UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA HEMIJU

Razvoj i validacija HPLC metode za određivanje polifenolnih

jedinjenja u odabranim biljnim čajevima

Master rad

MENTOR: STUDENT:

dr Milan Mitić Jovana Banković, 66

U Nišu, 2016

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јована Банковић

Ментор, МН: Милан Митић

Наслов рада, НР: Развој и валидација HPLC методе за одређивање полифенолних једињења у одабраним биљним чајевима

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

52. стр., 4 табеле, 17 слика

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Аналитичка хемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Полифенолна једињења, флавоноиди, развој и валидација, чај

УДК 543.544.52:547.56:663.9

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Циљ рада је био развој и валидација HPLC методе. Одређен је садржај полифенолних једињења у одабраним биљним чајевима са подручја југоисточне Србије. Вранилова трава има највећи садржај укупних фенолних једињења.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Јоvana Banković

Mentor, MN: Milan Mitić

Title, TI: Development and validation of HPLC method for determination of polyphenolic compounds in selected herbal teas

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

52 p., 4 tables, 17 figures

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Analytical chemistry

Subject/Key words, S/KW: Polyphenolic compounds, flavonoids, development and validation, teas

UC 543.544.52:547.56:663.9

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: The aim of this study was to development and validation of HPLC method. The content of the polyphenolic compounds was determined in the selected herbal teas from southeast region of Serbia. Oregano has the highest content of total phenolic compounds.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Sadržaj

1. Uvod ...................................................................................................................................................... 1

1.1 Istorijat čaja ......................................................................................................................................... 2

1.2. Karakteristike čaja .............................................................................................................................. 3

2. Teorijski deo .............................................................................................................................................. 6

2.1. Biljni čajevi ......................................................................................................................................... 7

2.2. Polifenolna jedinjenja ...................................................................................................................... 15

2.2.1. Flavonoidi .................................................................................................................................. 17

2.2.2. Biološka uloga flavonoida ......................................................................................................... 19

2.2.3. Flavan-3-oli ................................................................................................................................ 21

2.2.4. Flavonoli .................................................................................................................................... 22

2.2.5. Fenolne kiseline ........................................................................................................................ 22

2.2.6. Antocijani .................................................................................................................................. 23

2.3. Tečna hromatografija visoke efikasnosti (HPLC) .............................................................................. 24

2.4. Razvoj i validacija HPLC metode ...................................................................................................... 26

2.4.1. Izbor HPLC metode i početnog sistema .................................................................................... 27

2.4.2. Izbor početnih uslova ................................................................................................................ 27

2.4.3. Poboljšanje selektivnosti ........................................................................................................... 28

2.4.4. Poboljšanje parametra sistema ................................................................................................ 28

2.4.5. Validacija metode ..................................................................................................................... 29

3. EKSPERIMENTALNI DEO .......................................................................................................................... 31

3.1. Biljni materijal .................................................................................................................................. 32

3.2. Hemikalije i reagensi ........................................................................................................................ 32

3.3. Postupak ekstrakcije ........................................................................................................................ 32

3.4. HPLC analiza metanolnih ekstrakata lekovitog bilja ........................................................................ 33

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................................ 34

4.1. Linearnost ........................................................................................................................................ 35

4.2. Limit detekcije i limit kvantifikacije .................................................................................................. 36

4.3. Tačnost i preciznost ......................................................................................................................... 37

4.4. HPLC analiza metanolnoih ekstrakta odabranih biljnih vrsta .......................................................... 37

5. ZAKLJUČAK .............................................................................................................................................. 45

6. Literatura ................................................................................................................................................. 47

Zahvaljujem se svom mentoru, profesoru dr Milanu Miticu, na neprocenjivoj

pomoći u izradi ovog master rada, ukazanom strpljenju i razumevanju.

Posebnu zahvalnost dugujem mojim roditeljima, bratu i prijateljima na

bezgraničnoj podršci i razumevanju koju su mi pružili tokom studiranja.

1

1. Uvod

2

1.1 Istorijat čaja

U priču o dragocenim zelenim listovima čaja, utisnute su niti drevnih legendi, mitova i

istorijskih prevrata iz gotovo svih krajeva sveta.

Čaj je počeo da se koristi prvi put u Kini pre 5.000 godina. Prema jednoj legendi, kineski

car Shen-Nong otkrio je tajnu pripreme ovog napitka prilikom jednog od svojih mnogobrojnih

lovačkih izleta godine 2737. pne. Kada je hteo da prokuva nešto rečne vode u posudu na vatri,

vetar mu je doneo jedan list sa stabljike čaja koja je tu u blizini rasla. Voda u posudi je brzo

promenila boju i pritom je osetio neobičan i njemu nepoznat miris. Radoznalo je popio nekoliko

gutljaja tečnosti i bio je oduševljen aromom, vrlo brzo je osetio osveženje, i umor od dugotrajnog

lova je nestao. Tako je, prema legendi, otkriven čaj.

Prvu knjigu o pripremanju čaja napisao je Lu Yu 800 godina pre Hrista, a u njoj obrađuje

razne načine uzgajanja i pripreme čaja u drevnoj Kini. U Japan su čaj uveli budistički monasi u

9. veku i ubrzo je postao omiljeno piće među japanskim plemenicima. Sveštenik Yeiseij koji je

doneo čaj u Japan smatra se ocem čaja jer je razvio ceremoniju nazvanu „chazem icimi“ što

znači „topla voda za čaj“, a čitava ceremonija u početku je bila povezana sa Zen budizmom. U

Evropi čaj po prvi put u svojim spisima spominje Italijan Giovani Botero koji je 1590. godine

opisao način uzgoja posebne biljke u Kini od koje prave piće koje im zamjenjuje vino. Čaj se u

Evropu počeo širiti istovremeno sa kafom u 16. veku. Prvi su čaj u Evropu doneli Portugalci iz

Kine i Japana. Britanci su u Novi svet, svoje američke kolonije, preneli i kulturu ispijanja čaja. U

vreme težnji za oslobođenjem od kolonijalizma događaj koji je pobudio Američku revoluciju je

tzv. Bostonska čajanka – Boston Tea Party događaj koji se odigrao u četvrtak, 16. 12. 1773. u

Bostonskoj luci, kad je jedna grupa u znak protesta protiv britanske politike, pobacala 342 bale

čaja s brodova.

Ledeni čaj – Ice Tea izmislili su Amerikanci i to sasvim slučajno. Naime za vreme jednog

svetskog sajma u 19. veku skuvali su velike količine čaja koje su želeli ponuditi posetiocima.

Kako je tog dana bilo jako vruće niko nije želeo piti čaj pa su ga ohladili većom količinom leda i

od tad nastaju nebrojen recepti „ice tea“ širom sveta. Prvu čajnu filter vrećicu načinjenu od gaze

izumeo je 1903. godine u New Yorku trgovac kafom i čajem Thomas Sullivan. Papirnate vrećice

za čaj pojavile su se 30-tih godina prošlog veka, a danasnji oblik čajne vrećice izmišljen je tek

1944. godine.

Danas se u svetu potroši oko 750 000 tona čaja godišnje, a samo u Britaniji potroše 4,2

kg čaja po stanovniku. Najviše čaja proizvodi Indija, Šri Lanka, Indonezija i Japan. Kina pak

svojom proizvodnjom zadovoljava domaće potrebe.

3

1.2. Karakteristike čaja

Svi listovi čaja (osim biljnih i voćnih) potiču od istog grma zimzelene biljke koja ima

latinsko ime – Camellia sinensis. Drvo čaja je jako i otporno zimzeleno drvo ili grm. Ono treba

da bude što mlađe, da bi čaj bio na ceni. Listovi su tamno zelene boje i bez mirisa, dok su

cvetovi beli, krupni i imaju vrlo prijatan miris koji podseća na jasmine.

Postoje dve velike grupe čajeva. To su:

čaj (en. Tea) (koji se dobija od biljke čaj (Camelia (Thea) sinensis ) i

biljni čaj (herbal tea) koji se dobija od raznih lekovitih biljaka.

Namena i karakter ove dve grupe čajeva je različita. Pravi čaj ima u sebi kofeina i obično se

koristi kao stimulativno ili umirujuće sredstvo dok se biljni čaj u najvećoj meri koristi kao

lekovito sredstvo narodne medicine.

Osnovne vrste pravih čajeva su:

crni, koji je potpuno oksidisan i fermentisan i zato ima tamnu boju. Pije se, uglavnom, u

Americi i Engleskoj;

zeleni, nije oksidisan, ima zlatnozelenu boju. Pije se u Aziji, ali i na zapadu, jer je

prijatnog ukusa i jako je zdrav;

“oolang”, predstavlja mešavinu crnog i zelenog.

I zeleni i crni čajevi napici su dobijeni iz sušenog lišća biljke čajevca (lat. Camellia sinensis),

ali procesi kojima se dobija konačan proizvod od iste biljke su različiti. Pa tako, ukoliko se lišće

biljke Camellie sinensis pre procesa sušenja potpuno fermentiše dobiće se sušeno lišće za

pripremanje crnog čaja, ali ukoliko se to isto lišće pre procesa sušenja blanšira, kasnije ne

podleže procesu fermentacije dobijamo proizvod za pripremu zelenog čaja.

Da bi šoljica čaja mogla da nas okrepi u toku dana, čaj treba pripremiti na odgovarajući, pravilan

način:

INFUZI se izrađuju od biljaka nežnije strukture, koje sadrze termolabilne supstance

(etarska ulja). Lako ćete znati od kojih biljaka se priprema infuz, jer kada se biljni delovi

aromatičnih biljaka protrljaju prstima, oseća se prijatan miris etarskog ulja (menta,

limun). Pripremaju se tako što se biljna droga prelije ključalom vodom, poklopi i ostavi

da stoji 10min. Tako se izrađuju infuzi kamilice, nane, žalfije, matičnjaka.

4

DEKOKTI se izrađuju ekstrakcijom biljne droge na povišenoj temperaturi. Npr.dekokt

šipurka se priprema tako što se droga prelije vodom i ostavi da ključa na povišenoj

temperaturi.

MACERATI se izrađuju ekstrakcijom biljne droge na sobnoj temperaturi. Znači, biljni

delovi se preliju hladnom vodom i ostave da stoje na sobnoj temperaturi. Na ovaj način se

pripremaju biljne droge koje sadrže sluzi i termolabilne supstance (beli slez).

Od važnijih sastojaka čaj sadrži: tanin, katehin, flavonoid, teanin, adenin, rutin, etarska ulja,

teofilin i kofein. Pored ovih jedinjenja čaj sadrži i teobromin, teofilin i zanemarljive količine

ugljenhidrata, masti i proteina, ima još i gume, dekstrina, masti, voska, belančevina...

U zelenom čaju ima vitamina C, B1, B2, nikotinske i pantotenske kiseline. Zeleni čaj je

snažan antioksidans i primenjuje se u mnogim dijetama, gde treba unositi veću kolicinu tečnosti

uz odgovarajuću fizučku aktivnost.

Kofein je alkaloid koji nadražuje koru velikog mozga, usled čega se smanjuje pospanost,

odnosno povećava budnost i povećava psihomotorna izdržljivost. Deluje i na kardiovaskularni

sistem ( tako što povećava snagu kontrakcije srčanog mišića), relaksira glatke mišiće bronhija

(što ima terapijski značaj), povećava sekreciju hlorovodonične kiseline u želucu, povećava

diurezu.

Predstavnici antioksidanata u čajevima su flavonoidi, sa nutricionističkog gledišta ,,pravi" se

čajevi uglavnom smatraju predstavnicima ovakvih svojstava. Flavonoidina sposobnost

antioksidacije je vrlo velika, smatra se da je aktivnost pojedinih biljnih polifenola veća od

aktivnosti već dobro poznatih antioksidativnih supstanci - vitamina C i E. Flavonoidi pre svega

pozitivno deluju na funkciju srca, ali i sprečavaju razvoj pojedinih vrsta raka. Osim navedenog,

flavonoidi inhibiraju metaboličke reakcije nekih mikroorganizama kao što su npr. Salmonella

typhi, Campilobacter jejuni, Campilobacter coli, Helicobacter pylori, Shigella, Clostridium,

Pseudomonas, Candida i ostali. Najnovija istraživanja objavljena u američkom časopisu za

kliničku ishranu (American Journal of Clinical Nutrition) ukazuju da ekstrakti iz pravog čaja

mogu pomoći pri mršavljenju time što ubrzavaju oksidaciju masti.

Tanini su heterogena grupa polifenola, tj. polimernih flavonoida, prisutnih u biljkama. Zeleni

čaj sadrži znatne količine tanina. Tanini daju gorak ukus. Što duže biljka sazreva količina tanina

se smanjuje, a time i lekovitost biljke čaja.

Katehini pripadaju grupi polifenola. Imaju fenolnu strukturu i antioksidativna svojstva.

Najviše katehina imaju beli i zeleni čaj. Flavonoidi su heterociklična grupa sa kiseonikom. To su

5

pigmenti boja kao što su plava, zelena, žuta, naranđzasta i crvena. Flavonoidi u velikim

količinama se mogu naći u voću, zelenom i belom čaju itd.

Tanini su složena polifenolna i bezazotna jedinjenja. Tanini su vrlo rasprostranjeni u biljnom

svetu i predstavljaju zaštitu od insekata i ostalih štetočina. Određene karakteristike čaja kao boja

i jačina zavise direktno od polifenola i njihovih transformacija. Čaj bogat taninima ima veću

gustinu i gorčinu, koja se javlja kada se čaj ostavi da odstoji.

Čaj se može začiniti na različite načine dodavanjem mleka, ruma, limuna, vanile. Najčešće se

zaslađuje šećerom ili medom. U Kini i Japanu pije se nezaslađen i bez ikakvih dodataka. Može

se koristiti i kao začin. Iz listova se dobija i boja.

Čaj suzbija i smanjuje umor i sanjivost, naročito ako je umor nastao zbog umnog naprezanja.

Čaj okrepljuje i omogućava bolji rad mišića (refleksi su brzi), što pomaže u svakodnevnom radu

sportistima, pilotima, vozačima. Uz čaj se može sanjariti, ali i koncentrisanije vladati duhovnim i

fizičkim naporima. On je pomoć pri opuštanju, davalac energije, zdravlja, nacionalno piće,

lekovito sredstvo, razonoda, sredstvo za uživanje i druženje.

6

2. Teorijski deo

7

2.1. Biljni čajevi

Biljni čajevi se dobijaju od raznih lekovitih biljaka. U tu grupu se ubrajaju

vitaminskolekoviti čajevi, kao sto su: kamilica, zova, kopriva, šipak, lipa, hibiskus, kantarion,

kao i mnogi drugi. Biljni delovi (biljne droge) koji se najčešće koriste za izradu čajeva su: cvet,

list i koren, ali se u njima, pored lekovitih sastojaka, nalaze i balastne materije koje su nepoželjne

i mogu umanjiti delovanje lekovitih supstanci (belančevine, masti, smole). Ovi delovi biljaka se

najčešće pakuju u male filter kesice, za koje se uglavnom koristi čajna prašina, a koje se nalaze u

prodaji i sa kojima se lako barata. Međutim, na taj način su im prilikom prerade delom umanjena

lekovita svojstva, kao i ukus i aroma u odnosu na čaj u listićima.

Biljni čaj ili skraćeno čaj, je biljna mešavina napravljena od svežih ili suvih listova,

cveća, korenja ili semena različitih vrsta biljaka. U biljne čajeve ne spada pravi čaj koji se pravi

od grma čaja i sa njim nema mnogo zajedničkog.

Biljni čajevi u sebi nemaju kofeina. To su napici koji se dobijaju kada se vrelom vodom

preliju različite usitnjene biljke. One se često prodaju upakovane u filter kesice, radi lakše

upotrebe. Dobijena tečnost se ostavi da odstoji neko vreme i po potrebi procedi. Služi se topla ili

hladna, uz mogući dodatak šećera ili meda, najčešće. Biljni čajevi su jako zastupljeni u narodnoj

medicini kao alternativni lekovi.

Lipa (Tilia L.)

Lipa je listopadna drvenasta biljka, doseže visinu od 25 do 30 m, a starost od nekoliko

stotina godina. Listovi lipe su sa dugom peteljkom, većinom srcasti i po obodu testerasti. Cvetovi

lipe su mali, petočlani zelenkasto-žute boje, prijatnog mirisa. Cvetanje u junu traje 2 do 3

nedelje, a nekad se desi da prođe i za 5 do 6 dana. Lipu treba brati čim počne da cveta, odnosno

kada su se dve trećine cvetova u cvasti rascvetale, jer precvetala lipa nema nikakvu vrednost.

Treba voditi računa da se cvasti beru po suvom i lepom vremenu, i naravno sa prirepkom. Cvet

lipe je izuzetno vredan jer sadrži tanin, etarsko ulje, heterozide, šećer, vosak, manitol, tartarat...

Ubrani cvetovi se suše u hladu na prozračnom mestu, po mogućstvu najbolje na tavanu. Važno je

da sušenjem, cvetovi zadrže svoju prirodnu boju i prijatan miris. Lipov cvet se najčešće koristi u

obliku čaja, protiv grčeva i za umirivanje bolova, kao vrlo blago sredstvo. Koristi se i protiv

prehlada, hroničnog kašlja i proliva, kao i za zaceljivanje opekotina i rana, pomaže nadraženoj i

oštećenoj sluzokoži. Takođe, čaj od lipe uklanja bolove prilikom mokrenja, umora, kao i za

smirivanje nervne napetosti. U suštini, lipov cvet predstavlja najomiljeniji čaj u narodu.

8

Nervoznim osobama sklonim stresu i ljudima koji teško dolaze do sna, čaj od lipe preporučuje se

kao svakodnevni napitak. Za opuštanje ne mora samo da se pije nego može i da se doda vodi za

kupanje. Mnoge žene lipu koriste za vreme menopauze da bi smanjile nervozu i problem sa

snom. Zaslađen sa lipovim medom povoljno deluje u sprečavanju arterioskleroze, upale vena,

angine pektoris, infarkta. Čaj od lipe pospešuje znojenje, pa se upotrebljava kod povišene

temperature. Oporavlja organizam izložen psihičkim naporima. Kod konzumiranja čaja od lipe

potreban je određeni oprez, ne sme se konzumirati u velikim količinama, jer može izazvati

srčane tegobe.

Slika 1. Lipa

Majčina dušica (Thymus serpyllum)

Majčina dušica, timija, divlji bosiljak ili mala mažurana je višegodišnja poludrvenasta

biljka sa veoma razvijenim i razgranatim korenom. Stablo je razgranato i obraslo sitnim lišćem

izduženog oblika. Lišće izbija naspramno na stablu i povijeno je ka zemlji. Na obe strane lista

nalaze se mnogobrojne žlezdice. Cvetovi su ružičasto-beli i izbijaju u pazuhu listova. Plod je

sastavljen od četiri oraščića u kojima je smešteno sitno seme. Bere se u doba cvetanja cveta i

mladica; suši u hladu i na promaji. Sadrži gvožđe, eterično ulje, smolu, kalcijum, tanin, karvakol,

boreol, limalol, pimen.

Lekoviti sastojci nalaze se jedino i isključivo u listu i cvetu majčine dušice.

Majčina dušica je jak antiseptik za unutrašnje organe, organe za disanje i urogenitalne organe.

Biljka daje snagu koja stimuliše psihičke i fizičke funkcije, a deluje kod oboljenja kao što su:

razne neuroze; depresije, neurastenije, alkoholizam - za njih je majčina dušica pravi lek. U

narodnoj medicini preporučuje se u lečenju alkoholizma jer posle uzimanja čaja dolazi do

povraćanja, a osoba koja pije gubi volju za daljim uživanjem alkohola; zatim se koristi kod

9

slabosti i seksualnih smetnji jer pojačava, stimuliše seksualne funkcije; kod plućnih oboljenja

kao što su astma, bronhitis, emfizem, tuberkuloza uzima se čaj ili sirup od majčine dušice jer

deluje višenamenski: kao ekspektorans (rastvara sluz, katar) koji olakšava iskašljavanje, kao

antiseptik koji umiruje jak kašalj kao antiseptik koji sprečava širenje infekcije tj deluje

antiinflamatorno; za ženske bolesti se koristi kao emenagog (podstiče i reguliše menstruaciju),

antiseptik (za infekcije materice); koristi se i za lečenje migrene, bolesti bešike, bubrega, želuca

(grčevi), anemije, angine, difterije, padavice, kijavice, nesanice, reume.

Majčinu dušicu ne bi smele uzimati osobe sa komplikacijama žuči, sa akutnim čirom na

želucu, osobe slabog želuca i sa komplikacijama na jetri.

Slika 2. Majčina dušica

Divlja nana ili menta (Mentha piperita)

Menta, nana ili metvica, je višegodišnja zeljasta biljka, visine od 30 do 80 cm, sa

uspravno-razgranatom stabljikom. Biljka je prijatnog i vrlo aromatičnog mirisa. Vreme cvetanja

joj je od juna do avgusta. Nana se smatra prirodnim lekom koji može pomoći ljudima koji imaju

probleme sa varenjem, dijareom, mučninom i bolovima u stomaku. Nana ima umirujuce dejstvo

na stomak. Služi se nakon obroka kako bi stimulisala lučenje žuči i želudačnih kiselina za lakšu i

bržu razgradnju hrane. Nana ima dejstvo antikonvulzivnih lekova i sprečava grčenje koje može

izazvati povraćanje tokom puta. Njegove analgetske osobine pomažu u otklanjanju stomačnih

tegoba kao što su grčevi i ima umirujuće dejstvo na želudac i creva. Mnogi ljudi piju čaj od nane

kad su prehlađeni ili pate od gripa. Nana je puna vitamina B, kalijuma i kalcijuma, koji mogu

ojačati imuni sistem. Neki čak tvrde da redovno ispijanje čaja od nane pomaže u ublaživanju

astme, mada je većina stručnjaka skeptična što se tiče ove tvrdnje. Ljudi koji imaju problem sa

zadahom mogu koristiti čaj od nane da bi ublažili neprijatan miris. Sam miris i ukus nane

10

ublažavaju stres. Otkriveno je da pomaže ljudima da noću lakše zaspu i obezbeđuje kvalitetniji

san, zbog svojih umirujućih svojstava. Čaj od nane pomaže u mršavljenju, deluje tako što

smiruje želudac a ujedno smanjuje apetit pa nema rizika od prejedanja i nagomilavanju

neželjenih masnoća. Čaj od nane donosi olakšanje ljudima koji pate od galvobolje i migrene. O

primeni čaja u toku trudnoće mišljenja su podeljenja. neki smatraju da je bezbedan za trudnice i

da im može pomoći u odklanjanju mučnine, nadutosti, dok drugi stučnjaci smatraju da je bolje ne

konzumirati jer nana zahvaljujući svom spazmolitičkom dejstvu opušta glatke mišiće materice,

pa može izazvati spontani pobačaj (mada ova tvrdnja jos uvek nije naučno dokazana). U velikim

količinama se troši i kao čaj za uživanje.

Slika 3. Nana

Rtanjski čaj (Satureja montana)

Rtanjski čaj, planinski čubar ili vrijesak je višegodišnja žbunasta biljka visoka 10 do 40

cm čiji su donji delovi stabla i grana odrveneli, poluuspravni ili uspravni. Listovi su kožasti i

sjajni linearno-lancelastog oblika, celog oboda pokriveni svetlucavim žlezdama. Cvetovi su

dvousno sakupljeni u pazuh listova, sa kruničnim listićima bele, ružičaste ili ljubičaste boje. Plod

je jajasta i svetlomrka orašica sa žlezdanim tačkama. Prikupljaju se cvetni vrhovi. Koristi se u

narodu za lečenje bolesti organa za disanje, varenje i mokraćnog sistema. Spolja se upotrebljava

kod upala kože i sluzokože. Uspešno se koristi u lečenju bronhitisa, astme, kašlja i upale disajnih

organa kod dece, kao i u lečenju starih osoba. Ima antiseptička svojstva, sa njim može se

dezinfikovati usna duplja, može pomoći i u ublažavanju upale grla. Fenolna jedinjenja koja

rtanjski čaj ima u sebi se mogu vrlo uspešno boriti protiv raznih gljivičnih infekcija ili bakterija.

Mnogi iskusni travari tvrde da je rtanjski ćaj u direktnoj vezi sa jačanjem imuniteta. Rtanjski ćaj

11

se vrlo uspešno koristi za ublažavanje neprijatnih i nezgodnih bolova u mokraćnim kanalima

izazvanim kamenom ili peskom u bubregu. U narodu se priča da se rtanjski čaj pokazao kao

dobar afrodizijak. Rtanjski čaj nije dovoljno ispitan pa se njegovo konzumiranje ne preporucuje

tokom trudnoće i u periodu dojenja. Takodje se ne preporučuje deci.

Slika 4. Rtanjski čaj

Žalfija (Salvia officinalis)

Žalfija kadulja, kuš, lekovita ili slavulja je višegodišnja, polugrmovita biljka. Raste do

visine 30-60cm. Ima jak koren. Donji delovi stabljike su drvenasti, a gornji zeljasti. Stabljika je

uspravna četvorouglasta. Listovi su uski, oblika elipse, sitno naborani sa dugačkim peteljkama;

na stabljici su nasuprotno poređani. Cvetovi su veliki, tamnoljubičasti i skupljeni u cvasti poput

klasova. Lekoviti delovi žalfije su listovi i mlade grančice. Dobar je antiseptik i antioksidant.

Leči promuklost, jača nerve, otklanja nadutost, pomaže kod svake vrste prehlade, katara i

influence. Žalfija deluje na čišćenje krvi i time oslobađa organizam od uzročnika mnogih bolesti.

Ima i protiv upalno dejstvo, pa se preporučuje kod svih zapaljenja. Reguliše znojenje, podiže

tonus, leči obolele od reumatizma i antibiotik je širokog spektra. Efikasan je regulator hormona

lek za čišćenje jetre, za bolesti bubrega i protiv noćnog znojenja. Efikasna je za održavanje

zdravlja desni i zuba. Ublažava menstrualne grčeve, umanjuje stres, poboljšava pamćenje,

ublažava bol u zglobovima. Protiv upalna svojstva žalfije svoj povoljan uticaj odražavaju i na

bolove u zgolovima i grčeve u mišićima koji mogu biti izazvani od strane velikog broja

zdravstvenih oboljenja. Pomaže kod prekomernog znojenja, ovde ključnu ulogu igra umirujući

efekat žalfije, koji je zaslužan za umanjenje intenziteta rada znojnih žlezda. Ljudi koji

svakodnevno konzumiraju čaj od žalfije u proseku imaju znatno bolju memoriju od onih koji to

12

ne čine. Žalfija opušta mozak i zato ume da pojača moždane funkcije ukoliko se dovoljno često

unosi u organizam. Ovaj umirujući efekat takođe pomaže u savladavanju stresa. Zahvaljujući

svojim antiupalnim dejstvima koristan je u smanjivanju intenziteta menstrualnih grčeva, ali

takođe i grčeva u stomaku izazvanih otežanim varenjam.Simptomi groznice kao što su nemiran

san i dilerijum mogu biti znatno ublaženi korišćenjem čaja od žalfije. Zahvaljujući svojim

rashlađujućim i osvežavajućim svojstvima, čaj od žalfije može prodreti u kožu i ublažiti

simptpme groznice.

Slika 5. Žalfija

Vranilova trava (Origanum vulgare)

Vranilova trava ili vranilovka biljka-divlji origano je dugovečna zeljasta biljka-žbun, koji

raste na sunčanim i suvim stranama, a pripada porodici usnatica (Lamiaceae). Vranilovka ima

uspravne čvrste drške, visoke oko 50 cm, crvenkasto obojene i obrasle krupnim listovima. Biljka

cveta od jula do oktobra, a cvetovi su na vrhovima stabljika skupljeni u kompaktne okrugle

cvasti, roze purpurne boje, prijatnog mirisa i lepog izgleda. Beru se samo gornji, mladi delovi i

cvetovi, suše se u hladu na vazduhu i koriste kao začin i lek. Ukus divljeg origana je opor i

gorak. Sastav i dejstvo je vrlo slican majcinoj dušici. Ova biljka je odlican izvor minerala kao što

su kalijum, kalcijum, mangan, gvožđe i magnezijum.

Efekat origana na ljudsko zdravlje poznato je još od antičke Grčke, naziv potiče iz grčkog

jezika i znači „Radost planina“. U priridi postoje 52 vrste, ali najefikasniji je divlji origano

(Origanum vulgare). Naučno je dokazano da je vranilovka najjači prirodni antiseptik i antibiotik,

efikasno uništava viruse i bakterije. U prirodnoj medicini koristi se i u poboljšanju funkcije jetre

i žuči, primenjuje se kod upala sinusa, alergija, liringitisa i tuberkuloze, kao sredstvo za

iskašljavanje, zatim za širenje bronhija i protiv grčeva, protiv migrene, upale uha, upale bešike,

13

prehlade, gripa i moćan je borac protiv kancera (42 puta je snažnijii antioksidans od jabuke, 12

puta od pomoradže). Vranilovka ubija 100% kolonije tridesetak vrsta bakterija, među kojima su

Ešerihija Koli, Pseudomonas Aeruginusa, Salmonela, Stafilokoko i gljivicu Kandidu, u

organizmu i na koži. Vranilova trava čaj jača imunitet, a deluje i kao lek i kod bolesti organa za

disanje i varenje.

Slika 6. Vranilova trava

Uvin list (Arctostaphyllos uva-ursi)

Medveđe grožđe, medveđe uho, planivka, plivnjak je višegodišnji zimzeleni žbun iz

porodice vresova (Ericaceae). Medveđe grožđe je zimzeleni, polegli žbun, čije se grančice

zakorenjuju. Kora na granama je tamnosmeđa, ljuspa se. Listovi su naizmenični, sa kratkom

drškom ili sedeći, obrnuto jajasti na vrhu zaobljeni. Liska je kožasta, bez dlaka. Lice liske je

tamno zelen, sjajno, naličje svetlije. Cvetovi su sitni, vise u grozdovima na krajevima grančica.

Krunica zvonasta sa 4-5 režnjeva povijenih u stranu, ružičasto-beličasta. Plod je okrugla, crvena,

brašnjava koštunica. Cveta od maja do oktobra. Raste na suvim, kamenitimn mestima, na

grebenima visokih planina iznad 1200 m. Usled preteranog skupljanja kod nas, postala je

proređena vrsta na prirodnim staniništima pa je skupljanje listova kod nas regulisano posebnom

uredbom.

Čaj od uve koristi se za lečenje uvećane prostate, infekcija mokraćne bešike i mokraćnih

kanala, proliva i šecerne bolesti. Listovi pomešani s drugim lekovitim biljem dobro su

antiseptičko sredstvo, naročito u slučaju hronične upale mokraćne bešike i protiv peska ili

kamena u bubregu. Naši lekari često preporučuju čaj od jednakih delova uve i sitnice, a za

14

kvalitetan čaj potrebno je da se list izdrobi i duže kuva, jer kožasta i čvrsta koenzistencija lista

otežava i onemogućava ekstrakciju arbutina i tanina. Uva može da izazove mučninu, povraćanje,

iritaciju želuca i tamnu obojenost mokraće. Osim toga, ne preporučuje se deci, trudnicama,

pacijentima koji imaju neko oštećenje mrežnjače (retine) i pacijentima sa ozbiljnim oštećenjem

jetre.

Slika 7. Uvin list

Breza (Betula Pendula)

Breza (brez, brezuša, briza, brizovina, metlika) je visoko drvo koje dostiže visinu do 28

m i prečnik do 40 cm. Starost može biti i do 100 godina. Visoko drvo ima tanke i vitke grančice,

belu glatku koru što se može ljuštiti na listiće tanke poput papira. Listovi na peteljkama su koso

četvrtasti ili trouglasti, zašiljeni i dvostruko pilasti. Cvetne rese dugačke su 3 do 4 cm, a razvijaju

se zajedno s lišćem. Kao lek se koristila za brzo rastvaranje bubrežnih kamenaca i čišćenje od

nataloženog mulja. Uspešno se koristio i lekoviti čaj od breze za sprečavanje obolevanja organa

u kojima se sakuplja suvišna voda: bubrega, bešike, jetre i zglobova. Ova biljka podmlađuje

tkivo i ubrzava zarastanje dubokih rana. Lišće ima blago i dezinfekciono dejstvo pa se koristi i

protiv ukočenosti mišića, reumatizma i gihta. Brezov čaj pospešuje bubrežnu filtraciju, pomaže i

u slučaju srčanih bolesti. Poznato je antibakterijsko i antivirusno dejstvo ove biljke u slučaju

upala i alergija. U narodnoj medicini od breze se prave čajevi za lečenje ateroskleroze i

menstrualnih tegoba, a preporučuje se i gojaznim osobama, jer čaj od breze pospešuje

mršavljanje. Ova biljka jača kardiovaskularni sistem i snižava krvni pritisak. Unutrašnji deo kore

breze podstiče rad jetre, jer olakšava lučenje i protok žuči.

Ova biljka je bogata flavonoidima, koji imaju izuzetno lekovito dejstvo, a osim njih

sadrže i eterična ulja, tanine, saponine i vitamin C. Zahvaljujući dragocenim flavonoidima,

15

brezov čaj pospešuje bubrežnu filtraciju, a pomaže i u slučaju srčanih bolesti. Takođe je poznato

antibaterijsko i antivirusno dejstvo ove biljke u slučaju upala i alergija. Osim mladih listova

breze, od kojih se prave čajevi, lekovita svojstva ima i sok od breze, koji se dobija zasecanjem

kore. Sadrži dosta organskih kiselina, pa se koristi kao izvanredno osvežavajuće i okrepljujuće

sredstvo.

Slika 8. Breza

2.2. Polifenolna jedinjenja

Polifenolna jedinjenja ili polifenoli, su najvažnija grupa sekundarnih biljnih metabolita

koji se nalaze u mnogim biljkama, koncentrisani u semenkama i pokožici voća i povrća,

žitaricama, kori drveća, lišću i cveću. To su supstance koje u strukturi imaju jedan ili više

aromatičnih prstenova sa jednom ili više hidroksilnih grupa. Ove supstance se mogu naći u

slobodnom obliku ili češće u obliku glikozida sa različitim šećernim ostacima ili u obliku

kompleksa sa organskim kiselinama, aminima, lipidima, ugljenim hidratima i drugim

polifenolnim jedinjenjima. Do danas je poznato više od 8000 različitih struktura polifenolnih

jedinjenja, a njihovu osnovnu strukturu čini aromatični prsten na koji može biti vezana jedna ili

više hidroksilnih grupa. U biljkama se ova jedinjenja pretežno nalaze u konjugovanom obliku, sa

jednim ili više molekula šećera, te pokazuju aktivnost kako u hidrofobnim, tako i u liofilnim

sistemima. Najzastupljenija fenolna jedinjenja su: fenolne kiseline (derivati benzoeve i cimetne

kiseline), flavanoli, flavonoidi i dihidrohalkoni. Prema osnovnoj hemijskoj strukturi dele se na:

flavonoide, neflavonoide- fenolne kiseline, fenole i ostala srodna jedinjenja. Međutim, najčešća

16

klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za osnovni skelet fenola što je

prikazano u tabeli 1.

Tabela 1. Klasifikacija polifenolnih jedinjenja (Robards i sar., 2000)

Osnovni skelet Klasa Jedinjenje

C6 Prosti fenoli Katehol,hidrohinon,rezorcinol

Benzohinoni

C6-C1 Fenolne kiseline p-hidroksibenzoeva kiselina

C6-C2 Fenilsirćetne

kiseline

p-hidroksifenilsirćetna

C6-C3 Cimetne kiseline Kafena kiselina, ferulna kiselina

Fenilpropeni Eugenol, miristicin

Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin

Hromoni Eugenin

C6-C4 Naftohinoni Juglon

C6-C1-C6 Ksantoni Mangostin, magniferin

C6-C2-C6 Stilbeni Razveratrol

Antrahinoni Emodin

C6-C3-C6 Flavonoidi

Flavoni Apigenin, luteolin, sinensitin, nobiletin, izosinensitin,

tangeretin, diosmin

Flavonoli Kvarcetin, kamferol

Flavonol glikozidi Rutin

Flavanoli Dihidrokvarcetin i dihidrokamferol glikozidi

Flavanoni Hesperidin, naringenin

Flavanon glikozidi Hesperidin, neohesperidin, narirutin, naringinin,

eriocitrin

Antocijanini Glikozidi peralgonidina, peonidina, delfinidina,

petunidina, cijanidina

Katehini Katehin, epikatehin, galokatehin, epigalokatehin

Halkoni Floridžin, arbutin, halkonarigenin

(C6-C3)2 Lignini Pinorezinol

(C6-C3-C6)2 Biflavonoidi Agatisflavon, amentoflavon

Smatra se da je antioksidantna aktivnost fenola prvenstveno rezultat njihove sposobnosti

da budu donori vodonikovih atoma i kao takvi uklanjaju slobodne radikale uz formiranje manje

reaktivnih fenoksil radikala:

17

ROO∙ + Flavonoid-OH → ROOH + Flavonoid-O∙

OH∙ + Flavonoid-OH → H2O + Flavonoid-O∙

Povećana stabilnost formiranog fenoksil radikala pripisuje se prvenstveno delokalizaciji

elektrona i postojanju više rezonantnih formi.

Slika 9. Rezonantna stabilizacija fenoksil radikala

Sa povećanjem stabilnosti nastalog fenoksil radikala povećava se mogućnost nastajanja

rekombinantnih reakcija koje dovode do terminacije slobodno radikalskih procesa kod

flavonoida, kumarina i fenolnih kiselina (Mimica-Dukići sar., 1994.; Kujundžić, 2002.).

Dokazano je da su vicinalne diolne funkcije značajne za kapacitet hvatanja radikala kao i da

metoksilacije ili glikolizacije o-hidroksi grupa kumarina i esterifikacija fenolnih kiselina

smanjuju antioksidantnu aktivnost ovih jedinjenja.

Fenolna jedinjenja nisu ravnomerno rasprostranjena u biljnim tkivima. Najznačajniji

izvori fenolnih jedinjenja, a time i izvori antioksidanata su razni napici (crno vino, voćni sokovi,

zeleni i crni čaj, kafa, pivo), kakao, crna čokolada, jezgrasto voće (lešnik, badem, kikiriki),

šljive, grožđe, borovnice, brusnice, kupine, maline, jabuke, masline, soja, integralne žitarice,

brokoli, celer, itd.

2.2.1. Flavonoidi

Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama, čija osnovna

struktura je difenilpropan (C6-C3-C6). Flavonoidi su grupa polifenolnih jedinjenja, različite

hemijske strukture i karakteristika, koji se nalaze u raznim vrstama biljaka. Flavonoidi su

odgovorni za boju voća i povrća, mada u prirodi su takođe prisutni i bezbojni flavonoidi.

Flavonoidi imaju 15 C-atoma, sadrže dva benzenova jezgra koja su međusobno povezana

18

tročlanim ugljovodoničnim nizom. Hemijska struktura flavonoida bazira se na C15 skeletu sa

hromanovim prstenom za koji je vezan bezenov prsten u položajima najčešće 2, ređe 3 ili 4 (slika

10). Flavonoidi predstavljaju jednu od najkarakterističnijih klasa jedinjenja viših biljaka. Mnogi

flavonoidi se lako prepoznaju kao biljni pigmenti u mnogim familijima Angiosmermija

(cvetnica). Međutim, oni se ne nalaze samo u cvetovima, već u svim delovima biljaka.

Slika 10. Hemijska struktura flavonoida

Klasifikacija flavonoida varira u zavisnosti od stepena oksidacije u strukturi prstena. Pet

najčešćih tipova flavonoida na osnovu toga jesu flavoni, flavonoli, flavanoli, flavanoni i

antocijanidini. Strukture ovih flavonoida prikazane su na slici 11.

19

Slika 11. Različite klase flavonoida

Flavonoidi, naročito flavoni i flavonoli, štite biljke od oštećenja UV radijacijom. Na

primer, reakcije tamnjenja fenolnih jedinjenja katalisane polifenoloksidazama su od velikog

značaja za preradu voća i povrća, zbog mogućnosti formiranja nepoželjnih komponenata, aroma i

gubitka nutrijenata. Takođe, oksidativne promene fenolnih jedinjenja tokom tehnološke prerade

su važne za razvoj željene boje i arome određenih namirnica, kao što su kakao i čaj. Uglavnom

se razlike među flavonoidima baziraju na hidroksilovanju i/ili metilovanju delova tricikličnog

sistema.

2.2.2. Biološka uloga flavonoida

1) Flavonoidi kao biljni pigmenti

Sva flavonoidna jedinjenja imaju visoku apsorbanciju na talasnim dužinma od 250 – 270

nm. Flavoni i flavonoli apsorbuju na talasnim dužiama od 320 – 350 nm, a antocijani u

20

oblasti od 520 – 560 nm. Ovo je važno jer je u vezi sa vizuelnom precepcijom životinja i daje

objašnjenje procesa oprašivanja. Veliki broj insekata ima čulo vida osetljivo na talasne

dužine do 350nm, tj na flavone i flavonole i njihove glikozide.

2) Flavonoidi kao antikancerogene supstance

Među mnogobrojnim ispitivanjima u kojima se razmatra korišćenje biljnih proizvoda za

proizvodnju lekova protiv raka, postoje brojna mišljenja da neka flavonoidna jedinjenja

mogu usporiti kancerogene procese.

3) Toksično delovanje flavonoida

Nije utvrđeno da su flavonoidi toksični za ljude. Neki flavonoidi imaju jako toksično dejstvo

na insekte i ribe. Flavoni sa više hidroksilnih grupa, zbog veće polarnosti su manje toksični, dok

su njihovi metilovani derivati zbog manje polarnosti i bolje rastvorljivosti u lipidima više

toksični.

4) Antivirusno dejstvo flavonoida je veoma izraženo.

Utvrđeno je da kvercetin inhibira Herpes virus kod čoveka pri koncentraciji od 0,3 mg/ml.

5) Antibiotičko dejstvo flavonoida

Većina flavonoida pri niskim koncentracijama od 1-2 mikromola sprečava respiraciju i

reprodukciju bakterija.

6) Flavonoidi kao prirodni antioksidansi

Zbog svoje specifične strukture flavonoidi su važni prirodni antioksidansi. Prisustvo

flavonoida prekida slobodno-radikalsku reakciju, pri čemu predaju atom vodonika radikalima i

prelaze u slobodne radikale. Ovako nastali slobodni radikali su rezonantno stabilizovani i nemaju

dovoljno energije da pokrenu lančanu reakciju sa supstratom:

ROO∙ + Flavonoid-OH → ROOH + Flavonoid-O∙

OH∙ + Flavonoid-OH → H2O + Flavonoid-O∙

21

2.2.3. Flavan-3-oli

Flavan-3-oli su gradivne jedinice tanina. Tanini su polikondenzovana jedinjenja velikih

molekulskih masa. Na osnovu gradivnih jedinica oni se mogu podeliti na hidrolizujuće i

kondenzovane tanine. Hidrolizirajući tanini su poliestri galne kiseline ili njenih derivata i

centralnog molekula šećera. Kao što im samo ime kaže, lako hidrolizuju sa kiselinam, bazama i

toplom vodom. Kondenzovani tanini (proantocijanidoli ili proantocijanidini) se sastoje iz dve ili

više različito vezane jedinice 14 flavan-3-ola ili flavan-3,4-diola. Najčešće jedinice

proantocijanidola su: (-)-epikatehin, (+)-katehin i (-)-epigalokatehin.

Jedinjenje R1 R2 R3

(+)Katehin OH H H

(-)Epikatehin H OH H

(-)Epigalokatehin H OH OH

(+)Galokatehin OH H OH

Slika 12. Struktura flavan-3-ola

Procijanidini nastaju oksidativnom kondenzacijom flavan-3-ola koja se najčešće odigrava

između C4 atoma heterocikličnog prstena jedne i C8 ili C6 atoma susedne monomerne jedinice.

Mogu biti prisutni kao pojedinačni monomeri, a u nekim slučajevima i kao oligomeri.

22

2.2.4. Flavonoli

Flavonoli su flavonoidi pronađeni u mnogim biljnim vrstama, uglavnom u obliku

glikozida, povezani sa glukozom ili ramanozom, ali i sa drugim šećerima. Hidroksilne grupe u B

prstenu flavonola mogu se nalaziti na C-4, C-3' i C-4' i C-3', C-4' i C-5', pa su u voću i

proizvodima od voća prisutni kemferol, kvercetin i miricetin.

Jedinjenje R1 R2

Kvarcetin OH H

Rutin H OH

Mircetin OH OH

Kamferol H H

Slika 13. Struktura flavonola

2.2.5. Fenolne kiseline

Fenolne kiseline su derivati benzoeve i cimetne kiseline. Fenolne kiseline su prisutne u

voću u glikozidnoj formi, iz koje se mogu osloboditi kiselom hidrolizom. Derivati benzoeve

kiseline imaju C6-C1 strukturu. Varijacije u strukturi derivata ove kiseline nastaju

hidroksilovanjem ili metilovanjem aromatičnog jezgra. Na slici 14. prikazana je opšta formula

derivate benzoeve kiseline. Ove kiseline se retko nalaze u slobodnom obliku, osim u prerađenoj

hrani koja je prošla kroz proces zamrzavanja, sterilizacije ili fermentacije.

23

Jedinjenje R1 R2 R3 R4

P-hidroksi

Benzoeva

H

H

H

H

OH

H

H

H

Vanilinska H OCH3 OH H

Galna H OH OH OH

Slika 14. Opsta formula derivata cimetne kiseline

2.2.6. Antocijani

Antocijani su klasa flavonoidnih jedinjenja koja predstavljaju prave biljne pigmente.

Njihovo ime je izvedeno od grčke reči antho što znači cvet i kyanos što znači plav. Mogu se naći

u svim delovima biljke, od cveta do korena, a osim što biljci daju obojenost, štite je i od

prekomerne UV svetlosti i od štetnog dejstva slobodnih radikala. To su glikozilirani, polihidroksi

ili polimetoksi derivati 2-fenilbenzopirilijuma ili flavijum katjona i sadrže dva benzoil prstena (A

i B) razdvojena heterocikličnim prstenom C (slika 15). Strukturne varijacije antocijana se

javljaju usled različitog broja hidroksi grupa i njihovog stepena metilovanja, prirode i broja

šećera povezanih za fenolni (aglikonski deo) molekul, kao i položaja tih supstituenata i prirode i

broja alifatičnih i aromatičnih kiselina vezanih za šećer. Najčešće grade glikozide sa glukozom,

ali i sa ramnozom, arabinozom ili galatkozom, kao i sa nekim disaharidima. Ovi šećeri mogu biti

vezani za položaj 3 i 5 na prstenovima A i C. Varijacije i raznolikost u strukturi antocijana su

najviše javljaju zbog acilovanja šećernih grupa različitim kiselinama. Kiseline mogu biti

alifatične kao što su sirćetna kiselina, p-kumarinska kiselina, kafeinska kiselina, malonska

kiselina, maleinska, ferulična kiselina, oksalna i ćilibarna.

24

Slika 15. Struktura antocijana

Aglikoni antocijana (deo bez šećera) poznati su kao antocijanidini, a u prirodi je do sad

poznato 6 antocijanidina: pelargonidin, cijanidin, peonidin, delfinidin, petunidin i malvidin.

Antocijanidini su aglikoni koji se sastoje od aromatičnog prstena, kondenzovanog heterociklusa

koji sadrži kiseonik, za koga je takođe vezan C-C vezom treći aromatični prsten.

2.3. Tečna hromatografija visoke efikasnosti (HPLC)

Hromatografija je naziv za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje komponenti iz

smeša. Naziv potiče od grčkih reči chroma-boja i grafein-pisati. Hromatografske metode

razdvajanja se zasnivaju na različitoj raspodeli komponenata uzorka između dve faze, od kojih je

jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna). Mobilna faza može biti tečna ili

gasovita. Stacionarna faza je nepokretna faza, koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili ploči (npr.

silika-gel u TLC), na čijoj se površini određeno vreme zadržavaju supstance (analiti) koje se

razdvajaju. Hromatografske metode uključuju kretanje ispitivane smeše, rastvorene u "mobilnoj

fazi", kroz "stacionarnu fazu" (eluiranje), čime se delovi smeše razdvajaju na komponente.

Vreme za koje analit prođe kroz hromatografski sistem pod određenim uslovima (temperatura i

pritisak) naziva se retenciono vreme (tR), a vizuelni prikaz rezultata hromatografskog postupka

naziva se hromatogram. Hromatografija može biti analitička i preparativna. U analitičkoj

hromatografiji se obično radi sa malim uzorcima i meri se relativni odnos komponenata u smeši.

Preparativna hromatografija se bavi razdvajanjem komponenti iz smeše radi dalje obrade, pa se

može smatrati metodom prečišćavanja.

25

Tečna hromatografija visoke efikasnosti (tečna hromatografija pri visokim pritiscima) ili

HPLC (High performance liquid chromatography ili high pressure liquid chromatography)

predstavlja vrstu hromatografije kojom se postiže izuzetno dobra rezolucija pri razdvajanju čak i

veoma kompleksnih smeša. HPLC je našla široku primenu u analitičkoj hemiji i biohemiji i

koristi se za razdvajanja, identifikaciju i kvantitativno određivanje različitih jedinjenja. HPLC

razdvajanja se zasnivaju na različitoj raspodeli supstance između dve faze: tečne (mobilne faze)

koja nosi smešu analita kroz porozni materijal (stacionarnu fazu), pri čemu, usled različite vrste

interakcija analita sa stacionarnom fazom, dolazi do razlike u vremenu migracije komponenti

analiziranog uzorka. Ono što je razlikuje od ostalih metoda je to što je mobilna faza izložena

dejstvu visokog pritiska. Visok pritisak omogućava kontinuirani protok mobilne faze i

uspostavljanje dinamičke ravnoteže sa stacionarnom fazom. Dinamička ravnoteža je uslov dobre

selektivne raspodele komponenti u ispitivanom uzorku.

HPLC instrument je veoma složen i skup. Njegova najveća prednost je u tome što se

mogu analizirati i razdvajati neisparljive supstance i što se analize vrše na sobnoj temperaturi.

Osnovni delovi HPLC sistema su: pumpa - stvara pritisak od oko 106 Pa i omogućavaju

kontinualnu promenu brzine mobilne faze, kolona (najvažniji deo HPLC sistema), detektor -

najčešće se koriste UV/Vis detektori. UV/Vis detektori kao izvor zračenja najčešće koriste

deuterijumsku lampu koja ima veoma širok emisioni spektar zračenja (200- 700 nm), (slika 16)

Slika 16. HPLC aparat

26

Tipičan HPLC sistem sastoji se od relativno polarne mobilne faze i nepolarne

stacionarne faze. Voda (ili pufer) se koristi kao slab rastvarač i acetonitril, metanol, ili manje

zastupljen tetrahidrofuran, kao jak rastvarač. Stacionarna faza (HPLC kolona) je materijal sa

silika česticama. Koji će tip kolone biti izabran zavisi od jedinjenja i cilja analize.

Mobilne faze koje se koriste u HPLC su vodeno-organske smeše. Najčešće korišćeni

organski modifikatori su metanol, acetonitril i/ili kombinacija ova dva modifikatora. Rastvarači

za mobilnu fazu treba da budu mešljivi i ne treba da dovode do taloženja kada se pomešaju. Izbor

odgovarajućeg detektora zavisi od osobina analita. Postoje različiti tipovi detektora, UV/VIS,

detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa refrakcije, plameno-jonizacioni detektori (FID),

maseni (MS), NMR i drugi. Pravilan izbor detekcione talasne dužine je kritičan deo razvoja

metode. Temperatura takođe utiče na određivanja kod tečne hromatografije, posebno kada je reč

o rastvorima male molekulske mase.

2.4. Razvoj i validacija HPLC metode

U cilju održavanja visokog kvaliteta rezultata neke analize, neophodna je pouzdana i

tačna metoda analitičkog testiranja. Mnoge probne metode nisu prosle validaciju, zbog toga što

nisu adekvatne za široku upotrebu. Ukoliko poznajemo propisne regulative i puteve kreiranja

metode, razvoj iste ne bi trbalo da predstavlja problem. Tako kreirana metoda može proći

validaciju bez odlaganja procesa i ubrzo se naći u laboratorijama.

Širok spektar opreme, kolone, eluenata i operativnih parametara čini da razvoj metode za

tečnu hromatografiju visoke performanse (HPLC) izgleda složeno. Proces je pod uticajem

prirode analita i prati sledeće korake:

Korak 1 – izbor HPLC metode i početnog sistema

Korak 2 – izbor početnih uslova

Korak 3 – poboljšanje selektivnosti

Korak 4 – optimizacija sistema

Korak 5 – validacija metode

U zavisnosti od prirode uzoraka i analita, neki od ovih koraka nisu neophodni tokom

HPLC analize.

Prilikom validacije metode mora se voditi računa o: da bude jednostavno, prvo pokušati

sa najčešće upotrebljivanim kolonama i stacioniranim fazama, temeljno istražiti binarne mobilne

faze pre prelaska na tercijarne, misliti o faktorima koji su verovatno značajni za postizanje

željenog razdvajanja.

27

Promena sastava mobilne faze je najmoćniji način optimizacije selektivnosti, dok

promena temperature ima mali uticaj na promenu selektivnosti. pH će znatno uticati samo na

zadržavanje slabih kiselina i baza.

2.4.1. Izbor HPLC metode i početnog sistema

Prvi korak je pregled literature radi utvrđivanja da li je odvajanje prethodno izvršeno, i

ako jeste, pod kojim uslovima. Ovo štedi vreme, otklanjajući nepotreban eksperimentalni rad.

Prilikom izobora metode mora se voditi računa da ima veliku verovatnoću razdvajanja uzorka.

Razmatranje problema mora sadržati sledeće korake:

Priprema uzoraka, da li uzorak zahteva sušenje, koncentrovanje, filtraciju, ekstrakciju,

čišćenje? Da li je potrebno dodavati hemikaliju radi pospešivanja osetljivost detektora ili

selektivnosti?

Vrste hromatografije. Obrnuta faza se najčešće koristi, ali ako su prisutni kiseli ili bazni

analiti treba koristiti metodu obrnute faze sa suzbijanjem jona. Za neorganske katjon/anjon

analize, najbolje je koristiti jonoizmenjivačku hromatografiju.

HPLC sa gradijentnom eluacijom. Ova vrsta hromatografije se razmatra samo kod

kompleksnih uzoraka sa velikim brojem komponenti (20-30). Postupak se takođe može koristiti

za uzorke koji sadrže analite sa širokim opsegom retencionih vremena.

Dimenzije kolona. Za većinu (osim za veoma složene) uzoraka preporučuju se kratke

kolone 10-15 cm, da bi se smanjilo vreme potrebno za razvoj metode.

Detektori. Razmatranje obuhvata sledeca pitanja: da li analiti imaju hromofore, da

omoguće UV detekciju? Da li je potrebna selektivnija ili osetljivija detekcija? Koje su granice

detekcije? Da li uzorak zahteva hemijsku derivatizaciju radi poboljšanja mogućnosti detekcije.

Za analizu supstanci u tragovima treba koristiti flurescentni ili elektrohemijski detektor.

Za preparativnu HPLC analizu poželjan je detektor promene indeksa prelamanja, jer može da

zabeleži visoke koncentracije analita bez preopterećenja.

2.4.2. Izbor početnih uslova

Ovaj korak određuje optimalne uslove za adekvatno zadržavanje svih analita na koloni.

Obezbeđuje da svaki analit ima faktor kapaciteta veci od 0,5 (loše zadržavanje može dovesti do

preklapanja pikova), a manji od 10-15 (prekomerno zadržavanje dovodi do povećanje vremena

28

potrebno za analizu i širokih pikova sa lošijom mogućnošću detekcije). Pristupa se odabiru

sledećih uslova:

Snaga rastvarača mobilne faze. Snaga rastvarača je mera njegove sposobnosti da ukloni

analit sa kolone. Obično se kontroliše koncentracija rastvarača sa najvećom moći solvatacije.

Ostali faktori kao sto su pH i prisustvo reagensa za formiranje jonskih parova mogu uticati na

ukupno reteciono vreme analita.

HPLC sa gradijentom eluenata. Sa uzorcima koji sadrže veliki broj analita ili sa širokim

spektrom retecionih vremena, gradijent eluenata biće neophodan da bi se skratilo zadržavanje.

Određivanje početnih uslova. Preporučena metoda podrazumeva primenu gradijenta dva

rastvarača, koji se razlikuju samo po vremenu potrebnom za ispiranje.

2.4.3. Poboljšanje selektivnosti

Cilj ovog koraka je da se postigne adekvatna selektivnost (maksimum poreda među

pikova). Treba uzeti u obzir sastav mobilne i stacionirane faze. Ispituju se samo oni uslovi koji

najviše utiču na selektivnost. Takođe se uzima u razmatranje i priroda analita. Menjanje

parametra mobilne faze u ciju poboljšanja uslova mnogo je lakše od promene stacionirane faze

(promene kolone).

Povećanje selektivnosti kod HPLC sa gradijentnom eluacijom. Na početku uslovi

gradijenta treba da budu prilagođeni koristeći binarni sistem acetonitril/voda ( ili vodenom

puferu) ili metanol/voda (ili vodenom puferu). Ako postoji nedostatak u selektivnosti treba

potražiti drugačiju organsku modifikaciju.

2.4.4. Poboljšanje parametra sistema

Koristi se za pronalaženje balansa izmedju razdvajanja i vremena koje je potrebno za

analizu (razmatra se tek nakon što je postignut zadovoljavajući nivo selektivnosti). Pomenuti

parametri su: dimenzije kolone, veličina čestca punioca i brzina protoka. Ovi uslovi se mogu

menjati bez uticaja faktora kapaciteta ili selektivnosti.

29

2.4.5. Validacija metode

Osnovni validacijski parametri koji se sprovode tokom validacije analitičke metode su

tačnost, preciznost, specifičnost, limit detekcije, limit kvantifikacije, linearnost, radno područje i

robusnost. Validacija metode mora imati napisan i odobren protokol pre samog korišćenja istog.

Sve hemikalije i reagensi koji se upotrebjavaju moraju biti na najvišem (HPLC) stepenu čistoce.

Prilikom izrade eksperimenta koristi se dejonizovana voda.

Tačnost metode.To je korak podudaranja između stvarne i vrednosti dobivene primenom

analitičkog postupka određeni broj puta. Tačnost se određuje na minimalno tri koncentracijske

tačke unutar radnog područja. Tačan iznos analita nije poznat, zbog čega se testiranje metoda

koristi za procenu tačnosti. Osim toga, retko se dešava da rezultati nekoliko ponovljenih testova

daju isti rezultat, pa srednja ili prosečna vrednost uzima kao procena tačnog rezultata.

Preciznost metode. Preciznost metode definišemo kao izraz slaganja između niza merenja

provedenih iz istog homogenog uzorka prema propisanom analitičkom propisu. Ako se taj

postupak ponovi nekoliko puta unutar istog dana, tada govorimo o dnevnoj preciznosti ili

preciznosti unutar dana, odnosno ako se postupak ponavlja nekoliko dana uzastopno tada

govorimo o međudnevnoj preciznosti. U rezultatu se prikazuje srednja vrednost ispitivanja,

relativna standardna devijacija (RSD) i interval pouzdanosti (CI). Granice prihvatljivosti se

definišu zavisno od vrsti analize, prirodi uzorka, koncentraciji analita. Kod provođenja ovog

koraka potrebno je napomenuti da se ispitivanje obavlja u istoj laboratoriji koje radi isti

hemičar uz korišćenje istih instrumenata i hemikalija.

Limit detekcije (granica detekcije). To je najmanja količina analita u uzorku koja se može

detektovati, ali ne i kvantifikovati. Ovaj parametar primenjuje se samo kod validacija metoda

određivanja onečišćenja bilo kvantitativnom metodom ili limit testom.

Limit kvantifikacije (granica kvantifikacije). To je najmanja količina analita u uzorku

koja se može kvantifikovati uz odgovarajuću preciznost i tačnost. Limit kvantifikacije je

parametar koji se određuje kod kvantitativnih analiza kod kojih je nivo koncentracije analita koji

se određuje nizak (npr. metode određivanja onečišćenja i/ili razgradnih produkata).

Vrednosti granice detekcije i kvantifikacije se mogu izračunati i iz standardne devijacije

odgovora i nagiba kalibracione krive, na nivou koji približno odgovara granici kvantifikacije.

Standardna devijacija odgovora se može odrediti na osnivu standardne devijacije slepe

probe, preko standardne devijacije linije regresije ili standardne devijacije odsečka na y-osi linije

30

regresije. Potrebno je analizirati veći broj uzoraka da bi se opravdao nivo pouzdanosti

izračunatih pragova.

Linearnost metode. Linearnost metode je mogućnost metode da unutar datog područja

daje rezultate koji su proporcionalni koncentraciji analita u uzorku. Za potvrdu linearnosti

metode odabere se najmanje pet različitih koncentracijskih tačaka. Za svaku tačku linearnosti

odredi se srednja vrednost, te se iz dobivenih podataka izračuna jednačina pravca, koeficijent

regresije, nagib i odsečak pravca.

Robusnost metode. Ovaj parametar označava otpornost analitičkog postupka na male,

namerne promene parametara metode. Kod ispitivanja robusnosti menjaju se radni parametri

unutar realnih granica te se prati kvantitativna promena rezultata. Ako je uticaj promene

parametra metode unutar specifikacije metode, kaže se da je parametar u području robusnosti

metode. Parametre koji bi mogli uticati na rezultate metode treba držati pod nadzorom i njih

jasno označiti kod opisa metode. Tipični parametri kod ispitivanja robusnosti metode su

stabilnost mernih rastvora, dužina trajanja ekstrakcije, ispitivanje uticaja različitih filtera,

provera preciznosti i linearnosti metode uz rad nekog drugog hemičara i uz korištenje drugih

instrumenata i hemikalija u laboratoriji. Kod instrumentalnih metoda tipični parametri su

promena pH vrednosti mobilne faze i promena sastava mobilne faze (HPLC) te korištenje

različitih kolona, rad kod različitih temperatura i brzine protoka (HPLC i GC) i sl.

Postupak provođenja validacije analitičke metode, obrada analitičkih rezultata i izrada

validacijske dokumentacije zahteva značajan angažman analitičara. Međutim, korištenjem

validiranih analitičkih metoda smanjujemo mogućnost analitičke greške, a dobivene rezultate

možemo smatrati tačnim i pouzdanim.

Analitička stabilnost rastvora. Validacija uzoraka i standarda priprema rastvora mogu biti

podeljene na etape, od kojih se svaka može proveriti posebno. Ovo uključuje ekstrakciju,

povećanje efikasnosti odziva, razblaženje, dodavanje internih standarda. Ekstrakcioni postupci

ne utiču na dazu merenja, ali su od kljucnog značaja za testiranje analitičke metode. Proces

ekstrakcije mora biti u stanju da izvuče supstancu iz proizvoda, ne sme se gubiti neki od analita u

kasnijim fazama (npr. oksidacijom ili hidrolizom).

Referentne supstance treba sveže pripremiti, jer vremenom menjaju svoje osobine.

Mogući uzorci su: apsorpcija na posuđu ili razaranje pod uticajem svetlosti ili rastvarača. Ako

referentnu vrednost dobijamo iz matičnog rastvora, mora se utvrditi da li se rastvor degradira

tokom skladištenja. Treba obaviti i pripremu reagensa, kako bi se osiguralo da je metod pouzdan

i da neće dovesti do pravljenja pogrešnih rastvora, losih koncentracije i pH vrednosti. Uzorci i

standardi trebaju se testirati tokom perioda najmanje od 24 časa kvantifikacija komponenata

treba da se utvrdi poređenjem sa sveže pripremljenim standardima.

31

3. EKSPERIMENTALNI DEO

32

3.1. Biljni materijal

U ispitivanjima su kao biljne sirovine korišćene:

- Vranilova trava – Origanum vulgare

- Rtanjski čaj – Satureja montana

- Majčina dušica – Thymus serpyllum

- Lipa – Tillia cordata

- Uvin list – Arctostaphylos uva-ursi

- Divlja nana – Mentha spicata

- Žalfija – Salvia officinalis

- Breza list – Betula pendula Roth. ***

Sirovine su obezbeđene iz spontane flore sa područja Sokobanje i prirodno sušene.

Mlevenje i prosejavanje pojedinačnih biljnih sirovina obavljeno je uz korišćenje odgovarajuce

opreme (mlin, sejalica) i na taj način su biljne sirovine prerađene i usitnjene do veličine čestice

od 3 mm.

3.2. Hemikalije i reagensi

U radu su korišćeni sledeći reagensi: Kafena i ferulna kiselina proizvođača Sigma-

Aldrich (Steinheim, Germany), p-kumarna kiselina, hlorogenska kiselina, ruzmarinska kiselina,

miricetin, luteolin, rutin, kvercetin, kemferol, apigenin proizvođača Merck (Darmstadt,

Germany) i hiperozid od Extrasynthese (Genay, France).

Sve hemikalije i rastvarači koji su korišćeni bili su p.a. i HPLC čistoće.

3.3. Postupak ekstrakcije

Biljni ekstrakti su dobijeni postupkom maceracije, pri čemu je tačno odmerena masa

suvog biljnog materijala prenešena u erlenmajerovu bocu u koju je dodato 20 ml metanola.

Nakon 24 h stajanja uz povremeno mućkanje rastvarač je odekantovan, dodata je nova količina

rastvarača od 20 ml i postupak je ponovljen. Nakon izvršene ekstrakcije i filtriranja kroz

kvalitativnu filter hartiju, filtrati su spojeni i u normalnom sudu dovedeni do ukupne zapremine

od 50 ml. Ekstrakti su čuvani na tamnom i hladnom mestu.

33

3.4. HPLC analiza metanolnih ekstrakata lekovitog bilja

Sadržaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima lekovitog bilja, dobijenih po

postupku 3.3. je određen tehnikom tečne hromatografije visoke rezolucije (High Performance

Liquid Chromatography, HPLC) na aparatu HPLC Agilent 1200 serije. Korišcena je kolona

Agilent, Eclipse XDB-C18, 4,6mm x 150 mm. Detekcija razdvojenih pikova je izvršena pomocu

detektora sa serijom dioda (Diode Array Detector, DAD) na 280, 320 i 360 nm.

U cilju razdvajanja više komponenti u jednoj analizi, razvijena je metoda. Kao mobilna

faza korišćen je sistem rastvarača: A – (H2O + 5% HCOOH) i B – (80% HCN + 5% HCOOH +

H2O). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom sledećeg linearnog gradijenta: 0-28 min,

0% B; 28-35 min, 25% B; 35-40 min, 50% B; 40-45 min, 80% B, i na kraju poslednjih 10 min

ponovo 0% B.

Protok mobilne faze je iznosio 0,8 ml/min. Injektovano je 5 μL rastvora uzorka,

automatski, korišćenjem autosampler-a. Kolona je termostatirana na temperaturi od 30 ºC.

Fenolne komponente prisutne u uzorcima su identifikovane poređenjem njihovih

retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za svaku

komponentu. Korišceni su standardi: ruzmarinske kiseline, ferulne kiseline, hlorogenske kiseline,

kafene kiseline, p-kumarne kiseline, kvercetina, rutina, hiperozida, izokvercetina, apigenina,

luteolina, kemferola i miricetina.

Za potvrdu identifikacije komponente je utvrđena i čistoća pika. Kvantifikacija

komponenata je izvršena metodom spoljašnjeg standarda. Za svaki pojedinačni standard je

pripremljen osnovni rastvor standarda masene koncentracije 1,0 mg/ml, rastvaranjem u

metanolu. Od ovog rastvora je pripremljena serija razblaženih rastvora standarda odgovarajućih

masenih koncentracija. Konstruisana je kalibraciona kriva, za svaki standard, na osnovu

dobijenih površina pikova u zavisnosti od masene koncentracije standarda. Iz dobijene jednačine

linearne zavisnosti izračunate su masene koncentracije komponenti u uzorcima.

34

4. REZULTATI I DISKUSIJA

35

Kvantitativno odredivanje fenolnih jedinjenja samo po sebi predstavlja analitički izazov s

obzirom da je procenjeno da postoji preko milion ovih jedinjenja, koja se u biljkama nalaze u

obliku glikozida, sa velikom raznovrsnošcu u broju, vrsti i načinu vezivanja šećernih ostataka

(Mišan, 2009).

Objavljen je veliki broj HPLC metoda za određivanje fenolnih jedinjenja u biljnim

matriksima. U osnovi, one su prilagođene određivanju sadržaja najzastupljenijih fenola u jednoj

biljnoj vrsti ili određenog broja jedinjenja ove klase u raznovrsnim matriksima (Harnly i sar.,

2006).

U literaturi je zastupljen veliki broj radova koji se odnose na ispitivanje sastava fenola

različitih biljnih vrsta (Duda i sar., 2015), među kojima i vranilove trave, nane i šalfije (Miron i

sar., 2011; Areias i sar.,2001; Hossain i sar., 2010).

Imajući u vidu radove ovih autora, u našoj laboratoriji smo razvili HPLC metodu

primenljivu za razdvajanje fenolnih jedinjenja u svim ispitivanim ekstraktima.

Određivanje fenolnih jedinjenja se uglavno izvodi sa HPLC na C18 kolonama, sa

različitim mobilnim fazama i detekcijom u UV-Vis području. U ovom radu je korišćena kolona

Agilent, Eclipse XDB-C18, 4,6mm x 150 mm, pri čemu su menjane mobilne faze. U cilju

dobijanja dobre hromatografske separacije odabrana je mobilna faza cijanovodonična kiselina –

mravlja kiselina – voda (80 – 5 – 15, v/v/v), opisana u referenci (Mitić i sar., 2012).

Injekciona zapremina standardnih rastvora od 10 μL, u početnoj metodi, smanjena

je na 5 μL, a protok je od 1,0 ml/min smanjen na 0,8 ml/min kako bi se povećao odziv metode

bez narušavanja hromatografskog oblika pika. Uticaj temperature na hromatografsku efikasnost

nije bio izražen pa je temperatura od 30 ºC izabrana kao radna temperatura.

Pri validaciji HPLC metoda za određivanje fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima

odabranih biljnih vrsta vršeno je određivanje sledećih parametara: linearnost, tačnost i

preciznost, limit detekcije i limit kvantifikacije.

4.1. Linearnost

Svrha testa linearnosti je pokazati da unutar analitičkog sistema (uključujući detektor i

obradu podataka) postoji linearni odgovor i da je direktno proporcionalan odgovarajućim

koncentracijama analita u određenom koncentracionom području. Osnovni rastvor za svaku

supstancu treba pripremiti nezavisno (odvojeno), a serija razblaženja od ovog osnosnog rastvora

mora biti injektirana u HPLC sistem (konstantna injekciona zapremina). Test linearnosti treba

ispitati za najmanje pet (5) različitih koncentracijionih nivoa unutar specifikovanog područja.

36

Prihvatljivost podataka iz testa linearnosti je često potvrđena na osnovu ispitivanja koeficijenta

određivanja, y-odsečka i nagiba u regresionom modelu. Koeficijent određivanja r2 > 0,990 se

obično smatra kao dokaz prihvatljivog slaganja podataka sa regresionom linijom.

Određena je linearnost odgovora (površine pika) pojedinačno za sve dostupne standardne

supstance prema njihovoj koncentraciji. Rastvori za linearnost su injektovani tri puta. Rastvori

standarda za linearnost odgovaraju sadržaju od 2,0 do 150,0 mg/L. Izračunata je najbolja

fitovana linija, kao i koeficijent određivanja (metodom najmanjih kvadrata), a podaci prikazani u

tabeli 2.

4.2. Limit detekcije i limit kvantifikacije

Limit detekcije (LOD) je najniža koncentracija analita koja može biti detektovana, ali ne i

neophodno kvantifikovana, pod eksperimentalnim uslovima. Limit kvantifikacije (LOQ) je

najniža koncentracija u uzorku koja može biti merena sa prihvatljivim nivoom tačnosti i

preciznosti, pod datim eksperimentalnim uslovima. Za HPLC, limit detekcije i limit

kvantifikacije može biti definisan u masenim ili koncentracionim jedinicama.

Postoje nekoliko postupaka za određivanje LOD i LOQ. U ovom radu primenjen je

postupak određivanja na osnovu standardne devijacije odgovora i nagiba, pri čemu se LOD i

LOQ izračunavaju pomoću sledećih formula:

𝐿𝑂𝐷 =3,3𝜎

𝑆 , 𝐿𝑂𝑄 =

10𝜎

𝑆

gde su: 𝜎 - standardna devijacija odgovora; 𝑆 - nagib kalibracione prave.

Nagib 𝑆 može biti procenjen iz kalibracione prave analita (standarda). Procena 𝜎 može

biti izvršena na dva načina: bazirano na standardnoj devijaciji blanka ili bazirano na

kalibracionoj pravoj (standardna devijacija y – odsečka regresione linije, što je korišćeno u ovom

radu).

Vrednosti za LOD i LOQ za sve standarde korišćene u ovom radu date su u tabeli 2.

Sadržaji: miricetin 3-galaktozida i miricetin 3-glukozida su izračunati kao mg miricetin

ekvivalenta/g suve materije; kemferol 3-rutinozida kao mg kemferol ekvivalenta/g suve materije;

luteolin – glikozida kao mg luteolin ekvivalenta/g suve materije i apigenin – glikozida kao mg

apigenin ekvivalenta/g suve materije.

37

Tabela 2. HPLC karakteristike za fenolne kiseline i flavonoide

Jedinjenje Kalibraciona

prava

R2 LOD

(μg/ml)

LOQ

(μg/ml)

kafena kiselina y=32870,2-0,163 0,9982 0,008 0,024

hlorogenska kiselina y= 20954-0,234 0,9995 0,029 0,097

p-kumarna kiselina y=60772,5+0,432 0,9999 0,042 0,140

ferulna kiselina y=33172,3-0,533 0,9996 0,028 0,093

ruzmarinska kiselina y=10778,6+0,438 0,9999 0,020 0,067

miricetin y=19250,2-0,356 0,9998 0,033 0,110

luteolin y=21650,8+0,253 0,9996 0,030 0,100

rutin y=16510,6+0,486 0,9988 0,049 0,150

hiperozid y=15251,0-0,234 0,9998 0,033 0,110

kvercetin y=36580,2+0,286 0,9995 0,030 0,100

kemferol y=19850,3+0,582 1,0000 0,029 0,097

apigenin y=10252,0+0,832 0,9996 0,052 0,173

4.3. Tačnost i preciznost

Test tačnosti demonstrira blizinu slaganja između nađenih vrednosti i vrednosti koje su

prihvaćene kao propisane tačne vrednosti ili kao prihvaćene referentne vrednosti.

Preciznost i tačnost HPLC metoda određene su za prvu koncentraciju sa kalibracione

prave iz pet ponavljanja uzastopnih merenja (1) i pet merenja iste koncentracije analita u toku

jednog meseca sa vremenskim razmakom od 5 dana (2) pri istim uslovima i na istom aparatu.

Relativna standardna deviacija u prvom slučaju za sve korišćene standarde iznosila je do 2,32; a

u drugom slučaju do 5,85%.

4.4. HPLC analiza metanolnoih ekstrakta odabranih biljnih vrsta

Cilj ovog rada je bio da se izvrši detaljna analiza fenolnih komponenata u metanolnim

ekstraktima vranolove trave, rtanjskog čaja, majčine dučice, lipe, uvinog čaja, divlje nane, žalfije

i lista breze.

38

HPLC analiza metanolnoih ekstrakta vranilove trave, Origanum vulgare (Lamiaceae)

U metanolnom ekstraktu vranilove trave utvrđeno je i kvantifikovano prisustvo

hlorogenske kiseline, ruzmarinske kiseline, miricetin - glikozida, apigeninin – glukozida i

kvercetina . U poređenju sa ostalim kvantifikovanim jedinjenjima, svojim sadržajem se ističe

ruzmarinska kiselina (Tabela 3.). Hromatogram ekstrakta vranilove trave na 360 nm prikazan je

na slici 17.

Tabela 3. Sadržaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima, izražen u mg/g suve

materije.

Vranilova trava Rtanjski čaj Majčina dušica Lipa

kafena kiselina 0,27±0,017

Hlorogenska kiselina 1,00±0,030 0,66±0,024 1,26±0,040 0,23±0,020

p-kumarna kiselina 1,03±0,038 0,13±0,009

ferulna kiselina

ruzmarinska kiselina 37,08±1,053 17,62±0,438 20,13±0,567

miricetin 3-

galaktozid 5,19± 0,362

luteolin – glikozid 2,11 ±0,324 2,49±0,265

miricetin 3-glukozid 0,89 ±0,022

rutin 0,90±0,025 0,73±0,009

hiperozid 0,81±0,023 izokvercetin 0,05 ±0,002

apigenin – glikozid 0,46± 0,021 4,99±0,412 0,84±0,018

miricetin

kemferol 3-rutinozid

kvercetin 0,06±0,002 0,06±0,002 0,11±0,007 1,76±0,015

luteolin 0,37±0,010

kemferol 0,13±0,003

apigenin

Σ 43,75±0,294 25,85±0,178 26,76±0,137 5,10±0,013

Analizom fenolnog sastava ekstrakata vranilove trave do sada je utvrđeno postojanje

sledećih fenolnih jedinjenja: miricetin 3-glukozida, kvercetin 3-rutinozida (rutina), Luteolin 7-

O-glukozida, luteolin O-glukoronida, apigenin 7-O-rutinoside, apigenin 7-O-glukoronide

(Hossain et al., 2010). Miron i saradnici (2011) kafenu kiselinu, ruzmarinsku kiselinu, apigenin,

luteolin i naringenin. Pri tome je kod svih autora, najzastupljenija komponenta bila rosmarinska

kiselina, što je u skladu sa našim rezultatima. Na hromatogramu metanolnog ekstrakta vranilove

trave (slika 17) se jasno uočava izraženi pik ruzmarinske kiseline.

39

Slika 17. Hromatogram metanolnog ekstrakta vranilove trave na 360 nm: (1) miricetin-

galakozid; (2) rosmarinska kiselina; (3) apigenin-glikozid; (4) kvercetin

HPLC analiza metanolnog ekstrakta rtanjskog čaja, Satureja montana (Lamiaceae)

U metanolnom ekstraktu rtanjskog čaja kvantitativno su određena sledeća jedinjenja:

kafena kiselina, hlorogenska kiselina, rozmarinska kiselina, luteolin-glikozid, apigenin-glikozid,

kvercetin i u tragovima apigenin.

Kvantifikovane količine fenolnih kiselina su u skladu sa literaturnim podacima, gde je

navedeno da je najzastupljenija fenolna kiselina rtanjskog čaja ruzmarinska kiselina. Vladimir-

Knežević i sar. (2014) su kvantitativnom analizom ekstrakta rtanjskog čaja odredili da je u

gramu ekstrakta prisutno 31,11; 1,19 i 0,65 mg ruzmarinske, hlorogenske i kafene kiseline. Isti

autori su zaključili da su ruzmarinska kiselina, hlorogenska kiselina, kafena kiselina i ferulna

kiselina najčešće prisutne hidroksicimetne kiseline u vrstama koje pripadaju porodici Lamiaceae,

što je potvrđeno i u radovima drugih autora (Štefan i sar. 2013; Zorka i Glowniak, 2001; Peterson i

Simmonds, 2003)

Prisustvo luteolin – glikozida, apigenin – glikozida, kvercetina i apigenina je potvrđeno i

u radovima drugih autora (Askun i sar., 2012).

40

HPLC analiza metanolnog ekstrakta majčine dušice (Thymus serpyllum) (Lamiaceae)

U metanolnom ekstraktu majčine dušice kvantitativno su određena sledeća jedinjenja:

hlorogenska kiselina, p-kumarna kiselina, rozmarinska kiselina, luteolin-glikozid, rutin,

apigenin-glikozid i kvercetin.

Suma kvantifikovanih pojedinačnih fenolnih jedinjenja u metanolnom ekstraktu majčine

dušice iznosi 26,76 mg/g suve materije, pri čemu je ruzmarinska kiselina prisutna sa 75,2%.

Ovakav podatak je u skladu sa rezultatima drugih autora. Varga i sar. (2015) su odredili da se

sadržaj ruzmarinske kiseline u vrstama roda Thymus (Thymus serpyllum, Thymus glabrescens,

Thymus pulegioides) kreće u intervalu od 1372,76 μg/g do 1426,36 μg/g, dok je sadržaj kafene

kiseline u intervalu 100,60 and 109,59 μg/g, dok su znatno manje količine određene za ferulnu,

p-kumarnu i hlorogensku kiselinu. Isti autori su u svim uzorcima potvrdili prisustvo apigenin-7-

glukozida, rutina i kvercetina.

HPLC analiza metanolnog ekstrakta lipe, Tillia cordata, Malvaceae

U metanolnom ekstraktu lipe kvantitativno su određena sledeća jedinjenja: hlorogenska

kiselina, p-kumarna kiselina, miricetin-glukozid, rutin, hiperozid, izokvercetin kvercetin, luteolin

i kemferol.

Negri i sar. su u ekstraktima Tillia cordata identifikovali kvercetin i derivate kvercetina

(quercetin-3-O- rhamnoside- 7-O- glucoside, quercetin-3,7-di-O-rhamnoside, quercetin-3-O-

glucoside, kaempferol-3,7-di-O-rhamnoside) i kaempferol-3-O-rhamnoside. Prisustvo

izokvercetin u vrstama roda Tillia, kao što su: Tilia cordata, Tilia rubra, Tilia argentea i Tilia

platyphyllos, je takođe potvrđeno (Loscalzo et al., 2009; Martinez et al., 2009). Bubueanu i sar.

su ekstraktu lipe (Tillia cordata) identifikovali sledeća jedinjenja: ferulne kiseline, rutina,

hiperozida i glikozide kvercetina, miricetina i kemferola, što je potvrđeno u radovima drugih

autora (Wagner and Bladt, 1996; Negri et al., 2013)

Takođe, ekstrakti roda Tillia, od kiselina uglavnom sadrže kafenu kiselinu, hlorogensku

kiselinu i p-kumarnu kiselinu, što je u skladu sa našim rezultatima (Committee on Herbal

Medicinal Products - HMPC)

HPLC analiza metanolnog ekstrakta uvinog čaja (Arctostaphylos uva-ursi, Ericaceae

U metanolnom ekstraktu uvinog čaja kvantitativno su određena sledeća jedinjenja:

miricetin - galaktozid, miricetin-glukozid, rutin, hiperozid, izokvercetin, kemferol-rutinozid i

kvercetin. Najzastupljenija komponenta je miricetin – galaktozid (63,0%).

41

Analizom fenolnog sastava uvinog čaja do sada je utvrdeno postojanje sledecih fenolnih

jedinjenja: p-kumarne kiseline, ferulne kiseline, kafene kiseline, salicilne kiseline, hiperozida,

izokvercetina, kvercetina, miricetina, kemferola, kvercetin galaktozida, miricetin galaktozida i

drugih flavonoida (Committee on Herbal Medicinal Products - HMPC)

Hromatogram ekstrakta uvinog čaja na 360 nm prikazan je na slici 18.

Slika 18. Hromatogram metanolnog ekstrakta uvinog čaja na 360 nm: (1) miricetin-

glukozid; (2) miricetin-glukozid; (3) rutin; (4) hiperozid (5) izokvercetin; (6)kemferol-rutinozid

(7)kvercetin

42

Tabela 4. Sadržaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima, izražen u mg/g suve

materije.

Uvin list Divlja nana Žalfija Breza list

kafena kiselina 0,80±0,016 Hlorogenska kiselina 0,68±0,013 0,40±0,008 2,57±0,198

p-kumarna kiselina 0,09±0,002 0,47±0,008 0,57±0,010

ferulna kiselina

ruzmarinska kiselina 15,59±0,738 33,72±1,066

miricetin 3-galaktozid 15,95±0,286 3,22±0,205

luteolin – glikozid 0,77±0,012 3,06±0,223

miricetin 3-glukozid 4,88±0,203 1,51±0,018

rutin 2,52±0,120 1,15±0,015

Hiperozid 0,51±0,016

izokvercetin 0,26±0,005 0,11±0,004

apigenin – glikozid

Miricetin 0,87±0,012

kemferol 3-rutinozid 1,05±0,010

Kvercetin 0,14±0,017 0,42±0,011 0,31±0,008

luteolin 0,11±0,003

kemferol 0,22±0,004 1,32±0,019

apigenin 0,28±0,005 0,65±0,011 2,23±0,253

Σ 25,31±0,094 17,85±0,098 40,04±0,19 13,23±0,082

HPLC analiza metanolnog ekstrakta divlje nane Mentha spicata Lamiaceae

U metanolnom ekstraktu divlje nane utvrdeno je i kvantifikovano prisustvo hlorogenske

kiseline, p-kumarne kiseline, ruzmarinske kiseline, kao i slobodnih aglikona: kemferola,

luteolina i apigenina. U poređenju sa ostalim kvantifikovanim jedinjenjima, svojim sadržajem se

ističe ruzmarinska kiselina. Naši rezultati su u saglanosti sa rezultatima navedenih autora.

Poznato je da vrste roda Mentha sadrže širok spektar fenolnih jedinjenja uključujući fenil

propanoide (Guédon i sar., 1994; Triantaphyllou i sar., 2001), kao i flavonoide u formi aglikona,

glikozida i acilovanih derivata (Voirin i Bayet 1992; Voirin I sar., 1994). Najznacajnije fenolne

komponente nane su eriocitrin (eriodiktol-7-Orutinosid), luteolin-7-O-glukozid i ruzmarinska

kiselina (Dorman i sar., 2003). Areias i sar. (2001) su pronašli da su najzastupljenije komponente

u vodenom ekstraktu pitome nane glikozid eriocitrin i ruzmarinska kiselina, koji čine od 59-67%

ukupnih fenola. Triantaphyllou i sar. (2001) je saopštio da vodeni ekstrakt pitome nane sadrži

vezane fenolne kiseline, slobodnu ruzmarinsku kiselinu, kao i 3- i 5- glikozide flavonoida.

43

Cirlini i sar. (2016) su ekstraktu Mentha spicata L. odredili da je sadržaj ruzmarinske

kiseline 173,76 mg/g, dok je sadržaj apigenina iznosio 0,19 mg/g. Vladimir-Knežević i sar.

(2014) su u ekstraktu Mentha x piperita odredili ruzmarinsku kiselinu u količini 61,05 mg/g

ekstrakta, dok je sadržaj hlorogenske kiseline iznosio 1,78 mg/g ekstrakta.

HPLC analiza metanolnog ekstrakta žalfije Salvia officinalis (Lamiaceae)

U metanolnom ekstraktu žalfije kvantitativno su određena sledeća jedinjenja:

hlorogenska kiselina, p-kumarna kiselina, ferulna kiselina, rozmarinska kiselina, luteolin-

glikozid, kvercetin kemferol i apigenin.

U metanolnom ekstraktu žalfije određen je, osim za ruzmarinsku kiselinu (33,72 mg/g) i

visok sadržaj luteolin – glikozida (3,06 mg/g). Prisustvo različitih glikozida luteolina potvrdili su

mnogi autori: luteolin 7-O-glukuronida (Cvetkovikj i sar., 2013), luteolin 3-O-glukuronida i

luteolin 7-O-rutinozida (Hossain i sar., 2010). Da je ruzmarinska kiselina zastupljena u najvećem

sadržaju u ekstraktima žalfije potvrdili su i Zimmermann i sar., 2011, Kontogianni i sar., 2013;

Roby i sar.,2013. Bandoniene i sar. (2005) su u 80% metanolnom ekstraktu žalfije odredili

sadržaj rzmarinske kiseline od 19,5 mg/d suve materije, dok su Dent I sar. (2013) u 50%

etanolnom ekstraktu žalfije iz Hrvatske (ostrvo Pag) odredili sadržaj od 32,04 mg/g suve

materije.

Roby i sar. (2013) su odredili da je apigenin prisutan sa 14,32%, u odnosu na sumu

individualnih fenolnih jedinjenja, u ekstraktu žalfije, dok smo mi odredili samo 1,6%.

HPLC analiza metanolnog ekstrakta lista breze, Betula pendula Roth. (Betulaceae)

U metanolnom ekstraktu lista breze kvantitativno su određena sledeća jedinjenja: kafena

kiselina, hlorogenska kiselina, p-kumarna kiselina, rutin, miricetin, kvercetin i apigenin,

miricetin 3-galaktozid i miricetin 3-glukozid.

Analizom fenolnog sastava ekstrakata breze do sada je utvrdeno postojanje sledecih

fenolnih jedinjenja: kvercetin 3-rutinozida (rutina), kvercetin 3-galaktozida (hiperozida),

kvercetin 3-glukuronida, kvercetin 3-arabinopiranozida, kvercetin 3-arabinofuranozida, kvercetin

3-ramnozida i miricetin 3-galaktozida (Dallenbach-Tölke i sar., 1986). Prisustvo miricetin 3-

digalaktozida, metilovanih flavona (acacetina i apigenin 7,4‘-dimetil etra), kao i različitih

fenolnih kiselina je takođe poznato (Hänsel and Hörhammer, 1954; Pawlowska, 1980). Ossipov i

sar. (1996) su osim hlorogenske, neo hlorogenske, galne (+) katehina, glikozida kvercetina i

miricetina utvrdili i prisustvo niza drugih niskomolekularnih fenola.

Svojim sadržaje fenolnih jedinjenja u ispitivanom ekstraktu lista breze odvajaju se

miricetin 3-galaktozid (3,22 mg/g), hlorogenska kiselina (2,57 mg/g) i apigenin (2,23 mg/g). A.

44

Mišan je u svojoj doktorskoj diseraciji (2009) ispitivala fenolni profil etanolnog ekstrakta lista

breze (Betula pendula Roth.) i pri tome je odredila sadržaje za miricetin 6,02 mg/g ekstrakta, za

hlorogensku kiselinu 0,295 mg/g i za apigenin 0,643 mg/g.

45

5. ZAKLJUČAK

46

U ovom radu je izvršeno kvantitativno određivanje i identifikacija fenolnih komponenata

metanolnih ekstrakata vranilove trave (Origanum vulgare, Lamiaceae), rtanjskog čaja (Satureja

montana, Lamiaceae), majčine dušice (Thymus serpyllum, Lamiaceae), lipe (Tillia cordata,

Malvaceae), uvinog čaja (Arctostaphylos uva-ursi, Ericaceae), divlje nane (Mentha spicata,

Lamiaceae), žalfije (Salvia officinalis, Lamiaceae) i lista breze, Betula pendula Roth.

(Betulaceae).

Na osnovu dobijenih rezultata se mogu izvesti sledeći zaključci:

- U pogledu ukupnog sadržaja individualnih fenolnih jedinjenja, signifikantne razlike

među uzorcima postoje, pričemu je lipa (5,10±0,013 mg/g) uzorak sa najmanjim

sadržajem, dok je vranilova trava (43,75±0,294 mg/g) uzorak sa najvećim sadržajem

individualnih fenolnih jedinjenja u ekstraktu.

- Ruzmarinska kiselina je najzastupljenija komponenta u ekstraktu vranilove trave,

rtanjskog čaja, majčine dušice, divlje nane i žalfije a miricetin 3-galaktozid u ekstraktu

uvinog čaja i lista breze.

- Ekstrakt majčine dušice sadrži znatno veće količine luteolin–glikozida (2,49±0,265

mg/g ) u odnosu na apigenin–glikozida (0,8±0,018 mg/g), dok je u slučaju rtanjskog

čaja situacija obrnuta (2,11±0,324 , 4,99±0,412 mg/g). Ekstrakti divlje nane i

žalfije sadrže samo luteolin – glikozid (0,77±0,012, 3,06±0,223 mg/g).

- Prisustvo miricetina i njegovih derivata je karakteristično za ekstrakte lipe, uvinog

lista i lista breze.

47

6. Literatura

48

Andersen, O.M. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications.

Areias, F. M., Valentão P., Andrade P. B., Ferreres F., Seabra R. M. (2001) Phenolic fingerprint

of peppermint leaves, Food Chemistry, 73, 307−311.

Askun, T., Tumen, G., Satıl, F., Karaarslan, D. (2012) Active constituents of some Satureja L.

species and their biological activities, African Journal of Microbiology Research, 6, 4623- 4633.

Bandoniene, D., Michael Murkovic, M., Petras R. Venskutonis, P.R. (2005). Determination of

Rosmarinic Acid in Sage and Borage Leaves by High-Performance Liquid Chromatography with

Different Detection Methods, Journal of Chromatographic Science, 43, 372-376

Bival, Š. M., Vuković R. J.; Blažeković, B., Kindl, M., Vladimir-Knežević, S. (2013) Total

hydroxycinnamic acids assay: Prevalidation and application on Lamiaceae species. Food

Analytical Methods, 6, 1–11.

Bubueanu, C., Grigore, A., Pirvu, L. (2015) HPTLC fingerrint use, an important step in plant-

derived products quality control, Horticulture, Vol. LIX, 437-442

Cirlini, M., Pedro Mena, P., Tassotti, M., Herrlinger, K.A., Nieman, K.M., Dall’Asta, C., Del

Rio, D. (2016). Phenolic and Volatile Composition of a Dry Spearmint (Mentha spicata L.)

Extract Molecules, 21, 1007; doi:10.3390/molecules21081007

Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC) - Assessment report on Arctostaphylos uva-

ursi (L.) Spreng. folium, EMA/HMPC/573462/2009 Rev.1

Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC) - Assessment report on Tilia cordata Miller,

Tilia platyphyllos Scop., Tilia x vulgaris Heyne or their mixtures, flos,

EMA/HMPC/337067/2011

Cvetkovikj, I., Stefkov, G., Acevska, J., Stanoeva, J.P., Karapandzova, M., Stefova, M.,

Dimitrovska, A., Kulevanova, S. (2013). Polyphenolic characterization and chromatographic

methods for fast assessment of culinary Salvia species from South East Europe. Journal of

Chromatography A, 1282, 38-45.

Dallenbach-Tölke K., Nyiredy Sz, Meier B., Sticher O. (1987). HPLC analysis of the flavonoid

glycosides from Betulae folium. Planta Medicine, 53, 189−192.

Dent, M., Dragović-Uzelac, V., Penić, M., Brnčić, M., Bosiljkov, T., Levaj B. (2013). The Effect

of Extraction Solvents, Temperature and Time on the Composition and Mass Fraction of

49

Polyphenols in Dalmatian Wild Sage (Salvia officinalis L.) Extracts, Food Technology and

Biotechnology, 51, 84–91.

Dorman H.J.D., Kosar M., Antioxidant properties of aqueous extracts from Mentha species,

hybrids, varieties, and cultivars, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 4563-4569.

Duda, S.C., Marghitas L.A., Dezmirean, D., Duda, M., Margaoan, r., Babis, O. (2015) Changes

in major bioactive compounds with antioxidant activity of Agastache foeniculum, Lavandula

angustifolia, Melissa officinalis and Nepeta cataria: Effect of harvest time and plant species,

Industial Crops and Product, 77, 499-507.

FDA, "Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing and Controls

Documentation; Availability", Federal Register (Notices) 65(169), 52776–52777 (2000).

Guédon D. J., Pasquier B. P. (1994) Analysis and distribution of flavonoid glycosides and

rosmarinic acid in 40 Mentha x piperita clones. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42,

679−684.

Hänsel R., Hörhammer L. (1954) Comparative investigations on the flavonoid glycosides of

Betulaceae species. Arch. Pharm., 287, 117-126.

Hossain, M.B., Rai, D.K., Brunton, N.P., Martin-Diana, A.B., & Barry-Ryan C. (2010).

Characterization of phenolic composition in Lamiaceae spices by LC-ESI-MS/MS. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 58, 10576-10581.

Kontogianni, V.G., Tomic, G., Nikolic, I., Nerantzaki, A.A., Sayyad, N., Stosic- Grujicic, S.,

Stojanovic, I., Gerothanassis, I.P. Tzakos, A.G. (2013). Phytochemical profile of Rosmarinus

officinalis and Salvia officinalis extracts and correlation to their antioxidant and anti-proliferative

activity. Food Chemistry, 136, 120-129.

Loscalzo, L.M.; Wasowski, C.; MarderA, M. (2009). Neuroactive Flavonoid Glycosides from

Tilia petiolaris DC. Extracts. Phytotherapy Research, 23, 1453-1457.

Martinez, A.L. et al. (2009). Antinociceptive activity of Tilia americana var. mexicana

inflorescences and quercetin in the formalin test and in an arthritic pain model in rats

Neuropharmacology, 56, 564-571.

Miron, T.L., Plaza, M., Bahrim, G., Ibáñez, E., & Herrero M. (2011). Chemical composition of

bioactive pressurized extracts of Romanian aromatic plants. Journal of Chromatography A,

1218, 4918-4927.

50

Mitić M. N., Jean-Marc, S., Obradović M. V., Mitić, S.S. (2012). Phytochemical profiles and

antioxidant activities of Serbian table and wine grapes, Food Science and Biotechnology, 21,

1619-1626.

Mišan, A. Antioksidativna svojstva lekovitog bilja u hrani, Doktorska disertacija, Prirodno-

matematički fakultet departman za hemiju, Univerzitet u Novom Sadu, 2009.

Negri, G., Santi, D.; Tabach, R. (2013) Flavonol glycosides found in hydroethanolic extracts

from Tilia cordata, a species utilized as anxiolytics, Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, 15, 217-224.

Ossipov V., Nurmi K., Loponen J., Haukioja E., Pihlaja K. (1996) HPLC separation and

identification of phenolic compounds from leaves of Betula pubescens and Betula pendula.

Journal of Chromatogrraphy, 721, 59−68.

Pawlowska L. (1980) Flavonoids in the leaves of Polish species of the genua Betula L. I. The

flavonoids of B. pendula Roth. B. obscura Kot leaves. Acta Soc. Bot. Pol., 49, 281-296.

Petersen, M.; Simmonds, M.S. Rosmarinic acid. (2003).Phytochemistry, 62, 121–125.

Radovanović B., Radovanović A., Souquet JM. (2010). Phenolic profile and free

radicalscavenging activity of Cabernet Sauvignon wines of different geographical origins from

the Balkan region. Journal of Science and Food Agriculture, 90, 2455–2461.

Robards K., Prenzler P.D., Tucke, G., Swatsitang P. and Glover W. (1999). Phenolic compounds

and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry 66: 401–436.

Robya, M.H.H., Sarhana, M.A., Selima, K.A.H., Khalela, K.I.(2013). Evaluation of antioxidant

activity, total phenols and phenolic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia

officinalis L.), and marjoram (Origanum majorana L.) extracts, Industrial Crops and Products, 43,

827– 831

Triantaphyllou K., Blekas G., Boskou D. (2001) Antioxidative properties of water extracts

obtained from herbs of the species Lamiaceae. Int. J. Food Sci. Nutr., 52, 313−317.

USP 25–NF 20, Validation of Compendial Methods Section (1225) (United States Pharmacopeal

Convention, Rockville, Maryland, USA, (2002) 2256.

51

Varga, E., Bardocz, A, Belak, A., Maraz, A., Boros, B., Felinger, A., Bosormenyi, A., Horvath,

G. (2015). Antimicrobial Activity and Chemical Composition of Thyme Essential Oils and the

Polyphenolic Content of Different Thymes Extracts, Farmacia, Vol. 63, 3

Vladimir-Knežević, S., Blažeković, B., Kindl, M.,, Vladić, J., Lower-Nedza, A.D., Brantner,

A.H. (2014). Acetylcholinesterase Inhibitory, Antioxidant and Phytochemical Properties of

Selected Medicinal Plants of the Lamiaceae Family, Molecules, 19, 767-782

Voirin B., Bayet C. (1992) Developmental variations in leaf flavonoid aglycones of Mentha x

piperita. Phytochemistry, 31, 2299−2304.

Voirin B., Bayet C., Faure O., Jullien F. (1999) Free flavonoid aglycones as markers of

parentage in Mentha aquatica, M. citrata, M. spicata and M. x piperita. Phytochemistry, 50, 1189-

1193.

Wagner, H. and Bladt S., 1996. Plant Drug Analysis, A thin layer chromatography atlas.

Springer, New York, 359

Zgórka, G.; Głowniak, K. (2001). Variation of free phenolic acids in medicinal plants belonging

to the Lamiaceae family. J. Pharm. Biomed. Anal. , 26, 79–87.

Zimmermann, B.F., Walch, S.G., Tinzoh, L.N., Stühlinger, W., & Lachenmeier, D.W. (2011).

Rapid UHPLC determination of polyphenols in aqueous infusions of Salvia officinalis L. (sage

tea). Journal of Chromatography. B, 879, 2459-2464.

http://dijetaplus.com/vranilova-trava-divlji-origano-kao-lek-caj-asp/

http://dijetamesecevemene.com/zdravi-recepti/sena-caj-od-sene-protiv-zatvora/

http://cokocaj-trgovina.hr/caj/zanimljivosti-o-caju/

http://www.stetoskop.info/Caj-magicni-napitak-528-s5-content.htm

http://www.stetoskop.info/Majcina-dusica-4584-s3-content.htm

http://www.najboljicajevi.com/caj-od-nane-peperminta-dejstvo-i-priprema/

http://dijetaplus.com/caj-od-nane-kao-lek-dejstvo-html/

http://dijetamesecevemene.com/zdravi-recepti/caj-od-breze-za-mrsavljenje-priprema/