RELATÓRIO 2 - Centrifugação

Bioquímica Experimental I

Departamento de Química e Bioquímica

Licenciatura em Bioquímica

Docente: Francisco Pinto

Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, nº 40267

Andreia Sousa, nº 40261

Telmo Paiva, nº 40243

PL 3

17 e 18 de Outubro de 2011

Ano Lectivo 2011/2012

Separação e

Análise de

componentes

celulares por

centrifugação

Diferencial

Separação e Análise de Componentes Celulares

por Centrifugação Diferencial

Página | 2

Índice

Resumo ......................................................................................................................... 4

Material e Métodos ....................................................................................................... 6

Preparação do homogenato de fígado de porco e centrifugação diferencial ................ 6

Determinação da actividade do succinato: citocrómo c oxidoreductase ...................... 8

Determinação da actividade do fosfatase ácido .......................................................... 9

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxilato ........................... 10

Análise da fracção nuclear – isolamento do DNA .................................................... 11

Resultados e Discussão ............................................................................................... 13

Apresentação do fluxograma do esquema da centrifugação diferencial utilizado no

fraccionamento sub-celular do fígado de porco. Identificação da composição

esperada para cada fracção. ................................................................................. 13

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato ........................ 14

Representação da curva de calibração de doseamento de proteína pelo método do

Biureto. Cálculo da concentração proteica do homogenato de fígado de porco e de

cada uma das fracções isoladas. ........................................................................... 14

Fracção Mitocondrial – determinação da actividade do succinato: citocrómo c

oxidoreductase ........................................................................................................ 16

Cálculo da actividade (U/mL) do succinato: citocrómo c oxidoreductase no

homogenato isolado e em cada fracção isolada. ................................................... 16

Representação gráfica da actividade específica (U mg-1

) do succinato: citocrómo c

oxidoreductase nas diferentes fracções. Comentário aos resultados obtidos. ........ 20

Fracção Lisossomal – determinação da actividade do fosfatase ácido ...................... 21

Determinação da actividade (U/mL) do fosfatase ácido no homogenato inicial e em

cada fracção isolada. ........................................................................................... 21


) do fosfatase ácido nas

diferentes fracções. Comentário aos resultados obtidos ........................................ 26



Página | 3

Distribuição dos marcadores enzimáticos estudados ................................................ 27

Conclusão sobre o sucesso do fraccionamento celular realizado. Discussão do

impacto do esquema de centrifugação, da técnica de homogeneização e dos ensaios

enzimáticos usados nos resultados experimentais obtidos. ................................... 27

Análise da fracção nuclear – isolamento do DNA .................................................... 30

Apresentação de um fluxograma dos vários passos envolvidos na preparação do

DNA. .................................................................................................................. 30

Cálculo da concentração de DNA na sua preparação (final) e também da

percentagem de DNA obtido por g de fígado. ...................................................... 31

Comentário sobre o grau de pureza do DNA obtido e a sua eventual contaminação

com proteínas. ..................................................................................................... 33

Conclusão ................................................................................................................... 34

Bibliografia ................................................................................................................. 36

Anexos........................................................................................................................ 37

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato ........................ 37

Cálculo das concentrações das soluções padrão ................................................... 37

Cálculo da concentração proteica das fracções ..................................................... 38

Fracção Mitocondrial: Determinação da actividade do succinato: citocrómo c

oxidoreductase ........................................................................................................ 40

Gráficos obtidos - curvas de calibração................................................................ 40



Página | 4

Resumo

A actividade laboratorial realizada teve como objectivo o isolamento de várias

fracções subcelulares a partir de um homogenato, neste caso, de fígado de porco por

centrifugação diferencial e a determinação da sua caracterização bioquímica, ou seja,

foram determinadas as actividades de dois marcadores enzimáticos: o succinato (pellet

2) e o fosfatase ácido (pellet 3) e ainda se procedeu ao doseamento de proteínas pelo

método do Biureto e ao doseamento de DNA (pellet 1).

As fracções obtidas foram a fracção nuclear (pellet 1), a mitocondrial pesada

(contém maioritariamente os mitocôndrios, pellet 2) e leve (contém maioritariamente

lisossomas, pellet 3) e uma quarta fracção contendo os restantes organelos celulares e o

citosol (fracção solúvel ou citosólica, que contém a parte solúvel da célula como as

proteínas solúveis, sobrenadante 3).

A primeira fracção recolhida foi a nuclear, na qual se procedeu ao isolamento

do DNA a fim de ser feita a determinação da sua concentração, cujo valor obtido foi de

0,289 g.mL-1

, cerca de 0,39% (m/m) presente na amostra.

Nas duas fracções seguintes, pellet 2 e pellet 3, foram determinadas as

actividades de succinato e de fosfatase ácido, respectivamente, a partir da lei de

Lambert-Beer. A actividade específica do succinato no pellet 2 foi de 0,0410 U.mg-1

e

esta foi a actividade específica mais elevada observada nesta fracção, o que era de

esperar uma vez que este enzima é específico da fracção mitocondrial. A actividade

específica de fosfatase ácido foi de 3,55×10-3

U.mg-1

para o pellet 3, que também foi a

actividade mais elevada, o que também era de esperar, pois este enzima é específico

para a avaliar a presença de lisossomas.

Através da realização de uns gráficos com as actividades de ambos os

marcadores enzimáticos, succinato e fosfatase ácido, foi possível concluir que, na

amostra de homogenato, a quantidade de mitocôndrios foi muito superior à quantidade

de lisossomas, dado que a actividade específica do enzima succinato desidrogenase foi

muito superior à actividade específica do enzima fosfatase ácido.



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Nesta actividade experimental procedeu-se, igualmente, ao doseamento de

proteínas através da aplicação do método do Biureto. Neste estudo concluiu-se que a

concentração de proteínas no homogenato era de 66,66 mg.mL-1

, no pellet 1 foi de

130,11 mg.mL-1

, no pellet 2 foi de 60,72 mg.mL-1

, no pellet 3 de 137,24 mg.mL-1

e

finalmente, no sobrenadante 3 verificou-se uma concentração proteica de 40,70

mg.mL-1

.



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Material e Métodos

Preparação do homogenato de fígado de porco e centrifugação diferencial

Material

Bisturis

Tesouras

Pinças

Homogeneizador de Potter-Elvehjem

Papel de filtro

Tubos de centrífuga

Supercentrífuga refrigerada

Soluções utilizadas

Meio de Isolamento: tampão HEPES (pH 7,4) 10 mM com sacarose 0,25

M e EDTA 1 mM

KOH 0.1 M

Tampão Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM contendo NaCl 150 mM e EDTA 100

mM (200 mL)

Métodos

Manteve-se o copo do homogeneizador em gelo até ao fim deste processo. Moveu-se para cima e para baixo entre 5-10 vezes, durante 5 segundos cada.

Transferiu-se porções dessa mistura para um homogeneizador de Potter-Elvehjem pré-arrefecido

Pesou-se o fígado, cortou-se em pequenos pedaços e adicionou-se meio de isolamento gelado

Transferiu-se o fígado lavado para um gobelé pré-tarado



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Suspendeu-se o pellet P3, que constitui a fracção mitocondrial "leve" meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvência

Guardou-se o sobrenadante S3

Centrifugou-se o sobrenadante S2 a 10000 x gav durante 20 minutos a 4ºC - C3

Suspendeu-se o pellet P2, que constitui a fracção mitocondria "pesada" em meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvência

Retirou-se o sobrenadante da C2 para outros tubos de centrífuga

Centrifugou-se o sobrenadante, S1, a 3000 x gav durante 10 minutos a 4ºc (centrifugação 2 - C2)

Suspendeu-se o pellet P1 em solução tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM; NaCl 150 mM e EDTA 100 mM. Manteve-se os tubos em gelo. Guardou-se uma amostra para

medir a absorvência

Removeu-se o sobrenadante cuidadosamente para outros tubos de centrífuga com o auxílio de uma pipeta de Pasteur

O pellet P1, obtido corresponde á fraccção nuclear. Manteve-se os tubos em gelo.

Dividiu-se o homogenato de fígado por tubos de centrífuga pré-arrefecida e centrifugou-se a 1000 x gav durante 10 minutos a 4ºC

Transferiu-se o fígado já homogeneizado para um erlenmeyer pré-arrefecido e colocado em gelo



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Nota: Todo o procedimento seguiu o protocolo, excepto a suspensão do pellet P2 e do

pellet P3, que foi efectuada em 0,5 mL de meio de isolamento. Procedeu-se desta forma,

uma vez que se usou fígado de porco em vez de fígado de rato, pelo que se diluiu

menos, de forma a não reduzir a actividade enzimática.

Determinação da actividade do succinato: citocrómo c oxidoreductase

Material

Espectrofotómetro UV-Vis

Cuvettes de plástico


Tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM

Citocromo C 1 mM em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM

KCN 0,3 M em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM

Succinato de sódio 0,5 M em tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM

Métodos

Repetiu-se o procedimento anterior para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final

Agitou-se a mistura por inversão, tapando a cuvette com parafilm. Seguiu-se a redução do citocrómo c pelo aumento de absorvência ao longo do tempo, 1 minuto

Iniciou-se a reacção com a adição de solução de succinato 0,5 M à célula amostra

Agitou-se bem a mistura e transferiu-se quantitativamente para uma cuvette

Adicionou-se tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM, solução de citocrómo c 1 mM, KCN 0,3 M e a fracção pretendida a um tubo de ensaio

Ajustou-se o zero do espectrofotómetro a 550 nm com água destilada



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Determinação da actividade do fosfatase ácido

Material




Desoxicolato de sódio 0,5% (m/v)

Tampão acetat de sódio (pH 5,0) 0,5M

pNPP (p-nitrofenilfosfato) 10 mM

NaOH 0,5M

Métodos

Repetiu-se o procedimento para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final

Leu-se a absorvência dos vários tubos a 400 nm, usando o conteúdo do tubo controlo como branco

Incubaram-se as amostras a 37˚C durante 10 min e pararou-se a reacção com a adição de NaOH 0,5 M

Adicionou-se a cada tubo desoxicolato de sódio 0,5% (m/v), misturou-se bem e adicionou-se tampão acetato de sódio (pH 5,0) 0,5 M

Preparou-se um tubo controlo igual aos anteriores, mas em que o volume de fracção celular foi substituído por água

Preparam-se 2 tubos de ensaio de acordo com o quadro abaixo (Quadro 1) para o homogenato, para as várias fracções colectadas e para o sobrenadante final



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Quadro 1. Doseamento da actividade do fosfatase ácido

Reagente Tubo

A B

Fracção (mL) 0,1 -

Fracção diluída ⁄ em

H2O (mL) - 0,1

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxilato

Material




Reagente do biureto com desoxicolato

Albumina sérica bovina (BSA) 5,0 mg/mL

TCA 10% (m/v)

Métodos

Arrefeceu-se e leu-se a absorvência a 540 nm

Aqueceu-se os tubos de ensaio num banho de água fervente durante 1 min

Preparou-se uma curva-padrão para o método do biureto segundo as indicações do quadro abaixo, Quadro 2

Adicionou-se água destilada para suspender o pellet.

Centrifugou-se a 600 X g durante 7 min e decantou-se o sobrenadante

Retirou-se uma alíquota de cada fracção e adicionou-se 1 volume de TCA 10% (m/v)



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Quadro 2. Doseamento de proteína pelo método do biureto com desoxicolato.

Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

BSA 5 mg mL-1

(mL) 0,0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,0

H2O (mL) 1,0 0,95 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,2 0,0

Reagente do

Biureto (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Análise da fracção nuclear – isolamento do DNA

Material


Cuvettes de quartzo


NaOH 10 M

Tampão Tris-HCI (pH 8,0) 1M (1 L)

NaCI 5 M (500 mL)

EDTA 0,5 M pH 8,0 (500 mL)

SDS 10% (m/v) (250 mL)

NaClO4 5 M (500 mL)

Tampão de citratos de sódio (pH 7,0) 0,15 M (1L)

Tampão citrato (pH 7,0) 0,015 M contendo 0,15 M NaCl

Clorofórmio: álcool isoamílico (24:1, v/v) (250 mL)

Etanol absoluto



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Métodos

Após se ter acertado o zero do espectrofotómetro, determinou-se a concentração de DNA na sua preparação através de absorvência a 260 nm. Registou-se também a

leitura de absorvência a 280 nm

Dissolveu-se o sedimento de DNA em solução de citrato (pH 7,0) 0,015 M contendo 0,15 M NaCl

Centrifugou-se durante 10 minutos a 600 x gav e desprezou-se o sobrenadante

Misturou-se por inversão.

Precipitou-se os ácidos núcleicos com etanol absoluto a -20ºC

Transferiu-se cuidadosamente a fase aquosa, superior, que continha os ácidos nucleicos para um tubo

Adicionou-se um volume de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1, v/v). Tapou-se e misturou-se com cuidado durante 20 minutos

Centrifugou-se a 3500 x gav durante 10 minutos

Adicionou-se NaClO4 5 M e misturou-se cuidadosamente por inversão

Arrefeceu-se o tubo à mergulhando-o em água

Aqueceu-se a mistura num banho de água a 60ºC durante 10 minutos, continuando a agitar

Misturou-se cuidadosamente por inversão

Adicionou-se SDS 10% (v/v) ao sedimento já ressuspendido em solução tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM, NaCl 150 mM e EDTA 100 mM



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Resultados e Discussão

Apresentação do fluxograma do esquema da centrifugação diferencial utilizado no

fraccionamento sub-celular do fígado de porco. Identificação da composição

esperada para cada fracção.

Figura 1. Esquema da centrifugação diferencial

Homogenato

Pellet 1

Fracção nuclear

Sobrenadante (S1)

Pellet 2

Fracção mitocondrial

"pesada"

Sobrenadante (S2)

Pellet 3

Fracção mitocondrial

"leve"

Sobrenadante (S3)



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Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato

Representação da curva de calibração de doseamento de proteína pelo método do

Biureto. Cálculo da concentração proteica do homogenato de fígado de porco e de

cada uma das fracções isoladas.

Para calcular a concentração proteica das diferentes fracções obtidas do fígado,

utilizou-se o método do biureto. O princípio do método de Biureto baseia-se na reacção

do reactivo do biureto, que é constituído por uma mistura de cobre (sulfato de cobre

pentahidratado) e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em

solução, que normalmente é tartarato de sódio. Em meio alcalino, o cobre reage com

proteínas (formando um complexo com ligações peptídicas) e forma um complexo

quadrangular plano de cor roxo.

No cálculo das concentrações proteicas das fracções obtidas foi necessário

compará-las com soluções padrão. As soluções padrão são preparadas com o fim de

possuírem diferentes concentrações proteicas, conhecidas, em que foi aplicado o método

do biureto (para que se encontrem nas mesmas condições que as amostras). Através

destas soluções, sabendo a sua concentração e a que absorvência correspondem é

possível obter uma recta de calibração que permitirá obter a concentração proteica das

amostras pretendidas.

Para a construção da curva de calibração, realizaram-se três medições de

absorvência para cada uma das concentrações proteicas teóricas (Quadro 3) – ver

cálculos referentes à concentração proteica das soluções padrão em anexo.

.

Quadro 3. Concentração das soluções padrão e respectivas absorvâncias.

Tubos Concentração

proteica (mg mL-1

)

1ª medição 2ª medição 3ª medição

0 0,000 0,035 0,033 0,032

1 0,083 0,057 0,056 0,058

2 0,167 0,076 0,083 0,075

3 0,333 0,123 0,117 0,116

4 0,500 0,166 0,169 0,153

5 0,666 0,198 0,201 0,199

6 0,833 0,241 0,216 0,244

7 1,000 0,285 0,281 0,277

8 1,333 0,349 0,346 0,351

9 1,667 0,434 0,424 0,417



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Figura 2. Representação gráfica da curva de calibração de doseamento proteico pelo

método do biureto.

Com a recta de calibração obtida ( ) é agora possível medir

a concentração das fracções através das absorvências medidas, sendo que corresponde

à absorvência medida e à concentração da solução, tem-se que:

Para a medição das absorvências foram retirados a cada fracção 0,5 mL no caso

do homogenato e do pellet 1, e 0,75 mL no caso das restantes fracções (volumes

correspondentes à concentração da fracção, [fracção]). A estes volumes foi adicionado o

mesmo volume (retirado de cada fracção) de TCA 10% (m/v), ou seja, ao homogenato e

ao pellet 1 foram adicionados 0,5 mL e às restantes 0,75 mL. Após centrifugação foram

adicionados 4 mL de água, o que significa que esta solução ficou com um volume total

de 5,0 mL (solução do homogenato e pellet 1) e de 5,5 mL (soluções restantes) – a

concentração da suspensão, [suspensão], corresponde à concentração proteica deste

volume.

A 1 mL das soluções anteriores foram adicionados 2 mL de reagente do biureto

(a esta solução corresponde a concentração da solução do tubo de ensaio, [tubo de

ensaio]) e foram aquecidas num banho de água fervente durante 1 minuto.

y = 0,078x + 0,0397

R² = 0,9969

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,333 0,666 0,999 1,332 1,665 1,998

Ab

sorv

ân

cia a

540 n

m

Concentração Padrão (mg mL-1)

Curva de Calibração de doseamento proteico pelo

método do biureto

Absorvância

Linear (Absorvância)



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No quadro seguinte (Quadro 4) é possível observar as concentrações referidas

anteriormente e a concentração na fracção – os cálculos necessários ao preenchimento

deste quadro encontram-se em anexo.

Quadro 4. Registo das absorvências das várias medições das fracções em que foi

aplicado o método do biureto e respectivas concentrações.

Tubos

Abs540nm

Dil

uiç

ão

[tu

bo d

e en

saio

]

(mg m

L-1

)

[su

spen

são]

(mg m

L-1

)

[fra

cção]

(mg

mL

-1)

VT (

Fra

cção)

(mL

)

m p

ro

teic

a

(m

g)

Medições

Média 1 2 3

H 0,199 0,228 0,213 0,213 - 2,222 6,666 66,66 211 14065,26

Pellet 1 0,346 0,457 0,330 0,378 - 4,337 13,011 130,11 20 2602,20

Pellet 2 0,269 0,252 0,245 0,255 - 2,760 8,280 60,72 7 425,04

Pellet 3 0,290 0,279 0,281 0,283 1:2 6,238 18,714 137,24 7 960,68

Sobrenadante

3 0,196 0,175 0,181 0,184 - 1,850 5,550 40,70

206 8384,20

Fracção Mitocondrial – determinação da actividade do succinato: citocrómo

c oxidoreductase

Cálculo da actividade (U/mL) do succinato: citocrómo c oxidoreductase no

homogenato isolado e em cada fracção isolada.

Para analisar a pureza das fracções mitocondriais e a sua “dispersão” ao longo de

outras fracções, analisou-se a presença de um enzima característico, succinato

desidrogenase, dos mitocôndrios. Este enzima participa em duas das mais importantes

vias metabólicas que ocorrem no mitocôndrio: a cadeia respiratória e o ciclo do ácido

cítrico. O succinato desidrogenase tem localização exclusiva no mitocôndrio e como tal

pode ser designado por marcador enzimático. Assim, determinando a sua actividade

pode-se determinar a fracção mais pura (em mitocôndrios) – considera-se que uma dada

fracção sub-celular se encontra “limpa”, quando a actividade específica do seu marcador

enzimático (succinato desidrogenase) é 3 vezes superior à das outras fracções.



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Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à

quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, succinato desidrogenase) – o

aumento de absorvência a 550 nm varia linearmente com o tempo.

Para calcular a actividade do enzima partiu-se da velocidade limite da reacção,

que corresponde à concentração de substrato que se forma por unidade de tempo:

Sabendo que o declive (m) do gráfico da absorvência a 550 nm em função do

tempo (em segundos) obtido corresponde a:

Pela Lei de Lambert-Beer obtém-se:

Substituindo na equação da velocidade obtém-se:

Como a concentração é dada em M (mol L-1

), é necessário multiplicar a fórmula

anterior pelo volume que se colocou na cuvette para obter as unidades pretendidas, ou

seja, mol min-1

. O volume que se colocou na cuvette foi mL, ou seja,

. Logo:

Como as unidades de U são em , multiplicou-se a equação anterior

por :

Para obter a actividade do enzima divide-se o resultado da equação anterior pelo

volume da fracção colocado na cuvette, ou seja, 0,05 mL:

Para obter a actividade total do enzima, multiplica-se a actividade pelo volume

total da fracção:



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Sabendo a massa de enzima (calculado no ponto anterior) é possível calcular a

actividade de especifica – SA – número de moles que reagem por unidade de tempo e

por massa de enzima:

Tome-se como exemplo o Homogenato:

Figura 3. Representação gráfica da variação de absorvência com o tempo, durante 1

minuto (60 segundos), do homogenato de fígado de porco.

Através do gráfico anterior (Figura 3) obtém-se o valor do declive da recta, ou

seja,

Através das equações deduzidas anteriormente, sabendo que

e , tem-se:

y = 0,0005x + 0,4818

R² = 0,9953

0,475

0,485

0,495

0,505

0,515

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860

Ab

s550n

m

Tempo (s)

Homogenato de Fígado de Porco



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Os cálculos para as restantes fracções realizaram-se analogamente – os gráficos

podem ser encontrados em anexo. O quadro abaixo (Quadro 5) resume os resultados das

fracções.

Quadro 5. Resumo dos resultados obtidos para o succinato desidrogenase.

Amostra

VT

(Fracção)

(mL)

Diluição

(min-1

)

Actividad

e (U mL-1

)

Actividade

T (U)

m proteica

(mg)

SA

(U mg-1

)

Homogenato 211 - 0,0005 1,036 218,60 14065,26 0,0155

Pellet 1 20 - 0,0009 1,866 37,32 2602,20 0,0143

Pellet 2 7 - 0,0012 2,466 17,42 425,04 0,0410

Pellet 3 7 - 0,0015 3,110 21,77 960,68 0,0227

Sobrenadan

te 3 206 - 0,0002 0,414 85,28 8384,20 0,0102



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) do succinato: citocrómo c

oxidoreductase nas diferentes fracções. Comentário aos resultados obtidos.

Figura 4. Gráfico representativo das actividades específicas do sucinato:citocrómo c

oxidorreductase das diferentes fracções em estudo

A actividade especifica é maior no pellet 2, como esperado (Figura 1), no

entanto, não é 3 vezes superior a todas as outras fracções (em relação ao pellet 3 é 1,8

vezes superior, 1,8 < 3, pelo que o pellet 2 não é limpo em relação ao 3), ainda assim,

pode-se considerar que a separação foi bem sucedida.

Para a actividade específica do enzima obtiveram-se valores muito baixos. Para

este facto deve ter-se em conta que o fígado utilizado não foi imediatamente congelado

após a morte do animal (porco) pelo que a maior parte das proteínas presentes já se

encontravam inactivas, o que conduziu a uma menor actividade enzimática.

00,0050,01

0,0150,02

0,0250,03

0,0350,04

0,045

0,0155 0,0143

0,041

0,0227

0,0102

Actividade Específica do Succinato:citocrómo c

oxidorreductase



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Fracção Lisossomal – determinação da actividade do fosfatase ácido

Determinação da actividade (U/mL) do fosfatase ácido no homogenato inicial e em

cada fracção isolada.

A presença dos lisossomas pode ser detectada através de um enzima específico,

o fosfatase ácido. Este enzima hidrolisa as ligações éster de fosfato de uma forma não

específica, pelo que vários compostos que possuam grupos fosfato terminais podem ser

usados como substrato. O ensaio a ser utilizado tira vantagem do facto de um substrato

artificial, o p-nitrofenilfosfato (pPP), que é incolor, ser hidrolisado pelo enzima,

produzindo p-nitrofenol, que é amarelo, podendo ser determinado

espectrofotometricamente.

Nesta parte da experiência foram preparados dois conjuntos de tubos: um

conjunto apenas com a fracção de amostra (identificado com a letra A) e outro conjunto

de tubos com a fracção da amostra diluída na proporção de 1:10 (identificado com a

letra B). Posteriormente procedeu-se à leitura das suas absorvências, que se apresentam

no quadro a seguir (Quadro 6).

Quadro 6. Absorvências medidas a 400nm para os tubos preparados para a fracção

lisossomal.

Tubo Fracção Abs400nm

A

Homogenato 1,272

Pellet 1 0,482

Pellet 2 1,091

Pellet 3 2,556

Sobrenadante 3 0,908

B

(diluição 1:10)

Homogenato 0,117

Pellet 1 0,079

Pellet 2 0,120

Pellet 3 0,118

Sobrenadante 3 -0,001( = 0*)



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* durante a medição da absorvência deve ter ocorrido um erro, pois a absorvência deu negativo,

por isso vamos considerar o seu valor como zero.

Em seguida apresentam-se ilustrados os métodos de cálculo para a

determinação da actividade do fosfatase ácido nos tubos A e B (diluição 1:10). Para

estes cálculos, é de referir que se considerou a variação de absorvência, ∆Abs400nm,

como sendo a diferença entre o valor lido no espectrofotómetro (valor final) e o valor

inicial, zero, uma vez que nesta altura não tinha passado tempo suficiente para ocorrer a

reacção.

Assim, para os tubos A e B tem-se:

Quadro 7. Valores da variação de absorvência para o tubo A.

Tubo Fracção Abs400nm inicial Abs400nm final ∆Abs400nm

A

Homogenato 0 1,272 1,272

Pellet 1 0 0,482 0,482

Pellet 2 0 1,091 1,091

Pellet 3 0 2,556 2,556

Sobrenadante 3 0 0,908 0,908

B

Homogenato 0 0,117 0,117

Pellet 1 0 0,079 0,079

Pellet 2 0 0,120 0,120

Pellet 3 0 0,118 0,118

Sobrenadante 3 0 0 0

Exemplificação dos cálculos para o homogenato no tubo A:

A variação de absorvência a 400nm por unidade de tempo, em min-1

é obtida

através do quociente entre a ∆Abs400 obtida em cada ensaio e o tempo de duração da

reacção, 10 minutos.



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Para determinar a actividade do fosfatase ácido é necessário calcular a

velocidade de reacção. A velocidade de reacção do enzima, variação da concentração

(moles por litro) por unidade de tempo, em mol.min-1

, é obtida pela seguinte equação:

⁄

Onde εpNPP = 21000 M-1

cm-1

e o volume do tubo é de4 mL = 4×10-3

L.

Assim, a velocidade de reacção é:

Através da velocidade de reacção podemos calcular a actividade do enzima,

correspondente ao número de moles que reagem por unidade de tempo, U/mL. Neste

caso, é preciso ter em atenção que U vem expresso em µmol.min-1

. Podemos, então

calcular esta actividade através da equação:

Assim sendo, para o caso particular do homogenato no tubo A tem-se:

A actividade total do enzima, número de moles que reagem por unidade de

tempo em U, é então dada pela seguinte equação:

Tem-se, assim, para o homogenato:

Sabendo a massa proteica de homogenato (cálculos apresentados em anexo) é,

então, possível calcular a sua actividade específica, SA através da expressão:

A actividade específica para o homogenato, é então:



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Para as outras fracções os cálculos são feitos analogamente, portanto,

apresentam-se os mesmos no quadro a seguir (Quadro 8).

Quadro 8. Resumo dos cálculos realizados para o tubo A

Amostra

VT

(Fracção)

(mL)

Diluição

(min-1

)

Actividade

(U mL-1

)

ActividadeT

(U)

m proteica

(mg)

SA

(U mg-1

)

Homogenato 211 - 0,1272 0,2423 51,12 14065,26 3,63×10-3

Pellet 1 20 - 0,0482 0,2078 1,84 2602,20 7,07×10-4

Pellet 2 7 - 0,1091 0,0918 1,45 425,04 3,41×10-3

Pellet 3 7 - 0,2556 0,4868 3,41 960,68 3,55×10-3

Sobrenadante 3 206 - 0,0908 0,1739 35,82 8384,20 4,27×10-3

Exemplificação dos cálculos para o homogenato no tubo B (diluição 1:10):

No caso dos tubos B as amostras foram preparadas analogamente às do tubo A,

mas diluídas em água na proporção de 1:10. Em seguida estão exemplificados os

cálculos para o homogenato do tubo B.

A variação de absorvência a 400nm por unidade de tempo, em min-1

é dada

por:

Para determinar a actividade do fosfatase ácido é necessário calcular a

velocidade de reacção. A velocidade de reacção do enzima, variação da concentração

(moles por litro) por unidade de tempo, em mol.min-1

, é obtida pela seguinte equação:

⁄

Onde εpNPP = 21000 M-1

cm-1

e o volume do tubo é de4 mL = 4×10-3

L.

Assim, a velocidade de reacção do homogenato para o tubo B é:



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Através da velocidade de reacção podemos calcular a actividade do enzima,

correspondente ao número de moles que reagem por unidade de tempo, U/mL. Neste

caso é preciso ter em atenção que U vem expresso em µmol.min-1

e que, como o factor

de diluição é de 1:10, é necessário multiplicar por 10 o valor da actividade obtida.

Podemos, então calcular esta actividade através da equação:

Assim sendo, para o caso particular do homogenato no tubo B tem-se:

A actividade total do enzima, número de moles que reagem por unidade de

tempo em U é, então, dada pela seguinte equação:

Tem-se, assim, para o homogenato:

Sabendo a massa proteica de homogenato (cálculos apresentados nos anexos)

é, então, possível calcular a sua actividade específica, SA através da expressão:

A actividade específica para o homogenato é então:

Para as outras fracções os cálculos são feitos analogamente, portanto,

apresentam-se os mesmos no quadro a seguir (Quadro 9).

Quadro 9. Resumo dos cálculos realizados para o tubo B (diluição 1:10).

Amostra

VT

(Fracção)

(mL)

Diluição

(min-1

)

Actividade

(U mL-1

)

ActividadeT

(U)

m proteica

(mg)

SA

(U mg-1

)

Homogenato 211 1:10 0,0117 0,223 47,05 14065,26 3,34×10-3

Pellet 1 20 1:10 0,0079 0,150 3,00 2602,20 1,15×10-3

Pellet 2 7 1:10 0,0120 0,228 1,59 425,04 3,74×10-3

Pellet 3 7 1:10 0,0118 0,225 1,58 960,68 1,64×10-3

Sobrenadante 3 206 1:10 0 0 0 8384,20 0



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) do fosfatase ácido nas

diferentes fracções. Comentário aos resultados obtidos

Figura 5. Gráfico representativo das actividades específicas do fosfatase ácido das

diferentes fracções em estudo

A partir de um homogenato de células de fígado podem ser obtidas 3 fracções,

como é visível no esquema da centrifugação (Figura 1). A terceira fracção recolhida,

Pellet 3, denomina-se fracção microssomal (ou mitocondrial “leve”) e nela encontram-

se ribossomas, polissomas e pequenas vesículas provenientes principalmente do

Retículo Endoplasmático e do Complexo de Golgi.

Assim sendo, a fracção onde era esperado obter-se mais actividade enzimática

era no pellet 3.

Através da observação da representação gráfica anterior (Figura 5), para o tubo

A, que tem a fracção não diluída, é possível observar que a actividade específica é

maior no sobrenadante 3, seguindo-se o homogenato e só depois o pellet 3, pelo que se

pode concluir que a separação não foi bem sucedida. Este resultado deve-se às

partículas de pequenas dimensões que, por se encontrarem perto do fundo do tubo da

centrífuga, pode sedimentar juntamente com as partículas de maior massa, ou até serem

0,00E+00

5,00E-04

1,00E-03

1,50E-03

2,00E-03

2,50E-03

3,00E-03

3,50E-03

4,00E-03

4,50E-033,63E-03

7,07E-04 3,41E-04

3,55E-03

4,27E-03

3,34E-03

1,15E-03

3,74E-03

1,64E-03

0

Act

ivid

ad

e E

spec

ífic

a U

.mg

-1

Fracção

Actividade Específica do Fosfatase Ácido

A (fracção não diluída)

B (fracção diluída 1:10)



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arrastadas por estas, dando origem a pellets impuros, logo a uma centrifugação menos

eficiente.

Quanto às soluções do tubo B, que contêm a fracção diluída 1:10, seria de

esperar obter uma actividade semelhante à do tubo A pois, apesar das soluções B terem

a fracção diluída, os cálculos da actividade específica (SA) efectuados tiveram em conta

esta diluição. A obtenção de valores tão diferentes nos tubos A e B deve-se a um erro

durante a incubação dos tubos que conduziu a que nem todos tivessem 10 minutos até a

reacção ser parada com NaOH, assim, tubos que tiveram mais tempo de incubação

possuem maior actividade enzimática e como tal maior actividade específica.

Distribuição dos marcadores enzimáticos estudados

Conclusão sobre o sucesso do fraccionamento celular realizado. Discussão do

impacto do esquema de centrifugação, da técnica de homogeneização e dos ensaios

enzimáticos usados nos resultados experimentais obtidos.

A avaliação do resultado final no isolamento de um organito subcelular requer

um teste para a presença desse organito. Tipicamente, mede-se a actividade de um

enzima cuja localização subcelular é exclusiva desse organito. Estes enzimas são

designados de marcadores enzimáticos. Estes marcadores fornecem informação sobre o

grau de pureza bioquímica dos organitos fraccionados.

Os marcadores enzimáticos desta actividade laboratorial são, nomeadamente, o

sucinato: citocrómo c oxidoreductase (fracção mitocondrial) e o fosfatase ácido (fracção

microssomal).

Os resultados obtidos para estes enzimas apresentam-se resumidos no quadro

seguinte (Quadro 10).



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Quadro 10. Quadro resumo das actividades dos marcadores enzimáticos.

Succinato:citocromo c

oxidorreductase Fosfatase ácido

Amostra Vt

(mL)

[proteína]

(mg.mL-1

)

Actividade

(U.ml-1)

SA

(U.mg-1

) Tubo

Actividade

(U.ml-1)

SA

(U.mg-1

)

Homogenato 211 66,66 1,036 0,0155 A 0,2423 3,63×10

-3

B 0,2230 3,34×10-3

Pellet 1 20 130,11 1,866 0,0143 A 0,2078 7,07×10

-4

B 0,1500 1,15×10-3

Pellet 2 7 60,72 2,466 0,0410 A 0,0918 3,41×10

-4

B 0,2280 3,74×10-3

Pellet 3 7 137,24 3,110 0,0227 A 0,4868 3,55×10

-3

B 0,2250 1,64×10-3

Sobrenadante

3 206 40,70 0,414 0,0102

A 0,1739 4,27×10-3

B 0 0

Para as conclusões a retirar acerca do sucesso do fraccionamento celular

realizado, apenas se teve em consideração os valores de actividade específica obtidos

para o caso A (fracções não diluídas), mesmo tendo sido calculados os mesmos valores

para o caso B (fracções diluídas na proporção 1:10).

Através da observação do gráfico e comparando os resultados obtidos para

cada amostra e para cada marcador enzimático, é claramente visível que na amostra de

homogenato, a quantidade de mitocôndrios (pellet 2) foi muito superior à das outras

fracções, dado que a actividade específica do enzima succinato desidrogenase, para uma

menor concentração proteica, foi muito superior comparando com as outras. Tal facto

era de esperar, visto que a determinação da actividade específica deste enzima consiste

na medição espectrofotométrica da redução do citocrómo c pelo sucinato.

Para o caso do fosfatase ácido, é possível observar que as maiores actividades

específicas obtidas foram para o pellet 3 e para o sobrenadante 3. Era de esperar, no

caso do pellet 3, que a actividade específica fosse mais elevada, uma vez que é nessa

fracção que se encontram os lisossomas e, visto que a presença dos mesmos é detectada

através do enzima específico fosfatase ácido, a actividade aí seria, então, maior. No caso

do sobrenadante 3 não era de esperar actividade do enzima, uma vez que, caso a



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centrifugação tivesse sido eficiente, nesta fracção não se encontrariam lisossomas ou

mitocôndrios e, por isso, não se observariam actividades dos enzimas específicos.

De uma forma global, verifica-se que, na amostra de homogenato, a quantidade

de mitocôndrios foi muito superior à quantidade de lisossomas, dado que a actividade

específica do enzima succinato desidrogenase foi muito superior à actividade específica

do enzima fosfatase ácido.

A eficácia da centrifugação diferencial realizada não foi a esperada, uma vez

que se obtiveram amostras heterogéneas e com alguns contaminantes. A maioria dos

contaminantes surgiu no sobrenadante 3, pois, teoricamente, esperava-se que esta

amostra não contivesse lisossomas ou mitocôndrios. Deste modo, na separação dos

mitocôndrios, pode concluir-se que os resultados experimentais correspondem aos

previstos, pois obteve-se uma maior actividade destes nos pellets 2 e 3. Também para o

caso dos lisossomas, os resultados experimentais corresponderam ao previsto porque,

apesar de se ter obtido estes organitos em todas as fracções, verificou-se uma maior

actividade no pellet 3.

A obtenção destes resultados foi feita com uma centrifugação diferencial,

centrifugação esta que, apesar de ter a vantagem de utilizar uma técnica simples e

rápida, tem como desvantagem a obtenção de pellets frequentemente heterogéneos, nos

quais pode ocorrer a distribuição do mesmo tipo de partículas por diferentes pellets.

Neste tipo de técnicas, é necessário ter também em atenção o processo de

homogeneização utilizado. Neste caso específico foram usados métodos mecânicos,

métodos estes que geram calor, pelo que é necessário assegurar um arrefecimento de

todo o material envolvido no processo. É também necessário ter em atenção as

dificuldades que existem no manuseamento do material biológico.

Um dos factores importantes é assegurar a preservação da integridade das

moléculas em estudo. Neste caso, usou-se um meio de homogeneização que continha

tampão HEPES (pH7,4) 10 mM para manter as condições de pH fisiológicas; sacarose

0,25 M de modo a evitar a lise osmótica dos organitos e EDTA 1 mM, por forma a

remover os iões metálicos que inactivam as proteínas por ligações dos seus grupos –SH

e também os iões Ca2+

que activam alguns enzimas presentes no homogenato e que

poderiam comprometer o estudo da separação e análise dos componentes celulares do



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Precipitaram-se os ácidos núcleicos com etanol absoluto.

Transferiu-se a fase aquosa, superior, para um tubo.

Adicionou-se clorofórmio: álcool isoamílico (24:1, v/v). Tapou-se e misturou-se.

Centrifugou-se.

Adicionou-se NaClO4 5 M e misturou-se por inversão.

Arrefeceu-se o tubo, mergulhando-o em água.

Aqueceu-se a mistura, continuando a agitar.


Adicionou-se SDS 10% (v/v) ao sedimento já ressuspendido em solução tamponada.

fígado de porco. Assim, uma aplicação deficiente destes compostos durante o

procedimento poderá ter dado lugar a erros nos resultados obtidos.

Análise da fracção nuclear – isolamento do DNA

Apresentação de um fluxograma dos vários passos envolvidos na preparação do

DNA.

Sumariamente, o processo de extracção do DNA baseou-se na sua libertação

para um meio no qual este era solúvel, seguida da dissociação dos complexos entre estes

e diversas proteínas, nomeadamente as histonas. Por fim, apenas foi necessário separar

o DNA dos outros componentes celulares solúveis.



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Determinou-se a concentração de DNA na preparação através de absorvância a 260 nm.

Registou-se a leitura de absorvência a 280 nm.

Dissolveu-se o sedimento de DNA em solução citrato.

Centrifugou-se e desprezou-se o sobrenadante.


Cálculo da concentração de DNA na sua preparação (final) e também da

percentagem de DNA obtido por g de fígado.

Tal como se encontra no protocolo da actividade experimental, considerando que

a 1 U.A260nm corresponde uma concentração de DNA de 50 μg/mL é possível calcular a

concentração de DNA dissolvido:

1 U.A260nm 50 μg/mL

0,867 U.A260nm [DNA]diluído

[DNA]diluído = μg/mL = mg/mL

Conhecendo a concentração de DNA diluído, é possível calcular a concentração

de DNA presente no homogenato, tendo em conta o factor de diluição (1/10):

[ ] [ ] mg/mL

Dado que, no final do processo de isolamento, se dissolveu o DNA em 20 mL de

tampão, pode calcular-se a massa de DNA.

[ ]

[ ]

Assim,



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A massa de DNA no homogenato é, portanto, de 8,67 mg, em 30 mL de volume

de resuspensão. Sabendo que a massa de fígado usado para a preparação do homogenato

foi 15,48 g, logo, recorrendo ao volume inicial de homogenato (211,4 mL), calcula-se a

massa de DNA total no fígado:

8,67 mg de DNA 30 mL (volume de resuspensão)

211,4 mL (volume de homogenato)

Cálculo da concentração de DNA no fígado recorrendo à massa calculada

anteriormente e ao volume de homogenato usado inicialmente:

[ ]

[ ]

Sabendo que a massa de fígado usado para a preparação do homogenato foi

15,48 g, determina-se a percentagem de DNA presente no fígado:

(

)

(

)

Quadro 11. Resumo dos resultados obtidos na análise da fracção nuclear.

Factor

de

diluição

[DNA]

(mg/mL)

Massa de

DNA (mg)

Massa de DNA no

fígado (mg)

[DNA] no

fígado (g/mL)

% (m/m) de

DNA no

fígado

1:10 8,67 61,09 0,289 0,39



Página | 33

Comentário sobre o grau de pureza do DNA obtido e a sua eventual contaminação

com proteínas.

O grau de pureza do DNA obtido a partir do fígado pode ser avaliado através da

leitura da sua absorvência a 260nm e a 280nm. A partir dos valores obtidos, calcula-se o

quociente entre eles e, a partir do resultado pode concluir-se acerca da purificação do

DNA:

O DNA obtido encontra-se com um grau de pureza

relativamente elevado e, portanto, pouco

contaminado.

Experimentalmente obtiveram-se os seguintes resultados:

Abs260 = 0,867

Abs280 = 0,430

Assim, pode concluir-se que o processo de isolamento do DNA foi eficaz, ainda

que, não se tenha obtido uma relação entre as duas absorvâncias exactamente igual a 2.

Este facto deve-se à presença de diversos resíduos de aminoácidos com cadeias laterais

aromáticas (tirosina, triptofano, fenilalanina), os quais apresentam absorvância a

280nm, comprimento de onda usado para a medição da absorvância do DNA isolado.

O valor obtido experimental deveria ser comparado com os valores teóricos que

correspondem à quantidade de DNA no fígado. No entanto, como não foi possível ter

acesso a esses valores, esta comparação não pôde ser feita e, como tal, não se pode

concluir se se purificou uma elevada quantidade de DNA, quando comparada com

aquela que existe no fígado do porco.



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Conclusão

A base da realização de todo o trabalho experimental centrou-se na técnica de

centrifugação diferencial, sendo que, através dela, se procedeu ao isolamento de várias

fracções subcelulares de fígado de porco, para no final se efectuar a sua caracterização

bioquímica. Assim, conseguiu-se extrair o DNA da fracção nuclear e estudar a

distribuição de dois marcadores enzimáticos pelas diferentes fracções isoladas com o

objectivo de avaliar o seu grau de pureza.

É de salientar que, em primeiro lugar, foi usado fígado de porco em vez de

fígado de rato para preparar o homogenato. Para o cálculo da sua concentração e de

cada uma das fracções isoladas utilizou-se o método de doseamento proteico do biureto

com desoxicolato. Concluiu-se, assim, que não é possível estabelecer uma relação

directa entre a concentração proteica das fracções recolhidas com a ordem de

centrifugação de cada uma delas, pois o pellet 2 apresenta menor concentração que o

pellet 3 e o pellet 1, enquanto este apresenta menor concentração que o pellet 3.

Relativamente à massa de proteína presente em cada uma das fracções

analisadas, esta é maior no sobrenadante 3, o que indica que, para além das proteínas

recolhidas, o fígado continha ainda outras, as quais ficaram suspensas no sobrenadante.

A fracção mitocondrial foi analisada através da determinação da actividade do

succinato: citocrómo c oxidoreductase, uma vez que o succinato pode ser classificado

com um marcador enzimático do mitocôndrio. Tal como esperado, o pellet 2 foi aquele

que continha a fracção mitocondrial, pois verificou-se que se trata da fracção cuja

actividade específica do succinato: citocrómo c oxidoreductase foi maior, tendo-se

efectuado uma separação relativamente eficaz.

A determinação da actividade do fosfatase ácido permitiu analisar a fracção

lisossomal, bem como a presença de ribossomas, polissomas e vesículas derivadas do

complexo de Golgi e do retículo endoplasmático. Face aos dados obtidos concluiu-se

que estes organitos encontram-se, em maior quantidade no sobrenadante 3. Apesar de

ser esperado que isto se verificasse apenas no pellet 3, isto não aconteceu, pois os

lisossomas possuem um tamanho heterogéneo e, durante a centrifugação diferencial,

acabam por cosedimentar com outros organitos, daí a sua dispersão pelas várias

fracções.



Página | 35

Através da determinação e análise da actividade específica dos diversos

marcadores enzimáticos estudados foi possível, finalmente, concluir acerca da

composição de todas as fracções recolhidas e da comparação com o resultado previsto.

Globalmente, apesar da centrifugação diferencial ter sido bem sucedida, não se

conseguiu proceder ao isolamento total das proteínas correspondentes a cada uma das

fracções.

Por fim, extraindo o DNA da fracção nuclear foi possível garantir que, de facto,

a primeira centrifugação permitiu separar o conteúdo nuclear do homogenato de fígado.

Concluiu-se que, apesar de este se encontrar relativamente contaminado com outras

proteínas, foi possível quantificar o material genético presente nesta fracção.



Página | 36

Bibliografia

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raif M, Roberts K, Watson J (1989) Molecular Biology of

the Cell, 2nd ed, Garland Pub., New York.

Alexander R, Griffiths JM, Wilkinson ML (1985) Basic Biochemical Methods, John

Wiley and Sons, New York.

Bohinski RC (1983) Modern Concepts in Biochemistry, 4th ed., Allyn & Bacon Inc.,

Boston.

Clark JM Jr, Switzer RL (1977) Experimental Biochemistry, 2nd ed. W. H. Freeman &

Co, San Francisco.

Quintas, A.,Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica – Organização Molecular da

Vida”, Lidel, Lisboa, 2008



Página | 37

Anexos

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato

Cálculo das concentrações das soluções padrão

Através do quadro abaixo (Quadro I), pode-se calcular as concentrações de BSA

teóricas das soluções padrão.

Quadro I. Preparação das soluções padrão para a recta de calibração.

TUBO 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

BSA

5 mg mL-1

(mL)

0,0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,0

H2O (mL) 1,0 0,95 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,2 0,0

Reagente do Biureto

(mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Tome-se como exemplo o cálculo da concentração proteica do tubo 1.

Tubo 1

Pretende-se então calcular a concentração final, , que é a concentração referente ao

valor de absorvância medido. Através da equação , obtém-se:

O cálculo para os restantes tubos foi análogo. Os resultados obtidos para cada tubo

encontram-se resumidos no Quadro 3.



Página | 38

Cálculo da concentração proteica das fracções

Para o cálculo das concentrações proteicas das fracções foi utilizada a equação

da recta de calibração, visível na Figura 2:

Tome-se como exemplo o cálculo da concentração proteica para o homogenato e

para pellet 3.

Homogenato

Concentração no tubo de ensaio

Como se realizaram 3 medições de absorvância, o valor mais correcto a ser

utilizado é o valor da média entre os 3.

[ ]

Concentração suspensão

[ ]

Concentração da fracção



Página | 39

[ ]

Massa da fracção

Como o

A massa proteica da solução é:

[ ]

Pellet 3

Concentração no tubo de ensaio

Como se realizaram 3 medições de absorvância, o valor mais correcto a ser

utilizado é o valor da média entre os 3.

Esta solução teve que ser diluída 1:2 porque os valores de absorvência medidos

estavam acima da recta de calibração. Assim, para obter a concentração no tubo de

ensaio é necessário multiplicar a concentração obtida por 2:

[ ]

Concentração suspensão

[ ]

Concentração da fracção



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[ ]

Massa da fracção

Como o

A massa proteica da solução é:

[ ]

Para as restantes fracções (pellet 1, 2 e sobrenadante 3) efectuaram-se cálculos

análogos. No Quadro 4 encontra-se o resumo dos resultados obtidos.

Fracção Mitocondrial: Determinação da actividade do succinato: citocrómo

c oxidoreductase

Gráficos obtidos - curvas de calibração

Figura I. Representação gráfica da variação de absorvência com o tempo, durante 1

minuto (60 segundos), do Pellet 1 – fracção nuclear.

y = 0,0009x + 0,7725

R² = 0,6319

0,750,760,770,780,790,8

0,810,820,830,840,850,860,870,880,890,9

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860

Ab

s550n

m

Tempo (s)

Pellet 1 - fracção nuclear



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Figura II. Representação gráfica da variação de absorvência com o tempo, durante 1

minuto (60 segundos), do Pellet 2 – fracção mitocondrial “pesada”.

Figura III. Representação gráfica da variação de absorvência com o tempo, durante 1

minuto (60 segundos), do Pellet 3 – fracção mitocondrial “leve”.

y = 0,0012x + 0,5833

R² = 0,9996

0,58

0,59

0,6

0,61

0,62

0,63

0,64

0,65

0,66

0,67

0,68

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860

Ab

s550n

m

Tempo (s)

Pellet 2 - fracção mitocondrial "pesada"

y = 0,0015x + 0,9086

R² = 0,9993

0,90,910,920,930,940,950,960,970,980,99

11,011,021,031,041,05

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860

Ab

s550n

m

Tempo (s)

Pellet 3 - fracção mitocondrial "leve"



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Figura IV. Representação gráfica da variação de absorvência com o tempo, durante 1

minuto (60 segundos), do sobrenadante 3.

y = 0,0002x + 0,3574 R² = 0,9957

0,350,3510,3520,3530,3540,3550,3560,3570,3580,3590,36

0,3610,3620,3630,3640,3650,3660,3670,3680,3690,37

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860

Ab

s55

0n

m

Tempo (s)

Sobrenadante 3

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RELATÓRIO 2 - Centrifugação