44 22 2 1 62 46 1,5 20 53 52 23 2 3 70 58 2,0 27 58 38 15 3 3 60 47 3,0 30 70 28 6 1 0 38 18

Agat

% 11,4 60,2 40,6 17,2 1,8 1,4 57,6 37,2

X / genotip

29,1 63,1 38,7 16,6 1,0 1,3 55,1 33,9

Fitohormonii orientează procesul de dezvoltare in vitro. O valoare ridicată a

raportului auxină/citochinină, favorizează rizogeneza şi calusogeneza, iar o valoare mai

mică, duce la o proliferare a mugurilor axilari şi a organogenezei tulpinale.

S-a evidenţiat cǎ în absenţa citochininelor, dar şi a auxinelor procesul de diviziune

nu are loc. În prezenţa individualǎ a acestora în mediul de culturǎ se evidenţiazǎ procese de

organogenezǎ pe un anumit palier de dezvoltare a plantelor de soia, ceea ce impune

introducerea în procesele de organogenezǎ, în mod concomitent a unei citochinine şi a unei

auxine.

Necesitatea realizǎrii unei balanţe hormonale corespunzǎtoare, care sǎ faciliteze

organogeneza, implicǎ necesitatea tatonǎrii efectului cumulat a acestor fitohormoni.

17

Prezenţa în mediul de culturǎ a chinetinei şi auxinei favorizeazǎ procesul de

organogenezǎ. Se constatǎ însǎ, apariţia unor diferenţieri de rǎspuns în funcţie de genotip.

Soiul Agat manifestǎ cel mai favorabil rǎspuns la combinaţiile din balanţa hormonalǎ.

Cele menţionate sunt ilustrate de valorile medii procentuale ale genotipurilor,

evidenţiindu-se faptul cǎ cele mai echilibrate balanţe hormonale sunt realizate de

combinaţia K+AIA în cazul caulogenezei (Diamant 50%, Perla 50%, Agat 52,8%) şi a

rizogenezei (27% la Diamant, 25% la Perla, 27% la Agat). Rǎspunsul balanţei hormonale

evidenţiazǎ existenţa unei corelaţii negative între caulogenezǎ şi rizogenezǎ dacǎ

vizualizǎm rapoartele procentuale de concentraţie K cu cele trei auxine (AIA, AIB, ANA)

(vezi tabelul 14). Cea mai eficientǎ şi economicǎ formulǎ este K+AIA, în concentraţii de

1,0-1,5 mg/l, asigurând declanşarea organogenezei la soia. Tabelul 14

Efectul cumulat al fitohormonilor asupra organogenezei la soia Cumulative effect of phytohormones on soybean organogenesis

Cultivarul Cultivar

Variantǎ Variant

Fără diferenţieri

No differences




Diamant

K+AIA K+AIB K+ANA K+AIA+AIB+ANA

56,6 62,2 54,8 35,4

39,8 37,0 32,4 32,4

27,0 24,6 28,0 29,4

52,0 47,6 45,8 50,6

Perla


57,4 58,6 50,6 40,0

40,8 37,6 34,6 34,0

25,6 24,2 30,2 29,6

50,6 47,4 42,6 48,8

Agat


49,8 55,2 50,7 35,5

42,9 40,3 35,4 37,6

27,9 27,1 31,5 32,7

52,8 49,8 45,9 51,8

Efectuarea subculturilor stă la baza creşterii eficienţei de multiplicare in vitro la

soia. Ea constă în transformarea tulpiniţelor generate dintr-un inocul în micro şi minibutaşi.

Repicările derivate din cultura iniţială evidenţiază că pe parcursul ciclurilor de subcultură

apar diferenţieri ce indică reacţii genotipice diferite a cultivarelor de soia. Pe parcursul

celor trei cicluri de subculturǎ apar diferenţieri ce indicǎ reacţii genotipice. Se constatǎ în

subculturǎ cǎ din 150 de fragmente de lǎstari, provenite de la plantulele culturii iniţiale,

122 de plantule au proliferat (cca 80%) lǎstari, în subcultura a II-a au proliferat 61%, iar în

subcultura a III-a procentul proliferǎrii a fost de 40%. Rezultatele evidenţiazǎ o tendinţǎ de

senescenţǎ, pe mǎsura multiplicǎrilor în subculturǎ, tendinţǎ ce se manifestǎ prin scǎderea

procentului de proliferare (vezi tabelul 15).

Tabelul 15 Evoluţia multiplicării in vitro în subcultură a soiei

In vitro multiplication evolution in subcultivation for soybean

Cultura iniţială Initially culture

Subcultura I Subcultivation I

Subcultura II Subcultivation II

Subcultura III Subcultivation III

Plantule cu proliferare

Plantlets with proliferation





Rata plantulelor cu proliferare

Rate of plantlets with proliferation

Cultivar Cultivars

Plantule stadiul I Stage I

plantlets



Semnif. Significa

tion

Fragmente de lăstari Offshoot

fragments nr. %

Semnif Significa

tion

Lăstari detaşaţi

Detached offshoots nr. %

Semnif Significa

tion

Lăstari detaşaţi

Detached offshoots nr. %

Semnif Significa

tion

Total lăstari

detaşaţi Total of detached offshoots

nr. %

Semnif Significa

tion

Diamant 50 fără proliferare - 50 40 80,0 - 100 60 60,0 - 150 50 33,6 - 300 150 50,0 -

Perla 50 fără proliferare - 50 27 54,0 0 100 54 54,0 - 150 45 30,0 - 300 126 42,0 -

Agat 50 fără proliferare - 50 45 90,0 × 100 70 70,0 × 150 95 63,3 ×× 300 210 70,0 ×

Total/ media

150/ 50 150/

50 122/ 40 73,0 300/

100 184/61,3

184/ 61,3 450/

150 190/63,3

126,9/ 42,3 900/

300 486/ 162

162/ 54

DL 5% 16,3 15,7 13,4 16,0 DL 1% 20,4 21,7 19,0 28,0 DL 0,1% 32,8 32,5 28,0 35,8

În vederea realizării de mutante in vitro trebuie avute în vedere procesele şi etapele

ce trebuiesc realizate şi care se rezumă la: realizarea mutagenezei la nivel celular, utilizarea

celui mai adecvat sistem experimental, realizarea selecţiei la nivel celular, decelarea

expresiei caracterului mutant a plantulelor regenerate şi transmiterea caracterelor mutante

în descendenţă.

În procesul de mutageneză, se constată că diferitele concentraţii a factorilor

mutageni chimici determină o letalitate evidentă a plantelor. Acest fapt face necesară

cunoaşterea DL 50% (doza letală 50%). În cazul genotipurilor de soia, doza letală 50% se

situaează la nivelul variantelor cu concentraţia de 0,2-2,0 ppm a factorilor mutageni în

cazul mutagenilor DES şi DMS şi 1,0-2,0 ppm în cazul EMS (vezi tabelele 16,17,18). Tabelul 16

Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Diamant

The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Diamant

Soiul Cultivar

Factorul mutagen

Mutagenic agent

ConcentraţiaConcentration

Nr. explante tratate

Number of treated explants

Explante viabile Viable

explants

% explante viabile

Percent of viable

explants

Explante neviabile Nonviable explants

% explante neviabile Percent of nonviable explants

v0- netratat/ untreated 100 100 100 - -

v1 = 0,001 100 98 98 2 2 v2 = 0,01 100 86 86 14 14 v3 = 0,1 100 76 76 24 24 v4 = 0,02 100 78 78 22 22 v5 = 0,2 100 54 54 46 46 v6 = 2,0 100 48 48 52 52

DES Dietilsulfat

Diethyl sulphate

v7 = 3,0 100 32 32 68 68 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 95 95 5 5 v2 = 0,01 100 76 76 24 24 v3 = 0,1 100 71 71 29 29 v4 = 0,02 100 70 70 30 30 v5 = 0,2 100 58 58 42 42 v6 = 2,0 100 51 51 49 49

DMS Dimetilsulfat

Dimethyl sulphate


Dia

man

t

EMS Etilmetansulfonat

Ethyl methanesulfonate

v7 = 3,0 100 23 25 75 75

3

Tabelul 17

Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Perla

The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Perla

Soiul Cultivar

Factorul mutagen

Mutagenic agent





explants

% explante viabile

Percent of viable

explants



v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 91 91 9 9 v2 = 0,01 100 88 88 12 12 v3 = 0,1 100 80 80 20 20 v4 = 0,02 100 83 83 17 17 v5 = 0,2 100 57 57 43 43 v6 = 2,0 100 52 52 48 48

DES Dietilsulfat

Diethyl sulphate


DMS Dimetilsulfat

Dimethyl sulphate


Perla



v7 = 3,0 100 27 27 63 63

4

Tabelul 18

Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Agat

The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Agat

Soiul Cultivar

Factorul mutagen

Mutagenic agent





explants

% explante viabile

Percent of viable

explants



v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 92 92 8 8 v2 = 0,01 100 87 87 13 13 v3 = 0,1 100 80 80 20 20 v4 = 0,02 100 83 83 17 17 v5 = 0,2 100 56 56 44 44 v6 = 2,0 100 50 50 50 50

DES Dietilsulfat

Diethyl sulphate


DMS Dimetilsulfat

Dimethyl sulphate


Aga

t



v7 = 3,0 100 21 21 79 79

Studiul mediului de cultură utilizat în mod obişnuit în culturile in vitro ca şi modul

în care substanţele mutagene DES, DMS şi EMSce pot influenţa dezvoltarea şi evoluţia

meristemelor in vitro, au drept punct de plecare observaţiile făcute asupra procentului de

regenerare de propagule din meristeme. Rezultatele, inclusiv a variantei netratate (mt)

evidenţiază o regenerare redusă de 14,3% de propagule formate la soiul Diamant, 14,5% la

soiul Perla şi 17,2% la soiul Agat (vezi tabelul 19).

5

Tabelul 19 Număr de propagule regenerate (%) la soiurile Diamant, Perla şi Agat

Number of regenerated propagules (%), Diamant , Perla and Agat cultivars Diamant

Varianta/ concentraţia

Variant/ x ±s x ±d

Semnif. dif. Difference

signification

r-martor/varianta r - control variant

r-doze mutageni r – mutagens

dose Martor/Control 14,3 - - - 1,000 -

DES1=0,2 14,9 1,17 +0,6 - 0,500 -

DES2=2,0 14,0 1,02 -0,3 - 0,863 -0,364

DMS1=0,2 12,7 2,63 -1,6 0 -0,500 -

DMS2=2,0 12,0 2,76 -2,3 0 -0,765 -0,688

EMS1=1,0 8,7 1,86 -5,6 000 -0,500 -

EMS2=2,0 7,8 2,33 -6,5 000 -0,480 -0,189

Media/Average 11,7 1,96 2,8

DL (LSD) 5% = 1,06 ; DL (LSD) 1% = 2,67 ; DL (LSD) 0,1% = 4,52 Perla




signification



dose Martor/Control 13,7 - - 1,000 -0,239 DES1=0,2 14,5 1,26 0,8 - 0,364 DES2=2,0 14,0 1,37 0,3 - 0,500 DMS1=0,2 13,0 2,64 0,7 - 0,836 -0,463 DMS2=2,0 12,2 2,32 1,5 - 0,656 EMS1=1,0 10,4 3,46 3,3 0 0,436 -0,646 EMS2=2,0 8,5 3,10 5,2 00 0,500 Media/Average 12,10 2,35 1,96

DL (LSD) 5% = 2,36 ; DL (LSD) 1% = 4,85 ; DL (LSD) 0,1% = 5,32 Agat




signification



dose Martor/Control 17,2 - - - 1,000 - DES1=0,2 17,2 - - - - - DES2=2,0 16,8 2,40 -0,4 - 0,326 -0,264 DMS1=0,2 15,6 2,11 -1,6 - 0,500 -0,536 DMS2=2,0 14,3 3,16 -2,9 0 0,743 - EMS1=1,0 11,6 3,56 -5,6 000 0,650 0,746 EMS2=2,0 9,3 5,25 -6,9 000 0,864 Media/Average 14,3 2,74 2,9

DL (LSD) 5% = 2,40 ; DL (LSD) 1% = 3,63 ; DL (LSD) 0,1% = 5,12 S-a constatat un efect de uşoarǎ stimulare a mutagenului DES1 privind formarea

neoplantulelor, mai ales în cazul concentraţiei de 0,2 ppm, mai evidentǎ la soiurile Perla şi

6

Diamant. Utilizarea mutagenului DMS determină o evidentă scădere a procentului de

propagule regenerate, pe măsura creşterii concentraţiei de la 0,2 la 2,0 ppm.

Faţǎ de efectele manifestate de mutagenii DES şi DMS, în ambele concentraţii,

introducerea în mediul de culturǎ a mutagenului EMS (1,0-2,0 ppm) evidenţiazǎ un efect

negativ vizibil asupra procesului de regenerare a propagulelor de soia, la nivelul celor trei

soiuri analizate.

Efectul negativ cel mai evident se constatǎ la soiul Diamant cu o scǎdere de cca.

50% faţǎ de martorul netratat la tendinţa de formare a propagulelor. Efecte asemǎnǎtoare

se constatǎ la soiul Perla (25% la EMS1 şi 38% la EMS2) şi 33% la EMS1 şi 46% la EMS2

la soiul Agat. Din datele prezentate rezultǎ efectul negativ al mutagenului EMS asupra

formǎrii de neopropagule de soia, fǎrǎ a trage concluzii asupra efectului mutagen.

Influenţa compoziţiei mediului de cultură asupra ratei de multiplicare constituie o

etapă deosebit de importantă în fluxul tehnologic in vitro, de care depinde realizarea într-

un timp cât mai scurt a unui număr mare de indivizi identici cu planta mamă, excluzând

variabilitatea somaclonală. În baza acestui considerent s-a urmărit modul în care

compoziţia mediului de cultură, respectiv prezenţa unor substanţe cu efecte mutagene pot

influenţa coeficientul de multiplicare. Raportată la influenţa compoziţiei chimice a

mediului de cultură, cât şi a modului de reacţie a soiurilor de soia, s-a evidenţiat un

coeficient de multiplicare superior la soiul Agat, în condiţiile unui mediu de cultură

completat cu DES, 0,2 ppm, valoarea acestuia scăzând odată cu creşterea concentraţiei

mutagenului la 2,0 ppm.

Un efect negativ, evident se semnalează sub influenţa mutagenului DMS,

amplificat odată cu creşterea concentraţiei agentului mutagen, diferenţele faţă de martorul

netratat fiind semnificativ negativ (vezi tabelul 20).

O scǎdere a ratei de multiplicare s-a obţinut în cazul includerii în compoziţia.

Comportamentul materialului biologic studiat pe cele şase variante de medii de

cultură, a fost diferit de la un genotip la altul, sub aspectul procesului de rizogeneză.

Agentul mutagen DMS, determină diferenţe foarte semnificativ negative, în ambele

concentraţii la soiul Diamant. Se evidenţiază, de fapt, un comportament similar şi al

celorlalte soiuri studiate la efectele mutagenului DMS, diferenţele faţa de martor fiind

foarte semnificativ negative. Efectul cel mai pronunţat este semnalat în variantele cu

mutagenul EMS, la nivelul celor trei genotipuri analizate (vezi tabelul 21).

7

Tabelul 20 Rata medie de multiplicare (număr de propagule/explant)

Average rate of multiplication (propagules number/explant) Diamant




signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 4,8 - - 1,000 DES1=0,2 4,4 1,30 -0,4 - 0,570 DES2=2,0 4,2 0,93 -0,6 0 0,876 0,364 DMS1=0,2 3,2 1,76 -1,6 0 0,832 DMS2=2,0 2,8 1,88 -2,0 00 0,530 0,564 EMS1=1,0 2,0 1,94 -2,8 00 0,367 EMS2=2,0 1,6 2,31 -3,2 00 0,763 -0,168 Media/Average





signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 4,7 - - 1,000 DES1=0,2 4,3 1,63 -0,3 - 0,364 DES2=2,0 4,0 1,52 -0,7 0 0,765 0,455 DMS1=0,2 3,6 2,13 -1,1 00 0,832 DMS2=2,0 3,1 2,18 -1,6 00 0,456 0,566 EMS1=1,0 3,0 2,00 -1,7 000 0,256 EMS2=2,0 2,3 1,96 -2,4 000 0,463 0,602 Media/Average

DL (LSD) 5% = 0,4; DL (LSD) 1% = 1,0 ; DL (LSD) 0,1% = 1,5 Agat




signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 5,3 - - 1.000 DES1=0,2 4,8 0,86 -0,5 - 0,345 DES2=2,0 4,6 1,13 -0,7 0 0,636 0,426 DMS1=0,2 4,2 1,05 -1,1 0 0,823 DMS2=2,0 4,0 1,23 -1,3 00 0,763 0,546 EMS1=1,0 3,6 1,87 -1,7 00 0,684 EMS2=2,0 2,6 2,00 -2,7 000 0,912 0,763 Media/Average

DL (LSD) 5% = 0,7 ; DL (LSD) 1% = 1,2 ; DL (LSD) 0,1% = 2,5

8

Tabelul 21 Rizogeneza plantulelor in vitro (nr.)

Rooting of plantlets obtained by in vitro cultures

Diamant




signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 6,2 - - 1,000 DES1=0,2 6,0 1,86 -0,2 - 0,236 DES2=2,0 5,6 2,15 -0,6 0 0,500 0,655 DMS1=0,2 5,6 2,02 -0,6 0 0,636 DMS2=2,0 4,8 1,98 -1,4 00 0,856 0,082 EMS1=1,0 3,1 2,14 -3,1 000 -0,736 EMS2=2,0 2,0 2,36 -4,2 000 -0,463 0,856 Media/Average





signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 6,1 - - 1,000 DES1=0,2 6,2 1,36 +0,1 - 0,326 DES2=2,0 5,8 1,76 -0,3 - 0,500 0,633 DMS1=0,2 5,1 0,94 -1,0 0 0,626 DMS2=2,0 4,7 0,98 -1,4 0 0,536 0,545 EMS1=1,0 3,0 1,93 -2,9 000 0,784 EMS2=2,0 2,0 2,13 -3,9 000 0,812 0,836 Media/Average

DL (LSD) 5% = 0,6 ; DL (LSD) 1% = 1,8 ; DL (LSD) 0,1% = 2,9 Agat




signification

r-martor/ varianta

r - control variant

r-doze mutageni

r – mutagens dose

Martor/Control 5,8 - - 1,000 DES1=0,2 5,4 1,86 -0,4 0 0,436 0,436 DES2=2,0 5,0 1,76 -0,8 0 0,55 DMS1=0,2 4,8 1,94 -1,0 0 0,764 0,688 DMS2=2,0 4,3 1,03 -1,5 00 0,823 EMS1=1,0 3,0 2,04 -2,8 000 0,913 0,866 EMS2=2,0 1,8 2,00 -4,0 000 0,814 Media/Average

DL (LSD) 5% = 0,4 ; DL (LSD) 1% = 1,3 , DL (LSD) 0,1% = 2,5

9

Concluzionând comportamentul explantelor în culturile in vitro, de la prelevare

până la elaborarea radicelelor plantelor neoformate, se constată că introducerea în cultura

de bază a celor trei agenţi mutageni, provoacă modificări fenotipice la nivelul ambelor

genotipuri. Introducerea în mediul de cultură a mutagenului DMS şi EMS, în ambele

concentraţii, influenţează negativ atât neoformarea propagulelor din culturile de

meristeme, rata de multiplicare şi procesul de rizogeneză, evidenţiind faptul că

dimetilsulfatul (DMS) şi mai ales etilmetansulfonatul (EMS) sunt mutageni mai puternici,

comparativ cu efectele provocate de dietilsulfat (DES) şi ca atare ar avea capacitatea

producerii de posibile mutaţii într-un procent mai ridicat (vezi tabelele 22- 27 ). Tabelul 22

Efectul factorilor mutageni asupra soiului Diamant, în cultură in vitro, la un tratament de 48 h

Neoformare Plantule Rădăcini Medii

mutagene Concen traţia Varianţa

nr. înălţime (cm) nr.

lungime

(cm)

Observaţii: modificări fenotipice

V1 7 8,5 1 1,2 evoluţie normală, rădăcini bine dezvoltate V2 5 2,5 1 1,1 evoluţie normală M Martor V3 5 3,0 1 1,0 evoluţie normală

V1 6 1,5 1 2,4 rădăcini groase, ramificaţii secundare multe, masă de ţesut, evoluţie uniformă

V2 - - 1 0,3 ramificaţii de la colet a neoplantulelor, evoluţie neuniformă

M1 DES

0,2 ppm

V3 5 0,8 1 2,2 evoluţie neuniformă

V1 4 6,3 5 3,4 fără ramificaţii, plante de coloraţie roşietică

V2 - - - - masă de ţesut , fără neoplantule diferenţiate M2

DES 2,0 ppm

V3 3 1,0 1 2,4 rădăcini groase, nodozităţi, ramificaţii la baza coletului, evoluţie neuniformă

V1 3 7,3 1 4,5 evoluţie interesantă, rădăcini lungi, frunze adevărate, roşietice

V2 - - - - fără evoloţie M3 DMS

0,2 ppm V3 3 0,8 4 2,4 evoluţie lentă, explantele abia se înalţă V1 1 6,0 1 4,5 rădăcini lungi, pubescente V2 - - - - fără evoluţie M4

DMS 2,0 ppm V3 1 0,3 - - rădăcini multe şi ramificate, frunze

adevărate

V1 2 4,0 3 2,5 evoluţie lentǎ, normală, rădăcinǎ dezvoltatǎ

V2 1 2,8 1 1,8 evoluţie lentǎ, neuniformă M5 EMS

1,0 ppm V3 1 1,0 1 1,5 rădăcini groase, evoluţie lentǎ V1 1 3,5 1 2,0 rădăcini alungite, pubescente

V2 1 0,8 1 0,6 evoluţie lentă, fǎrǎ ramificaţie, coloraţie roşiaticǎ M6

EMS 2,0 ppm

V3 1 0,5 1 0,5 fǎrǎ neoplantule diferenţiate

10

Tabelul 23

Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Diamant Overview of the macroscopic changes observed in Diamant cultivar

VARIANTELE VARIANTS

Dietilsulfat/Diethyl sulphate (DES)

Dimetilsulfat/Dimethyl sulphate (DMS)

Etilmetansulfonat/Ethyl methanesulfonate (EMS)

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Modificări macroscopice Macroscopic

changes V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3

La nivel radicular Roots level + - - + - - - - - + - - + - - + - -

La nivel foliar Leaves level - - - - - + - - - - - + - + - - + -

La nivel tulpini ramificate Branched stems level

- - + - - + + - - + - + - - + - - -

Coloraţii roşietice Reddish color + - - + + - - - - - - - - - - - + -

Anomalii, necroze Abnormalities, necrosis

- - - - - - - + + - + - - - - - - +

Tabelul 24

Efectul factorilor mutageni asupra soiului Perla, în cultură in vitro Neoformare

Plantule Rădăcini Medii mutagene Concentraţia Varianţa

nr. înălţime (cm) nr. lungime

(cm)


V1 5 6,0 3 2,4 evoluţie normală, rădăcini normale V2 5 4,0 3 2,0 evoluţie normală M Martor V3 4 4,0 3 2,0 evoluţie normală V1 3 3,2 2 2,1 evoluţie neuniformă rădăcini torsionate V2 3 2,3 - - colet ramificat, coloraţie roşietică M1

DES 0,2 ppm V3 2 2,0 1 1,8 masă de ţesut fără diferenţieri, radicele

contorsionate V1 2 3,0 1 1,8 rădăcini groase, evoluţie neuniformă V2 - - - - masă de ţesut nediferenţiat M2

DES 2,0 ppm V3 1 3,0 2 1,5 evoluţie lentă, cu tendinţe de nediferenţiere

V1 1 3,0 1 2,2 rădăcini lungi, pubescente V2 1 2,5 1 2,0 ramificaţii secundare, rădăcini torsionate M3

DMS 0,2 ppm V3 1 2,0 1 2,0 rădăcini groase, început de nodozităţi

V1 1 2,0 1 1,0 evoluţie lentă V2 1 2,5 - - masă de ţesut, fără neoplantule diferenţiate M4

DMS 2,0 ppm V3 1 2,5 1 1,2 rădăcini lungi, pubescente

V1 1 1,0 1 1,0 evoluţie lentǎ, început de ramificare V2 1 1,0 1 1,0 rădăcini ramificate, apariţie frunze M5

EMS 1,0 ppm V3 - - - 0,8 fără evoluţie

V1 - - 1 0,8 calus, radicele V2 1 0,6 1 0,5 evoluţie lentă M6

EMS 2,0 ppm V3 1 0,5 1 0,5 evoluţie lentă, ramificaţii roşietice

11

Tabelul 25

Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Perla Overview of the macroscopic changes observed in Perla cultivar

VARIANTELE VARIANTS



Etilmetansulfonat/ Ethyl methanesulfonate (EMS)

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Modificări macroscopice

Macroscopic changes

V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 La nivel radicular Roots level + - - + - + + - - + + + - + - + - -

La nivel foliar Leaves level - - - - - - - - - - - - + + - - + -


- + - - - - - - - - - - + - - - - -

Coloraţii roşietice Reddish color - - - - - - - - - - - - - - - - - +


- + - - - - - - - - - - - - - - + +

Tabelul 26 Efectul factorilor mutageni asupra soiului Agat, în cultură in vitro,

la un tratament de 48 h Neoformare

Plantule Rădăcini Medii mutagene

Concentra ţia Varianţa

nr. înălţime (cm) nr. lungime

(cm)


V1 4 6,0 1 1,2 evoluţie normală, rădăcini dezvoltate V2 3 2,0 1 1,1 evoluţie normală M Martor V3 3 2,5 1 1,0 evoluţie normală V1 4 1,0 1 2,4 ramificaţii secundare, rădăcini groase torsionate V2 - - 1 0,3 evoluţie neuniformă M1

DES 0,2 ppm V3 2 0,8 1 2,0 ramificare la colet a neoplantulelor, coloraţie

neuniformă V1 2 11,0 5 3,5 fără ramificaţii, plante cu coloraţie roşietică V2 - - - - masă de ţesut, fără neoplantule diferenţiate M2

DES 2,0 ppm V3 1 1,0 2 2,4 rădăcini foarte groase, nodozităţi, ramificaţii la

baza coletului, evoluţie neuniformă

V1 3 2,0 1 4,1 evoluţie curioasă, rădăcini lungi, frunze adevărate, roşietice

V2 - - - - fără evoluţie M3 DMS

0,2 ppm V3 3 0,5 - - evoluţie lentă, explantele abia se înalţă V1 3 7,0 1 4,5 rădăcini lungi, pubescente V2 - - - - fără evoluţie M4

DMS 2,0 ppm V3 1 0,8 6 2,0 multe rădăcini ramificate, frunze adevărate

V1 5 3,0 1 2.4 evoluţie normalǎ, rǎdǎcini dezvolatate V2 3 2.5 1 2.0 evoluţie normalǎ, rǎdǎcini groase M5

EMS 1,0 ppm V3 2 2.0 1 1.5 rǎdǎcini torsionate

V1 3 2.0 - - evoluţie neuniformǎ V2 3 0.8 1 1.0 evoluţie lentǎ, rǎdǎcini ramificate M6

EMS 2,0 ppm V3 1 0.6 1 1.7 frunze adevǎrate, roşietice

12

Tabelul 27

Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Agat Overview of the macroscopic changes observed in Agat cultivar

VARIANTELE VARIANTS



Etilmetansulfonat/ Ethyl methanesulfonate (EMS)

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Modificări macroscopice

Macroscopic changes

V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 La nivel radicular Roots level

+ - - + + - + - + + - - - + + - - +

La nivel foliar Leaves level

- - - - - - - - - + - - - - - - - +


- - + - - + + - - - - - - - - + + -

Coloraţii roşietice Reddish color

+ - - - - - - - - - - - - - + - - +


+ - - + + - + - + + - - + + - - - -

Modificările macroscopice, somatice, sunt redate în funcţie de efectul substanţelor mutagene (notat cu + sau -).

Legenda :

M = MB – martor (după Murashige-Skoog 1962) V1 =MS1/2 (după Murashige-Skoog 1962) M1= MB+DES 0,2ppm V2 =MB+BA-0,5 mg/l+ANA-0,5 mg/l M2= MB+DES 2,0 ppm V3 = MB+Z-0,5 mg/l+AIB-0,5 mg/ M3=MB+DMS 0,2 ppm M4=MB+DMS 2,0 ppm BA = benziladenină M5=MB+EMS 1,0 ppm Z = zeatină M6=MB+EMS 2,0 ppm AIB = acid indolil butiric

ANA = acid alfa-naftil-acetic S-a constatat că agenţii mutageni influenţează puternic în prima generaţie (M0)

unele caractere cantitative. Anomaliile morfologice din M0 afectează toate organele, dar

cel mai frecvent se întâlnesc la frunze şi tulpină. Exteriorizarea fenotipică a acestora

îmbracă forme foarte diferite în funcţie de genotip şi de mărimea concentraţiei mutagenului

administrat. Importanţa ce se acordă acestor anomalii derivă din faptul că ele servesc, în

unele cazuri, la aplicarea selecţiei încă din M0, cu scopul de a obţine o frecvenţă mai mare

de mutaţii în M1. Aspectul general al neoplantulelor poate fi caracterizat prin apariţia

sporadică a unor indivizi insuficient dezvoltaţi, debili, cu frunze clorotice, tulpiniţe

contorsionate ş.a. (vezi tabelele 22 - 27).

În condiţiile desfǎşurǎrii experimentelor şi a prezentǎrii tezei de doctorat în trei ani,

intercalarea unei generaţii gametice în experienţele noastre este greu de făcut; evidenţierea

posibilelor mutante, s-a realizat în generaţia M0-1 (poate impropriu notificat) bazându-ne pe

13

considerentul că mutantele apar în celulele somatice şi se pot exterioriza chiar în anul

tratamentului. Au fost prelevate meristeme de la plantele M0 obţinute în culturile in vitro,

considerate ca ascendenţi ai generaţie M0-1 obţinută prin multiplicare vegetativă in vitro.

În aceste condiţii, s-a constatat că generaţia M0-1 a fost identică, sub aspect

comportamental cu generaţia M0, sub aspectul numărului de propagule regenerate şi a

efectelor negative imprimate de mutagenul factorii mutageni (vezi tabelele 28 ,29). Tabelul 28

Procentul de plante similar fenotipice şi plante presupuse mutante la soia The percentage of similar phenotipical plants and presumed mutant plants in soybean

Soiul DIAMANT cultivar

Varianta Variant

% de plante similar fenotipice % similar phenotipical plants

% de plante presupuse mutante

% presumed mutant plants

Bonificarea Bonification

Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 97.0 3.0 × DES2 (2,0 ppm) 88.0 12.0 × DMS1 (0,2 ppm) 73.0 27.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 60.0 40.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 41.0 59.0 ××× EMS2 (2,0 ppm) 23.0 77.0 ×××

Soiul PERLA cultivar

Varianta Variant





Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 93.0 7.0 × DES2 (2,0 ppm) 81.0 19.0 × DMS1 (0,2 ppm) 68.0 32.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 60.0 40.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 38.0 42.0 ×× EMS2 (2,0 ppm) 21.0 79.0 ×××

Soiul AGAT cultivar

Varianta Variant





Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 90.0 10. × DES2 (2,0 ppm) 83.0 17.0 × DMS1 (0,2 ppm) 73.0 23.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 61.0 39.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 26.0 74.0 ××× EMS2 (2,0 ppm) 16.0 84.0 ×××

14

Legendă: – fără modificări/no changes; × uşoare modificări fenotipice sub 20%/under 20% phenotipical

changes ; ××modificări până la 25%/ changes to 25% ; ××× evidente modificări peste 50%/ obvious changes over 50%

Tabelul 29 Numărul de propagule regenerate în M1 Propagule number regenerated in M1

Soiul DIAMANT cultivar

Varianta Variant x ±s x s% ±d %

Semnificaţia diferenţei

Significance Martor/Control 5,4 0,86 8,3 - 100,0 -

DES1 (0,2 ppm) 5,2 1,02 7,6 -0,2 96,3

DES2 (2,0 ppm) 4,8 1,36 7,3 -0,6 88,9 0

DMS1 (0,2 ppm) 4,3 0,96 8,9 -1,1 79,6 0

DMS2 (2,0 ppm) 3,8 0,88 9,3 -1,6 70,4 00

EMS1 (1,0 ppm) 3,2 0,93 9,0 -2,2 59,3 000

EMS2 (2,0 ppm) 2,6 0,95 8,7 -2,8 48,1 000

DL5%= 0,60 ; DL1% = 1,4 ; DL0,1% = 2,2

Soiul PERLA cultivar




DES1 (0,2 ppm) 4,8 0,76 7,5 - 100,0 -

DES2 (2,0 ppm) 4,5 0,90 7,3 -0,3 93,8 -

DMS1 (0,2 ppm) 4,2 0,93 8,2 -0,6 87,5 0

DMS2 (2,0 ppm) 4,2 0,76 7,9 -0,6 87,5 0

EMS1 (1,0 ppm) 4,0 0,85 9,3 -0,8 83,3 0

EMS2 (2,0 ppm) 3,8 0,92 9,0 -1,0 79,2 0

DL5%= 0,60 ; DL1% = 1,5 ; DL0,1% = 2,8

Soiul AGAT cultivar




DES1 (0,2 ppm) 4,8 1,13 7,3 -0,4 92,3

DES2 (2,0 ppm) 4,3 1,00 7,0 -0,9 82,7 0

DMS1 (0,2 ppm) 4,3 0,98 8,6 -0,9 82,7 0

DMS2 (2,0 ppm) 4,0 0,83 8,2 -1,2 76,9 0

EMS1 (1,0 ppm) 3,6 0,76 9,0 -1,6 69,2 00

EMS2 (2,0 ppm) 2,8 0,93 9,6 -2,4 53,8 000

DL5%= 0,80 ; DL1% = 1,4 ; DL0,1% = 2,4

15

Variabilitatea fenotipică şi diferenţierea morfologică indusă de factorii mutageni,

poate fi explicată şi prin evidenţierea la nivel cromozomal a efectelor primare ale

tratamentelor aplicate, ca urmare a producerii diferitelor modificări structurale, în

principal, în anafaza mitozei. Genotipurile analizate, Diamant, Perla şi Agat, au etalat în

principal două tipuri de aberaţii cromozomale în anafaza mitozei, anafază cu cromozomi

retardaţi şi anafaza cu punţi (vezi tabelul 30). Cercetările au pus în evidenţă specificitatea

fiecărui genotip în declaşarea aberaţiilor cromozomale.

În ceea ce priveşte efectul factorului mutagen DES, acesta realizează un procent

inferior de aberaţii cromozomale, comparativ cu ambele concentraţii ale mutagenilor DMS

şi EMS.

Aberaţiile cromozomale menţionate, evidenţiază, credem, fără echivoc, existenţa

unor fenomene mutaţionale la soia, premiză pentru crearea de noi variabilităţi genetice.

Relaţia dintre tratamentele mutagene in vitro şi frecvenţa aberaţiilor cromozomale

s-au raportat la coeficientul de regresie şi evidenţierea corelaţiilor existente dintre apariţia

celulelor aberante şi dozele de mutageni (vezi fig. 1- 3). Coeficienţii de regresie şi cei de

corelaţie sunt semnificativi, demonstrând legǎtura cauzalǎ strânsǎ dintre tratamentul cu o

anumitǎ concentraţie de mutagen utilizat şi procentul celulelor aberante obţinute.

2 2,0 3,0

Doza (ppm)

Fig .1Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Diamant sub influenţa EMS

The regression of chromosomal aberrations frequency in Diamant cultivar under the influence of EMS

16

0,2 2,0 3,0 Doza (ppm)

Fig .2 Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Perla sub influenţa EMS The regression of chromosomal aberrations frequency in Perla

cultivar under the influence of EMS

0,2 2,0 3,0

Doza (ppm)

Fig .3 Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Agat sub influenţa EMS The regression of chromosomal aberrations frequency in Agat cultivar

under the influence of EMS

Tabelul 30

Frecvenţa aberaţiilor cromozomale la soiurile de soia Diamant, Perla şi Agat în urma tratamentului cu mutageni chimici (DES, DMS, EMS)

The frequency of chromosomal aberrations in soybean Diamant , Perla and Agat cultivasr, following treatment with chemical mutagens (DES, DMS, EMS)

Celule cu aberaţii din 100 de celule observate Cells with aberrations in 100 cells observed

Total Total

Cu fragmente With fragments

Cu punţi şi fragmente With bridges and fragments

Cultivar Varianta Variant (ppm)

x s x % x s x % x s x % Mt V0 0 - - 0 0 DES V1=0,1 4,0 0,08 4,00 - - - 1,0 0,08 1,00 DES V2=0,2 8,0 0,40 8,00 2,0 0,16 2,00 1,0 0,16 2,00 DES V3=2,0 14,0 1,12 14,00 5,0 1,00 5,00 3,0 0,27 3,00 DES V4=3,0 16,0 1,18 16,00 5,0 1,25 5,00 3,0 0,39 3,00 Mt V0 0 - - - DMS V1=0,1 3,0 0,01 3,00 1,0 0,80 1,00 1,0 0,03 1,00 DMS V2=0,2 7,0 0,08 7,00 1,0 0,90 1,00 - - DMS V3=2,0 15,0 1,14 15,00 6,0 1,12 6,00 2,0 0,82 2,00 DMS V4=3,0 26,0 1,16 18,00 6,0 1,35 6,00 4,0 0,93 4,00 Mt V0 0 - - EMS V1=0,1 2,0 0,3 2,00 - - - - - - EMS V2=0,2 3,0 0,6 3,00 1,0 1,00 1,00 - - - EMS V3=2,0 42,0 1,67 42,00 21,0 1,67 21,00 5,0 1,10 5,00

DI

AM

AN

T

EMS V4=3,0 64,0 1,96 64,00 13,0 2,01 13,00 7,0 1,32 7,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DES V1=0,1 0 - - - - - - - - DES V2=0,2 3,0 0,80 3,00 1,0 0,80 1,00 - - - DES V3=2,0 8,0 1,10 8,00 3,0 1,10 3,00 - - - DES V4=3,0 12,0 1,80 12,00 5,0 1,13 5,00 - - - Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DMS V1=0,1 3,0 0,63 3,00 1,0 0,75 1,00 1,0 0,68 1,00 DMS V2=0,2 4,0 0,86 4,00 1,0 0,80 1,00 - - - DMS V3=2,0 12,0 1,12 12,00 3,0 1,83 3,00 2,0 1,23 2,00 DMS V4=3,0 16,0 1,36 16,00 6,0 2,01 6,00 3,0 1,76 3,00 Mt V0 0 - 0 0 EMS V1=0,1 3,0 0,93 3,00 1,0 0,63 1,00 - - - EMS V2=0,2 6,0 2,13 6,00 2,0 1,16 2,00 1,0 0,87 1,00 EMS V3=2,0 23,0 3,26 23,00 7,0 2,36 7,00 4,0 2,16 4,00

PE

RL

A

EMS V4=3,0 41,0 3,84 41,00 13,0 3,67 13,00 7,0 2,86 7,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DES V1=0,1 5,0 1,84 5,0 2,0 1,05 2,00 1,0 0,83 1,00 DES V2=0,2 8,0 1,97 8,0 2,0 1,16 2,00 - - - DES V3=2,0 16,0 3,64 16,0 5,0 2,10 5,00 2,0 1,11 2,00 DES V4=3,0 19,0 3,83 19,0 9,0 2,46 9,00 - - - Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DMS V1=0,1 3,0 1,12 3,0 - - - - - - DMS V2=0,2 9,0 2,13 9,0 2,0 1,12 2,00 2,0 1,07 2,00 DMS V3=2,0 21,0 3,67 21,0 10,0 3,16 10,00 2,0 0,86 2,00 DMS V4=3,0 30,0 4,12 30,0 7,0 2,13 7,00 3,0 1,83 3,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - EMS V1=0,1 4,0 1,32 4,0 1,0 0,68 1,00 - - - EMS V2=0,2 8,0 2,16 8,0 2,0 1,17 2,00 2,0 1,06 2,00 EMS V3=2,0 46,0 4,83 46,0 19,0 3,76 19,00 7,0 2,76 7,00

AG

AT

EMS V4=3,0 76,0 6,56 76,0 15,0 3,27 15,00 12,0 3,12 12,00

Pentru a întări cele susţinute au fost efectuate cercetări în direcţia depistării unor

linii celulare de soia, posibile mutante, ce să manifeste toleranţă la concentraţiile ridicate

de ioni de aluminiu (Al+). În vederea celor menţionate au fost utilizate calusuri embriogene

şi neembriogene de soia provenite de la un material biologic netratat şi tratat cu agenţi

mutageni chimici (DMS şi EMS). S-a constatat că mediul acid determinat de ionii de

aluminiu influenţează negativ dezvoltarea calusului prin diminuarea creşterii şi apariţia pe

zone mai mult sau mai puţin extinse a necrozelor.

Menţionǎm cǎ materialul biologic utilizat la calusare a provenit de la plantule ce au

manifestat modificǎri morfocitologice în urma tratamentului cu mutagenii DMS şi EMS,

posibil mutante.

Materialul calusat a fost diferenţiat pe mediul de culturǎ asupra cǎruia s-a acţionat

cu concentraţii diferite de ioni de aluminiu pentru a decela capacitatea lor de rezistenţǎ şi

diferenţierea pe baza analizei RAPD a variabilitǎţii genetice, ca rǎspuns la tratamentele cu

agenţii mutageni.

Din materialul presupus mutant s-au diferenţiat 10 linii calusale (tabelul 32) ce au

fost supuse efectului toxic al ionilor de aluminiu. Tabelul 32

Linii celulare supuse testului de rezistenţǎ la Al+ Cell lines under test for resistance to Al +

Varianta Variant

Provenienţa liniei calusale The origin of callus line

Varianta Variant

Provenienţa liniei calusale The origin of callus line

LC1DMS LC2DMS LC3DMS LC4DMS LC5DMS

Diamant Perla Perla Agat Agat

LC1EMS LC2EMS LC3EMS LC4EMS LC5EMS LC6EMS LC7EMS LC8EMS LC9EMS LC10EMS

Diamant Diamant Perla Agat Agat Agat Agat Agat Agat Agat

Analizând rǎspunsul culturilor calusale (tabelele 33 şi 34) se evidenţiazǎ o reacţie

pozitivǎ, de toleranţǎ la ionii de aluminiu la ambele concentraţii de ioni, de 0,5 respectiv

1,0%, la nivelul liniilor LC2DMS, LC1EMS, LC2DMS, LC6EMS, LC7EMS şi LC8EMS.

3

Tabelul 33 Creşterea calusului la genotipurile de soia pe mediul de control şi cu diferite concentraţii Al+

The soybean genotypes callus development in the control medium and with different concentrations of Al+

Concentraţia de Al+

Al+ concentration Martor (fără Al+) Control (without Al+)

0,5% 1,0% Soiul Genotype

Număr calusuri

No callus Suprafaţa calusului Callus area

(mm2) %

Suprafaţa calusului Callus area

(mm2) %

Suprafaţa calusului Callus area

(mm2) %

Diamant 95 4136 100 2100 53,2 798 19,3

Perla 95 3210 100 1396 43,5 659 17,4

Agat 98 3024 100 942 23,4 130 4,3

Tabelul 34

Dinamica creşterii calusului la genotipurile de soia provenite de la plantule probabil mutante pe medii de cultură cu concentraţii diferite de Al+

Dynamic of callus growth in genotypes of soybean probably from mutant seedlings on culture medium with different concentrations of Al+

Concentraţia în Al+

Al+ concentration Martor (0) fără Al+

Control no Al+ 0,5% 1,0% Varianta Variant

Provenienţa Origin

Nr. calusuri Callus number mm2 % mm2 % mm2 %

LC1DMS Diamant 60 3310 100,0 3330 100,6 3290 99,4

LC2DMS Perla 60 3460 100,0 3480 100,6 3390 98,0

LC3DMS Perla 60 3432 100,0 3396 99,0 3000 87,4

LC4DMS Agat 60 3120 100,0 2990 95,8 3120 100,0

LC5DMS Agat 60 2990 100,0 2990 100,0 3100 103,7

LC1EMS Diamant 60 3336 100,0 3300 98,9 3225 96,7

LC2EMS Diamant 60 3415 100,0 3384 99,1 3300 96,6

LC3EMS Perla 60 3390 100,0 3380 99,7 3250 95,9

LC4EMS Agat 60 2876 100,0 3000 104,6 2915 101,4

LC5EMS Agat 60 3030 100,0 3040 100,3 3000 99,0

LC6EMS Agat 60 3114 100,0 3100 99,6 2998 96,3

LC7EMS Agat 60 2956 100,0 3000 101,5 2889 97,7

LC8EMS Agat 60 2970 100,0 2950 99,3 2950 99,3

LC9EMS Agat 60 2868 100,0 2900 100,4 2796 97,5

LC10EMS Agat 60 3013 100,0 2987 99,1 3000 99,6

4

Studiul efectuat utilizând embrioni somatici proveniţi de la plante considerate

potenţial mutante a reconfirmat supoziţia anterioarǎ privind toleranţa la ionii de aluminiu

(tabelul 35). Tabelul 35

Efectul mediului cu ioni de aluminiu 1,0% asupra embrionilor la liniile posibil mutante de soia The effect of medium with 1,0% aluminium ions on embryos from probalbly soybean mutants

Embrioni somatici /Somatic embryos

în culturǎ purǎ/pure culture Tolerante /tolerant Varianta Variant nr. % nr. %

LC1DMS 2,0% 75 100,0 69 92,0

LC2DMS 2,0% 60 100,0 60 100,

LC3DMS 2,0% 60 100,0 58 96,7

LC4DMS 2,0% 75 100,0 70 93,3

LC5DMS 2,0% 90 100,0 88 97,8

LC1EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0

LC2EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0

LC3EMS 2,0% 75 100,0 72 96,0

LC4EMS 2,0% 75 100,0 70 93,3

LC5EMS 2,0% 75 100,0 68 90,7

LC6EMS 2,0% 75 100,0 75 100,0

LC7EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0

LC8EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0

LC9EMS 2,0% 75 100,0 79 97,3

LC10EMS 2,0% 90 100,0 88 97,8

x 75.8 100,0 74,7 96,5

Sub aspectul reacţiei genotipurilor faţă de ionii de aluminiu, soiul Agat s-a dovedit

mai tolerant, comparativ cu soiurile Diamant şi Perla.

Menţionăm că plantele rezultate din liniile celulare ce au manifestat o oarecare

toleranţă la ionii de aluminiu nu au fost testate in vivo, informaţiile obţinute rezumându-se

la rezistenţa la nivel celular faţă de stresul acid. Liniile celulare tolerante evidenţiază o

variabilitate câştigată sub aspectul toleranţei la ionii de aluminiu, iar regenerarea de plante

din aceste linii poate constitui un material de studiu interesant pentru elucidarea

mecanismului genetic şi molecular a toleranţei la ionii de aluminiu şi selecţia unor

potenţiale genotipuri adaptabile culturii pe solurile acide.

5

Tehnicile markerilor moleculari, cum ar fi analiza RAPD au fost utilizate pentru a

evidenţia efectul factorilor mutageni chimici în culturile in vitro, respectiv determinarea

polimorfismului ADN la soia. Izolarea ADN şi amplificarea PCR au evidenţiat un profil

electroforetic, constatându-se cǎ primerii OP-0-01 şi OP-0-05 au generat fragmente

polimorfice .

Schimbǎrile în ADN cauzate de factorii mutageni au avut ca rezultat detectarea

unei variabilitǎţi genetice cu ajutorul analizei RAPD. Au fost detectate douǎ forme

polimorfe din 124 de fragmente ce indicǎ un nivel ridicat mutagen.

6

B I B L I O G R A F I E S E L E C T I VĂ

ARDELEAN, M., 1979, Cercetǎri privind transmiterea ereditarǎ a caracterului “pǎstǎi terminale” şi posibilitǎţile de utilizare a acestuia în ameliorarea geneticǎ a soiei, Tezǎ de doctorat, Institutul Agronomic Cluj-Napoca

BARAKAT, H., 2004, Genetic Fingerprinting and Relationships of Six Soybeans (Glycine max L.) Cultivars Based on Protein and DNA Polymorfism, Int. J. of Agric.&Biol., vol. 6, No. 5

BARANEK, M., M. KLADEC, JANA RADDOVA, M. VACHUN, M. PIDRA, 2002, Evaluation of Genetic Diversity in 19 Glycine max (L.) Merr. Accesions Included in the Czech National Collection of Soybean Genotypes, Czech J. Genet. Plant Breed., 38(2)

CARROLL, B.J., D.L. McNEIL, P.M. GRESSHOFF, 1986, Mutagenesis of soybean (Glycine max (L.) Merr.) and the isolation of non-nodulating mutants, Plant Sci., 47

CIALÂCU, M., 1991, Parametrii care influenţeazǎ dezvoltarea in vitro a embrionilor de soia, Buletinul ARCTV, vol. I

CRISTEA, V., C. DELIU, 1993, Efectul fitohormonilor şi a zaharozei asupra inducerii şi dezvoltării calusurilor de soia, În: Lucrările celui de-al V-lea Simpozion Naţional de Culturi de Celule şi Ţesuturi Vegetale, Bucureşti (ed. Anghel I., Brezeanu A., Cachiţǎ C.D.)

GAMBORG, O.L., T. MURASHIGE, A. THORPE, K. VASIL, 1976, Plant tissue culture media, In vitro 12

HOFMANN, N.E., R. RAJA, R.L. NELSON, S.S. KORBAN, 2004, Mutagenesis of embryogenic cultures of soybean and detecting polymorphisms using RAPD markers, Biologia Plantarum 48(2)

KRAUSSE, G.W., 1986, Mutation research and mutation breeding in soybean in the German Democratic Republic, Eurosoya, 4

MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, MARIA ZǍPÂRŢAN, 2008, Obtaining the genetical variability and improvement trough mutagenosis in vitro on soybean (Glicine max L.), Bul. USAMV Cluj-Napoca, vol. 65 (1)

MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, 2008, Determinating the lethal dose 50 DL at soja (Soja hispida L.) under the influence of the chemical mutagene inducted in vitro, Bul. USAMV Cluj-Napoca, vol. 65 (1)

7

MARELE, DANIELA, 2008, Determining the effect of treatment with chemical mutagen agents on soybean, in culture in vitro, Analele Universitǎţii din Craiova, Agriculturǎ, vol. XXXVIII/B, Ed. Universitaria Craiova

MARELE, DANIELA, 2008, Determining the best dose of chemical agents depending on the concentration of mutagen solution in the process of soybean amelioration, Analele Universitǎţii din Craiova, Agriculturǎ, vol. XXXVIII/B, Ed. Universitaria Craiova

MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, 2009, Modificǎrile somatice apǎrute la soia, ca efect al agenţilor mutageni chimici, Bul. USAMV Cluj-Napoca, nr. 66 (1-2)

MURASHIGE, T., 1974, Plant propagation through tissue culture, Ann. Rev. Plant. Physiol., 25

MUREŞANU, E., LEONTINA CǍTINAŞ, A. CIORLǍUŞ, D. ŞERBU, LIDIA TǍNǍSESCU, 1989, Soiul precoce de soia “Diamant”, Cereale şi plante tehnice, vol. XLI, 6

MUREŞANU, E., LEONTINA CǍTINAŞ, V. LEGMAN, ADRIANA SǍMǍRTINEAN, I. TRIFU, 2000, “Agat” un nou soi timpuriu de soia cu inserţie înaltǎ a pǎstǎilor bazale, Analele ICCPT, vol. LXVII

NICOLAE, I., 1978, Mutageneza experimentală, Ed. Ceres, Bucureşti

RAICU, P., ELENA BADEA, 1986, Cultura de celule şi biotehnologiile moderne, Ed. Ştiinţificǎ şi Enciclopedicǎ, Bucureşti

SAVATTI, M., G. NEDELEA, M. ARDELEAN, 2004, Tratat de ameliorarea plantelor, Ed. Marineasa, Timişoara

SOARE, T., 1995, Studiul determinismului genetic al caracterului de prolificitate la soia, Tezǎ de doctorat, Universitatea de Ştiinţe Agricole Bucureşti

WILCOX, J.R., J.F. CAVINS, N.C. NIELSEN, 1984, Genetic alteration of soybean oil composition by a chemical mutagen, J. amer. Oil Chem. Soc. 61

ZĂPÂRŢAN, MARIA, M. SAVATTI, ANDRA IENCIU, 2003, Induction of in vitro multiplication to “Dacia” cultivar of Trifolium repens by treatment of dietylsulfat and dimetylsulfat, An. Univ. Oradea,, vol. IX

8

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI

MEDICINǍ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALǍ

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Ing. DANIELA CAMELIA MARELE

Influence of in vitro mutagenic chemical agents to obtain useful mutations

for breeding process in soybean (Glycine max (L.) Merril)

Abstract of PhD Thesis

Conducător ştiinţific

Prof. univ. dr. SAVATTI MIRCEA

CLUJ-NAPOCA 2009

9

Influence of in vitro mutagenic chemical agents to obtain useful mutations for

breeding process in soybean (Glycine max (L.) Merril)

Abstract of PhD Thesis

Most of the research that has been carried out in the field of vegetal vitro-cultures

over a century has revealed essential aspects related to the regeneration, the growth, the

organogenesis, the somatic embryogenesis and other phenomena manifested in tissue

structures or cell types, in relation with the composition of the culture medium and the eco-

physiological conditions in the culture containers or in the growth chambers. However,

there are still numerous aspects that have remained unknown; some refer to the factors

involved in morphogenesis (especially at cell and molecular level), some others refer to the

transmission of the newly acquired genetic information.

In vitro cultures have found, in a relatively short time, several practical applications

in breeding a large number of crop species, including soybean, regarding the multiplication

of the valuable genotypes, the propagation of virus-free stocks, the preservation of

genetical resources and so on. Moreover, the genetical variation showed by in vitro

regenerated plants (somaclonal variability), as well as the one obtained through induced

mutagenesis, could and are used to obtain valuable genotypes.

Starting from these statements, we tried, besides the summing up of the pros and

cons concerning the multiplication and the creation of in vitro genetic mutations in

soybean, to elaborate our own views within the PhD thesis entitled: Influence of in vitro

mutagenic chemical agents to obtain useful mutations for breeding process in soybean

(Glycine max (L.) Merril).

In the present PhD thesis we tried to clarify several aspects regarding the in vitro

regeneration and multiplication possibilities of soybean, the creation of genetic variability

and the selection of soybean mutants, under in vitro conditions.

In order to achieve all these, our approach refers to several major aspects which can point

out the following:

- Optimizing the protocol for direct organogenesis of soybean cultivars;

- Involvement of several cytokinines in the in vitro soybean morphogenesis;

10

- The capacity of in vitro regeneration of several types of soybean explants;

- The in vitro reaction of soybean genotypes, in meristem and callus cultures;

- Inducing in vitro mutations in soybean by using chemical mutagen agents (DES,

DMS and EMS);

- Analyzing the relationship between the mutagenic treatment and chromosomal

abnormalities;

- Using in vitro selection in order to point out several genotypes of soybean that

are tolerant to aluminum ions (Al+);

- Detecting polymorphism in soybean mutants by using RAPD markers.

During the elaboration of the PhD thesis we tried to elucidate the aspects taken into

study, correlating our own data with the multiple suggestions offered by the scientific

literature.

As soybean is an allogamous plant with possibilities of vegetative multiplication,

the methodology we applied offers the possibility of in vitro determination of the

biological forms of soybean genotype multiplication, and also of adaptation of the

neoplantlets to the mutagenic effect of the chemical agents

The creation of genetic variability by using mutagenic factors capable to amplify

the frequency of in vitro genetic mutations, in the case of soybean, is not much mentioned

in the scientific literature.

In vitro regeneration and organogenesis at some species of plants is an essential

condition to accomplish vegetative multiplication. The morphogenesis and organogenesis

processes are achieved under the influence of the endogenous and exogenous factors. The

endogenous content of hormones, their type, and also the enzymatic equipment are factors

with an important role in controlling the regeneration process. The nature of the

phytohormones used, and also their concentration, the differences of the hormonal

balances have an important role in the organogenesis processes.

The biological material used was represented by three native soybean genotypes

Diamant, Perla and Agat, created by SCDA Turda.

The research was carried out between 2006-2008, in the Biotechnology Laboratory

of the University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine of Cluj-Napoca.

11

In the first phase of the research we were interested in optimizing the protocol

regarding the implication of several cytokinins in the in vitro morphogenesis of soybean, as

well as in the regeneration capacity of several explants types. Based on the observations

we made at this stage, we passed on to the second phase of our studies, regarding the

creation of genetic variability in soybean by using chemical mutagenic factors and the use

of in vitro selection in order to identify the lines tolerant to aluminum ions (Al+).

For meristem prelevation and their inoculation on the culture media in order to

initiate the corresponding in vitro cultures, as well as for checking their effectiveness, the

following three media were used: the basic one, Murashige-Skoog (MS), Gamborg (B5)

and Lindsmaier-Skoog (LS), ( table 6.1).

In order to induce in vitro mutations, we used a protocol similar to the one used for

in vitro multiplications, only adding three chemical mutagenic agents in the culture

medium, diethyl sulphate (DES) and dimethyl sulphate (DMS) with two concentrations, of

0.5 and 2.0 ppm , and ethyl methanesulfonate (EMS) with three concentrations (0.3; 1.0;

2.0), (see table 5.2.). The treatment period was conditioned by the capacity of absorbtion of

the mutagenic agent by the biological treated material. After 24 hours the biological

material was put on the fresh culture medium, identical to the one of the control variant

(mt).

The in vitro cultures found several practical applications in breeding several crop

species, among which the multiplication of valuable genotypes,the propagation of viruse-

free stocks, the preservation of genetical resources, the creation of genetic variability etc.

Starting from the conditions previously mentioned, before approaching the aspects

of creating genetic variability in soybean through in vitro mutanogenesis, we first tested

the behavior of soybean cultivars under in vitro culture conditions.

Optimizing the protocol for direct organogenesis of the soybean meristems aimed

at highlighting the behavior of the genotypes, the source of explant, the culture media (MS,

B5 and L2) and the combination of growth regulators, in five variants (see table 5.1.). We

used vegetative organs, stem and meristems, disinfected by sinking into ethanol 70% (2’)

and sodium hypochlorite 2% (7’) with a drop of Tween 20/100 ml.

The observations made after 15, 30 and 60 days of culture pointed out the fact that on

the culture medium B5, supplemented with ANA as a source of auxine, the callus was

12

formed (variant I). All the other combinations of medium and growth regulators allowed for

a normal growth of the in vitro plants with no callus formation

There was pointed out that the organogenesis processes in soybean are different

depending on the source of the explant, the culture medium and the combination of growth

regulators. This fact is reflected by the difference between the Diamant and Perla cultivars

on the one hand, and the Agat cultivar on the other hand (see table 6.2).

By comparing the culture media MS and L2, with the same level of growth

regulators, we could notice that, from the point of view of neoplantlet formation, there is a

slight superiority of the L2 medium over the MS medium,but with insignificant differences

at the level of the observed parameters. This which draws to the conclusion that the use of

the two culture media is good for the in vitro multiplication of soybean (see tables 6.3,

6.4).

In order to complete several aspects of the previous study we tried to look into the

role of the two cytokinins, benzyl adenine (BA) and 2-izopentyl-adenine (Pip), in the

evolution of soybean plantlets obtained in vitro from apex, node, floral bud and young

pods, under the aspect of regeneration and their organogenesis (see tables 6.5, 6.6). It was

observed that the apex is capable to regenerate plants completely formed, with roots. As a

comparison, the node and the floral bud formed less neoplantlets (see table 6.7.). The

phyto-physiological effects of the cytokinins can be summed up, depending on the

concentration and their type, as facilitating the formation of buds and stems (caulogenesis),

being antagonistic, as a rule, to root formation.

We were interested in the in vitro regenerative capacity of several soybean

cultivars, depending on the explants donor, their nature and the culture medium. This

aspect was analyzed on four abbreviated culture media (T1 and T4).On T1, the explants

prelevated from nodes gave a 92-95% regeneration percentage, forming 1-2 neoplantlets

out of each node, with an initiation of the root system. Unlike the T4 medium, the number

of plants on node is lower, but with a more powerful root formation process (see table 6.7).

It was observed that the evolution of apexes was better from the point of view of

multiplication, rather than from the point of view of the nodes or the floral bud, but with

lower viability. As regards regeneration, number of plantlets and root formation, the best

results were obtained with explants originating from young pods.

13

Concluding the things mentioned above, it can be considered that there is a strong

connection between the culture medium and the contribution of the growth regulators on the

one hand, and the organogenesis and root formation processes on the other, while the

influence of the donor organs is less obvious. On the opposite, in the case of the apex only,

there can be noticed an influence upon the in vitro root formation process.

As mentioned before, the initiation of in vitro tissue cultures requires the formation

of a base culture medium with a certain mineral formula, which can stand and stimulate a

rapid cellular division of the meristematic explants. The mineral formula is supplemented

with auxines and cytokinins in order to initiate or to block the organogenesis of the roots

and sprouts. In our experiments auxines and cytokinins were used for making the culture

medium more effective. The auxines used in order to induce the cellular division process

and the root formation process were the indolyl-acetic acid (AIA), the indolyl-butyric acid

(AIB) and the alpha naphthyl acetic acid (ANA) with a concentration of 0.5-2.0 mg/l. The

synthesis cytokinins used were kinetin (K) (6 furfurylaminopurine) and BAP (6-benzyl-

aminopurine).

In order to point out their way of action on Murashige-Skoog as the culture

medium, individual growth hormones were used and then, by using several of them on the

base culture media, we observed the contribution each of them had upon the neo formation

of in vitro plantlets.

The reaction of the cultivars to the influence of AIA (β- indolyl-acetic acid), is

similar, in the process of organogenesis, to that of AIB, with the difference that the optimal

indicators in the rooting process and caulogenesis are obvious for a concentration of 1.0-

1.5 mg/l. In the case of root formation positive results were obtained with a concentration

of 1.5-2.0 mg/l for all soybean cultivars (see table 6.8).

The introduction of the AIB in the culture medium influences upon organogenesis

at the level of the concentrations of 1.0-2.0 mg/l (table 6.9). Organogenesis, irrespective of

cultivar, is mainly reflected by the root formation process at concentrations of 0.5-2.0 mg/l.

Callus formation displays genotypical differentiations, the Diamant cultivar being more

representative for this process than the other two, while for caulogenesis the situation is

reversed.

14

Unlike the two mentioned auxines (IAA and IBA), the alpha naphthyl acetic acid

(ANA) has a positive impact upon callus formation (table 6.10). The mean percentage of

caulogenesis for the Diamant cultivar is 54.2%, obviously superior to Perla and Agat.

The analysis of the effects of artificial auxines upon soybean organogenesis

reveales different reactions conditioned by the genotype. From here, the hypotesis that the

process of in vitro multiplication must be individualized, in the way that each cultivar has a

specific reaction towards the hormonal activity in the culture medium structure.

The influence of kinetin (K) has a significant effect upon the caulogenesis, at the

concentration of 1.5-2.0 mg/l (see table 6.11.). As compared to the auxines mentioned above,

kinetin (K) does not have rhyzogene effects, influencing the callus formation process and

especially caulogenesis. An increase of the concentration from 0.5 to 2.0 mg/l has a significant

effect upon the phenomenon of caulogenesis in the Agat cultivar.

Benzylaminopurine (BAP) has practically the same effect as the one obtained in the

case of kinetin usage (K), with major effects upon caulogenesis, then upon callus

formation, and , to a lower extent,upon root formation (see table 6.12).

Phytohormones orientate the in vitro development process. A high value of the

ratio between auxine/cytokinin favours root and callus formation, whereas a low value

leads to a proliferation of axilar buds and stem organogenesis.

It was noted that in the absence of both cynokinins and auxines the division process

does not take place. In the presence of one of them, certain organogenesis processes

happen, which draws to the conclusion that cytokinins and auxines should be introduced

simultaneously.

The necessity of identifying the right hormonal balance, able to facilitate

organogenesis, implies the necessity to study the summed up effect of the phytohormones.

Tables 6.13-6.15 present the effects generated by the introduction of kinetin (K)

and auxines (AIA, AIB, ANA) in the base medium (concentrations of 0.5-3.0 mg/l) upon

soybean organogenesis.

The presence of kinetin and auxine in the culture medium favors the organogenesis

process, with differentiated responses according to genotype. The Agat cultivar provided

the most favorable response to the combinations in the hormonal balance.

15

These statements are sustained by the mean percentages of the genotypes. The most

balanced combinations were K+AIA in the case of caulogenesis (Diamant 50%, Perla 50%,

Agat 52,8%) and root formation (27% - Diamant, 25% -Perla, 27% -Agat). The response of

the hormonal balance highlights the existence of negative correlations between

caulogenesis and root formation, if we analyse the percentages of K and the three auxines

(table 6.16). The most effective and also economical formula is K+AIA, in concentrations

of 1.0-1.5 mg/l, which allows for initiation of organogenesis in soybean.

The subculture method is the base of increasing the efficiency of in vitro soybean

multiplication. It consists of the transformation of the stems formed from an inocul in

micro and minicuttings. Repication derived from the initial culture points out the fact that

during the cycles of subculture there are differences which indicate different genotypic

reactions in the case of soybean cultivars. The differentiations which occur during the three

subculture cycles indicate the presence of genotypic reactions. Out of the 150 sprout

fragments originating in the plantlets of the initial culture, 122 proliferated (about 80%) in

the first subculture, 61% in the second subculture and about 40% in the third.It is noticed,

as a general rule, that advancing in subcultures leads to a senescence of the cultures which

manifest itself through a decreased proliferation process (table 6.17).

In order to create in vitro mutant it is necessary that we should follow certain

processes and stages which can be summed up in carrying out mutanogenesis at the cell

level., using the most appropriate experimental system, selecting at cell level, determining

the mutagenic trait of the regenerated plantlets and transmitting the mutant traits in

descendence.

During the mutanogenesis process, it was noticed the fact that certain

concentrations of the mutagenic factors can be lethal to the plants. This requires for

awareness of DL 50% (the lethal dose 50%). For soybean cultivars, the lethal dose 50% is

at the level of variants with 0.2-2.0 ppm concentration of mutagenic factors DES and

DMS, and1.0-2.0 ppm for EMS (tables 7.2, 7.3, 7.4).

The study of the culture medium usually used for in vitro cultures, as well as of the

way in which mutagenic substances such as DES, DMS and EMS can influence upon the

development and evolution of in vitro meristems has as a starting point the observations

made on the regeneration percentage of the meristem propagules. The results, including the

16

control, show a low regeneration rate, of 14.3% for the Diamant cultivar propagules, 14.5

% for the Perla cultivar and 17.2% for the Agat cultivar (tables 7.5-7.7).

A slight stimulation of neoplantlet formation was noticed in the case of the DES1

mutagenic factor, especially with a concentration of 0.2 ppm and mainly for the Perla and

Diamant cultivars. The use of DMS with concentrations growing from 0.2 to 2.0 ppm leads

to an obvious decrease in the percentage of regenerated propagules.

Toward the effects manifested by DES and DMS mutagens, in both concentrations,

the introduction of the mutagen EMS in the culture medium (1.0-2.0 ppm) shows a visible

negative effect on the regeneration of soybean propagules in the three analyzed varieties.

The negative effect is most obvious in the Diamond cultivar with a decrease of

about 50% as compared with the untreated control in what regards the tendency to form

propagules. Similar effects are present for the Perla cultivar (25% EMS1, 38% EMS2) and

Agat (33% EMS1, 46% EMS2). The presented data show the negative effect of the EMS

mutagen on the formation of soybean neopropagules, without drawing any conclusions on

the mutagenic effect.

The influence of the medium composition upon the multiplication rate represents

an important stage of the in vitro technological flux; based on it, we can aim at creating a

large number of individuals identical to the parent plant, in a short period of time,

excluding somaclonal variability. According to this, we observed the way in which the

culture medium, namely the presence of some substances with mutagenic effect, can

influence the multiplication coefficient. When seen in relation with the chemical

composition of the medium and the responses of the soybean cultivars, the multiplication

coefficient proved to be higher for the Agat cultivar, under the conditions of a medium

enriched with DES, 0.2 ppm, its value going down with the increase in the concentration of

the mutagen to 2.0 ppm.

An obvious negative effect occurs under the influence of DMS, and it is amplified

by the increasing of the concentration of the mutagenic agent, the differences from the

untreated control being significantly negative (tables 7.8-7.10).

The behavior related to the root formation process, observed on six different

medium variants, was different from a genotype to the other. The DMS mutagenic agent

determines very significantly negative differences, for both concentrations, in the Diamant

cultivar. Actually, similar behavior towards DMS was noticed in the case of the other

17

cultivars too, the differences to the control being very significantly negative. The strongest

effect occurs in the variants containing the EMS mutagen, in the three studied genotypes

(tables 7.11-7.13).

In conclusion, the analysis of the behavior of explants in in vitro cultures reveals

the fact that the use of mutagenic agents in the base culture produces phenotypical

modifications of both genotypes. The presence of DMS and EMS, in both concentrations,

has a negative influence upon the propagule neoformation from meristem cultures, the

multiplication rate and the root formation process, also pointing out the fact that DMS and

especially EMS are stronger mutagens, as compared to the effects of DES, and therefore

they are able to produce higher percentages of mutations (tables 7.15-7.20).

It was noticed that in the first generation (M0), mutagenic agents have a stronger

influence upon certain quantitative traits. Morphological abnormalities in M0 affect all

organs, but are more frequent in leaves and stems. The phenotypical manifestation of these

can take various forms, according to genotype and mutagen concentration. The attention

that is paid to these abnormalities can be explained by the fact that they facilitate selection

even starting with M0, with the purpose of obtaining a higher frequency of mutations in M1.

The general aspect of neoplantlets can be characterized by random occurrence of some

individuals with insufficient development, weak, with clorotic leaves, twisted steams

(tables 7.15-7.20).

Since the experiment and the thesis were carried out over three years, it would have

been too difficult to introduce a gametic stage. The possible mutants were identified in the

M0-1 generation, considering the fact that mutants occur in somatic cells and can become

manifest starting with the treatment year. We prelevated meristems from the in vitro

obtained M0 plants, which were considered to be parents of the M0-1 generation, obtained

through in vitro vegetative multiplication.

Under these conditions, it was noticed that the M0-1 generation was identical, from the

behaviour point of view, with generation M0, under the aspect of the number of regenerated

propagules and the negative effects caused by the mutagen agents (see tables 7.21-7.26).

The phenotypical variability and the morphological differentiation induced by the

mutagenic factors, may be explained also on a chromosomal level for the primary effects

of the treatments applied, as a result of the several structural changes, mainly, the mitosis

phases. The analyzed genotypes, Diamant, Perla and Agat had two types of chromosomal

18

aberrations which take place in mitosis anaphase, with retarded chromosomes and bridges

anaphase (see tables 7.27-7.29). The research pointed out the specificity of each genotype

in the chromosomal aberrations.

Regarding the effect of the mutagen factor DES, this one achieves an inferior

percentage of chromosomal aberrations, as compared to both concentrations of DMS and

EMS mutagen agents

The mentioned chromosomal aberrations point out, with no hesitation, the existence

of several mutational phenomena in soybean, which can a starting point to create new

genetic variability.

The relationship between the in vitro mutagenic treatment and the frequency of the

chromosomal abnormalities depends on the regression coefficient, and the existent

correlations between the occurrence of the aberrant cells and the mutagen doses (fig. 7.1-

7.5). The regression and correlation coefficients are significant, which proves the cause-

effect relationship between a certain concentration of mutagen and the percentage of

abnormal cells that occur.

In order to sustain these statements, there has been research in the direction of

identifying possibly mutant soybean cell lines that are tolerant to high concentrations of

aluminum ions (Al+). Embryogenic and non-embryogenic soybean callus was used, some

from untreated material and some from material that had been treated with chemical

mutagenic factors (DMS and EMS). The acid medium created by the aluminum ions has a

negative influence upon the development of the callus (decreased growth, occurrence of

necrosis).

The biological material used for callus came from plantlets which displayed

morpho-cytologic modifications as a result of the treatment with DMS and EMS.

Callus was differentiated on the culture medium, upon which certain concentrations

of aluminum ions were applied, in order to study their resistance and the genetic variability

as a result of the mutagenic treatment (RAPD analysis).

Ten callus lines were differentiated out of the possibly mutant material (table 7.30).

The toxic effect of the aluminum ions was studied on them. A positive response-tolerance

to the aluminum ions- was noticed, for both concentrations of ions (0.5 and 1.0), in the

following lines: LC2DMS, LC1EMS, LC2DMS, LC6EMS, LC7EMS and LC8EMS. The

19

study based on somatic embryos from possibly mutant plants reconfirmed the conclusion

referring to the tolerance to aluminum ions (table 7.33).

From the point of view of the genotypes reaction to the aluminum ions, the Agat

cultivar proved itself to be more tolerant than Diamant and Perla.

We mention the fact that the plants resulted from the cell lines which manifested a

certain tolerance to the aluminium ions were not tested in vivo, the information obtained

being reduced to the cell resistance towards the acid stress. Tolerant cell lines point out a

variability earned under the aspect of tolerance to the aluminium ions, and plant

regeneration out of these lines may be an interesting material to study to elucidate the

genetic and molecular mechanism of tolerance to the aluminium ions and the selection of

several potential genotypes adaptable to crops on acid soils.

The techniques based on molecular markers, such as RAPD analysis, were used for

pointing out the effect of chemical mutagenic agents upon the in vitro cultures, namely the

determination of the DNA polymorphism in soybean. DNA isolation and PCR

amplification have revealed an electrophoresis profile, as the OP-0-01 and OP-0-05

primers generated polymorphic fragments. (photos 7.7 and 7.8)

The DNA changes caused by mutagens had as a result the identification, by means

of RAPD analysis, of genetic variability. Two polymorphic forms have been identified out

of 124 fragments, which stand for a high mutagen level.

Documents

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Clujmutageni chimici şi realizarea selecţiei in vitro pentru depistarea unor linii tolerante la ionii de Al+. 5 Pentru prelevarea de meristeme