Replikacja, naprawa i rekombinacja DNA u eukariontów

Zasada replikacji DNA

Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego

U eukariontów DNA występuje w kompleksie zwanym chromatyną

Replikacja u eukariontów

• Inicjacja, elongacja, terminacja• Problem końców chromosomów• Jądro - organelle

Inicjacja(replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu miejscach)

ORI (Origins of replication)

• ARS (Autonomously Replicating Sequence) u drożdży- Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja

wymaganą do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.

U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz

U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane

W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie wszystkie funkcjonują w każdej komórce

Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)

Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.

Kontrola inicjacji

• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) – zapewnia, że chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą przez mitozę i znajda się w komórce potomnej.

• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6 i Cdt-1) umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM są usuwane przez przesuwające się widełki replikacyjne.

Licencjonowanie w ORI

Negatywna kontrola inicjacji - Geminina

• Geminina – białko występujące w komórkach w fazie G2• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do świeżo

zreplikowanego DNA (zablokowanie czynnika Cdt-1)• Jest degradowana po zakończeniu mitozy• Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!

Kontrola inicjacji w cyklu komórkowym

Elongacja

• Kompleks wielo enzymatyczny zawierający polimerazę DNA katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3’ końca DNA lub RNA przyłączonego do nici matrycowej DNA.

• Synteza DNA idzie w kierunku 5’ – 3’, a matryca jest odczytywana w kierunku 3’-5’.

• Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już istniejącego fragmentu kwasu nukleinowego (primera).

• Polimeraza DNA jest nie aktywna w nieobecności primera z wolną grupą 3’ OH, związanego poprzez wiązania wodorowe z matrycą.

• Primery są syntetyzowane przez specyficzną polimerazę rybonukleotydową zwaną DNA primazą. Inicjuje ona syntezę primera rozpoczynając od rybonukleotydu purynowego.

Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA

Elongacja - cd

• Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych *(kierunki!) synteza DNA jest w połowie nieciągła. Na nici wiodącej (jeden primer) dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły. Na nici opóźnionej synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów Okazaki, z których każdy wymaga swojego primera.

• Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycy nici opóźnionej wymaga systemu naprawy DNA zawierającego specyficzną rybonukleazę – RNazę H, który usuwa primery RNA i zastępuje je fragmentami DNA. Inny enzym – ligaza DNA łączy koniec 3’ nowego fragmentu DNA z 5’ końcem fragmentu DNA poniżej.

Elongacja - widełki replikacyjne

Elongacja - cd

• W jądrze eukariontów występują trzy główne polimerazy DNA – α, δ i ε.

• α – głównie funkcja primazy• δ i ε – synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej.• Helikaza DNA (występuje w kompleksie z pol δ i ε ) rozplata

dwuniciowy DNA u nasady widełek.• Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające w

wyniku rozplatania (są przyłączone przed widełkami).

Elongacja - cd

Wierność replikacji

• Wysoka wierność replikacji (śr. 1 błąd na 10 9 zreplikowanych pz).• Polimerazy DNA są enzymami z funkcją autokorety (proofreading),

które usuwają własne błędy podczas replikacji.• Kluczowe dla autokorekty są ich aktywności 3’-5’ egzonukleazy,

dzięki którym usuwają źle sparowane nukleotydy od 3’ końca nowo zsyntetyzowanego fragmentu DNA. Specjalny system naprawy uzupełnia następnie brakujące fragmenty nici.

Niektórych błędów nie da się skorygować

Terminacja replikacji

• Terminacja następuje w miejscach, w których spotykają się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch sąsiadujących miejsc ORI.

Aktywność telomerazowa -replikacja końców chromosomów (telomerów)

Punkty kontrolne (checkpoints) w cyklu komórkowym

Chromosomy politeniczne (Drosophila – 10 rund replikacji bez rozdzielania cząsteczek = 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie)

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

Produkty PCR (polimeraza Taq)

Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty

• Tlen, wolne rodniki

• UV

• Związki alkilujące

• Spontaniczna deaminacja (C do U)

• Przerwanie łańcucha

• Modyfikacje chemiczne zasad

• włączanie niesparowanych zasad w trakcie replikacji

Uszkodzenia DNA - przykłady

Systemy naprawy DNA

• Wycięcie nukleotydów • (dimery pirymidyn, aberracje struktury)

• Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (mylnie sparowane zasady)

• Naprawa przez wycięcie zasad (nietypowe – hipoksantyna, uracyl-, zalkilowane zasady)

• Naprawa bezpośrednia (metyloguanina, dimery pirymidyn)

• System helikazy XPA (Xerdoerma pigmentosum)

• Homologi bakteryjnych białek typu Mut

• Glikozylaza DNA, polimeraza δ

• Guanino-6-metylotransferaza

Rekombinacja DNA

• Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek (zapewnia zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą metę - w ewolucji (rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają nowe kombinacje sekwencji, które mogą generować nowe rodzaje RNA i białek, wpływając na fenotyp).

• Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z mechanizmami replikacji i naprawy

Rekombinacja w podziałach mejotycznych

Rodzaje rekombinacji

• Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy długimi sekwencjami, które zawierają rejony w dużym stopniu do siebie podobne (np. rekombionacja mejotyczna). Wymaga białek typu RecA; katalizują one reakcję przeniesienia nici, która umożliwia jednoniciowemu fragmentowi wniknięcie w strukturę dwuniciową w rejonie homologii (powstaje przejściowa struktura trójniciowa).

• Rekombinacja miejscowo specyficzna (np. rearanżacja genów immunoglobulin) występuje w specyficznych loci, nie wymaga długich rejonów homologii ani białek typu RecA. Wymaga białka rekombinazy (integrazy) i krótkich sekwencji palindroomowych w DNA donorowym i akceptorowym.

• Rekombinacja nieuprawniona może zachodzić w obecności krótkich rejonów homologicznych (udział polimerazy RNA), a także przy braku jakiejkolwiek homologii (np. integracja do genomów roślin) (udział gyrazy, tj. topoizomerazy II).

Struktura Hollidaya – etap pośredni w rekombinacji homologicznej