RELATÓRIO DE ESTÁGIO

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA

UNIDADE DE BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL – FACULDADE DE CIÊNCIAS E

TECNOLOGIA, MONTE DA CAPARICA

Efeito da conservação sob atmosferas modificadas na

composição de pigmentos de plantas silvestres.

Setembro de 2007

Ana Lúcia da Silva Gomes

Carla Maria Oliveira Nunes Ferreira

O orientador responsável

Doutor Paulo Renato Costa Figueiredo, Professor associado da universidade

Lusófona de Humanidades e Tecnologias (ULHT) e investigador da unidade de

biotecnologia Ambiental.

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ÍNDICE

Introdução ……………………………………………………………….. 4

Protocolo do Relatório ………………………………………………….. 5

1.Introdução teórica ……………………………………………………... 5

1.1-Vaccinum myrtillus………………………………………………… 5

1.2-Antocianinas………………………………………………………... 6

1.3-Atmosferas modificadas……………………………………………. 8

2.Materiais e Métodos …………………………………………………... 9

2.1-Extracção…………………………………………………………… 9

2.2 –Filtração…………………………………………………………… 10

2.3- Remoção por arrasto……………………………………………….. 10

2.4-Concentração dos extractos………………………………………… 11

2.5-Cromatografia Líquida ou HPLC………………………………….. 12

3.Actividade experimental ………………………………………………. 13

4.Observação ……………………………………………………………. 14

5.Apresentação dos Resultados………………………………………….. 15

6.Discussão dos Resultados / Conclusão………………………………… 17

7.Criticas ………………………………………………………………… 19

8.Bibliografia…………………………………………………………….. 20

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INTRODUÇÃO

Este relatório foi desenvolvido no âmbito do estágio “ Efeito da

conservação sob atmosferas modificadas na composição de pigmentos de

plantas silvestres”, pertencente ao projecto de Ocupação Cientifica dos

Jovens nas Férias criado pela entidade Ciência viva, compreendido entre 3

de Setembro de 2007 e 7 de Setembro de 2007.

O trabalho envolve a colheita das flores, acondicionamento em

atmosfera aeróbia e anaeróbia e análise das antocianinas das flores frescas e

preservadas recorrendo a HPLC-DAD.

Os Alunos envolvidos no projecto:

Ana Lúcia da Silva Gomes

Carla Maria Oliveira Nunes Ferreira

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PROTOCOLO DO RELATÓRIO

1-Introdução teórica:

1.1-Vaccinum myrtillus

Classificação Cientifica

Fig.1- Vaccinum myrtillus

Como o objectivo do trabalho é extrair antocianinas de plantas

silvestres, utiliza-mos o mirtilo uma vez que este possui em grandes

quantidades este tipo de pigmento.

O mirtilo, também conhecido como arando ou uva-do-monte

(Vaccinum myrtillus) é um arbusto que pertence à família Ericaceae

(família da azálea). As plantas são arbustos de pequeno porte que crescem

em sub-bosques de florestas temperadas na Europa. Vive em Portugal em

regiões nas quais o inverno é rigoroso, porque necessita em média de 500

horas anuais de temperatura entre os 10º e os 12º centígrados, daí a enorme

dificuldade em cultivá-lo na maior parte do território, é na zona do médio

Vouga, no vale do Rio Vouga que se encontra o local ideal para a produção

deste fruto, nos concelhos de Oliveira de Frades, Sever do Vouga, Águeda

e Albergaria-a-Velha, sendo Sever do Vouga o que reúne as melhores

condições.

Reino Plantae

Divisão Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Ordem Ericales

Família Ericaceae

Género Vaccinium

Espécie V. myrtillus

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Uso medicinal

Fortalecimento das paredes das artérias;

Previne a destruição do colagenio;

Prevenção de varizes;

Rico em antocianinas daí a sua eficácia no combate aos radicais

livres;

1.2-ANTOCIANINAS

O que são as antocianinas?

Existem três grandes Famílias de pigmentos que dão cor ás plantas:

as clorofilas, os carotenóides e os Flavonóides.

As Antocianinas constituem o maior grupo de Flavonóides

responsáveis pelas cores ciânicas que vão desde o rosa passando pelo

vermelho e violeta até ao azul da maioria das flores, frutos e folhas das

angiospérmicas.

Quase todos os polifenóides absorvem radiação na banda do

ultravioleta, no entanto as antocianinas são o único sub grupo dos

polifenóides que absorvem radiação na banda do visível.

As Antocianinas são armazenadas no vacúolo das células da planta, e

são responsáveis pela pigmentação das plantas e frutos.

Para obtermos uma porção de antocianinas são necessários muitos

meios e múltiplas técnicas de purificação, tornando-se desvantajoso quando

se pretendo produzir à escala industrial.

Das Antocianinas glicosiladas conhecidas, só seis delas (a

pelargonidina, a delfinidina, a cianidina, a petunidina, a malvinidina e a

peonidina) se encontram mais frequentemente nas plantas. A que existe em

maior quantidade nas folhas das plantas é a cianidina-3 - glicosilada, que

lhes confere o aspecto avermelhado.

Fig.2- Estrutura química da cianidina-3-

glicosilada

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Qual a sua estrutura?

As antocianinas são constituídas por três anéis benzénicos, um grupo

hidróxido e açúcares (as glicosiladas).

Num meio ácido existe predominantemente o catião flavilio, na sua

forma estável, apresentando a solução uma coloração estável

(avermelhado).

Num meio neutro existe a perda de protões, apresentando uma

coloração roxa escura.

Num meio básico fica na sua forma aniónica e instável devido á

perda de protões e a quebra dos anéis de benzeno pelo OH- da água, e a cor

vai se alterando e clareando ( azul - amarelo - incolor).

Fig.3- Estrutura química da Antocianina.

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Quais as suas aplicações?

Têm havido, nos últimos tempos um maior interesse na produção de

antocianinas devido ao seu potencial como suplemento alimentar para os

seres humanos e na produção de corantes alimentares naturais a fim de se

substituir os corantes sintéticos, uma vez que os corantes produzidos

através de processos naturais são mais saudáveis, seguros e podem dar

origem a uma grande gama de cores.

As antocianinas e outros polifenóides existentes em frutos, vegetais,

vinhos possuem propriedades que contribuem para a redução do risco de

desenvolvimento de doenças crónicas, como o cancro, doenças

cardiovasculares, doença de alzheimer, dando também um contributo na

inibição de vírus e como antioxidante desempenha um papel importante na

prevenção de doenças provocadas pela oxidação.

No entanto, sempre que ocorre uma mudança de pH ou

temperatura as antocianinas tornam-se instáveis, essa instabilidade torna-se

assim o maior obstáculo das antocianinas face à sua aplicação na indústria

alimentar.

1.3-O que são atmosferas modificadas?

Durante esta actividade experimental iremos submeter amostras de

uma solução com antocianinas a dois tipos de atmosferas de modo a

verificar os efeitos sobre o pigmento.

Na atmosfera anaeróbia é retirado da amostra o oxigénio através de

remoção por arrasto sendo este gás substituído por azoto.

Na atmosfera aeróbia não lhe foi retirado nenhum fluido (gás), uma

vez que durante a preparação houve a entrada de oxigénio.

É necessário termos a noção do que são a s atmosferas modificadas

uma vez que durante a nossa actividade experimental pretendemos observar

o efeito da oxidação pelo oxigénio na conservação das antocianinas.

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2-Materiais e métodos:

2.1-Extracção:

Materiais:

Água destilada

Etanol

Mirtilo

Balão erlenmyer

Agitador magnético

Barra de agitação

Papel de alumínio

Procedimento:

Iniciamos a preparação do solvente, onde misturámos etanol e água

numa proporção volumétrica de (50:50, v/v), onde colocámos umas bagas

de mirtilo e uma barra de agitação para auxiliar na extracção das

antocianinas, deixando a solução envolvida em papel de alumínio (para

evitar a foto-oxidação) durante cinco horas.

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2.2-Filtração:

Materiais:

Bomba de vácuo

Kitasato

Membrana de celulose Millipore tipo GV, 0.22 m

Funil de filtração

Membrana de celulose Millipor tipo Millex-HV 0.45 m

Procedimento:

Vertemos a solução de água + etanol + mirtilo para o funil de

filtração ligámos a bomba de vácuo fazendo-se passar a solução pela

membrana de celulose de modo a filtrar as impurezas.

Depois da solução já filtrada passámos com a pipeta de Pasteur uma

porção de solução para uma seringa com uma membrana de celulose

filtrando novamente a solução antes de ser introduzida nos Vial (Frascos

de pequenas dimensões próprios para injecção na coluna de

cromatografia).

2.3-Remoção por arrasto: Substituição de oxigénio por azoto

Após a purificação da solução retirámos duas porções desse fluido que

introduzimos em dois frascos vial. Um deles foi

submetido a uma atmosfera anaeróbia onde foi

removido o oxigénio por arrasto sendo este

substituído por azoto (essa substituição ocorre devido

á diferença de pressão entre os dois gases), e o outro

frasco manteve-se em atmosfera aeróbia.

Fig.4-As duas amostras obtidas

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2.4-Concentração dos estratos:

Material

Evaporador Rotativo

Procedimento

Para tornar uma porção da solução previamente filtrada mais

concentrada utilizámos o evaporador rotativo, aparelho que permite

evaporar solventes a baixa temperatura e recorrendo a baixa pressão (T =

40ºC).

Depois de definirmos uma temperatura para a água de aquecimento

da solução (T=40ºC), verificámos se o aparelho estava sob baixa pressão e

colocámos o balão com a solução para concentrar. Após sujeitar a solução a

estas condições o etanol, sendo o mais volátil dos solventes, será o primeiro

a evaporar e posteriormente evaporar-se-á a água, obtendo assim uma

solução mais concentrada do que a inicial, da qual retirámos uma porção e

encerrámos num Vial.

Fig.5-Evaporador Rotativo

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2.5-Cromatografia líquida ou HPLC (High Performance Liquid

Chromatography)

A cromatografia é um processo de separação físico-química, cuja

aplicação permite a análise qualitativa e quantitativa duma amostra.

Condições cromatográficas:

O fluxo (velocidade de passagem dos solventes ao longo do

tempo).

A percentagem de diluentes.

A cromatografia líquida é uma técnica que utiliza como fase móvel

um solvente ou mistura de solventes e como fase estacionária um material

polimérico. A amostra é injectada sob a forma de uma solução.

A fase móvel é então bombeada a alta pressão para o interior da

coluna onde se processa a eluição dos componentes da solução. A

separação cromatográfica ocorre porque diferentes moléculas têm

diferentes solubilidades na fase móvel e diferente afinidade para a fase

estacionária. Assim, serão eluidas em primeiro lugar as moléculas com

mais afinidade para a fase móvel e em último lugar para moléculas com

mais afinidade para a fase estacionária.

Fig.6- HPLC

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3-Actividade Experimental

As amostras obtidas: a concentrada, e as outras duas amostras uma

conservada em ambiente aeróbio e outra em ambiente anaeróbio foram

analisadas no aparelho de HPLC, Spectra Systems com detector de vector

de iodos UV6000LP (Grupo Thermo Electron). A recolha de dados e a sua

análise foi efectuada utilizando o software Finnigan Xcalibur 1.4.

A coluna de fase reversa utilizada foi uma C18 5 ODB (250 x 4.6 mm,

tamanho de partícula 5 m Interchim Uptisphere, Montluçon, France).

A evolução das amostras obtidas foi seguida através de cromatografia

líquida (HPLC) de acordo com Corrales et al.1

Foram usadas duas fases móveis desigadas por A e B. Ambas as fases

móveis são formadas por água, ácido fórmico e acetonitrilo, no entanto

estes constituintes estão em proporções diferentes em cada fase móvel:

A- 87:10:3 v/v/v respectivamente.

B- 40:10:50 v/v/v respectivamente.

Utilizámos como fases móveis as substâncias a cima referidas porque

estamos a trabalhar com amostras de substâncias hidrossoluveis, para

manter o ph constante ao longo da análise e para compensar o facto da água

ser um solvente agressivo para a coluna, respectivamente.

O gradiente de eluição usado foi de 10 para 25% B (10 minutos), 15

% B (3 minutos), de 15 para 25% B (7 minutos), 25 para 55% B (30

minutos) de 55 para 100% B ( 1 minuto), 100% B ( 5 minutos), de 100 %

para 10% B (0.1 minuto).

O fluxo foi de 1.0 ml/min e o volume de injecção das amostras foi de

20 l .

Fig.7- HPLC

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4-Observações:

No início da actividade experimental elaboramos três soluções: uma

solução de água + etanol + mirtilo, que abordámos anteriormente. As outras

soluções elaboradas foram uma constituída por metanol + ácido clorídrico

+ perpétuas rochas (solução 1), e a outra constituída por metanol + ácido

clorídrico + mirtilo (solução 2). Ambas foram sujeitas a agitação magnética

de modo a serem extraídos os pigmentos.

Após a extracção dos pigmentos ambas as soluções apresentavam

uma coloração avermelhada, no entanto a solução 1 continha betalaínas

(pigmentos existentes em espécies mais características e menos frequentes

na natureza; tem um estrutura azotada, e existem duas espécies principais

as betacianinas, de coloração amarelada, e as betaninas , de coloração

roxa/avermelhada) enquanto que a solução 2 continha antocianinas. Isto é

comprovado uma vez que a solução 1 não alterava a sua coloração quando

lhe eram adicionadas soluções ácidas ou básicas, já na solução 2 verificava-

se uma alteração da cor quando se alterava o pH.

Na solução 2 quando se adicionava uma solução ácida a cor ficava

avermelhada (e estável), quando se tinha uma solução neutra a cor era rosa

claro, e quando se adicionava uma solução básica a cor variava entre os

verdes e os amarelos até ficar incolor.

Portanto quando há presença de betalaínas numa solução, como na

solução 1, mesmo que se faça variar os valores de pH a coloração da

solução mantém-se estável. Quando na presença de antocianinas, como na

solução 2, a coloração varia conforme o pH, não sendo por isso estável.

Fig.8- Coloração obtida quando se fez variar o pH fig.9- Soluções 1 e 2

dos estratos preparados inicialmente respectivamente

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5- Apresentação dos resultados

Fig.10 - Cromatograma da amostra em atmosfera aeróbia

Fig.11-Cromatograma da amostra em atmosfera anaeróbia.

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Fig.12 – Espectro de absorção da amostra em atmosfera anaeróbia

Fig.13 – Espectro de absorção da amostra em atmosfera aeróbia.

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6-Discussão dos resultados /Conclusão

Foram observados, tanto na amostra em atmosfera aeróbia, como na

amostra conservada em atmosfera anaeróbia, dez picos que correspondem a

dez espécies de antocianinas.

Ao analisar os cromatogramas e espectros de absorção foi conferido

especial interesse aos três primeiros picos dos gráficos, uma vez que tem

um comportamento semelhante e por serem os mais intensos contribuem

mais para a estabilidade da cor da amostra.

No cromatograma:

No gráfico da amostra em atmosfera aeróbia verificou-

se um decréscimo proporcional da intensidade dos picos

ao longo do tempo devido á acção do oxigénio, dado

que se tentou minimizar a acção da luz e da temperatura.

Existiu oxidação das antocianinas presentes na amostra.

No gráfico da amostra em atmosfera anaeróbia não se

verificou uma redução significativa da intensidade dos

picos, logo podemos deduzir que não ocorreu oxidação.

NOTA: É de notar que o sistema de desarejamento pode não ter sido

o mais apropriado podendo ter interferido nos resultados finais, uma vez

que pode ter havido retenção de oxigénio na amostra.

Nos espectros de absorção:

No gráfico da amostra em atmosfera aeróbia houve uma

redução da intensidade dos picos, uma vez que o

oxigénio oxidou as antocianinas.

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No gráfico da amostra em atmosfera anaeróbia,

verificou-se um ligeiro aumento da intensidade dos

picos, no entanto isso deveu-se apenas a ligeira

diminuição do volume da solução e consequente

aumento da concentração, mas este aumento não é muito

significativo, Sendo o mais importante o facto de não ter

ocorrido uma diminuição acentuada da intensidade tal

como ocorreu no gráfico da atmosfera anaeróbia.

CONCLUSÃO:

Através da observação e discussão dos resultados obtidos

podemos concluir que a conservação das antocianinas para posterior

utilização é mais eficaz se for feita em ambiente anaeróbio pois este

protege ou evita a degradação dos pigmentos, o que não acontece na

presença de oxigénio, pois verifica-se uma oxidação e consequente perda

de cor ao longo do tempo.

Assim no nosso entender, deveríamos apostar na produção e

utilização de corantes naturais uma vez que estes são mais saudáveis

relativamente aos corantes sintéticos e desenvolver técnicas de produção

destes pigmentos em meio anaeróbio uma vez que é deste modo em que

estes se conservam e não apresentam qualquer tipo de degradação e ainda

apostar no estudo das antocianinas como contributo ao nível da saúde.

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7- Criticas

Após a elaboração desta actividade laboratorial podemos verificar

que foram ocorrendo determinadas “falhas” que podem ter condicionado os

resultados observados e conclusões obtidas, tal como não ter havido um

controlo rigoroso da atmosfera anaeróbia; a actuação dos factores da luz e

temperatura sobre as amostras que poderá ter afectado os resultados; o

facto dos extractos não ter sido completamente purificada e ainda o facto

da experiência se ter desenrolado num espaço de tempo relativamente curto.

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8-Bibliografia

>1 Corrales , M . et al . Extraction of anthocyanins from grape by-

products assisted by ultrasonics , high hydrostatic pressure or pulsed

electric fields: A comparison. Innovate Food Science and Emerging

Tecnologies (2007), doi:10.1016 / j.ifset.2007.06.002

>Faria ,Ana et al .Antioxidant Properties of Prepared Blueberry

(Vaccinium myrtillus) Extracts. Journal of Agricultural and Food

Chemistry(2005).Americam Chemical Society 10.1021/jf0511300.

Published on web 07/23/2005

>Manetas,Yiannis . Why some leaves are anthocyanic and why most

anthocyanic leaves are red? . Laboratory of Plant Physiology ,

Department of Biology , University of Patras, GR -26500 Patras Greece .

2005 Elsevier GmbH. doi:10.1016/j.flora.2005.06.010

>Brouillard,Raymond et al . Phytochemistry of Fruit and Vegetable-

Molecular ineractions of phenolic compounds in relation to the colour of

fruit and vegetables. Proceedings of the Phytochemical Society of Europe.

Clarendon Press , Oxford .1997

>M.Andersen, Oyvind and Jordheim ,Monica.Chapter 10 in

Flavonoids :Chemistry,Biochemistry and applications,(eds.O.M.Andersen,

K.R.Markhom) .2006,CRC Press. Boca Raton,USA

>www.scirus.com

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