REGENERACIÓN DE LA MIELINA EN LA ESCLEROSIS

MÚLTIPLE: INVESTIGACIÓN DE NUEVAS TERAPIAS QUE

CONTRIBUYAN A LA REMIELINIZACIÓN BASADAS EN LA

FIRMA GENÉTICA DE CÉLULAS MADRE NEURALES Y

CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES

Xavier Montalban Gairin

Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'Hebron

Mario Notari

CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona

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1. Resumen del proyecto

La esclerosis múltiple (EM) es una patología autoinmune que produce desmielinización

y daño axonal que causan déficits neurológicos a los pacientes. Los tratamientos de los

que disponemos actualmente actúan principalmente sobre el sistema inmune y son

bastante efectivos disminuyendo la actividad inflamatoria de la enfermedad, pero no

tienen ningún efecto en la regeneración de la mielina dañada.

Por ello, los objetivos de este estudio fueron: a) identificar compuestos químicos que

favorezcan la oligodendrogénesis in vitro en dos modelos celulares —células madre

neurales (CMN) de ratón y células madre humanas pluripotentes inducidas (CMPI)—, y

b) evaluar su potencial para mejorar la remielinización.

Diferenciamos CMN de ratón a células progenitoras de oligodendrocitos (CPOs) y a

oligodendrocitos, estudiamos su expresión génica y seleccionamos 15 genes como

huella genética que define la diferenciación desde CMN a oligodendrocito. Con esta

huella genética y el Connectivity Map obtuvimos una lista de compuestos. Cinco de

ellos se testaron in vitro y 3 de ellos demostraron que favorecían el proceso de

diferenciación de CMN a CPO y de CPO a oligodendrocito. Estos 3 compuestos se

testaron en dos modelos animales de desmielinización. Desafortunadamente, ninguno

de los fármacos seleccionados demostró tener efectos sobre la remielinización en

ninguno de los dos modelos animales.

También generamos 6 líneas de CMPI de 6 pacientes de EM, estratificados según un

polimorfismo en el gen TNFRSF1A. Demostramos que las CMPI generadas tenían la

capacidad de autorrenovarse y de diferenciarse a diferentes tipos celulares.

Observamos que las CMPI del grupo que tenía el alelo de riesgo formaban menos

rosetas neurales que el otro grupo, lo que indicaba que podría haber algún déficit en la

diferenciación al linaje neural. También encontramos que había una expresión

diferencial de OSP/claudina-11 entre los dos grupos durante el proceso de

diferenciación.

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2. Resultados

1.- Identificación de compuestos químicos que favorezcan la diferenciación de

oligodendrocitos y que podrían ser terapias neuroprotectoras para pacientes

con EM

1.1.- Definición de la huella de expresión génica y búsqueda de fármacos en

librerías químicas

En este estudio diferenciamos CMN de ratón a CPO y a oligodendrocitos, neuronas y

astrocitos, y se recogió su ARNm para definir el perfil de expresión génica que

caracteriza los diferentes estadios mediante microarrays.

Con el análisis de los microarrays encontramos que en el proceso de diferenciación de

CMN a CPO 1.093 genes estaban sobreexpresados y 1.010 reprimidos, y que en el

proceso de maduración de CPO a oligodendrocitos mielinizantes 557 genes estaban

sobreexpresados y 681 reprimidos. Los genes expresados diferencialmente se

seleccionaron y obtuvimos una huella de expresión génica formada por 15 genes:

Ncam2, Adra1a, Thra, Npas2, Sulf1, Cntn2, Prox1, Ndrg1, Bcl3, Cebp, Stat3, Sox5,

Fcgr2b, Ifnar2 e Il13ra1. Esta huella se consideró informativa del proceso de

diferenciación de CMN a oligodendrocito.

La huella genética se comparó con los perfiles de expresión génica de pequeñas

moléculas del Connectivity Map, y se obtuvo una lista de 39 compuestos. Los 5 mejor

posicionados con potencial para favorecer la remielinización (deptropina, picrotoxinina,

ácido valproico, perhexilina y pimozida) se seleccionaron para ser validados in vitro.

1.2.- Validación in vitro de los compuestos seleccionados

Las CMN se diferenciaron a CPO y a oligodendrocitos con los fármacos seleccionados

durante 48 horas, juntamente con un control positivo, un control negativo y un control

de vehículo (DMSO). Los cultivos celulares se fijaron para hacer inmunotinciones con

marcadores específicos para CPO (NG2) y oligodendrocitos (O4, O1, MBP, PLP), y

encontramos que la deptropina, la pimozida y el ácido valproico tenían un efecto

positivo sobre los cultivos, induciendo la diferenciación a CPO y a oligodendrocito en

comparación con el control negativo y el vehículo, aunque ninguno de ellos fue tan

efectivo como los factores de crecimiento del control positivo.

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Fig. 1. Diferenciación de CMN a CPO con los fármacos seleccionados. Los fármacos seleccionados se

añadieron a cultivos de CMN y se compararon con cultivos que tenían factores de crecimiento (+ Control),

sin factores de crecimiento (− Control) y con vehículo (DMSO), y se valoraron mediante inmunotinciones

para Olig2 (oligodendrocitos), Nestin (CMN), GFAP (astrocitos) y NG2 (CPO). Los recuentos celulares

demostraron que los fármacos testados inducían la diferenciación de CMN a CPO. Las barras representan

la media ± error estándar de la media. El asterisco negro (*) indica significación estadística (p < 0,05) al

comparar los fármacos con el Control +. El asterisco rojo (*) indica significación estadística (p < 0,05) al

comparar los fármacos con el Control −. El astersico verde (*) indica significación estadística (p < 0,05) al

comparar los fármacos con DMSO.

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1.3.- Validación in vivo de los fármacos seleccionados

La deptropina, la pimozida y el ácido valproico, los tres fármacos que mejores

resultados demostraron in vitro, fueron testados in vivo en dos modelos animales de

desmielinización: la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y un modelo

murino con lisolecitina.

Después de inducir la EAE, valoramos el curso clínico de la enfermedad en los grupos

de ratones tratados con deptropina, pimozida, ácido valproico o DMSO en comparación

con un grupo control de EAE. El curso clínico fue similar entre los diferentes grupos

tratados con los fármacos seleccionados y el grupo de DMSO en comparación con el

grupo control de EAE. Concluimos que la administración de estos fármacos de forma

terapéutica no producía una mejora en el curso clínico de la EAE.

Fig. 2. Diferenciación de CPO a oligodendrocitos con los fármacos seleccionados. Los

fármacos seleccionados se añadieron a cultivos de CPO y se compararon con cultivos con factores de

crecimiento (+ Control), sin factores de crecimiento (− Control) y con vehículo (DMSO), y se valoraron

con inmunotinciones para NG2 (CPO), GFAP (astrocitos), Olig2 (oligodendrocitos), O1

(oligodendrocitos mielinizantes), O4 (oligodendrocitos premielinizantes) y MBP (oligodendrocitos

mielinizantes). Los recuentos celulares demostraron que los fármacos testados inducían la

diferenciación de CMN a CPO. Las barras representan la media ± error estándar de la media. El

astersico negro (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el Control

+. El astersico rojo (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el

Control −. El asterisco verde (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos

con DMSO.

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También inducimos desmielinización con lisolecitina a ratones que después se trataron

con deptropina, pimozida, ácido valproico o DMSO. Valoramos el efecto de estos

fármacos en los diferentes grupos con inmunotinciones y observamos que la densidad

de oligodendrocitos (células olig2 +) era comparable en todos los grupos, excepto en el

grupo tratado con ácido valproico, donde se observaba un ligero incremento en la

densidad de oligodendrocitos que no resultó ser estadísticamente significativo.

Fig. 3. CPO en lesiones de lisolecitina. El análisis de la densidad de CPO en les lesiones de lisolecitina

no evidenció diferencias remarcables entre los ratones tratados con ácido valproico (VA), pimozida (PZ),

deptropina (DP) o vehículo (ctrl), a pesar de que el grupo tratado con VA mostraba un cierto incremento

en la densidad de CPO que estadísticamente no fue significativo. Además, este grupo de animales mostró

una cierta dificultad en la recuperación de la pérdida de peso debida al estrés de la cirugía. Los datos se

muestran como media +/−s.e.m. y como valores individuales.

2.- Identificación de buenos y malos remielinizadores basándose en la

diferenciación de oligodendrocitos generados a partir de CMPI de pacientes

con EM clasificados según factores genéticos

2.1.- Estratificación de pacientes con EM con alelos de riesgo asociados a la

susceptibilidad de sufrir EM

Pacientes con EM se estratificaron según la presencia o ausencia del alelo de riesgo

para el polimorfismo rs1800693 del gen TNFRSF1A, que codifica el principal receptor

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del TNF-alfa, TNF-R1, y que en los portadores del alelo de riesgo genera una isoforma

funcional soluble que no contiene el exón 6 (Δ6-TNF-R1) y que se asocia a un aumento

del riesgo de sufrir EM. En total 6 pacientes con EM, 3 portadores del alelo de riesgo y

3 sin este alelo, se seleccionaron como candidatos para la generación de CMPI.

2.2.- Generación de CMPI a partir de fibroblastos de pacientes de EM y

diferenciación a oligodendrocitos

Usando retrovirus se generaron 6 líneas de CMPI de pacientes de EM con dos genotipos

diferentes, CC o TT, del polimorfismo rs1800693. Las líneas tenían un cariotipo normal,

expresaban genes de pluripotencia y se diferenciaron a células de las tres capas

germinales. Así, demostramos que las CMPI de EM tenían capacidad de autorrenovarse

y diferenciase a distintos tipos celulares.

Fig. 4. Capacidad de diferenciación de las líneas de CMPI de EM. El potencial de diferenciación de las

líneas de CMPI de EM se confirmó in vitro con la diferenciación de los cuerpos embrioides a las tres capas

germinales. Como se demuestra con las inmunotinciones, había expresión de marcadores endodérmicos:

α-fetoproteína (AFP) y forkhead box A2 (FOXA2), ectodérmicos: βIII-tubulina (TUJ1) y proteína ácida

fibrilar glial (GFAP), y mesodérmicos: α-smooth muscle actin (ASMA) y α-sarcomeric actin (ASA).

Los protocolos de diferenciación de CMPI a oligodendrocitos en humanos son muy

ineficientes y variables, así que la producción de oligodendrocitos resulta ser un

proceso muy largo y caro. A pesar de ello, con el protocolo de diferenciación que

usamos, como mínimo, pudimos diferenciar CPO de forma eficiente. Con las CPO

obtenidas caracterizamos molecularmente las 6 líneas de CMPI de EM para identificar

diferencias entre los dos grupos. El protocolo de diferenciación se inicia con la

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diferenciación al linaje neural. En ese momento observamos que las células del grupo

con el alelo de riesgo formaban menos rosetas neurales (característica del desarrollo

de progenitores neurales en cultivo) que el otro grupo, lo cual indicaba algún posible

déficit en la diferenciación al linaje neuroglial. También encontramos que había una

expresión diferencial de OSP/claudina-11 entre grupos durante los diferentes estadios

de la diferenciación.

Fig. 5. Diferenciación de CMPI a precursores de oligodendrocitos. En el estadio de progenitores

neurales se observaba la formación de rosetas con contraste de fases. En el estadio de precursor de

oligodendrocito expresaban Olig2 y O4. Las líneas derivadas de los pacientes 1, 2 y 5 (genotipo TT)

presentaban represión de OSP/claudina-11 en comparación con las líneas 3, 4 y 6.

Estas 6 líneas de CMPI de EM están disponibles en el Banco Español de Líneas Celulares (ISCIII) y se

pueden obtener con la presentación de un proyecto que deberá ser aprobado por el comité competente.

4. Relevancia y posibles implicaciones

Este proyecto nos ha llevado a la identificación de fármacos con capacidad para inducir

mielinización in vitro. Aunque no hemos podido demostrar ningún efecto en la

remielinización in vivo con ninguno de los modelos animales de EM, pensamos que la

estrategia utilizada es la apropiada para identificar compuestos químicos con potencial

para inducir remielinización. Cabe destacar que una limitación muy importante en este

tipo de estudios es el número de compuestos químicos que se pueden testar a la vez

para demostrar efectos tanto in vitro como in vivo. Se identificaron 39 compuestos

químicos, de los cuales solo 5 se han podido testar. Como ya hemos dicho antes, este

número es el resultado de nuestras limitaciones para manejar grandes cantidades de

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fármacos al mismo tiempo, lo que nos ha llevado a poder testar solo 5 fármacos.

Mientras, han quedado pendientes de estudio 34 compuestos más que podrían tener

capacidad remielinizante tanto in vitro como in vivo, y que podrían ser candidatos para

estudios futuros.

La generación de 6 líneas de CMPI específicas de pacientes de EM ofrece un modelo de

la enfermedad que podría aportar ventajas en el estudio de las causas de la EM y de

sus mecanismos patogénicos, la búsqueda de nuevos fármacos y el desarrollo de la

medicina personalizada. El hecho de que estas líneas de CMPI sean accesibles para la

comunidad científica maximiza los beneficios de este campo de la investigación.

Los resultados obtenidos en este proyecto apuntan a un posible papel de OSP/claudina-

11 en los mecanismos patogénicos de la EM. Previamente se habían encontrado

anticuerpos anti-OSP/claudina-11 en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM

recurrente-remitente y también se había descrito una expresión aberrante de

OSP/claudina-11 en leucocitos de pacientes de EM. Teniendo en cuenta que

OSP/claudina-11 es la tercera proteína más abundante de la mielina y que controla la

migración y la proliferación de oligodendrocitos, sugiere una posible correlación

genotipo-fenotipo que podría explicar el mayor riesgo que confiere el genotipo CC.

Estos resultados demuestran claramente que es necesario seguir investigando el papel

de los anticuerpos anticlaudina-11 en estos pacientes para aclarar el rol de claudina-11

en la etiología de le EM.

4. Literatura generada

Congresos

Search of therapies that favour remyelination based on genomic-signatures of

neural stem cells.

Costa C, Nurtdinov R, Malhotra S, Pohl H, Montalban X, Comabella M.

ECTRIMS, Londres 2016. Póster.

Artículos

Generation of six multiple sclerosis patient-derived induced pluripotent stem

cell lines.

11

Miquel-Serra L, Duarri A, Muñoz Y, Kuebler B, Aran B, Costa C, Martí M, Notari M,

Comabella M, Malhotra S, Montalban X, Veiga A, Raya A.

Stem Cell Research.

(En revisión.)

Registro de líneas celulares

Las 6 líneas de CMPI de EM generadas en este proyecto están en proceso de ser

registradas en el Banco Nacional de Líneas Celulares y de ser inscritas en el Human

Pluripotent Stem Cell Registry.