REPLIKACJA, NAPRAWA i REKOMBINACJA DNA

1) Replikacja DNA

2) Replikacja całych chromosomów

3) Replikacja telomerów

4) Naprawa DNA przy jego syntezie

5) Naprawa DNA poza jego syntezą

6) Naprawa DNA – system SOS

7) Rekombinacja homologiczna DNA

1) Replikacja DNA – konieczność odsłonięcia jednoniciowego DNA

Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłonięcie ‘lepkich’

pojedynczych nici, które maja tendencję do ponownego łączenia się.

Zapobiegają temu białka SSBs (single strand binding).

1) Replikacja DNA – inna przeszkodą jest skręcenie helisy

Nić helisy jest skręcona i to skręcenie się nasila w miarę przesuwania się

kompleksu replikacyjnego. Rozwiązaniem jest działanie topoizomerazy,

która nacina jedną z nici, przepuszcza drugą przez powstałą przerwę i

doprowadza do powtórnego złączenia.

1) Replikacja – jeszcze inny problem, przeciwbieżność nici DNA

Kopiowanie musi przebiegać w jednym kierunku podwójnej nici DNA

(od 5’ do 3’ nowej nici), ale nici stare są przeciwbieżne

1) Replikacja DNA

– rozwiązaniem jest

„normalna” replikacja w

przypadku nici “wiodącej” i

odcinkowa replikacja

(fragmenty Okazaki)

“spóźniającej się” nici DNA

(polimeraza RNA może

syntetyzować krótkie odcinki

na pojedynczej nici DNA,

polimeraza DNA może wtedy

zacząć od nici podwójnej)

1) Replikacja DNA

- helikaza – rozdziela starą podwójną nić DNA

- polimeraza DNA –dokłada komplementarne zasady do starej nici DNA

- topoizomeraza – likwiduje naprężenia powstające

- primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA

- ligaza DNA – łączy fragmenty Okazaki w ciągłą nową nić

2) Replikacja chromosomu bakteryjnego

- chromosomy bakterii (a także plazmidy i koliste genomy wirusów) mają

jeden początek replikacji

eukarionty

2) Replikacja chromosomu eukariotycznego

U organizmów eukariotycznych występuje wiele początków replikacji w

każdym z chromosomów

3) Replikacja telomerów

Przy replikacji liniowych chromosomów eukariontów na ostatnim fragmencie

nici opóźniającej się (lagging) nie można utworzyć starteru RNA i dlatego ta

nić skracałaby się o ten fragment po replikacji.

3) Replikacja telomerów

Okazuje się, że w końcowych

odcinkach chromosomu jest po

kilkuset kopii sekwencji 5’-

TTAGGG-3’.

Jest to wynik działania telomerazy,

enzymu mającego za zadanie

wydłużanie skracającego się końca

chromosmu.

To białko o aktywności odwrotnej

transkryptazy, które ma własną

matrycę RNA.

3) Telomery a starzenie się

komórek

Telomeraza jest aktywna w

komórkach linii generatywnej i

komórkach progenitorowych

(stem cells). W tkankach

normalnie nie działa.

Dlatego tam telomery się

skracają i jest to zegar starzenia

się. Po odliczonej liczbie

podziałów, zwykle

kilkudziesięciu, komórka nie

może się dalej dzielić.

4) Naprawa DNA przy jego

syntezie

Polimeraza DNA działa tak by

nie popełniać błędów. Selekcja

nukleotydów jest imponująco

dokładna, pomyłki występują

raz na 10,000 sparowań.

4) Naprawa DNA przy jego

syntezie

Jeśli polimeraza DNA się

pomyli, to potrafi sama

naprawić swój błąd ponieważ

jest też egzonukleazą

Ta forma naprawy nazywana

jest naprawą korekcyjną

(proofreading). Pomyłki

następują tu około 1/1000.

4) Naprawa DNA tuż po

jego syntezie –

mismatch repair

Tuż po syntezie można

jeszcze rozróżnić nić starą

od nowe.

U bakterii tylko stara nić

jest zmetylowana (rycina).

U eukariontów

rozróznianie jest inne i

gorzej poznane.

Można wtedy usuwać

niedopasowania

(mismatches) tylko z

nowej nici.

4) Naprawa DNA tuż po jego

syntezie – mismatch repair –

naprawa niedopasowań

U bakterii dwa białka, MutH i MutS,

skanują DNA.

Po natrafieniu na źle sparowane

nukleotydy przywołują egzonukleazę

wycinającą fragment nowej nici i

polimerazę, która zapełnia ubytek.

Białka homologiczne do MutS i MutH

wykrywające złe sparowania są także

u eukariontów.

Ta naprawa pozostawia około 1/1000

niepoprawnych sparowań.

4) Naprawa DNA przy jego syntezie – efekt łączny

Badania kultur bakteryjnych w laboratorium wykazały, że:

- przy dobieraniu nukleotydów tempo błędu wynosi 1 x 10-4

- z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x 10-3

- z tego po naprawie niedopasowań pozostaje 1 x 10-3

Łącznie daje to tempo błędów zaledwie 1 x 10-10 na nukleotyd

Jak to się ma do tempa mutacji u człowieka szacowanego na

podstawie porównywania sekwencji rodziców i dzieci?

Bakteryjne tempo 10-10 na jeden nukleotyd na jeden podział komórkowy

to około 10-8 na jeden nukleotyd na jedno pokolenie ludzkie zakładając

około 102 podziałów komórkowych w linii generatywnej człowieka …

- zgadza się z danymi z sekwencjonowania -

…. czyli większość mutacji powstaje przy powielaniu DNA

5) Naprawa DNA poza jego syntezą

DNA w komórce nie dzielącej się może zostać uszkodzone w pojedynczym

nukleotydzie w taki sposób, który nie wymaga (A) lub wymaga (B) wycięcia

w starej nici. Niedopasowanie (C) z definicji wymaga wycięcia. Pęknięcie

obu nici (D) wymaga złączenia, co może odbywać się bez względu na

sekwencję pękniętych końców (nonhomologous).

5) Naprawa DNA poza jego syntezą – naprawa bezpośrednia

Naprawa bezpośrednia to np. naprawa pęknięcia (nick) jednej nici DNA

przez ligazę.

5) Naprawa DNA poza jego syntezą – wycięcie jednego nukleotydu

Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylazę DNA i odcinana od cukru.

Następnie cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany

prawidłowym.

5) Naprawa DNA poza jego syntezą – wycięcie wielu nukleotydów

Gdy uszkodzenie lub brak sparowania powoduje lokalne zaburzenie struktury

helisy, najpierw następuje rozdzielenie nici (melting) przez helikazę. Potem nić

zawierająca uszkodzenie jest wycinana, polimeraza dobudowuje drugą nić, a

ligaza łączy ją kowalencyjnie.

5) Naprawa DNA poza jego syntezą – łączenie końców

Gdy podwójna nić pęknie

istnieją systemy

szybkiego łączenia

wolnych końców.

U eukariontów

pośredniczy w tym białko

Ku i szereg innych

białek.

W ten sposób złączeniu

ulec mogą końce, które

niedawno się przełamały

lub nie odpowiadające

sobie (nonhomologous).

6) Naprawa DNA – bakteryjny system SOS

Gdy w czasie replikacji

‘normalna’ polimeraza III

natrafi na zbyt uszkodzone

DNA nie może posuwać się

dalej.

Wtedy przywoływane są

białka RecA, które pozwalają

na odłączenie polimerazy III i

umożliwiają pracę mniej

wymagającej polimerazie V.

Synteza postępuje, ale z

błędami.

U eukariontów także istnieją

takie ‘ratunkowe’ polimerazy

pomostowe, zdolne do

przejścia przez uszkodzone

DNA.

Rekombinacja

między dwiema

chromatydami z

chromosomów

homologicznych jest

molekularną

podstawą procesów

- crossing over,

- konwersji genów

- naprawy

dwuniciowych

uszkodzeń DNA

7) Rekombinacja homologiczna

Początkiem

rekombinacji jest

(niekiedy celowe)

przecięcie obu nici

(A).

Potem każda z nici

jest skracana tak by

wystawał koniec 3’ (B)

7) Rekombinacja homologiczna

(A)

(B)

Następnie jeden z

końców 3’ dokonuje

inwazji powodując

miejscowe rozejście się

w drugiej nici połączone

z odszukaniem

sekwencji

homologicznej (C). Ten

koniec 3’ ma już

matrycę.

Rozejście przesuwa się

i drugi koniec 3’ zyskuje

matrycę. Oba końce 3’

mogą się wydłużać (D).

(C)

7) Rekombinacja homologiczna

(B)

(C)

(D)

Po zapełnieniu odcinków

jednoniciowych drugą nicią

tworzy się struktura z

dwóch różnych chromatyd

(heterodupleks)

Połączone są dwoma

przejścia nici między

chromatydami

homologicznymi - Holliday

junctions (E)

(D)

(E)

7) Rekombinacja homologiczna

Heterodukpleks musi

być przecięty.

Możliwe są różne

kombinacje cięć (F)

Prowadzą one albo

tylko do lokalnej

wymiany materiału

genetycznego

(konwersja genu) lub

do wymiany ramion

chromatyd (cross-

over)

konwersja

cross-over

(E)

(F)

7) Rekombinacja homologiczna

Powtórzenie całego szlaku.

Ten proces jest inicjowany

celowo na początku mejozy

by chromosomy

homologiczne na pewno się

odnalazły.

Jest także używany do

reperacji dwuniciowych

uszkodzeń DNA (pęknięcia,

połączenia kowalencyjne)

by zreperować poprawnie,

korzystając z sekwencji

innej chromatydy.

7) Rekombinacja homologiczna