Refrakterumas trombocitų masės transfuzijoms: diagnostikos ir gydymo strategijaLINA  KRYŽAUSKAITĖ

RITA  ČEKAUSKIENĖ

ARTŪRAS   JAKUBAUSKAS

Antigenai trombocitų paviršiuje

•ABO•HLA I klasės Ag (A, B). Neekspresuoja HLA‐B44/45, silpnai HLA‐C (Datema et al,2000)

•HPAoGPIIb/IIIa (Tro agregacija) 

oGPIa/IIa (Tro adhezija) 

oGPIb/IX/V (vW receptorius)

oCD 109 (kolageno receptorius)

Dažniausi

Rečiausi

P. Rozman „Platelet antigens. The role of human platelet alloantigens (HPA) in blood transfusion and transplantation“ Transplant Immunology 10 (2002) 165–181

Refrakteriškumas TK transfuzijai

CCI1val. po 2 transfuzijų <5000, kuomet bent viena ištransfuzijų ‐ ABO tapati, o trombocitų amžius ‐ ≤ 72 (48)val.

Nepakankamas atsakas :

1 val. po transfuzijos CCI < 7500 μ/l

24 val. po transfuzijos CCI < 4500 μ/l

Sumažėjęs 1 val. CCI atspindi galimą Tro suardymą dėl imuninių 

priežasčių

Sumažėjęs 24 val. CCI – labiau dėl neimuninių priežasčių

HLA Aloimunizacija

Pacientai:

Transfuzijų anamnezė: Iki 15 %  nuo transfuzijų priklausantys pacientai. Taikant leukoredukciją, sumažėjo iki 5 %. (TRAP grouo, NEJM,1997)

Diagnozė : ~ 50% ŪML/MDS/Aplastinė anemija, 8‐40% LLL/MM/Ne‐Hodžkino limfomos) Killick et al 1997, Laundy et al, 2004, Agarwall et al, 2014

Nėštumų anamnezė: 9 % vs 32% TRAP study group NEJM 1997

Donorai (moterys): 17% moterų, 24 %, kurios turėjo bent vieną nėštumaą Kleinmal et al, 2012

EtiologijaTrombocitų 

refrakteriškumas

Imuniniai faktoriai (<20%) Neimuniniai faktoriai (>80%)

HPA aloimunizacija

Aloimunizacija HLA I klasei

Aloimunizacija HLA I kl ir HPA

Autoimuniniai mechanizmai 

(nežinomos priežastys)

Sepsis, karščiavimas, DIK, splenomegalija, 

kraujavimas, vaistai ir kt.

Po kraujo transfuzijų, nėštumo metu ar po transplantacijos

80%  HLA8‐20% HPA

44 % hematologinių pacientų refrakterūsTRO transfuzijoms: 67 % priežastys ‐neimuninės, 21% ‐ HLA/HPA AkDoughty Ha et al. Vox Sang 1994

Vaistų sukeltas refrakteriškumas

Problematika20 % nepaisant visų galimų parinkimo būdų, adekvatus atsakas (CCI) nepasiekiamas

Kintantis imunologinis paciento statusas

Neimuninės priežastys

Kitų priemonių ‐ IvIg , plazmaferezių klinikinis efektyvumas neįrodytas.

Ištyrimo galimybės:

Jautrios bei specifiškos 

Greitos 

„Pigios“

Tinkamiausia taktika/algoritmas

(Ištyrimo) galimybės 1 . PAR INK IMAS   PAGA L  HLA /HPA / CREG

2 . ANT I G ENU I  NE IG I AM I   TROMBOC I TŲ  KONCENTRATA I

3 . S P EC I A LU S   TROMBOC I TŲ   KONCENTRATŲ  PAR INK IMAS ( CROS S ‐MATCH ING )

HLA/HPA tipavimas (donorai/pacientai)Anti HLA/HPA Ak nustatymas (pacientai)Kryžminės reakcijos (cross‐mathing) įrankiaiVirtualaus parinkimo įrankiai

Aloimunizacijos laboratorinis įrodymas

The Evolution of HLA‐Matching in Kidney Transplantation, 2013Hung Do Nguyen1, 2, Rebecca Lucy Williams1, Germaine Wong3 and Wai Hon Lim1,

LCT         ELISA         TC

Galimybės

HLA tapatūs Tro koncentratai/Pagal epitopą parinkti Trokoncentratai (virtuali paieška – išplėstos galimybės)

Ag neigiami Tro koncentratai

Cross – matched Tro koncentratai

HLA tapatumo lygiaiA tapatumo lygis: 4 Ag tapatumas (identiški abiejose HLA‐A ir HLA‐B srityse)

BU tapatumo lygis: paciento HLA A ir B srityse nėra vieno identiško Ag dėl donoro homozigotiškumo

BX tapatumo lygis: vienas HLA A arba B sričių netapatumas (cross reactive group)

C tapatumo lygis: Donoras turi vieną noncross‐reactvive HLA netapatų Ag

D tapatumo lygmuo: du ir daugiau noncross‐reactvive netapačių Ag.

=

Nesėkmės lygis vis tiek siekia 20 % (Moroff et al, 1992)

HLA tapatūs Trombocitų koncentrataiPRIVALUMAI

•Stipriai sensibilizuotiems pacientams gali būti vienintelėalternatyva

•Leidžiami (Ne)Tapatumo lygiai. Virtualios paieškosgalimybė

•Antigenų grupavimas į kryžmiškai reaguojančias grupesCategorization of antigens into cross‐reactive groups(CREG)

pvz.: HLA A1 ir A36 yra vienoje CREG. Jei pacientas turiA36 Ag, o tokio donoro nėra, tuomet A1 (Europiečiųpopuliacijoje paplitęs) donoras g.b. tinkamas (B tapatumas)

•HLA Matchmaker www.hlamatchmaket.net imunogeniniųepitopų identifikavimu ir parikimu paremtas IT algoritmas,naudojamas potencialių trombocitų donorų idetifikavimui,kurie g. b. tinkami ir nesant HLA tapatumo.

TRŪKUMAI•Ilgai užtrunkantis•Reikalinga:oPaciento HLA tipavimas ir Anti HLA Akvertinimas (jei reikia, įgalina atlikti Agneigiamų TRO koncentratų paiešką)

oDidelė HLA tipuotų donorų imtis. ~3000donorų reikia, kad patenkintų transfuzijųporeikius pagal A ir BU/BX tapatumą (Bolgiano etal, 1989)

Donorų imties padidinimas:  *HLA B12 Ag (25 % populiacijos, patenkinamas CCI 

70% (Schiffer et al, 1989)* www.hlamatchmaket.net ‐ geresnė prognostinė 

vertė nei įprastinio tapatumo vertinimo, paremto CREG nustatymu (Nambiar et al,2006)

TIRIAMIEJI

2007 ‐2014 m laikotarpis. Hematologiniai pacientai 

Refrakteriškumo diagnozė: du iš eilės nepakankamo inkremento rezultatai 1h CCI ≤5000 ir/ar 24 h CCI ≤ 2500

Kitos galimos reftakteriškumo priežastys: splenomegalija, buvusios transfuzijos gimdymai (≥2 nėštumai), infekcijos, vaistai, karščiavimas.

Trombocitų koncentratai: 

ogauti aferezės būdu;

oHLA pilnai tapatūs arba su vienu netapatumu (mažiau nei 9 skirtingi tripletai netapataus Ag sekoje), parinkti naudojant virtualią paiešką (www.hlamatchmaker.net)

TYRIMAI

HLA A/B sričių tipavimas – sequence specificoligonucleotide probe hybrridization ‐ SSOPH

HPA 1/2/3/5/15 – Restriction fragment lenghtpolymorphisms (RFLP)‐PCR/PCR‐SSP

Paciento serumas – PRA Class I ir singleAntigen Bead class I  (SAB) Luminex platform; 

Trombocitų Ak vertinimas paciento serume: MAIPA 

Kryžminis vertinimasSEROLOGINĖS

Limfocitų kryžminė reakcija – nuo komplemento priklausomas limfocitotoksiškumas pridedant anti‐humanglobulin (AHG‐CDC)

Trombocitų kryžminis parinkimas (FCxM) –visiems perpiltiems trombocitams, taikant TC trombocitų imunoflorescentinį metodą (FC‐PIFT) – HLA/HPA netapatumų identifikacija

VIRTUALUS

Retrospektyvus vertinimas, naudojant EpHLAanalizę www.hlamatchmaker.net sistemoje

97 parinktų TRO K transfuzijų

• 27 trombocitų transfuzijoms refrakterūs pacientai: 5 limfoproliferaciniai, 17 ne‐limfoproliferaciniai, 5 trombocitopatijos

• 63% mot.• Cross‐matched TRO K transfuzijųmediana – 3 (1‐13)

75 TRO K parinktivnt.

22 pilnai tapatūs(CREG tapatumo 

lygis A)

16 (22%)Rezultataiišsiskyrė

100%:Specifiškumas. Jautrumas. NPV. PPV

J: 54%S: 98%

J: 46%S: 95%

HLA tapačių transfuzijų CCI vertinimas

•1/24 h CCI duomenys iš 30 transfuzijų

•22/30 (73 %) CCI patenkinamas

1 h CCI mediana 6450;  24 h CCI  ‐ 7100

21

Sign up today at www.epvix.com.br. It´s free!

Virtuali paieškahlamatchmaker.net

Galimybės

HLA tapatūs Tro koncentratai/Pagal epitopą parinkti Tro koncentratai

Antigenui neigiami Tro koncentratai

Cross – matched Tro koncentratai

Antigenui neigiami Trombocitų koncentrataiAlternatyvus TRO K parinkimo būdas, įvertinus Ak specifiškumą ir parenkant TRO K donorų, kurie neturi Ag nustatytiems Ak. (Antibody specificity prediction (ASP) method)

Selecting donors of platelets for refractory patientson the basis of HLA antibody specificity, LD.Petz et al, 200

•An anti‐human globulin‐enhanced microlymphocytotoxicity test modified by a double addition of serum and a computer program were used to determine the specificity of patients' HLA antibodies. 

•Platelet cross‐matching was performed with a solid‐phase adherence assay. The percentage of platelet recovery (PPR) was determined in 1621 platelet transfusions in an observational study in 114 patients, and the PPR of platelets selected by the ASP method was compared with the PPR of those that were HLA‐matched, cross‐matched, or randomly selected. 

PRP = Nepakankamas PRP <30% 1 H, <20% 24H

Išvados

•The ASP method of donor selection for refractory alloimmunized patients appears as effective as HLA matching or crossmatching.

•For 29 alloimmunized HLA‐typed patients, the mean number of potential donors found in a file of 7247 HLA‐typed donors was 6 who were an HLA‐A match (median = 1), 33 who were an HLA‐BU match (median = 20), and 1426 who were identified by the ASP method (median = 1365).

The mean +/‐ SEM (standard error of mean)  PPR was similar for HLA‐matched (21 +/‐4%), cross‐matched (23+/‐4%), and ASP‐selected (24+/‐3%) platelets and was significantly lower for randomly selected (15+/‐1.4%) platelets.

Antigenui neigiami TRO koncentrataiPRIVALUMAI

•Paremta paciento anti HLA Ak profiliu

•TRO K parinkti be HLA Ag, prieš kuriuos paciento serume aptikti anti HLA Ak

•Išplečia tinkamų donorų/Tro K aptikimo galimybių ribas, taip įgalina greitai surasti tinkamą TRO K turimame inventoriuje

•Galima taikyti vidutiniškai/stipriai sensibilizuotiems pacientams. Ak profilis t.b. tikrinamas bent vieną kartą per mėnesį. 

TRŪKUMAI

Reikalinga didelė HLA tipuotų donorų bazė

•Stipriai sensibilizuotiems pacientams –complement fixing solid‐phase assay:

CCI 10,6x109±0,8x109/L vs 2,5x109±0,8x109/L p<0,0001) Fountain MJ et al. Transfusion 2000

Galimybės

HLA tapatūs Tro koncentratai/ Pagal epitopą parinkti Tro koncentratai

Ag neigiami Tro koncentratai

Cross – matched (CM) Tro koncentratai

Cross‐matching

MACE

Tėkmės citometrija ‐TRO K cross‐matching

Plauti intaktiški Trombocitai inkubuojami su paciento serumu

Pridedamas AHG

Vertinamas florescencijos intensyvumas paciento serume lyginant su neigiama kontrole.

Apžvalga.. Utility of cross‐matched platelet transfusions in patients with hypoproliferative thrombocytopenia: a systematic review Apr 2014, Vol 54

Statistiškai patikimai CCI padidėjo naudojant CM TRO K refrakteriems pacientams su aloimunzacijaPetz LD, Garratty G, Calhoun C, Clark BD, Terasaki PI, Gresens C, Gornbein JA, Landaw EM, Smith R, Cecka JM. Selecting donors of platelets for refractory patients on the basis of HLA antibodyspecificity. Transfusion 2000Sayed D, Bakry R, El‐Sharkawy N, Zahran A, Khalaf MR. Flow cytometric platelet cross‐matching to predict platelet transfusion in acute leukemia. J Clin Apher 2011Gelb AB, Leavitt AD. Crossmatch‐compatible platelets improve corrected count increments in patients who are refractory to randomly selected platelets. Transfusion 1997Köhler M, Dittmann J, Legler TJ, Lynen R, Humpe A, Riggert J, Neumeyer H, Pies A, Panzer S, Mayr WR. Flow cytometric detection of platelet‐reactive antibodies and application in plateletcrossmatching. Transfusion 1996

HLA tapatumas ir/arbaCross matching: CM metodikos parodė panašią prognostinę vertę kaip HLA tapačių TRO K kategorijoje. CCI reikšmingai didesnis po cross‐mattched/HLA matched transfuzijų.Moroff G, Garratty G, Heal JM, MacPherson BR, Stroncek D, Huang ST, Ho W, Petz LD, Leach MF, Lennon SS, Rowe JT, Saleh MN, Arndt P, Foley K, Masel D, Postoway N. Selection of platelets forrefractory patients by HLA matching and prospective crossmatching. Transfusion 1992Gates K, MacPherson BR. Retrospective evaluation of flow cytometry as a platelet crossmatching procedure. Cytometry 1994Petz LD, Garratty G, Calhoun C, Clark BD, Terasaki PI, Gresens C, Gornbein JA, Landaw EM, Smith R, Cecka JM. Selecting donors of platelets for refractory patients on the basis of HLA antibody

specificity. Transfusion 2000

PSIFT: platelet suspension immunofluorescence test PRAT: platelet radioactive antiglobulin LCT :Lymphocytotoxity test SPRCA: solid‐phaseRBC adherence assay, LAA: Latex aggliutination assay

NPV‐ % parinktųtapačių TRO K 

vienetų, kurie davė adekvatų transfuzinįrezultatą