UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Katedra zoologie

Raná morfogenéza hlavových a dentálnych tkanív bichira P. senegalus .

DIPLOMOVÁ PRÁCA

Martin Kráľovič

Vedúci práce: Mgr. Robert Černý , Ph.D.

Praha 2009

Ak by som objavil v Egypte iba tento druh, bolo by to pre mňa zadosťučinenie za bolesť, ktorú dlhá cesta obnáša. Nepoznám viac podivné zviera hodné pozornosti prírodovedcov ukazujúce ako sa príroda môže odlíšiť od jej obvyklých štandardov, a ktoré by mohlo rozšíriť obzory našich predstáv o jej organizácii.

Étienne Geoffroy Saint-Hilaire, 1809 Poissons du Nil, de la Mer Rouge et de la Méditerranée. In: Description de l’Egypte,

Prehlásenie Prehlasujem, že som diplomovú prácu vypracoval samostatne pod vedením Mgr. Roberta Černého, Ph.D. a s použitím citovanej literatúry. V Prahe dňa 3.9.2009 ………………………..

Poďakovanie Na tomto mieste by som sa chcel poďakovať Mgr. Robertovi Černému, Ph.D. za jeho trpezlivosť, venovaný čas a za poskytnutie cenných rád a pripomienok. Taktiež sa chcem poďakovať pani Nohýnkovej za požičanie mikrotómu. V neposlednom rade ďakujem mojim rodičom a blízkym za ich podporu pri mojom štúdiu.

Abstrakt Bichiry, ako najbazálnejší zástupcovia skupiny Actinopterygii, predstavujú dôležitý článok pre pochopenie evolučných procesov nižších stavovcov a môžu pomôcť identifikovať pleziomorfné stavy znakov nielen skupiny Actinopterygii a Sarcopterygii, ale i čeľustnatých stavovcov (Gnathostomata) všeobecne. Doterajšia vzácnosť ich embryonálneho materiálu však bránila detailnejšiemu poznaniu vývinu týchto zaujímavých stavovcov. Moja práca je založená na opakovaných úspešných odchovov druhu Polypterus senegalus v ČR a mal som možnosť analyzovať cez 70 jedincov v kľúčových vývinových štádiách. Zameral som sa na raný vývin zubov a dentice v orálnej oblasti i na branchiálnych oblúkoch v kontexte vývinu orofaryngeálnej dutiny. Orofaryngeálna dutina bichira vzniká pomerne unikátne schizocélným spôsobom, najranejšia morfogenéza hlavy je zrejme ovplyvňovaná prítomnosťou cementových (príchytných) orgánov. Raný vývin úst zahŕňa formáciu unikátnych štruktúr, ktoré som nazval epitelové mostíky (epithelial bridges) (Kralovic et al., 2009), a ktoré môžu predstavovať ekto-endodermálnu hranicu, kľúčovú pre zakladanie a paternovanie dentice. Porovnával som vývin orálných a faryngealných zubov a zistil som, že medzi vznikom prvých zubov v ústach a vo faryngeálnej dutine je výrazný časový posun, zrejme v priamej závislosti na heterochrónii skeletalných elementov. Ve farynxe na poslednom, teda štvrtom ceratobranchiále, sa počas vývinu formujú zväčšené ozubené dosky, pripomínajúce tzv. faryngeálne čeľuste niektorých Teleostei. Spôsob vývinu dentice na štvrtom ceratobranchiále pripomína vývin dentice na niektorých zubonosných kostiach v ústnej dutine a tieto dáta sú diskutované v komparatívnom kontexte. Táto diplomová práca popisuje stav vybraných dentálnych znakov a ich vývojovú dynamiku v rámci oro-faryngeálneho komplexu bichira a diskutuje tieto znaky v komparatívnom kontexte stavovcov. Kľúčové slová: vznik úst, orálne zuby, faryngeálne zuby, orálna dutina

Abstract Polypterid fishes are considered the basal-most group of extant actinopterygians and thus may serve as a direct link for understanding the evolution of the first bony fishes. Their embryonic and larval material, however, is extremely scarce what makes it difficult to study their developmental patterns and processes. This work of mine is based on several successful breedings of the bichir Polypterus senegalus that allowed me to analyse development of some 70 specimens at key developmental stages. I have focused my attention to the early morphogenesis of teeth and dentition on several locations within a developmental context of oropharyngeal cavity. Oropharyngeal cavity develops quite differently when compared to other vertebrate species: it arises by means of a schizocoelic-like split of epithelial layers and, moreover, the earliest mouth cavity seems to be strongly constrained by the presence of cement (attachment) glands. Mouth opening proceeds by development of new, enigmatic structures that I have entitled the epithelial bridges (Kralovic et al., 2009) and that might represent the ectoderm-endoderm border often judged to be essential for tooth initiation and patterning. I have described a pronounced delay in initiation of pharyngeal teeth when compared to the oral teeth, probably as a direct consequence to the similar heterochronic development of skeletal elements. Enlarged dental patches developing on the fourth ceratobranchial resemble pharyngeal jaws of some Teleostei. The manner in which dentition on the fourth ceratobranchial develops paralells development of teeth on some tooth-bearing bones within oral cavity and this data are discussed in a comparative context. This Diploma work thoroughly describes some dental features of the bichir Polypterus senegalus and their developmental dynamics within an oropharynx, as well as discusses this data within a broad comparative context of vertebrates. Keywords: mouth development, oral teeth, pharyngeal teeth, oral cavity

1

OBSAH

OBSAH ………………………………………………………………………………… . .1 ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK ………………………………………………… 2 1.ÚVOD …………………………………………………………………………………. 4 2.LITERÁRNY PREHĽAD ……………………………………………………………. 7 2.1. Vznik úst …………………………………………………………………………….7 2.2. Evolučný pôvod zubov stavovcov ……………………………………………..…7 2.3. Faryngeá lne zuby a čeluste …………………………………………………..….10 2.4. Š tádiovanie a vývinové tabuľky bichira …………………………………….…13 3.MATERIÁL A METODIKA ………………………………………………………. 15 3.1.Zber materiá lu ……………………………………………………………………..15 3.2.Š tádiovanie …………………………………………………………………………15 3.3. Histologická analýza ……………………………………………………………..16 3.3.1.Zhotovovanie kryorezov ……………………………………………………………………16 3.3.2.Zhotovovanie plastových rezov …………………………………………………………….17 3.3.3.Farbenie histologických rezov ……………………………………………………………...18 3.4. Farbenie a pre jasňovanie celých jedincov ……………………………………..18 3.4.1.Farbenie alizarínovou červeňou …………………………………………………………….19 3.4.1.Farbenie alciánovou modrou a alizarínovou červeňou ……………………………………..20 4.VÝSLEDKY ………………………………………………………………………….. 22 4.1.Deskripc ia embryonálných štádií …………………………………………………22 4.2.Vznik úst a raný vývin orofaryngeá lnej dutiny ……………………………….. .23 4.3.Vývin dent ice ……………………………………………………………………….26 4.3.1.Vyvin orálnych zubov ………..……………………………………………………………...26 4.3.2.Vývin zubov na branchiálnych oblúkoch ……………………………………………………31 5.DISKUSIA ………………………………………………………………………….…34 5.1.Vznik ústne j dut iny ………………………………………………………………..34 5.2.Vývin zubov vústne j dutine ……………………………………………………….36 5.3.Vývin zubov na branchiá lnych oblúkoch ……………………………………..…40 5.4.Orá lne vs . faryngeálne zuby ……………………………………………………....41 6.ZÁVER …………………………………………………………………………………44 7.ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY …………………………………………..…..45 8.PRÍLOHY ………………………………………………………………………………53 8.1.Zoznam obrázkov ……………………………………………………………………53 8.2.Č lánok Kralovic e t a l. , 2009, submitted ………………………………………….74

2

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK ak anteriórny koronoid

ak.z zub na anteriórnom koronoide

bb bazibranchiále

cb1-4 ceratobranchiále prvého až štvrtého branchiálneho oblúku

ch ceratohyále

co cementové orgány

de dentále

de.z zub na dentále

dmp dermopalatínum

dmp.z dermopalatinálny zub

eng endopterygoid

epb1-2 epifaryngobranchiále prvého a druhého branchiálneho oblúku

epg ektopterygoid

epg.z zuby na ektopterygoide

hb1-3 hypobranchiále prvého až tretieho branchiálneho oblúku

hh hypohyále

h.o. hyoidný oblúk

lc labiálna chrupavka

max maxila

max.z maxilárny zub

m.o. mandibulárny oblúk

Mc Meckelova chrupavka

n nazálny vak

nt notochord (chorda dorsalis)

o oko

opz operkulárny záhyb

osk osifikácie senzorického kanálika hlavovej vetvy bočnej čiary

par parasfenoid

per perikard

pk posteriórny koronoid

prea preartikuláre

3

prea.z zub na preartikuláre

prik pripojovacia kosť

pq palatoquadratum

spir spirákulum

TL celková dĺžka tela (total lenght)

vo vomer

vo.z zub na vomere

žv žĺtkový vak

Úvod

4

1.ÚVOD Bichiry (Polypteriformes, syn. Cladistia) predstavujú malú skupinu sladkovodných

rybovitých stavovcov. Skupina zahŕňa jedinú recentnú čeľaď (Polypteridae) s približne

pätnástimi druhmi rodu Polypterus a jedným druhom rodu Erpetoichthys. Ich areál rozšírenia

je obmedzený na tropickú Afriku, avšak fosílne nálezy pochádzajú taktiež z Južnej Ameriky

(Daget et. al., 2001).

Aj napriek tomu, že od prvého popisu rodu Polypterus známym evolučným biológom E.

G. Saint-Hilaireom uplynulo už vyše dvesto rokov, fylogenetická príbuznosť bichirov

vyvolávala ešte donedávna diskusie. Bichiry totiž vlastnia unikátnu kombináciu znakov, ktorá

sa nevyskytuje u žiadnej inej žijúcej či fosílnej skupine stavovcov. Najmä prítomnosť znakov,

ktoré možno interpretovať ako evolučne primitívne či pleziomorfné, vyvolávala a stále

vyvoláva predstavu o „primitívnosti“ či bazálnosti tejto skupiny. Vďaka tejto predstave

primitívnosti sa z bichirov stal atraktívny objekt pre štúdie systematikov, anatómov a v

neposlednom rade aj embryológov.

Prehľad možných hypotéz o fylogenetickej príbuznosti ku recentným skupinám

stavovcov zachytáva obr.1. Dlhé desaťročia zostávala spornou otázka, či sú bichiry bližšie ku

línii lúčoplutvých rýb (Agassiz, 1833-1844; Goodrich, 1928; Romer 1946), alebo ku línií

vedúcej ku tetrapódom (Huxley, 1861; Kerr 1907). Treťou možnosť bola predstava, že bichiry

vytvarajú samostatnú líniu Brachiopterygii (Jarvik, 1964; Jollie 1984; Bjerring, 1985). Dnes

vo svetle molekulárnych štúdií (Venkatesh et al., 1999; Inoue et al. 2003; Kikugawa et al.,

2004; Chui et al., 2004) sa za najpravdepodobnejšou hypotézu javí možnosť (A na obr.1), že

bichiry predstavujú najbazálnejšie žijúce zástupcov lúčoplutvých rýb (Actinopterygii).

Každopádne bichir nestráca svoj status evolučne zaujímavého stavovca. Práve naopak, bichir

sa zrejme nachádza relatívne blízko vetvenia evolučných línií Actinopterygii a Sarcopterygii.

Z tohto dôvodu bichir má významnú úlohu v pochopení evolučných procesov, ktoré nastali

nielen v evolúcii Actinopterygii, ale taktiež v ranej evolúcii Sarcopterygii, a teda i tetrapódov.

Bichir teda predstavuje ideálny objekt pre komparatívne štúdie znakov medzi líniami

Actinopterygii, .Sarcopterygii a taktiež Chondrichthyes. Vznik znakov, čiže evolučných

noviniek a ich evolučnú dynamiku v ontogenetickom kontexte študuje jedna z

najprogresívnejšíe sa vyvíjajúcich biologických disciplín, evolučne-vývinová biológia („evo-

devo“). Medzi časté objekty evo-devo štúdií patria zuby stavovcov z mnohých dôvodov. Zuby

niektorých stavovcov patria medzi najjednoduchšie orgány čeľustnatcov, zložené z

Úvod

5

dentínového kužeĺu s kostenou bázou a pokrytého hypermineralizavaím tkanivom. Relatívna

jednoduchosť vývinu robí zo zubu ideálny model pre epitelo-mezenchymálne interakcie vo

vývinovej biológie. Zuby sú tvorené z najtvrdších tkanív v tele stavovcov a majú ideálne

predpoklady pre fosilizáciu.. Zuby s čeľustným aparátom sú všeobecne esenciálne pre

obstarávanie potravy, a preto ich tvar a funkcia odrážajú potravne-ekologické stratégie svojho

majiteľa.

Moderných odontologické práce boli spočiatku zamerané na molekulárnu reguláciu

vývinu zubov myši (Mus musculus), neskôr sa rozšíril o lúčoplutvú rybu dánio pruhované

(Danio rerio). Oba modely však majú veľmi odvodenú denticu. Myš má iba jednu generáciu

vysoko špecializovaných zubov, zatiaľ čo dánio nemá zuby v ústach, ale iba na piatom

žiabrovom oblúku, čo komplikuje ich vzájomnú komparáciu. Recentne sa problematika

výzkumu dentice u stavovcov rošírila na nové druhy, z ktorých niektoré majú oba typy zubov:

pstruh (Oncorhynchus mykkis), medaka (Oryzipias laticeps), tetra mexická (Astyanax

mexicanum) či africké cichlidy. Nevýhodou týchto rýb je, že sú to všetko zástupcovia

odvodenej skupiny rýb Teleostei. Z mnohých prác je evidentné (Stock 2001; Smith, 2003), že

dentica u stavovcov prešla cestou reduktívnej evolúcie, pričom pleziomorfný stav dentice je

zachovaný u niektorých bazálných Actinopterygii. Pre štúdium ancestrálných znakov v

dentice stavovcov sú preto vhodnejšie tieto bazálne skupiny rýb. Je zrejmé, že bichir ako

najbazálnejší zástupca Actinopterygii túto požiadavku spĺňa. Avšak aj napriek veľkému

záujmu o tohto stavovca sú informácie o dentálnom či kraniálnom vývine bichira kusé. Je to

spôsobené vzácnosťou embryonálneho materiálu. Veľký záujem o spoznanie ontogenézy

tohto tak trochu záhadného stavovca dokonca viedol kedysi na prelome 19.-20. storočia

zoológov k nebezpečným expedíciám do trópov Afriky počas období dažďov, často s

tragickými následkami (Kerr, 1907; Hall, 2001). Odchovy v zajatí sú relatívne zriedkavé. Je

totiž problém vytvoriť v zajatí optimálne podmienky pre rozmnožovanie. Bichiry sa množia

počas záplav v období dažďov, kedy sa výrazne mení kvalita vody.

Niekoľko úspešných odchovov druhu bichir senegalský (Polypterus senegalus, Cuvier)

umožnilo vznik tejto práce., v ktorej som si vytýčil tieto nasledujúce ciele:

1. Popísať ranú morfogenézu orofarynxu.

2. Popísať a porovnať vývin zubov v ústnej dutine a na branchiálnych oblúkoch v kontexte

vyvinu orálnych a faryngeálnych skeletálnych elementov.

3. Diskutovať tieto znaky v komparatívnom kontexte stavovcov.

Úvod

6

Literárny prehľad

7

2. LITERÁRNY PREHĽAD 2.1. Vývin úst Ústna dutina vzniká takmer u všetkých stavovcov približne rovnakým spôsobom (Kerr,

1919; Kardong, 1995; Liem et al., 2000). Ektoderm na povrchu hlavy sa invaginuje a vytvorí

stomodeum. U embryí kostnatých rýb (Teleostei), ktoré vlastnia veľký žĺtkový vak, nie je v

tomto štádiu vytvorený lumen orofaryngeálnej dutiny (Senior, 1909;Waterman & Kao, 1982).

Lumen vzniká neskoršie schizocélne, separáciou vrstiev orofaryngeálneho epitelu.Vytvorí sa

tak medzi lumenom stomodea a prvočreva prechodná prepážka nazývaná orofaryngeálna (tiež

aj buko- či stomofaryngeálna) membrána. Podľa Dickinson & Sive (2006) u žaby Xenopus

leavis sa postupne táto membrána stáva tenšou, pričom ekto- a endodermálne bunky

interkalujú medzi seba. Nakoniec dôjde k ruptúre orofaryngeálnej membrány čím vznikne

priechodná časť anteriórnej tráviacej trubice.

Ústa u niektorých stavovcov však vznikajú odlišne. U mlokov (Urodela) invaginuje

bazálna vrstva ektodermu a obalí anteriornu časť faryngeálneho ektodermu (Johnson, 1910;

Adams, 1924; Reisinger, 1933). Nevzniká teda stomodeum, ale vytvára sa prstenec

ektodermu okolo endodermu tzv. „ectodermal collar“. Taktiež nevzniká orofaryngeálna

membrána. Lumen orofaryngeálnej dutiny vzniká separáciou vrstiev v endoderme. Tejto

schéme odpovedá vznik úst u bahníkov (Dipnoi) (Kerr 1902, 1910 a 1919). Zaujímvé je, že u

bazálneho mloka Hynobius tokyoensis bolo pozorovaná formácia orofaryngeálnej membrány

(Takahama et al., 1988). Vývin úst u bazálnej žaby Ascaphus truei (Reiss, 1997) sa odlišuje

od procesu formácie úst u žaby Xenopus leavis (Dickinson & Sive, 2006) pripomína skôr

vývin úst u mlokov a bahníkov. Postavenie úst u žubrienok Ascaphus truei je neobvýklé,

nachádzajú sa ventrálne. Ústa sú pretvorené na ústny terč, ktorým sa fixujú ku substrátu v

rýchle tečúcich vodách horských potokov. Je preto veľmi ťažké rozhodnúť ktorý z oboch

spôsobov predstavuje ancestrálny či pleziomarfný stav.

Evolučný pôvod zubov stavovcov

Zuby sú významnou apomorfiou stavovcov, ale ich evolučný pôvod je stále nejasný. V

súčasnosti existujú tri teórie, ktoré sa snažia vysvetliť proces vzniku zubov.

Literárny prehľad

8

„Outside-in theory“

Mnohé fosílne ale i recentné stavovce majú na povrchu tela šupinky, ktoré sa nápadne

podobajú zubom v čeľustiach. Obe štruktúry zuby aj šupinky sú zložené z dentínu, na báze sa

nachádza acelulárna či celulárna kosť. V mnohých prípadoch je dentín pokrytý

hypermineralizovanou vrstvou skloviny či enameloidu. Obe štruktúry majú dreňovú

(pulpálnu) dutinu s odontoblastami, nervovými vláknami a krvnými cievami. Zuby v

čeľustiach a šupinky na povrchu tela sa označujú ako odontódy čiže štruktúry, ktoré obsahujú

dentín a jemu podobné tkanivá pokryté hypermineralizavaným tkanivom v podobe skloviny či

enameloidu (Orvig 1967 a1977; Donoghue & Sansom, 2002). Recentné Chondrichthyes a

majú obe: šupinky na povrchu tela nazývané plakoidné šupiny a v čeľustiach zuby. Na

základe podobností dernálných šupiniek a zubov bola vytvorená tzv.„Odontode Regulation

theory“ (Reif, 1982). Odontódy vznikajúce na povrchu tela vytvárajú určité inhibičné pole pre

vznik ďalších odontód. Nové odontódy môžu vznikať iba mimo tohto inhibičného poľa napr.

ak stará odontóda vypadne. Uvedený mechanizmus vzniku odontódy je však nevhodný pre

čeľuste. Nová odontóda by tak vznikala na uvoľnenom mieste po starej odontóde. Bola by tak

priamo vystavená vystavená tlaku okludujúcich čeľustí. Tento problém pomohla vyriešiť

epiteliálna invaginácia, teda zubná lišta (ang. dental lamina). Pomocou tohoto orgánu nové

odontódy vznikajú chránené hlboko pod povrchom čeľustí unikli z inhibičného pôsobenia

susedných odontód. Na povrch čeľustí sa dostávajú už plne vyvinuté odontódy, ktoré môžu

plniť funkcie zubov. Zuby sú podľa Reifa (1982) definované ako odontódy vznikajúce

výhradne zo zubnej lišty.

Tento model vzniku zubov predpokladá. že zuby pochádzajú z povrchu tela a teda sú

derivátmi ektodermu. Mnohé staršie morfologické práce výhradný pôvod zubov z ektodermu

spochybňujú (napr. Edwards, 1929). Recentné štúdie ukazujú, že zubný epitel v ústnej dutine

axolotla (Ambystoma mexacanum) vzniká ako z ektodermu, tak i z endodermu (Soukup et al.,

2008). U mnohých stavovcov sa však zuby v ústnej dutine vyvíjajú povrchovo bez žiadnej

epiteliálnej invaginácie (Sire et al. 2002). Dokonca aj u niektorých stavovcov so zubnou lištou

sa počas embryonálneho vývinu prvé zuby vznikajú rudimentárné zuby povrchovo, mimo

zubnej lišty (Sire et al., 2001).

Literárny prehľad

9

„Inside-out theory“

Nové fosílne nálezy a ich interpretáie viedli k vytvoreniu alternatívneho modelu vzniku

zubov u stavovcov. Loganellia scotica patrí medzi thelodonty, bezčeľustnaté stavovce s

rybovitým telom pokrytým drobnými šupinkami. Vo farynxe v blízkosti žiabrových štrbín

boli nájdené drobné šupinky (Van der Brugghen & Janvier, 1993). Usporiadanie šupiniek vo

farynxe podľa Smith & Coates (2001) bolo odlišné než u šupiniek na povrchu tela.

Faryngeálne šupinky boli závitnicovo usporiadané, čo pripomína usporiadanie zubov u

bazálných čeľustnatcov (Van der Brugghen & Janvier, 1993).

Zastupcovia fosílnej skupiny konodonti (Conodonta) mali mineralizovaný aparát vo farynxu,

ale bez dermálneho skeletu na povrchu tela. Predpokladá sa že mineralizované elementy

aparátu vo farynxu boli zložené zo skloviny a dentínu a predstavujú štruktúry homologické k

zubom stavovcov (Donoghue & Sansom, 2002). Prítomnosť skloviny a dentínu ich zaraďuje

medzi stavovce. Konodonti by teda mohli predstavovať prvé stavovce s mineralizovaným

skeletom.

Prítomnosť šupiniek vo farynxu bezčeľustnatých stavovcov a ich podobnosť ku dentici

bazálných stavovcov viedli Smith & Coates (2000, 2001) k návrhu, že zuby mohli vzniknúť

vo farynxu pred vznikom čeľustí. Až neskôr pri vzniku čelustí zuby osídlili ústnu dutinu a

čeluste. Tento model predpokladá, že zuby vznikli pôvodne v endodermu až neskôr bola

odontogénna schopnosť epitelu posunutá na ektoderm. Podľa Smith (2003) zuby v ústnej

dutine vznikajú v blízkosti hranice ektodermu a endodermu čiže orofaryngeálnej membráne.

Hranica ektodermu a endodermu je preto považovaná za miesto pre iniciačnú informáciu pre

iniciáciu odontogenézy. Prítomnosť zubov vo faryngeálnej dutine konodontov ukazuje na

skutočnosť, že zuby zrejme vznikli v asociácii s viscerokrániálnym skeletálnym systémom a

sú preto vývojovo odlišné od dermoskeletálných šupiniek (Donoghue Sansom).

„Modified outside-in theory“

Nedávno bola publikovaná nová hypotéza o vonkajšom pôvode zubov (Huysseune et al.,

Sire, 2009). Táto hypotéza oponuje hypotéze o endodermálnom pôvode zubov (inside out

theory). Podobne ako klasická teoria o vonkajšom pôvode zubov (outside-in theory, sensu

Reif 1982 ) tvrdí, že odontódy a zuby pochádzajú z vonkajšieho povrchu tela. Líši sa však v

Literárny prehľad

10

posune odontogénnej kompetencie z ektodermu na endoderm čiže v opačnom ako v prípade

inside-out theory. Teória o modifikovanom vonkajšom pôvode je založená na

paleontologických a embryologických dátach. Faryngeálne zuby sa nachádzajú iba u skupín

stavovcov so žiabrovými štrbinami. Strata žiabrových štrbín pri prechode terapódov na súš by

mohla byť dôvodom, prečo sa faryngeálne zuby u tetrapódov nenachádzajú. Medzi

embryonálne dáta podporujúce túto teóriu patria transplantačné experimenty u

obojživelníkov, podľa ktorých je ku tvorbe zubov potrebný ektoderm, endoderm a bunky

ektomezenchýmu a nie iba endoderm a ektomezenchým (napr. Sellman, 1946, Wilde, 1955,

Graveson et al., 1997). Podrobná histologická analýza vzniku faryngeálných zubov u kapra

(Cyprinus carpio) ukazuje že dentálny epitel vzniká z endodermálnj bazálnej vrstvy(Edwards,

1929). Apikálná vrstva je však z ektodermu. Zuby u kapra vznikajú v blízkosti kontaktu

endodermu a ektodermu. Teória o modifikovanom vonkajšom pôvode zubov navrhuje ako

primárny ektodermálny, teda od dermálnych odontód odvodený pôvod zubov. Tento

argument môže podporiť Eda mutanty u dánia ktoré postrádajú okrem dermálnych

skeletálných štruktúr ako šupiny a lepidotrichiá aj zuby vo farynxe (Harris et al. ,2008).

2.4. Faryngeálne zuby a čeľuste V orofaryngeálnej dutine mnohých recentných žralokov sa nachádzajú početné dentikuly

pripominajúce plakoidné šupiny na povrchu tela (Hertwig, 1874; Steinhard, 1903; Imms

1905, Nelson 1970). Nachádzajú sa voľne v stene orofaryngeálnej dutiny a môžu siahať až po

začiatok hltanu (Steinhard, 1903). V usporiadaní a tvare orofaryngeálných dentikul žralokov

je značná vnútrodruhová a medzidruhová variabilita, ale predpokladaný ancestrálny stav je

výskyt na povrchu pozdĺž celej dutiny orofarynxu (Nelson, 1969). Podľa Reifovej definície

(Reif, 1982) sú zuby odontódy vznikajúce z dentálnej laminy v čeĺustiach. Dentikuly v

orofaryngeálnej dutine žralokov by teda nemali byť označované ako zuby, ale skôr ako

šupiny. Situácia však nie je tak jednoduchá, ako to na prvý pohľad vyzerá. Na branchiálnych

oblúkoch niektorých žralokov sa totiž nachádzajú na dorzálnej a ventrálnej časti

branchiálneho aparátu špecializované štruktúry označované ako tzv. „pharyngeal pads“. Sú to

zhrubnuté časti branchiálnych oblúkov epitelu s dentikulami podporovaná určitou časťou

skeletu branchiálných oblúkov. Na štruktúrach označovaných ako „pharyngeal pads“ sa

nachádzjú ostrovčeky dentikul. Zaujimavé je, že na tých štruktúrach sú u niektorých druhov

ako napríklad Carcharhinus milberti či Scoliodon terraenovae sa nachádzajú tieto dntikuly v

radoch (Nelson, 1970). U žralokov sú zuby v čeľustich usporiadané do radov a predpokladá

Literárny prehľad

11

sa, že toto usporiadanie vzniká pôsobením zubnej lišty (Reif, 1982; Smith & Coates, 2001;

Smith, 2003). Nie je však známe, ako sa tieto rady dentikul na „pharyngeal pads“ vyvíjajú a či

je tam prítomný nejaký ekvivalent zubnej lišty v čelustiach. Orofaryngeálne dentikuly u

žralokov teda vyzývajú po prehodnotení definície zubov a zubnej lišty. Podľa Nelsona (1970)

„pharyngeal pads“ s dentikulami u Chondrichthyes sú analogické ku horným a spodným

faryngeálnym čeľustiam u kostnatých rýb (Osteognatostomata), ktoré u oboch skupín sa

podieľajú na transporte potravy do hltanu. Lund (1985) uvádza pri deskripcii fosílneho

bazálneho žraloka druhu Falcatus falcatus, že v branchiálnej oblasti boli zrejme prítomné

ozubené dosky asociované s opornými elementami žiabrových oblúkoch. Je preto docela

možné, že bazálni zástupcovia boli vybavený ozubenými doskami ako u Actinopterygii a

Sarcopterygii (Osteognatostomata.)

Na rozdiel od recentných Chondrichthyes sa dentikuly či zuby vo farynxe u zástupcov

skupiny Osteognathostomata sú nachádzajú iba v asociácii s branchiálnýnmi oblúkami

(Nelson, 1969). Zuby vo farynxe veľmi často u bazálnych skupín sú pripevnené k menším

zubmým doskám, ktoré sprostredkúvajú sekundárne pripevnenie zubov ku oporným

elementom. Zuby sú ku oporným elementom pripojené rôznymi spôsobmi. Nachádzajú sa už

u bazálných skupín oboch línií Sarcopterygii aj Actinopterygii. U bahníkov (Dipnoi) nie je

známi výskyt zubov vo farynxe. Bahníci si už v ranej evolúcii vyvinuli čeľuste so

špecializovanými dentálnymi doskami na drtenie schránok bezstavovcov (Reisz & Smith,

2001). Durofágna potravná stratégia by mohla byť jedným z dôvodov prečo bahníci stratili

faryngeánu denticu. Známym zástupcom Sarcopterygii s početnou faryngeálnou denticou je

Eustenopteron foordi. Okrem ozubených branchiálnych oblúkov sa zuby na ozubených

doskách u tohoto rodu vyskytujú na hyoidnom oblúku (Jarvik, 1964). Veľmi početné sú zubné

dosky na branchiálných oblúkov u recentného zástupcu Latimeria chalumnae (Nelson, 1969).

Pri prechode na súš u skupiny Tetrapoda došlo k strate faryngeálnych zubov. Ojedinele u

niektorých fosílných temnospondylných obojživelníkov sa zachovali zuby na zubných

doskách (Stoch, 2001). U týchto obojživelníkov sa predpokladá, že mali ešte stále vytvorené

žiabrové štrbiny (Schoch, 2001; Huysseune et al., 2009).

Diverzita faryngeálnych zubov je u Actinopterygii je často prehliadaná a podľa mňa

môže vážne konkurovať dentálnej diverzite orálných zubov u cicavcov. Bazálni zástupcovia

Actinopterygii majú faryngeálne zuby rozšírené pozdĺž celej faryngeálnej dutiny (Clemen et

al., 1998, Grande & Bemis 1998, Stock, 2001; Smith, 2003). U bazálnych Teleostei (napr.

Elopomorpha) tento stav pretrváva (Vandewalle et al., 2000). Ale u pokročilejších skupín

Teleostei dochádza ku redukcii dentice a zuby sú skôr lokalizované na určitom mieste na

Literárny prehľad

12

branchiálnom aparáte (Nelson, 1969). Napríklad u pstuha sa faryngeálne zuby nachádzajú na

piatom ceratobranchiále a taktiež na bazihyále, ktoré predstavuje analógiu k jazyku

tetrapódov. U niektorých Teleostei vznikli vo farynxu tzv. faryngeálných čeluste (ang.

pharyngeal jaws, secondary jaws ale aj „old (oral) and new (pharyngeal) jaws“ in sensu Fraser

et al., 2009). Tieto štruktúry vznikli modifikáciou muskuloskeletálneho systému časti

branchiálneho aparátu. Faryngeálne čeluste sú vybavené faryngeálnymi zubami a v mnohých

ohľadoch pripomínajú orálne čeluste. Orálne čeluste sú zásadnou apomorfiou čeľustnatcov

(Gnatostomata) čiže vznikli len raz u predka tejto skupiny (Janvier, 1996). Faryngeálne

čeluste však niekoľkokrát nezávisle na sebe vyvinuli u rôznych skupín rýb (Vandewalle et al.,

2000)

Faryngeálne čeľuste u jednotlivých rýb sa od seba značne odlišujú svojím tvarom,

denticou a funkciou. Napríklad čeľuste u murény (Muraena retifera) zafixujú korisť ulovenú

orálnymi čelustami a ďalej vťahujú a posúvajú do hltanu (Mehta & Wainwright, 2007).

Umožňujú muréne prehlnúť ulovenú korisť bez jej fragmentácie. Faryngeálne čeľuste u

murény vznikli modifikáciou štvrtého faryngeálneho oblúku, čím sa odlišujú od ostatných

faryngeálných čeľustí. Skladajú zo spodných čelustí, ktoré artikulujú s hornými čelusťami.

Spodné čeluste predstavujúce štvrté ceratobranchiália sú anteriórne spojené a nesú zuby.

Párové horné čeluste sa skladajú z faryngobraniálíí so zubami a z bezzubých epibranchiálií,

ktoré prepájajú ozubené faryngobrancjáliá s ceratobranchiáliami. Celý čeľustný aparát je

umiestnený v zložitom svalovom zavese, ktorý umožňuje pohyb čeľustí.

Zástupci radu Cypriniformes postrádajú zuby v orálnych čeľustiach. Napriek tomu tento

rad obsahuje zástupcov s rôznymi trofickými stratégiami (Nelson, 2006). Umožňujú im to tzv.

cypriniformné faryngeálne čeľuste, ktoré vznikajú z piateho branchiálného oblúku. U týchto

rýb je piaty branchiálny oblúk vytvorený iba z ceratobranchiále. Faryngeálne zuby sa

nachádzajú len na piatom ceratobranchiále. Oklúzia vzniká medzi zubmi oboch

ceratobranchiáliami. U niektorých skupín sa sa na báze neurokránia na kosti os basioctipitale

rohovitá trecia ploška, s ktorou okludujú zuby na piatom ceratobranchiále. Značná

morfologickou diverzita faryngeáných zubov a čeľustí je využívana v systematike tohoto

radu. Nachádzajú sa tu zuby kónické, kónické s háčikom, dlátovité, stoličkovité, nožovité atď

(Stock, 2007).

Podrad Labroidei má vytvorené tzv perciformné faryngeálne čeluste, u ktorých artikulujú

spodné čeľuste s hornými čeľusťami. Spodná čeľusť vzniká z ceratobranchiálií piateho

branchiálneho oblúku, zatiaľ čo horná čelusť vzniká zrastom infrafaryngobranciálií druhého,

Literárny prehľad

13

tretieho a štvrtého branchiálneho oblúku. Oklúziou oboch dolných a horných čeľusti vzniká

skus (Vandewalle et al., 2000).

Čelade Cichlidae a Labridae, ktoré patria do tohoto podradu vedľa čeladí Pomacentridae,

Embiotocidae, Odacidae a Scaridae, sa vyznačujú vysokou biologickou diverzitou. Vedľa

druhovej bohatosti (približne 1478 spp. u Cichlidae a 576 spp. u Labridae) je u oboch čeladí

veľmi výrazná tvarová diverzita orálných čelusti. Podľa Westneat (2004) je funkčná diverzita

spodnej čeľusti u Labridae porovnateľná s ostanými Actinopterigii. Čo je však generátorom

tak ohromnej funkčnej diverzity u týchto rýb?

Podľa Mabuchi et al. (2007) došlo u oboch čeladí k nezávislému zdokonaleniu faryngeálných

čelustí:

1 Pravá a ľavá spodná čelusť sfúzovali a vytvorili jednu štruktúru tzv. spodnú faryngeálnú

čelusť. *

2 Spodná faryngeálna čeľusť je zavesená v svalovom závese, ktorý sa z neurokránia upína na

spodnú faryngeánú čeľusť.

3 Elementy horných čelustí majú dvojité kĺbové spojenie s neurokrániom.

Inovácie v perciformných faryngeálných čelustiach úmožnujú svojím majiteom účinnejšiu

manipuláciu s potravou a taktiež vyvinúť silnejší tlak pri skuse (Kaufman & Liem, 1982).

Liem (1973) prišiel zo zaujímavou hypotézou, ktorá by mohla vysvetliť ohromnú funkčnú

diverzitu orálných čelustí u rýb oboch čeladí. Kedže faryngeálné čeluste oslobodzujú orálne

čelusťe od úlohy manipulacie s potravou, orálne čeluste môžu diverzifikovať a špecializovať

sa na rôzny spôsoby zberu potravy. Toto umožnuje diverzifikáciu potravných ekologických

typov. Inovácia vo faryngeálných čelustiach by mohla byť kľučovou evolučnou novinkou,

vďaka ktorej prebehla adaptívna radiácia druhov ako v morskej čelade Labridae i

sladkovodnej čelade Cichlidae.

Faryngeálne zuby dosiahli maximu svojej diverzity u Teleostei. V mnohých skupinách ryb sú

evoučné inovácie makroevolučného významu a mohli sa spolupodieľať na vysokej

biologickej diverzte týchto stavovcov.

2.5. Štádiovanie a vývinové tabuľky bichira Pri deskripci vývinových procesov je potrebné rozčleniť vývojový cyklus druhu, ako

kontinuálný proces, na menšie na seba naväzujúce jednotky. Tieto jednotky sa označujú ako

štádia a predstavujú skupinu idivíduí jedneho druhu, ktoré spĺňajú zadefinované morfologické

*(Poznámka: U cichlíd živiacich sa durofágne sa dokonca vyvinuli medzi oboma ceratobranchiáliami švi (sutures), ktoré posiľnujú vzájomné spojenie kostí (Hulsey, 2006).)

Literárny prehľad

14

či iné kritéria. Grafické vyobrazenie štádií spolu s ich deskripciou tvorí tabuľku normálneho

vývinu daného druhu. V súčasnosti slúžia vývinové tabuľky vo vývinovej biológii ako

bazálny deskriptívny aparát. Je preto zaujímavý fakt, že aj napriek vyše dvojstej historie

výskumu bichira neexistuje dodnes tabuľka normálneho vývinu bichira detailnosťou

odpovedajúca tabuľkám modelových druhov Actinopterygii ako Danio rerio (Kimmel et al.,

1995) a Oryzias latipes (Iwamatsu, 2004) či nemodelových ako Polyodon spathula (Ballard

and Needham, 1964), Lepisosteus osseus (Long and Ballard, 2001) a pod.

Prvy pokus o výtvorenie tabulky normálneho vývinu bichira urobil Kerr (1907). Na

základe nazbieraného embryologického materiálu z afrických expedícií a tiež z nákresov J.S.

Budgetta rozdelil Kerr vývin do 36 štádií od oplodnenia po 12 dňovú a 9.3 mm dlhú larvu. Aj

napriek relatívne dosť vysokému počtu okolo 200 vajíčok, embryí a lariev odráža táto tabuľka

nedostatky vznikajúce pri zbere materiálu z prírody. Zastúpenie jedincov jednotlivých štádií

je veľmi nerovnomerné. Od štádia 30 je popis vychádza z jedného exempláru na každé

štádium a štádia 34, 35 a 36 sú popísané iba na základe farebných nákresov. Veľmi často sú

jedince značne poškodené čo neumožňuje urobiť vyčerpávajúcu deskripciu. Pri popise

vývinových procesov týkajúcich sa diferenciácii čeľustí je preto potreba vytvoriť nové štádia,

ktoré vyplnia medzeru medzi Kerrovými štádia 32 a 33. Taktiež je potrebné detailnejšie

popísať embryonálny vývin od štádia 33.

Bartsch et al. (1997) na základe piatich úspešných odchovov druhu P. senegalus vytvorili

kompletnú tabuľku normálneho vývinu. Vývinový cyklus bichira hierarchicky rozdelili na

periódy, fázy a kroky. Doplnili tým chýbajúce úseky v Kerrovej tabuľke. Vývinová tabuľka

podľa Bartsch et al. (1997) však postráda jemnejšie delenie v porovnaní napr. s inými (napr.

Kimmel et al., 1995). Použiteľnosť tabuľky výrazne obmedzujú behavoriálne znaky často

využívané k determinácii krokov či fáz.

Materiál a metodika

15

3. MATERIÁL A METODIKA 3.1. Zber materiálu V práci boli použité jedince bichira senegalského, Polypterus senegalus (Cuvier, 1829).

Materiál pochádzal z odchovov p. Vojtěcha Tichého, Kravaře, ČR. Po nerese boli vajíčka s

vodným machom expedované a ďalej odchovávané na Přírodovědeckej fakulte UK v Prahe.

Inkubácia vajíčok a odchov až do larválných štádií prebiehal v prevzdušňovanom akváriu s

hustou vodnou vegetáciou pri teplote 28˚C. Larvy boli kŕmené v prvých 3 dňoch naupliovými

štádiami žiabronožky soľnej (Artemia salina), neskôr tubifexom (Tubifex sp.).

Množstvo jedincov v jenom odbere a frekvencia odberov závisela na veľkosti znášky a na

konkrétnych ontogenetických štádiách, ktoré bolo treba doplniť. Odobratý materiál bol

prenesený do vody z vodovodu približne rovnakej teploty ako v odchovnom akváriu. Embryá

a larvy boli usmrtené pridaním malého množstva látky MS-222 (orig. Tricaine

methanesulfonate). Následne boli fixované v 4% vodnom roztoku paraformaldehydu (PFA)

pufrovaným 0,1 M roztokom PBS. Od roku 2007 bol k tomuto fixačnému roztoku pridaný

Tween pre uľahčenie priestupnosti tkanív.

3.2. Štádiovanie Vzhľadom na spomenuté nedostatočné vypracovanie štadiovania u bichira senegalského

v štádiách kritických pre moju štúdiu ( viz kapitola Štádiovanie a vývinové tabuľky bichira,

str. 13) som vytvoril vlastné štádiovanie. Z praktických dôvodov som štádiá vymedzil na

základe vonkajšej morfológie. Vzhľadom ku predmetu mojej štúdie som zvolil znaky ako sú

veľkosť, a pozícia cementových orgánov, tvar a proporcie hlavy a žĺtkového vaku a pod.

Vybral som jedince vo voľnej embryonálnej fáze (podľa Bartsch et al., 1997), u ktorých je

podľa Wacker et al. (2001) začína odontogenéza. Ďalej boli vybraté jedince odpovedajúce

ranej a neskorej apterolarvy a ranej pterorolarvy podľa Bartsch et al., 1997). Deskripcia štádií

sa nachádza v kapitole 4.1. Deskripcia embryonálných štádií.

Materiál a metodika

16

3.3. Histologická analýza Pre histogické štúdie som vyskúšal dve metódy zhotovovania histologických rezov.

Prvou metódou bolo pužitie želatíny ako zalievacieho média a rezanie na zmrazovacom

mikrotóme (kryotóme). V druhej som ako zalievacie médium použil plast JB-4 a rezal na

mikrotóme. Výhodou oboch metodík je použitie menšieho počtu chemikálií a relatívna

šetrnosť k biologickému materiálu. Klasickú metódu histologických rezov v zalievacom

médiu paraplaste som nepoužil. Okrem zvýšenej teploty a tiež vyššieho počtu chemických

látok ma táto metóda značnú nevýhodu pri použití u embryonálnych štádií obsahujúcich

relatívne veľké množstvo žĺtku. Pri zalievaní embrya do paraplastu môže dochádzať ku

deformáciám tkanív obsahujúcich žĺtok a taktiež ku fragmentácii rezov počas rezania na

mikrotóme. Celkovo bolo histologicky spracovaných 43 jedincov.

3.3.1.Metóda zhovenenia kryorezov V tejto metóde sa využíva ako zalievacie médium želatína. Pri zhotovovaní kryorezov bol

použitý následovný postup:

1. Oddelenie hlavovej časti tela od vačšiny tela jedinca priečnym rezom skalpelom približne 3

mm za hlavou.od okraja skrelí. Týmto krokom sa urýchli výmena roztokov medzi objektom a

prostredím.

2. Objekt bol prenesený zo 4% fixačného roztoku PFA do 0,1 M roztoku PBS.

3. Po niekoľkominútovom vypraní objektu v 0,1 M roztoku PBS bol objekt prenesený do

roztoku 7,5% sacharózy a následovne a 15% sacharózy. Objekt bol v jednotlivých roztokoch

pokým neklesol na dno nádoby t.j. približne 2 hodiny pri RT. Potom bol objekt prenesený do

roztoku 15% sacharózy a 7,5% želatíny na niekoľko hodín pri 37˚C. Následne bol objekt

prenesený do 15% sacharózy a 20% želatíny tiež na niekoľko hodín. Tento roztok predstavuje

zalievacie médium. Po uplynutí niekoľkých hodín pri 37˚C bol objekt pripravený na

zalievanie.

4. Zaliatie objektu do roztoku 15% sacharózy a 20% želatíny. Na dno zalievacej vaničky bola

naliat spodná vrstva asi 1-2 mm zalievacieho roztoku a následne zmrazená pri -23˚C. Na túto

vrstvu bola nanesená ďalšia vrstva roztoku s objektom, ktorý bol pomocou preparačných ihiel

upravený do požadovanej pozície a následne zmrazený pri -23˚C. Po zmrazení bol vytvorený

bloček vylúpnutý zo zalievacej vaničky a nalepený na držadlo pomocou zmrazovacieho média

Tissue Tech. Z predpokladanej reznej plochy bolo zmrznuté médium Tissue Tech žiletkou

odstránené a ostatné plochy upravené.

Materiál a metodika

17

5. Rezanie bločkov na kryotóme Leica CM3050 S na rezy o hrúbke 14 µm pri teplote -25˚C.

Rezy boli prenesené na poly-L lyzínové sklíčka Superfrost vopred ohriate na teplotu 35˚C a

sušené na elektrickej platni pri teplote 35˚C.

6. Odželatínovanie rezov. Sklíčka s rezmi boli 2-3 krát premáchané v roztoku 3% žetatíny a

38% etanolu o teplote 37˚C, nasledne 2-3 krát premáchané v destilovanej vode a sušené na

elektrickej platni pri 35˚C.

3.3.2. Metóda zhotovenia plastových rezov Ako zalievacie médium bol použitý plast JB-4 Embedding Kit (Polyscience, Inc.), ktorý

sa skladá z troch komponentov A,B,C. Na zhotovenie histologických rezov bol použitý

nasledovný postup.

1. Oddelenie hlavovej časti tela od väčšiny tela jedinca priečnym rezom skalpelom približne 2

mm za posteriórnym, okrajom žĺtku. Týmto krokom sa urýchli dehydratácia a infiltrácia

daného objektu.

2. Dehydratácia prenesením jedinca z fixačného 4% roztoku PFA do 100% etanolu. Pre

jedince s TL do 1 cm pri RT

25% etanol 10 minút

50% etanol 10 minút

70%etanol minimálne 6 hodín

95% etanol 7 minút

100%etanol 7minút

3. Infiltrácia vzorky roztokom A+C pripraveného zmiešaním 10 ml komponenty A s 125 mg

komponenty C. Minimálna dĺžka infiltrácie je 6 hodín pri RT.

4. Zalievanie vzorky do roztoku A+C+B pripraveného zmiešaním 1ml roztoku A+C s jednou

kvapkou zo sklenenej pastérky. Komponenta B je katalyzátor, ktorý spustí polymerizáciu

monomérov v roztoku A+C. Polymerizácia vytvorí kompaktný blok so vzorkou a umožní tak

krájanie na mikrotóme. Vzorka bola prenesená do zalievacej vaničky (Polyscience, Inc.),

krátko opláchnutá novým roztokom A+C, upravená do správnej polohy a nakoniec zaliata

roztokom A+C+B. Povrch vaničky bol prekrytý parafilmom, keďže polymerizácia prebieha

za anaeróbnych podmienok. Minimálne po 5 hodinách je možné bloček s embryom vytiahnúť

a nechať približne hodinu oschnúť na vzduchu. Po oschnutí bol bloček so vzorkou pripevnený

k držadlu pomocou sekundového lepidla. Uvedený postup zalievania vzoriek možno uplatniť

hlavne u horizontálnych a sagitálnych rezov. U frontálných rezov boli bločky upravené

Materiál a metodika

18

pomocou skalpelu, pilky a pilníka aby orientácia vzorky odpovedala požadovanej rovine

rezania. Upravený bloček bol opať zaliaty vo vaničke roztokom A+C+B. Dvojnásobné

zalievanie som používal iba v nevyhnutných prípadoch, pretože takýto bloček je tvorený z

dvoch materíáloch s odlišnými mechanickými vlastnosťami, čo môže spôsobovať menšie

problémy pri rezaní.

5 Rezanie bločkov na mikrotóme Microm HM 310 s oceľovým nožom na rezy o hrúbke 3-8

µm Jednotlivé rezy boli prenášané pomocou pinzety na poly-L-lyzínové sklíčka Superfrost do

kvapky destilovanej vody a sušené na elektrickej platni pri 35˚C niekoľko hodín.

3.3.3. Farbenie histologických rezov Na farbenie usušených histologických rezov a kryorezov bola použitá metóda

Romanowsky-Giemsa. Farbiacia roztok bol pripravený zmiešaním roztoku Azure B, Eozínu a

destilovanej vody v pomere 4:1:125.

1. Rezy boli farbené 2 minúty ponorením sklíčka do farbiaceho roztoku.

2. Po uplynutí tejto doby boli niekoľkokrát opláchnuté destilovanou vodou a sušené na

elektrickej platni pri 35˚C niekoľko hodín.

3. Po usušení boli rezy zamontované do syntetickej živice DPX (DPX, for mountain

histology, Sigma) a po oschnutí pripravené k histologickej analýze.

Histologické rezy boli študované na mikroskope Olympus BX 51, snímané pomocou

digitálnej kamery SPOT Cam a softwarom Spot Advanced. Snímky boli upravované pomocou

programu Adobe Photoshop 7.0 CE.

3.4. Farbenie a prejasňovanie celých jedincov Zhotovenie celých preparátov umožňuje v porovnaní s histologickými preparátmi lepšie

vnímať priestorové vzťahy medzi študovanými orgánmi. Preto je táto metóda užitočná pri

štúdiu vývinu dentice bichira, u ktorého sa zuby vyskytujú takmer v celej orofaryngeálnej

dutine. Použitá metodika vychádza z Taylora (1967), Dingerkusa & Uhlera (1977) a ich

modifikácie pre prácu na rybách Balona a Balonovej (1985) Celkovo bolo nafarbených a

prejasnených 32 jedincov.

Materiál a metodika

19

3.4.1.Farbenie alizarínovou červenou

Princíp farbenia alizarínovou červeňou spočíva vo viazaní tejto zlúčeniny na vápenaté

ióny v extracelulárnej matrix, čim vytvára koplexné väzby a červené zafarbenie. Pomocou

tejto neinvazívnej metódy možno detekovať mineralizované zuby a kosti a ich topografické

vzťahy ku štruktúram orofarynxu. Na základe intenzity zafarbenia možno určiť rozsah

mineralizácie extracelulárnej matrix zubu alebo kosti, prípadne pripojenie zubu ku kosti.

Postup bol nasledovný

1. Krátke omytie (1-3 minúty) vzorky fixovanej v 4% vodnom roztoku PFA v destilovanej

vode.

2. Prenesenie vzorky do roztoku vzniknutého zmiešaním 3% vodného roztoku peroxidu

vodíka (H2O2) a 2% vodného roztoku hydroxidu draselného (KOH) pri rovnakom objemovom

množstve. Roztoky peroxidu a KOH je nutné zmiešať tesne pred začatím vlastnej práce.

Roztok KOH nie je vhodné skladovať príliš dlho. Nádobu s uvedenými roztokmi je dobré

chladiť pre obmedzenie tvorby bubliniek kyslíku, ktorý môže poškodiť vzorku. Po prenesení

vzorky do uvedeného roztoku je na vzorku svietené lampou.. Svetlo katalyzuje rozklad

peroxidu a spolu s KOH odstraňuje pigment zo silne pigmentovaných embryí a lariev bichira.

3. Prenesenie vzorky do farbiaceho roztoku alizarínovej červenej pripraveného zmiešaním 0,5

- 1 ml (závisí na veľkosti) zásobného roztoku alizarínu a 8 ml 0,5% (u najranejších embryí

0,25%) vodného roztoku KOH. Zásobného roztoku bol pripravený rozpustením 0,7 g

práškového Alizarin Red S (Sigma) v 380 ml 96% etanolu. Farbenie prebiehalo pri izbovej

teplote približne 12 hodín.

4. Prepratie vzorky v 0,5% (príp. 0,25%) vodnom roztoku KOH. Zo vzorky bol týmto

vyplavený. Roztok KOH bol niekoľkokrát vymenený pokiaľ nedošlo ku vyplaveniu

nenaviazaného alizarínu zo vzorky.

5. Odpreparovanie spodnej čeľusti a branchiálneho aparátu u niektorých jedincov. Vzorka

bola prenesená do 0,1 M PBS a zafixovná v médiu prepraveného zo 4% agaru v 0,1 M PBS.

Pomocou pinziet, preparačných ihiel, mikronožníc a mikroskalpelov bola oddelená spodná

čeľusť v čeľustnom kĺbe a odpreparované branchiálne oblúky od neurokránia.

6. Prevedenie vzorky vzostupnou radou (25, 50, 75 a 100%) roztoku glycerolu v 0,5% (príp.

0,25%) vodnom roztoku KOH. Týmto krokom sa dosiahne macerácia a presvetlenie okolitých

tkanív čím sa zviditeľnia štruktúry nafarbené alizarínom. Dĺžka pobytu vzorky v jednotlivých

roztokoch závisí na celkovej dĺžke vzorky. Tento krok výrazne urýchli teplota zvýšená na 37

˚C.

Materiál a metodika

20

3.4.2. Farbenie alciánovou modrou a alizarínovou červeňou

Alciánová modrá sa viaže na glykoproteiny extracelulárnej matrix chrupaviek a iných

spojivových tkanív. Touto metódou možno dostať preparáty s chrupavkami sfarbenými na

modro a so zubami a kosťami zafarbenými na červeno

Pri súčasnom farbení alciánovou modrou a alizarínovou červeňou však môže dochádzať

ku vyplavovaniu vápenatých iónov v kyslom prostredí použitom ako rozpúšťadlo pre

alciánovú modrú. Tým sa výrazne znižuje intenzita zafarbenia alizarínovou červeňou.

Všeeobecne zuby embryí a lariev u Actinopterygii sú jemnejšej stavby s relatívne tenkým

mineralizovaným dentínom a enameloidom (Sire et al., 2002). Z tohoto dôvodu boli touto

metódou farbené jedince väčšie než 2 cm

Na zhotovenie týchto preparátov bol použitý nasledovný postup:

1. Krátke omytie (1-3 minuty) vzorky fixovanej v 4% vodnom roztoku PFA v destilovanej

vode.

2. Dehydratácia vzorky prenesením vzorky vzostupnou radou etanolu (25, 50, 75 a 96%).

3. Farbenie v roztoku alcianovej modrej 12-20 hodín (v závislosti na veľkosti konkrétneho

jedinca).

Farbiaci roztok alciánovej modrej: 20 mg Alcian Blue 8 GX (Sigma) 70 ml 96% etanolu 30 ml 100% kyseliny octovej (Sigma)

4. Vypranie vzorky v kyslom etanole 1 až 2 hodiny.

Roztok kyslého etanolu: 70 ml 96% etanolu 30 ml 100% kyseliny octovej (Sigma)

5. Vybielenie vzorky v 3% vodného roztoku peroxidu vodíka (H2O2) a 2% vodného roztoku

hydroxidu draselného (KOH) pri rovnakom objemovom množstve. Na urýchlenie procesu

bolo použité svetlo z lampy.

6. Macerácia vzorky v 1% vodnom roztoku KOH po dobu niekoľkých (3-5) dní až do

vyblednutia modrého zafarbenia pokožky.

7. Farbenie vo farbiacom roztoku alizarínovej červenej (10-12 hodín): 1 ml zásobného roztoku alizarínovej červenej 8 ml 1% KOH

Zásobný roztok alizarínovej červenej: 0,7 g práškového Alizarin Red S (Sigma) 380 ml 96% etanolu

8. Pranie objektu V 1% a 0,5% vodnom roztoku KOH

Materiál a metodika

21

9. Odpreparovanie spodnej čeľusti a branchiálneho aparátu u niektorých jedincov. Vzorka

bola prenesená do 0,1 M PBS a zafixovná v médiu prepraveného zo 4% agaru v 0,1 M PBS.

Pomocou pinziet, preparačných ihiel, mikronožníc a mikroskalpelov bola oddelená spodná

čeľusť v čeľustnom kĺbe, a odpreparované branchiálne oblúky od neurokránia.

10. Prevedenie vzorky vzostupnou radou (25, 50, 75 a 100%) roztoku glycerolu v 0,5%

vodnom roztoku KOH.

Prejasnené a nafarbené preparáty boli digitálne spracované pomocou stereolupy Olympus

SZX12 s digitálnou kamerou Olypmpus DP70 a so softvérom Deep Focus3.0, ktorý umožňuje

skladať optické rezy objektom a vytvárať ostrejšie trojrozmerné snímky. Preparáty boli ďalej

skladované 100% glycerole pri 4˚C.

Pozn.: Ak počas skladovania došlo k vyplaveniu alizarínu a teda k odfarbeniu vzorky, možno

použiť metódu vychádzajúcu z práce Springer & Johnson (2000):

1. Prenesenie vzorky do roztoku 75% glycerolu v 70% roztoku etanolu.

2. Prenesenie vzorky do roztoku vniknutého zmiešaním 8 ml 75% roztoku glycerolu v 70%

roztoku etanolu a zásobného roztoku alizarínovej červene.

3. Prenesenie nafarbenej vzorky do 100% glycerolu. Vhodné je nechať otvorenú nádobu pre

vyparovanie etanolu. Po približne 12 hodinách sa roztok glycerolu vymení.

Tento postup umožňuje opäť dofarbiť odfarbené štruktúry bez nutnosti použitia zdĺhavej

procedúry zostupnej rady roztokov glycerolu v KOH, farbenia v KOH a následnej vzostupnej

rady roztokov glycerolu v KOH. Vyhnutím použitia KOH možno chrániť preparáty pred

nadmernou maceráciou a poškodením

Výsledky

22

4. VÝSLEDKY 4.1. Deskripcia embryonálných štádii ontogenézy Vzhľadom na nedostatky v súčasnom štádiovaní embryonálneho vývinu bichira

senegalského (uvedené v časti Literárny prehľad, kap. Štádiovanie a vývinová tabuľka, str.

) som vytvoril vlastné štádiovanie. V mojich štádiách nie je zahrnutá celá embryonálna

perioda, ale štádiá kľúčové pre vývin popisovaných štruktúr. V nasledujúcej kapitole

uvádzam stručný popis jednotlivých embryonálnych štádií. Preto pri popisu používam

vývinovú tabuľku podľa Bartsch et al. (1998).

Š tádium 1

Embryo je žubrienkovitého vzhľadu s nápadným žĺtkovým vakom, vonkajšími

žiabrami a plutvovitým chvostom. Celistvý plutvový lem sa tiahne od posteriórneho konca

hlavy na dorzálnej strane a na ventrálnej od konca žĺtkového vaku. Žĺtkový vak výrazne

prominuje do strán. Na jeho dorzálnom povrchu sú rozoznateľné základy prsných plutiev.

V tomto štádiu sú vo vertikálnej pozícii a majú tvar nízkeho lemu. Vonkajšie žiabre sú

tvorené spoločným základom, z ktorého vybiehajú prstovité výbežky. Cementové organy

sú nápadným útvarmi umiestnenými po stranách hlavy embrya. Sú cylindrického tvaru a

obsahujú lumen, ktorý sa otvára anteroventrálne. Cementové orgány sú v tesnej blízkosti s

anteriorným okrajom žĺtkového vaku. Pri ventrálnom pohľade nemožno rozlíšiť

mandibulárny oblúk. Podobne nemožno rozlíšiť ostatné faryngeálne oblúky na povrchu

embrya.

Š tádium 2

V porovnaní s predchádzajúcim štádiom je nápadné predĺženie hlavy. Cementové

orgány sú stále výraznými štruktúrami na hlave embrya, ale neležia už v tesnej blízkosti

žĺtkového vaku. Medzi cementovými orgánmi a žĺtkovým vakom už možno jasne rozoznať

mandibulárny oblúk. Pri ventrálnom pohľade cementové orgány už neprekrývajú

mandibulárny oblúk. Prstovité výbežky vonkajších žiaber sú dlhšie než u predošlého

štádia. Prsné plutvy sú stále vo vertikálnej pozícii na dorzálnej strane žĺtkového vaku, ale

majú plochý diskovitý tvar.

Výsledky

23

Š tádium 3

V tomto štádiu je výrazné presunutie cementových orgánov do viac anteriórnej polohy

v porovnaní s predchádzajúcim štádiom. Pri ventrálnom pohľade sú cementové orgány

bližšie k sebe. Anteriórne od mandibulárneho oblúku medzi cementovými orgánmi je na

hlave vytvorená priehlbina. Vonkajšie žiabre sú väčsie a majú viac vetví a lúčov. Na báze

vonkajších žiaber je vytvorený operkulárny záhyb. Žĺtkový vak je menší.

Š tádium 4

Žĺtkový vak je značne redukovaný. Prsné plutvy sú predĺžené a v približne

horizontálnej polohe. Hlava embrya je predĺžená a takmer rovnako dlhá ako žĺtkový vak.

Cementové orgány sú oveľa menej nápadné ako u predchádzajúcich štádií. Pri ventrálnom

pohľade sú relatívne blízko seba v mediálnej oblasti. Na hlave embrya možno rozoznať

základy budúcich nozdier. Mandibulárny oblúk je anteriórne predĺžený na rozdiel od

predchádzajúcich štádií, u ktorých je v priečnej pozícii.

Š tádium 5

Rudiment žĺtkového vaku nepokrýva už celú ventrálnu časť, ale nachádza sa len

prevažne na pravej strane. Na ľavej strane možno rozoznať pečeň (hepar). Okraje vrchnej a

spodnej čeusti sú lemované labiálnym záhybom. Postavenie ústneho otvoru je

subterminálne. Redukované cementové orgány sú umiestnené terminálne na vrchnej

čeľusti. Prsné plutvy sú približne trojuholníkovitého tvaru a v horizontálnej pozícii.

4.2. Vznik úst a raný vývin orofaryneálnej dutiny Š tádium 1 V tomto štádiu nie je vyvinutý lumen orofaryngeálnej dutiny. V mediálnej oblasti

ektoderm vytvára invagináciu a farynx predstavuje iba tenká vrstvu buniek, ktorá sa

nachádza sa medzi mozgom a perikardiálnou dutinou. Mandibulárny oblúk sa nachádza

tesne za cementovými orgánmi. Ventrálna časť mandibulárneho oblúku na parasagitálnych

rezov vyzerá ako val na žĺtkovom vaku vyplnený mezenchýmom. (Tabx21.psd). Výška

ventrálnej časti oblúku sa mediálne znižuje, až v mediálnej rovine je mandibulárny oblúk

nerozoznateľný od okolitého povrchu (Obr. 2). Anteriórny okraj mandiblárneho oblúku je

Výsledky

24

prekrytý na oboch stranách cementovými orgánmi. Lumen cementového orgánu je tvorený

žľaznatým epitelom s cylindrickými bunkami vyplnenými tukovými granulami. Hyoidný

oblúk sa nachádza posteriórne a dorzálne od mandibulárneho oblúku. Medzi oboma

oblúkmi je vytvorená široká endodermálna evaginácia (Obr. 3 A, A').

Obr.3A a A' ukazujú ako vyzerá laterálne časť orofarynxu. Epitel na povrchu embrya

je tvorený dvoma vrstvami buniek. Vonkajšia vrstva buniek epitelu je tvorená väčšinou

plochými bunkami a niektoré z týchto buniek nesú niekoľko cílií. Pod ňou leží bazálna

teda vnútorná vrstva buniek epitelu tvorená prevažne bunkami kubického tvaru. V

oblastiach bez vzájomného dotyku cementového orgánu a mandibulárneho oblúku možno

obidve vrstvy epitelu zreteľne rozoznať na oboch spomínaných štruktúrach. V oblasti

budúcej orofaryngeálnej dutiny však nemožno rozlíšiť medzi mandibulárnym oblúkom a

budúcim stropom orofarynxu dvojvrstevnosť epitelov. V mandibulárnom oblúku ako aj na

strope orofarynxu možno identifikovať bazálnu vrstvu epitelu. Medzi bazálnymi vrstvami

sa nachádza vrstva plochých buniek a prázdne dutinky ohraničené extracelulárnou matrix

sfarbenou na fialovo. V posterolaterálnej časti bazálnej vrstvy buniek epitelu

mandibulárneho oblúku a stropu orofaryngu sa nachádza signifikantne väčší počet

žĺtkových granulí ako v jej ostatných častiach alebo v bazálnej vrstve cementového orgánu

čo poukazuje na možný endodermálny pôvod. V laterálnej oblasti mandibulárneho oblúku

(a stropu orofarynxu) je tvar buniek nápadne pozmenený v porovnaní s bunkami bazálnej

vrstvy iných oblastí orofarynxu či mimo neho. Bunky majú skôr cylindrický než kubický

tvar. V tejto oblasti mandibulárneho oblúku sú taktiež rozlíšiteľné agregácie

mezenchymálnych buniek. Pod bazálnou vrstvou buniek epitelu sú mezenchymálne bunky

nahusto skondenzované s minimálnymi medzibunkovými priestormi do jednej vrstvy

paralelne bežiacej pod bazálnou vrstvou epitelu. V laterálnej oblasti budúceho stropu

orofarynxu oproti agregáciám mezenchýmu v mandibulárnom oblúku možno tiež rozlíšiť

agregácie mezenchýmu. Bunky mezenchýmu však nie sú tak husto kondenzované ako to

možno pozorovať u buniek pod bazálnym epitelom mandibulárneho oblúku. Bunky

mezenchýmu sú orientované k bazálnej vrstve epitelu čomu nasvedčuje pretiahnutosť tiel

buniek mezenchýmu a orientácia lobopódií v tomto smere.

V priestore pod epitelom orofarynxu medzi mandibulárnym a hyoidným oblúkom sa

nachádza mezenchým. Mezenchým nie je priestorovo vymedzený iba na faryngeálne

oblúky ale nachádza sa aj medzi nimi. Medzi mandibulárnym a hyoidným oblúkom neskôr

nedochádza k ruptúre a vzmiku faryngeálnej štrbiny. V tomto štádiu možno v bazálnej

Výsledky

25

vrstve buniek epitelu stropu orofarynxu identifikovať dorzálnu evaginácu tohoto epitelu .

Bunky evaginácie majú relatívne vysoký obsah žltkových granúl, podobne ako bunky

bazálnej vrstvy stropu v okolí evaginácie. Evaginácie neobsahuje žiadny lumen a siaha až

ku epitelu na dorzálnej strane hlavy embrya. Miesto vzájomného kontaktu endodermálnej

evaginácie a ektodermu je miesto budúcej ruptúry a teda spirakulárnej štrbiny. Hyoidný

oblúk obsahuje aferentnú artériu vonkajších žiaber. V mediálnej oblasti je v anteriórnej

časti žĺtkového vaku uložený perikard so srdcom v tesnej blízkosti s mandibulárnym a

hyoidným oblúkom.

Š tádium 2 Medzi bazálnymi vrstvami buniek epitelu dna a stropu orofarynxu v rozmedzí

mandibulárnym a hyoidným oblúkom sa vyskytujú malé dutinky ohraničené

extracelulárnou matrix zafarbenou na fialovo. V mieste ich vzniku možno jasne rozoznať

aj povrchové vrstvy buniek epitelu (Obr. 3B a B'). Tieto dutinky sa nachádzajú na oboch

stranách orofarynxu, v blízkosti jeho laterálneho okraju. Dutinky sa nenachádzajú v oblasti

žiabrových oblúkov. Žiabrové štrbiny nie sú vytvorené. Mandibulárny oblúk je väčší než u

predchádzajúceho štádia a má podobný tvar. V mediálnej oblasti, je mandibulárny oblúk

stále veľmi nízky a pod jeho epitelom sa nachádza jednovrstevný mezenchým. U tohto

štádia je taktiež nápadná morfologická diferenciácia buniek bazálnej vrstvy epitelu

mandibulárneho oblúku s agregáciami mezenchýmu.

Š tádium 3 V rozvoji dutiny orofarynxu je v porovnaní s predchádzajúcim štádiom výrazný

pokrok. Epitely medzi mandibulárnym a hyoidným oblúkom a stropom orofarynxu sú od

seba z veľkej väčšiny oddelené. Týka sa to predovšetkým v laterálnych oblastí. Lumen

orofarynxu v tomto štádiu predstavujú dva kanále, ktoré ústia na každej strane do

operkulárnej dutiny (Obr.4). V laterálnej oblasti nie sú epitely kompletne od seba

separované a medzi mandibulárnym oblúkom a stropom možno rozpoznať útvary medzi

bazálnymi vrstvami buniek epitelov (Obr.5 a Obr. 6B). Tieto štruktúry sú zložené z dvoch

vrstiev buniek a v uvedených miestach spájajú ventrálnu časť mandibulárneho oblúku so

stropom orofarynxu, teda vrchnú a spodnú čeľusť. Tieto útvary boli pomenované epitelové

Výsledky

26

mostíky (ang. epithelial bridges; Kralovic et al., 2009). V branchiálnej oblasti nie sú

vyvinuté kompletné štrbiny medzi branchiálnymi oblúkmi, iba na ventrálnej strane sú

vytvorené menšie priestory medzi branchiálnym oblúkom I až III. Laterálne od

branchiálnej oblasti sa nachádza dutina tvorená duplikatúrou z hyoidného oblúku, ktorá

predstavuje základ pre vývin operkula. Mandibulárny oblúk je značne pretiahnutý v

anteriornom smere. V laterálnej oblasti v blízkosti budúceho ústneho kútiku a u bázy

mandibulárneho oblúku sa nachádzajú prechrupavčité primordiá chrupaviek

mandibulárneho oblúku.

Š tádium 4 Lumen orofarynxu je už kompletne vytvorený. V tomto štádiu sa štruktúry nazvané

ako epitelové mostíky nevyskytujú (Obr.6C).. Medzi branchiálnymi oblúkami sú vytvorené

branchiálne štrbiny. V jednotlivých faryngeálnych oblúkoch sú vytvorené oporné

chrupavčité elementy. Na anterolaterálnom okraji mandibulárneho oblúku možno rozoznať

evagináciu epitelu. Táto epiteliálna duplikatúra vyplnená mezenchýmom predstavuje rané

štádium vývinu labiálneho záhybu (ang. labial fold). V okolí Meckelovej chrupky sa

nachádzajú kondenzácie mezenchýmu. V kondenzácii mezenchýmu, ktorá sa nachádza

anterolaterálne od Meckelovej chrupavky, možno nájsť na parasagitálnych rezov dentále.

4.3. Vývin dentice 4.3.1. Vývin orálnych zubov

Embryonálna perióda Š tádium 3 V tomto štádiu som našiel prvé morfologicky rozlíšiteľné základy zubov. Najranejšie

základy zubov predstavujú nápadné lokálne zhrubnutie bazálnej vrstvy. Z bazálnej vrstvy

epitelu ústnej dutiny sa vytvárajú invaginácie, ktoré predstavujú základy enameloidných

orgánov. Vnútro invaginácie je vyplnené niekoľkými mezenchymálnymi bunkami. Pre

lepšiu prehľadnosť budem v nasledujúcom popise používať názvy zubov podľa ich

Výsledky

27

príslušných zubonosných kosti aj napriek tomu, že v tomto štádiu zuby ešte nie sú

pripojené ku kostiam, príp. kosti ešte nie sú vytvorené. Jednotlivé zuby boli identifikované

na základe porovnávania s neskoršími štádiami. Základy zubov a ich priestorové

rozloženie zachytáva Obr. 7.

Dentica maxily predstavuje základ prvého zubu, ktorý sa vyvíja v šikmej pozícii voči

anteroposteriórnej osi (Obr. 7 A, A'). Tento zub je lokalizovaný najviac laterálne zo

všetkých zubov prítomných v tomto štádiu. Prvý maxilárny zub sa nachádza na oboch

stranách hlavy embrya približne v úrovni vonkajšej strany cementových orgánov, v oblasti

budúceho kútiku úst.

Dentica dermopalatina sa nachádza mediálne od maxilárnej na vnútorných bázach

cementových orgánov v tesnej blízkosti s ich žľaznatým epitelom. V tomto štádiu je

rozoznateľná ako zhrubnutá bazálna vrstva orálneho epitelu Obr. 7B, B').

Dentica dentále sa vyskytuje na dorzálnom povrchu ventrálnej (mandibulárnej) časti

mandibulárneho oblúku mediálne od maxilárných zubov, približne v opozícii s

dermopalatinálnou denticou. Laterálne sa nachádzajú dva zuby v štádiu invaginácie epitelu

a mediálne od nich sa nachádza niekoľko zubných základov. Invaginácie dentálnych zubov

sa vyvíjajú približne vo vertikálnej polohe voči anteroposteriórnej ose (Obr.7B, B').

Dentica anteriórneho koronoidu je lokalizovaná na dorzálnej strane ventrálnej časti

mandibulárneho oblúku podobne ako dentálna dentica, ale nachádza sa viac mediálne

(Obr. 7C, C'). Na každej strane je možno nájsť po jednom zubnom základe vo vertikálnej

polohe voči anterioposteriórnej osi.

Š tádium 4 Zuby prítomné v predchádzajúcom štádiu 3 ako zubné základy sú v pokročilejšej fáze

vývinu. Enameloidný orgán je tvorený dvoma vrstvami buniek, vonkajším a vnútorným

dentálnym epitelom. Vnútorný dentálny epitel je morfologicky diferencovaný od

vonkajšieho. Bunky vnútorného dentálneho epitelu sú predĺžené v porovnaní s vonkajším,

u ktorého sú skôr ploché čí kubické. Enameloidný orgán obklopuje pupilu nahusto

vyplnenú bunkami. Medzi vnútorným dentálnym epitelom a bunkami pupily možno u

najvyvinutejších zubov rozoznať extracelulárnu matrix (predentín). Okrem zubov na

maxile, dermopalatíne, dentále a anteriórnom koronoide sú v tomto štádiu prítomné na

ektopterygoide, vomere a preartikuláre. Zuby sa vyvíjajú v rôznych pozíciách voči epitelu

a sú sústredené v anteriórnej časti orálnej dutiny (Obr. 8).

Výsledky

28

Dentica na maxile zahŕňa tri zuby vyvíjajúce sa v relatívne blízkej vzájomnej pozícii.

Dentica na vomere sa nachádza mediálne medzi cementovými orgánmi.

Dentica na dermopalatine leží medzi maxilárnou a vomerálnou odontogénnou oblasťou.

Dentica na ektopterygoide je lokalizovaá mediálne od maxilárných zubov a posteriórne od

dermopalatinálných zubov.

Dentica na dentále je lokalizovaná na anteriórnej strane mandibulárnneho oblúku začína za

oblasťou symfýzy Meckelových chrupiek a končí pred kútikom úst. Je teda najväčšou

odontogénnou oblasťou v tomto štádiu. Dentálne zuby sa mierne posteriorne zakrivené a

vyvíjajú sa vo vertikálnej pozícii voči anterioposteriórnej osi.

Dentica na preartikule sa nachádza na posteriórnej strane mandibulárneho oblúku paralelne

vedľa dentálnej odontogénnej zóny. V tomto štádiu možno rozpodnať základ jedného

zubu.

Dentica na anteriórnom koronoide jeden zub v každej parasymfyzálnej oblasti. V

porovnaní s predchádzajúcim štádiom sa zmenila pozícia zubu voči anteroposteriórnej osi

z vertikálnej na takmer horizontálnu.

Š tádium 5 V tomto štádiu už možno u embryí nájsť zuby, ktoré sú už pripevné ku zubonosným

kostiam. Na Obr. 9 je vidieť zub pripojený ku zubonosnej kosti dentále. Pripojovacia kosť

na báze zubu vytvára plochú dosku, ktorá nesie zub. Je však takmer nemožné histologicky

od seba odlíšiť zub. pripojovaciu kosť a zubonosnú kosť. Zuby ešte stále nie sú

eruptované. Možno nájsť aj ďalšie základy primárnych zubov. Nové zuby sa zakladajú

superficiálne v blízkosti už vzniknutých zubov.

Denticu hornej čeľustie tvoria zuby na maxile, vomeru dermopalatínu a

ektopterygoidu (Obr. 10). V prednej časti hornej čeľusti sa nachádzajú ešte stále prítomné

cementové orgány(Obr. 10 A, B, D). Na podnebí sa nachádza rozľahlá osifikácia

parasfenoid, ktorá je však bezzubá. Maxila predstavuje v tomto štádiu tenkú líštu tiahnucu

sa od cementových orgánov po zadný okraj oka. Maxilárne zuby sú však lokalizované len

na jej anteriórnom konci. Na oboch maxilách je po jednom pripojenom zube a anteriórne a

posteriórne po nepripojenom zube. Dermopalatínom predstavuje malú osifikovanú plôšku

na podnebí mediálne od maxily. Na oboch dermopalatínach je po jednom pripojenom zube

a jednom nepripojenom. Medzi dermopalatínami sú dva vomerálne zuby, ale vomer ešte

nie je vytvorený. Ektopterygoidy ležia posteriórne od dermopalatín a mediálne od maxíl.

Výsledky

29

Predstavujú tenkú osifikovanú lištu s jedným zubom umiestneným anteriórnom konci

ektopterygoidu. Pri ventálnom pohľade na denticu hornej čeľusti je nápadný výskyt zubov

len v obmedzenom priestore a to aj napriek tomu, že zubonosné kosti ako maxila a

ektopterygoid sú pomerne dlhé kosti.

Spodná čeľusť je v porovnaní s hornou viac ozubená a osifikovaná (por. Obr.10 C a

D). Je to predovšetkým masívna osifikácia dentále s pripojenými zubami. Dentále pokrýva

predný povrch Meckelovej chrupavky od oblasti symfýzy po čeľustný kĺb. Dentálne zuby

sú relatívne robustné, dozadu zahnuté a so širokými bázami. Koronoidné zuby sa

nachádzajú na vnútornej strane symfyziálnej oblasti. Na oboch stranách symfýzy sa

nachádza jeden zub. Koronoidné zuby sú rovné a ich enameloidná čapička (ang. enameloid

cap) je bodcovitá utváraná. Zuby sú v šikmej pozícii a ich hroty smerujú dorzálne a

posteriórne. Zubonosná kosť, teda anteriórny koronoid, nie je v tomto štádiu vytvorená a v

čeľusti sú ukotvené svojimi rozšírenými bázami. Preartikuláre sa nachádza posteriórne na

vnútornom povrchu Meckelovej chrupavky. Je približne trojuholníkového tvaru a má

vytvorený výbežok (processus coronoideus). V tomto štádiu na preartikuláre možno

rozlíšiť jeden mineralizovaný zub na oboch stranách, ktorého hrot smeruje mediálne.

Larválna perióda Raná apterolarva Najvýraznejším rozdielom medzi najstarším študovaným embryonálnym štádiom a

najmladším larválnym štádiom je kompletná redukcia cementových orgánov (Obr. 11 A,

B). Na ich mieste sa nachádzajú izolované zuby ktoré sa neskôr pripoja k premaxile.

Premaxila v tomto štádiu ešte nie je vyvinutá. Okrem uvedenej redukcie cenentových

orgánov sa raná apterolarva príliš nelíši od embryonálneho štádia 5. Na jednotlivých

zubonosných kostiach možno pozorovať viac pripojených zubov. Zuby na jednotlivých

kostiach sú usporiadané v jednom rade tzv. monostichné (ang. monostichous)

usporiadanie. Rady zubov na hornej a dolnej čeľusti vytvárajú oblúky. Na hornej čeľusti

vytvára vonkajší (marginálny) oblúk zuby na premaxilách a maxilách, na dolnej čeľusti

dentáliá. Vnútorný oblúk hornej čeľusti tvoria zuby na vomere, dermopalatinách a

ektopterygoidoch. Na dolnej čeľusti je vnútorný oblúk vytvorený zubami na preartikuláre a

koronoidnými zubami (Obr. 11 C). Oblúky zubov v tomto štádiu nie sú kompletné a medzi

Výsledky

30

jednotlivými kosťami sú medzery. Zuby na marginálnych oblúkov sú v porovnaní so

zubami vnútorných oblúkov mohutnejšie so širšími bázami.

Neskorá apterolarva Neskorá apterolarva predstavuje výrazný pokrok vo formácii larválnej dentice.

Čeľuste sú výrazne dlhšie a obsahujú viacej zubov. Na oboch stranách spodnej čeľusti je

rozoznateľný prvý zub posteriórneho koronoidu (Obr. 13 C). Podobne ako v ranejších

štádiách v prípade zubu na anteriórnom koronoide, je aj zub na posteriórnom koronoide

bez zubonosnej kosti.

Na hornej čeľusti dorzálne od premaxil sa nachádzajú na každej strane dve tubulárne

osifikácie senzorického infraorbitálneho kanáliku hlavovej časti bočnej čiary (Obr. 13 B).

Premaxily sú už vyvinuté a napojené na anteriórny koniec maxíl. Vzájomne sa však

premaxily nedotýkajú v mediálnej rovine. Na premaxilách je vytvorený jeden rad zubov.

Na dermopalatínach sa zuby nachádzajú aj mimo pôvodne jedného radu a na tejto

zubonosnej kosti je monostichné usporiadanie zubov nahradené polystichným

usporiadaním. Maxily a dermopalatína sú prepojené tenkou kostenou lamínou z labiálneho

povrchu maxíl.

Pterolarva U prerolarvy sú znaky neskorej apterolarvy ešte viac výraznejšie. Dermopalatína,

ektopterygoidy, koronoidy a preartikulária pokrývajú štíhle zuby, ktoré nie sú zoradené v

jednom rade (Obr. 15, Obr. 16). Zuby na dermopalatínach nie sú rovnako dlhé ale

labiálnym smerom sa zmenšujú. Na premaxilách maxilách a dentáliách však zostáva

monostichné usporiadanie. Zuby na týchto kostiach sú v porovnaní s ostatnými masívnejšie

a posteriórne zahnuté. Obe premaxily sa mediálne nedotýkajú. Premaxily, maxily a

dermopalatína sú navzájom prepojené. Na oboch stranách sú premaxily a maxily spojené

do jedného celku. Maxily a dermopalatína sú spojené labiálnou kostenou lamínou z maxíl.

Dorzálne nad premaxilou a maxilou sa nachádza 5 tubulárných osifikácií, ktoré vznikajú

okolo infraorbitálnej senzorickej línie hlavovej častí bočnej čiary. Anteriórne osifikované

kanáliky sú napojené na premaxilu.

Výsledky

31

4.3.2. Vývin zubov na branchiálných oblúkoch Keďže v rámci jednotlivých skúmaných idivíduí odpovedajúcich určitému

dosiahnutému stupňu v ontogenéze existuje značná variabilita v usporiadaní zubov na

branchiálnych oblúkov, popisujem vývinové procesy dentice na konkrétnych jedincoch.

Larválna perióda Raná apterolarva U ranej apterolarvy začínajú objavovať prvé osifikácie na elementoch branchiálnych

oblúkov. Ceratobranchialiá I-III osifikújú na povrchu chrupavky čiže perichondrálne. Na

branchiálnych oblúkov sa však nenachádzajú zuby (Obr. 11 B). Na histologických rezoch

branchiálnymi oblúkmi nie sú žiadne známky odontogenézy ako napr. zmeny v epiteli

oblúku či kondenzácie mezenchýmu pod epitelom (Obr. 12).

Neskorá apterolarva V tomto období sa nápadne predĺži hlava a zväčší sa ako preorbitálna tak aj

postorbitálna dĺžka hlavy (Obr. 13A). Vytvorí sa tým priestor na diferenciáciu branchiálnej

oblasti. Jediné osifikované elementy branchiálneho aparátu sú ceratobranchiáliá (Obr.13

D). Tieto elementy sú mierne zahnuté okrem cb4, ktoré je rovné a tvarom pripomína

tyčinku. Prvé faryngeálne zuby sa objavujú práve cb1-4. Sú jednoduchého kónického

tvaru, mierne zahnuté a s bázami rozšírenými do malých platničiek. Prvé faryngeálne zuby

sú na pohľad menšie a štíhlejšie než orálne marginálne zuby napr. na dentále. Zuby na

jednom ceretobranchiále v porovnaní s orálnymi zubami sú od seba relatívne vzdialené a

zdá sa, že vznikajú nezávisle na sebe.

Na histogických rezoch branchiálnymi oblúkmi (Obr. 14) je zjavné, že prvé zuby

vznikajú v relatívne obmedzených priestorových podmienkach. Väčšinu branchiálneho

oblúku tvorí chrupavka ceratobranchiále, na ktorého povrchu možno rozoznať

perichondrálnu kosť. Zuby sa nachádzajú na mediálnej ploche oblúku. Zuby na

branchiálnych oblúkoch vznikajú z invaginovaného faryngeálneho epitelu. Zuby sa

vyvíjajú superficiálne a invaginovaný epitel stále zostáva v kontakte s okolitým epitelom.

Nebol pozorovaný žiadny pruh epitelu medzi dentálnym organom a povrchovým epitelom

číže dentálna lamína. Báza mineralizovaného epitelu sa rozširuje do tenkej lamíny, ktorá je

Výsledky

32

farbiteĺná alizarínovou červeňou (Obr. 13 A, D) Tenká lamína na báze zubu vzniká

nezávisle na perichondrálnej kosti branchiálneho oblúku.

Pterolarva V porovnaní s neskorou apterolarvou sa nachádza u 21 mm pterolarvy viac zubov na

branchiálnych oblúkoch. Okrem zubov na cb1-4, na oboch hb1 sú prítomné prvé zuby

(Obr. 17). Zuby na cb1-3 nie sú náhodne rozmiestnené. Vytvárajú rady pozdĺž

ceratobranchiálií, pričom jednotlivé zuby v rade sú približne rovnako vzdialené od seba.

Na cb I sú vytvorené dva rady. Oba sú na mediálnej strane prvého branchiálneho oblúku,

jeden rad na anteriórnej hrane oblúku, druhý na posteriórnej hrane oblúku. Na cb4 okrem

zubov s rozšírenou bázou nájsť ešte nepripojené zuby, ktoré sú zoradené v jednej línii s

pripojenými zubami. Medzi zubami na cb4 (Obr.17 D) sú vzdialenosti oveľa menšie než u

osamotených zubov na cb1-3 (Obr.17A). V porovnaní s predchádzajúcimi larvami má 32

mm larva na branchiálnych oblúkov okrem samostatných zubov aj zubné dosky s

viacerými zubami (Obr. 18). Zuby na týchto doskách sú pripojené svojími bázami s

kosťou, ktorá vznikla splynutím báz zubov. U 32 mm pterolarvy možno nájsť zuby na hb1-

2 a cb1-4. Na vnútornom povrchu cb4 sa nachádzajú tri zubné dosky, na ktorých sú všetky

pripojené a aj nepripojené zuby zoradené v jednej línii (Obr. 18 B). Obr. 18 A ukazuje

taktiež na pravoľavú asymetriu v utváraní zubných dosiek a počte zubov na hb1.

Na cb4 39 mm pterolarvy sa na zubných doskách doteraz vybavených jednou líniou

zubov objavujú ďalšie zuby (Obr. 19 B). Tieto zuby sa nachádzajú mimo marginálnej linie

zubov a v porovnaní s nimi sú kratšie. Okrem uvedených troch veľkých zubných dosiek sa

na cb4 nachádzajú menšie zubné dosky podobné tým, ktoré sa nachádzajú na ostatných

ceratobranchiáliách. U 58 mm pterolarvy je prítomná tenká perichondrálna osifikácia

okolo hb1 (Obr. 20 A, D). Ozubené dosky sú už sformované aj na okraji bb. Ozubné dosky

na hb1 a bb sú v porovnaní so zubnými doskami na ceratobranchiáliách plochejšie a tenšie

a zuby sú kratšie s relatívne širšími bázami (Obr. 20 C, D).

Juvenilná perióda

Najpokročilejšie skúmané štádium vo vývine zubov na branchiálnych oblúkov predstavuje

Výsledky

33

70 mm juvenil. Na bb, hb2 a 3 a cb1-4 sú perichondrálne osifikácie. Zuby sa nachádzajú na

väčšine oporných elementov branchiálnych oblúkov: bb, hb1 a 2, cb1-4 (Obr.21 A).

Najväčšie ozubené dosky sa nachádzajú na hb1. Na hyoidnom oblúku sa nenachádzajú

žiadne ozubené dosky a ani osamotené zuby. Na zväčšených ozubených doskách cb4 (Obr.

21 C, D) je rozoznateľná marginálny (okrajový) rad väčších zubov a menšie zuby

usporiadané menej pravidelne. Zväčšené ozubené dosky sa odlišujú od ostatných

ozubených dosiek na branchiálnom aparáte práve uvedenou relatívnou usporiadanosťou

marginálneho radu zväčšených zubov.

Diskusia

34

5. DISKUSIA 5.1. Vznik ústnej dutiny Ústa a farynx u bichira vzniká schizocélne, čo dokumentujú obr. a obr. V štádiu 1 možno

spoľahlivo identifikovať obe bazálne vrstvy epitelov, ale medzi nimi sa nachádza iba jedna

relatívne úzka vrstva buniek, identifikovaná na základe jadier buniek umiestnených za

sebou (Obr 3 A, A'). V nasledujúcom štadiu 2 vznikajú v tejto vrstve malé kavity. V

miestach vzniku kavít možno už bezpečne rozpoznať dvojvrstevnosť epitelu stropu a dna

orálnej dutiny (Obr. 3 B, B'). U dánia (Danio rerio) bolo pozorované, že dutina farynxu,

teda endodermálna časť orofaryngeálnej dutiny, vzniká separáciou oboch vrstiev buniek

endodermu (Waterman & Kao, 1982). Schizocélnym vývinom vzniká aj lumen

orofaryngeálnej dutiny u mlokov (Urodela) (Adams, 1924; Soukup et al., 2008). Taktiež

vznik lumenu endodermálnej časti orofarynxu u bahníkov (Dipnoi) vzniká týmto

spôsobom (Kerr, 1902 a 1919). Spoločnou znakom ontogenézy uvedených stavovcov je

vývin anteriórnej časti tela, a teda aj hlavy na veľkom žĺtkovom vaku (Semon, 1893; Kerr,

1907; Adams, 1924, Kimmel et al., 1995). Farynx sa totiž nachádza práve medzi masou

žĺtku a mozgom. Je preto zrejmé, že je priestorovo obmedzovaný okolitými štruktúrami. Je

veľmi pravdepodobné, že až rostrálna prolongácia hlavy vytvorí dostatočný priestor na

vznik lumenu farynxu. Zdá sa, že spomenuté stavovce zdieľajú podobný proces formácie

farynxu. Ako je to však s formáciou orálnej oblasti?

Waterman & Kao (1982) popisuje u dánia vznik ektodermovej inivaginácie tzv.

stomodea. Medzi stomodeom a lumenom farynxu vzniká prechodná prepážka tzv.

orofaryngeálna membrána, ktorá je ekto- endodermálneho pôvodu. Zánik tejto štruktúry

umožní priechodnosť anteriórnej časti tráviacej trubice. Tento spôsob vývinu úst bol

popísaný aj u iných stavovcov ako napr. u žaby Xenopus leavis (Dickinson & Sive, 2006).

U mlokov proces formácie úst sa odlišuje od vývinu úst u dánia (Johnson, 1910; Adams,

1924; Reisinger, 1933). U mlokov nevzniká stomodeum, ale tzv. ectodermal collar. Ide o

časť bazálneho ektodermálneho epitelu vytvárajúci prstenec okolo faryngeálneho

endodermu. Ústa vznikajú bez prechodnej orofaryngeálnej membrány separáciou vrstiev

buniek epitelu.

Vývin úst u bichira pripomína skôr situáciu u dánia. Aj napriek tomu, že mi k

preštudovaniu chýbajú ranejšie štádiá, v mediálnej oblasti u štádia 1 som našiel

Diskusia

35

invaginovaný ektoderm. Zaujímavé je, že u bichira nevzniká orofaryngeálnaj membrána.

Vo vznikajúcej orálnej dutine som ale našiel unikátne štruktúry. Nazval som ich epitelové

mostíky (ang. epithelial bridges Kralovic et al., 2009). Pri pohľade parasagitálne rezy

hlavy bichira (Obr. 5 vyzerajú epitelové mostíky ako štruktúry pozostávajúce z dvoch

vrstiev buniek. Epitelové mostíky vznikajú počas štádia 2 a v štádiu 4 už nie sú prítomné.

Nachádzajú sa skôr laterálne, ale nie mediálne. Ak by to boli tieto štruktúry homologické

ku orofaryngeálnej membráne, očakával by som ich výskyt v blízkosti mediálnej línie, kde

je lokalizovaná invaginácia stomodea. Nachádzajú sa však v blízkosti cementových

orgánov. Cementové orgány sú párové štruktúry umiestnené po stranách hlavy bichira.

Objavujú sa veľmi skoro v ontogenéze bichira (Kerr 1907 a 1919; Bartsch et al.,1997).

Počas vývinu orofaryngeálnej dutiny predstavujú dominantné hlavové štruktúry. Je preto

možné, že cementové orgány zohrávajú nemalú úlohu v morfogenéze hlavových tkanív

bichira. Cementové orgány môžu priestorovo obmedzovať rozsah invaginácie

stomodeálneho ektodermu na mediálnu oblasť. Význam epitelových mostíkov v ranej

morfogenéze orofarynxu je otázny a v nasledujúcej časti bude prebraný.

Na ventrálnej časti mandibulárneho oblúku v štádiu 1 možno rozlíšiť, že obe bazálne

vrstvy sú zložené z histologicky odlišných epitelov. Na posteriórnej strane mandibulárneho

oblúku sa nachádza nápadné rozhranie bazálnych vrstiev epitelov. Posteriórne od toho

rozhrania sa nachádzajú bunky s relatívne vysokým obsahom žĺtkových granúl a anteriórne

je obsah žĺtkových granúl v bunkách veľmi nízky. Anteriórna časť bazálnej vrstvy epitelu

obsahuje bunky pretiahnuté v apikobazálnom smere. V okolí modifikovaných buniek a

stretu oboch typov tkanív možno pozorovať výrazné agregácie mezenchymálnych buniek

ako v mandibulárnom oblúku, tak i na strope orofarynxu. Pri detailnejšom pohľade možno

rozpoznať, že mezenchymálne bunky sú priestorovo orientované k bazálnym epitelom. V

štádiu 3 možno v tomto regióne nájsť základy zubov. Aj napriek faktu, že u bichira nebola

doposiaľ urobená štúdia vývinu zárodočných vrstiev, možno pokladať časť

orofaryngeálneho epitelu bohatého na žĺtkové granule za endodermálnu. Doménu epitelu

orafarynxu s minimálnym obsahom žĺtkových granúl zase možno pokladať za

ektodermálnu. Na mieste je istá dávka opatrnosti s interpretáciou zárodočných vrstiev.

Žĺtkové granule sú počas vývinu metabolizované, zmenšujú svoje rozmery a nakoniec sú

resorbované, takže endoderm vývinom stráca svoj identifikačný znak (Kerr, 1907). Pri

zhrnutí doterajších informácii možno skonštatovať, že epitelové mostíky sa nachádzajú v

blízkosti vznikajúcich zubov, ktoré vznikajú v blízkosti kontaktu ektodermu a endodermu.

Diskusia

36

Hranica ektodermu a endodermu v ústach identifikovaná ako orofaryngeálna membrána

predstavuje podľa Smith (2003) miesto iniciačnej informácie pre tvorbu odontogénnych

zón v epiteli. Tento predpoklad pochádza z množstva transplantačných experimentov,

ktoré ale boli primárne uskutočňované na mlokoch (napr. Sellman, 1946, Wilde, 1955,

Graveson et al., 1997). Spoločným záverom týchto pokusov je zistenie, že okrem

ektodermu a buniek ektomezenchýmu je ku iniciácii vzniku zubov potrebný ešte aj orálny

endoderm. Určiť rozsah endodermu v ústach je však problematické. Až použitie

moderných transplantačných experimentov umožnilo vizualizovať rozsah endodermu v

orálnej dutine (Soukup et al., 2008). Obe recentné alternatívne teórie o pôvode zubov

(„inside-out theory“ Smith & Coates, 2000; „modified outside-in theory“ Huysseune et al.,

2009) považujú miesto vzájomného kontaktu ektodermu a endodermu za iniciačné miesto

odontogenézy. Na základe týchto poznatkov sa domnievam, že epitelové mostíky môžu

mať význam v iniciácie odontogenézy u bichira. Tiež tieto štruktúry by mohli označovať

ekto- a endodermálnu hranicu a mohli by byť obdobou orofaryngeálnej membrány a

podielať sa na iniciácií odontogenézy u bichira. Pomocou optickej mikroskopie je

problematické zistiť zárodočný pôvod tých štruktúr. Do budúcnosti by mohlo pomôcť

použitie transmisnej elektrónovej mikroskopie na identifikáciu bazálnych membrán u

oboch epitelov v ranejších štádiách

5.2. Vývin zubov v ústnej dutine Pred vlastným zahájením morfogenézy prvých orálnych zubov u bichira možno na

mandibulárnom oblúku rozpoznať niektoré znaky, ktoré s týmto procesom súvisia. Bunky

bazálneho epitelu v laterálnej oblasti orálnej dutiny v štádiu 1 sú predĺžené v

apikobazálnom smere. Tento epitel je obmedzený iba v laterálnych oblastiach a v

mediálnej časti sa nenachádza. Predĺžené bunky epitelu orálnej dutiny sa nachádzajú aj

napr. u cichlidy Hemichromis bimaculatus, ale podľa Huysseune & Sire (1997b) nich

nemožno tento znak spájať iba s odontogenézou. Z modifikovaných buniek epitelu môžu

podľa nich vznikať aj iné štruktúry ako napríklad chuťové poháriky. U bichira sa

anteriórna oblasť modifikovaných buniek bazálneho epitelu spolu s apikálnou vrstvou

epitelu na spodnej čeľusti sa v ďalších štádiách evaginuje a vytvára tenkú duplikatúru

pozdĺž spodnej čelusti tzv. spodnú peru (ang labial fold). Presný rozsah odontogénne

Diskusia

37

aktívneho epitelu teda nemožno histologicky s presnosťou rozpoznať. K tomuto účelu by

bolo vhodné zistiť kde sú exprimované gény s ranej morfogenézou epitelu počas

odontogenézy ako napríklaf Pitx2 či Shh (Fraser et al., 2004, Smith et al., 2008).

Prvé základy zubov možno rozpoznať v štádiu 3 ako invaginácie bazálnej vrstvy epitelu.

Invaginácie zostávajú v rámci bazálnej vrstvy epitelu a teda vývin zubov prebieha v

epitelu. Nebola pozorovaná žiadny invaginovaný pruh epitelu, z ktorého by vznikali zubné

zárodky čiže zubná lišta. Invaginovaný bazálny epitel obklopí niekoľko buniek

mezenchýmu čím vytvorí pupilu. Prvé zuby bichira sú relatívne malé bez nervov a ciev v

pulpálnej dutine. Ako uvádzajú Sire et al. (2002) predstavujú typické primárne zuby

lúčoplutvých rýb (Actinopterygii). Najranejšie zuby u bichira sú asociované s dentale,

anteriorným koronoidom, maxilou a ďalšie s dermopalatinom a preartikuláre. Zuby

začínajú mineralizovať od apexu ku bázy. Báze zubov sa rozšrujú a splývajú medzi

susednými zubami. Vzniká tak tenká doska, ktorou sa sa pripájajú ku zubonosným

kostiam.

Prvé zuby sa u bichira zakladajú počas voľnej embryonálnej fázy. V tejto časti vývinu

je embryo pasívne prichytené s mohutne vyvinutými cementovými orgánmi ku subtrátu a

spotrebúva žĺtkové zásoby. Táto fáza je okrem iného charakterizovaná rostrálnym

predĺžením a relatívným zväčšením hlavy. Následkom tohoto procesu je posunutie

cementových orgánov do anteriórnejšej pozície. Týmto posunom vznikne medzi

cementovými orgánmi a žĺtkovým vakom s perikardom priestor pre diferenciáciu

farygeálnych oblúkov a celej orofaryngeálnej oblasti. Histogenéza orálnych zubov je

spojená s diferenciáciou mandibulárneho oblúku. Dorzálna časť mandibulárneho oblúku

teda budúca horná čeľusť je v tesnom susedstve s bázami cementových orgánov. Ventrálna

časť mandibulárneho oblúku predstavuje budúcu dolnú čeľusť. V štádiu 1 a 2 pripomína

dva mediálne nespojené záhyby pod cementovými orgánmi. Madzi štádiom 2 a 3 dochádza

k diferenciácii mediálnej oblasti. Od štádia 3 má ventrálna časť kontinuálny charakter a

začína sa rostrálne predlžovať. Mandibulárny oblúk má v tomto štádiu tvar roztiahnutého

písmena V, pričom špička písmena V mieri posteriórne. S rostrálnym predĺžením dochádza

k výraznej zmene tvaru mandibulárneho oblúku. Mediálna (symfyzeálna) oblasť sa presúva

anteriórne a spodná čeľusť nadobúda typický V-tvar, kde mediána oblasť mieri anteriórne.

Z týchto údajov možno vyvodiť, že diferenciácia spodnej čelusti u bichira prebieha v

lateromediálnom smere.

Diskusia

38

Zmena tvaru spodnej čeľuste počas voľnej embryonálnej fáze uvedená vyššie je

doprevádzaná zväčšením jej dĺžky. Tento fakt môže mať okrem iného vplyv na

disproporcie v počte zakladajúcich sa zubov medzi dentále a maxilou. Na dentále možno

totiž už v štádiu 3 rozlíšiť niekoľko zubných základov. V rovnakom štádiu možno rozlíšiť

v maxilárnej odontogénnej zóne jeden zubný základ. V nasledujúcom štádiu 4 sú

rozlišiteľne tri zubné základy. Pri tejto komparácie možno rozpoznať odlišné vývinové

dynamiky týchto odontogénnych zón. Pozadie týchto odlišností možno hladať napríklad v

rôzných pozíciách odontogénnych zón v orofarynxu a teda aj odlišných priestorových

možností zón. Dentálna odontogénna zóna je lokalizovaná pozdĺž mandibulárneho oblúku

a je rozsahom najväčšia v tomto štádiu. Obsahuje niekoľko založených zubov, ktoré

vznikli súčasne alebo vo veľmi krátkom časovom úseku. Naopak maxilárna odontogénna

zóna je výskytom obmedzená na vrchnú časť kútiku úst, teda v priestore dorzálne

obmedzenom mozgom a anteriórne cementovými orgánmi (Obr.7 A). Simultánne

zakladanie dentálnych zubov v tesnej vzájomnej blízkosti možno chápať ako

maximalizáciu vývinového potenciálu dentálnej odontogénnej zóny. Založenie zubov v

týchto ranných štádiách je zrejme dôležité z pohľadu časového rozvrhu odontogenézy v

priebehu ontogenézy bichira. Resorbcia žĺtku a následný prechod na exogénny spôsob

výživy lariev musí nevyhnutne časovo korelovať s funkčnosťou aparátu pre príjem a

spracovanie potravy. Funkčnosť zubu ako súčasti tohto aparátu je podmienená jeho

kompletnou mineralizáciou, pripevnením ku zubonosnej kosti a erupciou na povrch

ústneho epitelu. Pri relatívne dlhých zubov je teda výhodné posunúť odontogenézu hlboko

do ranného embryonálneho štádia.

U neskorších embryí (štádium 5) a raných lariev predstavujú maxily a ektopterygoidy

relatívne dlhé kosti. Zuby na týchto kostiach sa však nachádzajú iba na ich anteriórnom

konci. Všeobecne zuby hornej čeľusti sa u bichira počas embryonálneho a raného

larválneho vývinu vyskytujú na relatívne obmedzenom priestore ústnej dutine v porovnaní

s neskoršími larvami. Prečo je vlastne odontogenéza v raných štádiách obmedzená len na

určitú časť ústnej dutiny?

Počas embryonálnej fáze vývinu sú na anteriórnom konci hornej čeľuste cementové

orgány, ktoré sa redukujú pri prechode do larválnej fáze. Podobne ako v prípade vzniku

úst, možu tieto štruktúry zohrávať úlohu v organizácii embryonálnej dentice. Wacker et al.

(2001) uvádzajú, že prítomnosť cementových orgánov na anteriórnom konci hornej čeľuste

zrejme spôsobuje oneskorenie vývinu zubov a kostí premaxil a vomeru. Anteriórne

Diskusia

39

obmedzenie dentice hornej čeľuste je zjavné, ale nemožno ním vysvetliť zakladanie zubov

na anteriórnom konci maxil a dermopalatín. Jedným z možných vysvetlení hypotéz je

predpoklad, že zuby vznikajú zo spoločnej zóny. V štádiu 1 a 2 sa nachádza v miestach

budúcej odontogénnej aktivity bazálny epitel s predĺženými bunkami ako už bolo uvedené

a diskutované vyššie.

Zuby u ranej apterolarvy sú na zubonosných kostiach zoradené do jednej línie a takéto

usporiadanie sa označuje ako monostichné. V ústnej dutine u ranej apterolarvy sa na

čeľustiach vytvoria dve línie zubov. Vonkajšiu líniu zubov na hornej čeľustí tvoria zuby na

premaxilách a maxilách, na dolnej zuby na dentáliách. Vnútorná línia zubov hornej

čeľuste je vytvorená zo zubov na vomere, dermopalatínach a ektopterygoidoch, na dolnej

čeľuste ju predstavujú zuby na koronoidoch a preartikuláriách. Oblúky nie sú kompletné a

medzi zubami jednotlivých kostí sú značné medzery. Monostichné usporiadanie zubov

vnútorných oblúkoch na hornej i dolnej čeluste zaniká po prechode do neskorej apterolarvy

a pterolarvy Je nahradené polystichným usporiadaním, teda zuby nie sú zoradené do

jedneho radu, ale rozprestne po ploche kosti. Zuby v marginálných čiže vonkajších

zubných oblúkoch si však monostichné usporiadanie uchovávajú. Monostichné

usporiadanie marginálaneho oblúku na premaxile, maxile a dentále u bichira je podľa

Wacker et al., (2001) odvodeným znakom bichirov. Opierajú sa pritom na poznatky

získané komparáciou u bazálnych zástupcv Actinopterygii ako fosílneho rodu Birgeria tak

aj recentné rody Lepisosteus a Amia. Tento názor podporujú aj recentné nálezy fragmentov

dentálií s polystichným usporiadaním zubov u jedných z najstarších bazálnych

Osteognathostomata, a to u rodoch Andreolepis a Lophosteus (Botella et al., 2007).

Monostichné usporiadanie sa teda zdá byť apomorfným znakom pre marginálnu líniu

zubov u bichirov. Ako však došlo k tejto evolučnej novinke príp. akým spôsobom je

udržovaná? Fraser et al. (2008) publikovali model, v ktorom navrhujú molekulárný

mechanizmus vzniku zubných radov na dentále u cichlíd. Najprv sa vytvorí jedna línia. Po

vytvorení prvého radu zubov je dentálna kompetencia a iniciácia posunutá na nasledujúci

rad. Po vytvorení tohto radu je opäť zahájená tvorba ďalšieho radu. Je pritom používaná tá

istá molekulárna mašinéria ako v prípade prvého radu. Je preto možné, že je po vytvorení

jedného radu zablokovaná expresia niektorej z kľúčovej signálnej molekuly ako napr. Shh

(Smith et al., 2008).

Diskusia

40

5.3. Vývin zubov na branchiálných oblúkoch Faryngeálne zuby na branchiálnych oblúkoch bichira sa nachádzajú v početných

menších agregáciách (Clemen et al., 1998; Wacker et al., 2001). Každé takéto zoskupenie

pozostáva zo zubov prichytených ku špongióznej zubonosnej kosti. Zuby vo farynxu sa

vyskytujú výlučne v spojení so zubonosnými kosťami. Ako však vzniká tento uniformný

pattern?

Pri porovnávaní s nasledujúcimi štádiami vo vývine dosiek je dosť ťažké nájsť

odpovedajúce si zubné dosky, prípadne jednotlivé zuby na nich. Preto je problematické

vytvoriť nejaký diagram, ktorý by zobrazoval počet a pozíciu jednotlivých zubov na

jednotlivých zubných doskách. Aj napriek tomu sa mi podarilo porovnávaním medzi

jedincami a štádiami nájsť nejaké všeobecné vlastností. Zubonosné elementy vo farynxu

bichira vznikajú nezávisle na chrupavkách a perichondrálných kostí žiabrových oblúkoch.

Na bázach jednotlivých zuboch vzniká kosť a vytvára najprv tenkú laminu okolo zubu.

Tento zub možno označiť ako iniciačný či zakladajúci (ang. founder tooth). Ďalšie zuby

vznikajúce v tesnej blízkosti iniciačného zubu sa potom pripojú ku sformovanej kostenej

doske. Popísaným procesom vznikajú patche zubov na žiabrových oblúkoch. Dosky so

zubami môžu byť voľne uložené pod epitelom žiabrových oblúkov, alebo fúzovať s

chrupavkami a perichondrálnými kosťami prostredníctvom väziva či kosti.

Zväčšené dentálne dosky na štvrtom ceratobranchiále (cb4) sa odlišujú od ostatných

dentálných dosiek na branchiálnych oblúkoch. Dosky sú nápadne veľké a pokryté zubami.

Marginálna línia zubov je výrazne zväčšená. Zubné dosky pripomínajú tzv. faryngeálne

čeľuste t.j. modifikovaný piaty branchiálny oblúk nachádzaný u mnohých zástupcvov

Teleostei (Nelson,1969; Vandewalle et al., 2000). Umiestnenie zväčšených dentálnych

plátov na cb4 vyvolávalo pochybnosti či sa vlastne jedná o štvrtý alebo piaty oblúk. Britz

& Johnson (2003) ukázali, že ide o štvrtý branchiálný oblúk pričom piaty oblúk zanikol.

Zväčšené ozubené dosky u bichirov sú na štvrtom branchiálnom oblúku ako u niektorých

úhorotvarých (Anguilliformes) (Nelson, 1969; Mehta & Wainwright, 2007). Štvrtý

branchiálny oblúk u bichirov však pripomínajú tzv. cypriniformné faryngeálne čeluste. Na

oboch sa nachádzajú zuby len na ceratbranchiáliách, ktoré predstavuje tzv. spodné

faryngeálne čeľuste. Podobne ako u cypriniformných faryngeálnych čeľustí oklúzia vzniká

medzi zubmi na ceratobranchiále. U rýb s cypriniformnými faryngeálnymi čeľusťami ,

hlavne u čeľade Cyprinidae je známy posun v osifikáci piatych ceratobranchialií oproti

Diskusia

41

ceratobranchiáliám ostatných oblúkov (Nakajima 1984 a 1991; Wandervalle et al., 1992;

Cubagge & Mebee , 1996; Eugeman et al., 2009). U bichira som podobne ako Wacker et

al. (2001) však žiadny posun v osifikácii štvrtého ceratobranchiále nezaznamenal.

Kaprovité ryby totiž ireverzibilne stratili asi pred 50 miliónmi rokov orálne zuby a jediné

zuby sa nachádzajú na piatom ceratobranchiále (Cavender, 1991). Faryngeálne čeľuste

prebrali hlavnú úlohu v spracovaní potravy. Preto je osifikácia piateho ceratobrachiále

posunutá v porovnaní s ostatnými branchiálnymi oblúkmi. U bichira sa prvé faryngeálne

zuby objavujú oveľa neskôr ako orálne zuby. Možno preto predpokladať, že faryngeálne

zuby u bichira plnia vedľajšiu funkciu pri spracovaní potravy akou je predovšetkým

transport potravy do hltanu (Clemen et al, 1998).

5.4. Orálne vs. faryngeálne zuby Podľa „inside out“ modelu pôvodu zubov (Smith & Coates, 2000 a 2001, Smith 2003)

zuby vznikli z faryngeálneho endodermu. Starší alternatívny model nazvaný „outside-in“

(Smith & Coates, 2000) predpokladal ektodermálny pôvod zubov z povrchových dentikul

(Reif, 1982). S novým pohľadom na evolúciu zubov sa vynorila aj nová otázka či sa orálne

a faryngeálne zuby od seba líšia, príp. či sú to homologické orgány. Dodnes bolo

vypracovaných niekoľko štúdií, ktoré porovnávajú expresiu génov počas ranej

odontogenézy medzi orálných a faryngeálných zubov. Niektoré štúdie ukázali na isté

rozdiely v expresii niektorých génov (Fraser et al., 2004; Jackman et al., 2004; Laurenti et

al., 2004) Dokonca bola publikovaná hypotéza (Tucker & Sharpe, 2004), že dentálna

diverzita môže byť vysvetlená dvojitým pôvodom zubov z orálneho ektodermu a

faryngeálneho endodermu. Všeobecne orálne a faryngeálne zuby sú seriálne homologické

štruktúry (Stock, 2001). Podľa Debiais-Thibaud et al. (2007) možno chápať rozdiely v

expresii génov ako výsledok procesu vzajomnej individualizácie genetických kaskád

vedúcich ku formácii oboch zubov.

Orálne a faryngeáne zuby (zuby na branchiálných oblúkoch) u bichira vykazujú

rovnakú vonkajšiu morfológiu. Sú kónického tvaru, monokuspidné s enameloidnou

čapičkou na apexe. V rámci homodontnej dentice bichira Clemen et al. (1998) rozlišujú tri

typy zubov. Iba zuby typu 1, čiže masívne zuby so širokými bázami sú obmedzené len na

ústnu dutiny. Zuby typu 2 a 3 sa nachádzajú ako v orálnej dutine tak aj na branchiálnych

oblúkoch. Orálne aj faryngeálne zuby sú stavané podľa rovnakej schémy. Dentínový kužeľ

Diskusia

42

s pulpálnou dutinou je na apexe pokrytý hypermineralizovanou matrix, enameloidom. Na

báze zubov sa vytvára kostený materiál, ktorým sa zuby napájajú k zubonosným

elementom.

Prvé zuby na branchiálnych oblúkov sa objavujú u bichira oveľa neskôr než prvé zuby

v ústnej dutine. Prvé orálne zuby sa vyskytujú v embryonálnom štádiu 4 a prvé faryngeálné

zuby až u neskorej apterolarvy. K podobnému zistili aj Wacker et al (2001). Uvedený

posun v ontogenéze bichira predstavuje pri použití tabuľky vývinu pri 28 ˚C podľa Bartsch

et al. (1998) vyše dvojtýždňové oneskorenie. Túto heterochróniu vo vývine možno

vysvetliť časovo posunutú diferenciáciou branchiálných oblúkov až do neskorej

apterolarvy. Aj napriek tomuto faktu uvedené vysvetlenie nie je úplne postačujúce. Totiž

ceratobranchiáliá, teda elementy, na ktorých sa vyvíjajú prvé zuby, začínajú osifikovať už

u ranej apterolarvy. Ďalším argumentom je relatívna vzájomná nezávislosť faryngeálných

zubov a oporných elementov branchiálnych oblúkov. Nezávislosť vzťah medzi uvedenými

štruktúrami dokumentujú mutanty vo formácii branchiálnych oblúkov u dánia (Danio

rerio), ktoré však neovplyvňujú faryngeálnu denticu (Schilling et al., 1996). U medaky

(Oryzipias laticeps) je taktiež známa heterochrónia v odontogenéze orálnych a

faryngeálnych zubov (Debiais-Thibaud et al., 2007). V prípade medaky je však situácia

opačná a časový posun nie je tak výrazný: faryngeálne zuby vznikajú v štádiu 30 t.j. 3,5

dňa po oplodnení a orálne zuby až v štádiu 36 teda 6 dní po oplodnení. Herochrónia medzi

iniciáciou orálnych a faryngeálnych zubov ukazuje na ďalší aspekt individualizácie

vývinových programov orálnych a faryngeálnych zubov. Taktiež to poukazuje na

vzájomnú vývinovú nezávislosť oboch dentálnych systémov.

Na štvrtom ceratobranchiále u bichira vznikajú zväčšené ozubené dosky. Zuby na

týchto doskách majú najprv monostichné usporiadanie, čiže vyvíjajú sa v jednej rade. Po

vytvorení prvej rady sa zuby začinajú objavovať aj mimo tejto rady. Na ozubených

doskách vzniká polystichné usporiadanie dentice. Podobný proces, kedy monostichné

usporiadanie predchádza polystichnému, som pozoroval aj na niektorých zubonosných

kostiach ústnej dutiny

Na bázach orálnych a faryngeálných zubov vzniká kosť, ktorá spája bázy zubov a

vytvára tenkú kostenú dosku. Táto doska v prípade orálnych zubov splýva so zubonosnými

kosťami. Predstavuje pripojovaciu kosť. Dlho sa predpokladalo, že u bichira nie je ešte

pripojovacia kosť vyvinutá (Kerr, 1959). Fink (1981) prišiel s návrhom, že pripojovacia

kosť je u bichira vyvinutá, ale nie je odlíšiteľná histologicky a chemickým zložením od

Diskusia

43

zubonosnej kosti. Domnievam sa, že na branchiálných oblúkoch táto kosť vytvára dosky,

ktoré nesú faryngeálne zuby. Tú myšlienku podporuje predpoklad, že kosť tvoriaca

ozubené dosky na branchiálných oblúkoch je homologická pripojovacej kosti na bázach

zubov väčšiny stavovcov . Predpokladá sa, že ancestrálne boli zuby rošírené po celom

orofarynxe ako je to u niektorých bazálnych zástupcov Actinopterygii vrátane bichira

(Stock, 2001; Smith, 2003). Reduktívnou evolúciou sa počet zubov znižoval a dnešných

Teleostei sú faryngeálne zuby často lokalizované len na určitej časti branchiálneho aparátu

(Nelson, 1969, Vandewalle, 2000; Stock, 2007). Je preto veľmi pravdepodobné, že

redukcia postihla aj ozubená kostené dosky. Tie sa mohli redukovať na pripojovaciu kosť

ako to je napríklad u kaprovitých rýb (Huysseune et al.,1998; Van der heyden et al., 2000).

Záver

44

6. ZÁVER

V tejto práci bol rámcovo popísaný vývin orofaryngeálnej dutiny a vývin zubov v

ústnej dutine a na branchiálnych oblúkoch bichira senegalského (Polypterus senegalus).

Ďalej pre potreby deskripcie vývinových procesov bolo vytvorených 5 embryonálnych

štádií, ktoré pokrývajú medzery v štádiovaní bichira senegalského (Kerr 1907, Bartsch et

al., 1997).

Bolo zistený schizocélny spôsob formácie dutiny. Počas diferenciácie ústneho otvoru

sa vyskytujú unikátne štruktúry nazvané epitelové mostíky (ang. epithelial bridges,

Kralovic et al., submitted). Podľa našeho názoru tieto mostíky predstavujú ekto-

endodermálnu hranicu v orofaryngeálnej dutine a môžu hrať úlohu v iniciácii

odontogenézy (Smith & Coates, 2000; Huysseune et al., 2009). Cementové (príchytné)

orgány zrejme ovplyvňujú pri vývine úst odlišnú lateromediálnu dynamiku.

V práci som nadviazal na recentne publikované štúdie o kraniálnom a dentálnom

vývine bichira Clemen et al., (1998) a Wacker et al., (2001). Zuby v čeľustiach majú

najprv monostichné usporiadanie a vytvárajú dva zubné oblúky, vnútorný a vonkajší

(marginálny). V priebehu ďalšieho vývinu je na kostiach vnútorného oblúku monostichné

usporiadanie nahradené polystichným, čiže zuby vytvárajú viacej radov na jednej

zubonosnej kosti. Vonkajší (marginálny) oblúk zubov si zachováva monostichné

usporiadanie. Tento proces postupného prechodu z monostichného na polystichný bol

pozorovaný i na zväčšených zubných doskách na štvrtom ceratobranchiále. Zuby na

branchiálnych oblúkoch sa najprv vyskytujú jednotlivo. Z ich báz sa vytvára kostená doska

(attachement bone), ku ktorej sa pripájajú ďalšie vyvíjajúce zuby. Podobný proces bol

pozorovaný aj v prípade orálnych zubov.

Na záver by som chcel vyzdvihnúť osobný prínos diplomovej práce. Počas jej

vypracovania som si osvojil niektoré histologické techniky a taktiež som sa naučil robiť

presvetlené preparáty. Analýza dát, ich interpretácia a komparácia so známymi poznatkami

mi umožnili zdokonaliť svoje premýšľanie v evolučne vývinových problematikách.

Použitá literatúra

45

7. POUŽITÁ LITERATÚRA Agassiz JLR (1833-44) Recherches sur les poissons fossiles. Neuchâtel et Soleure: Petitpierre. Citované podľa Patterson (1982). Adams AE (1924) An experimental study of the development of the mouth in the amphibian embryo. The Journal of Experimental Zoology. 40,311-379. Ballard WW & Needham RG (1964) Normal embryonic stages of Polyodon spathula (Walbaum). Journal of Morphology. 114(3), 465-477. Balon EK & Fleger-Balon C (1985) Microscopic techniques for studies of early ontogeny in fishes: problems and methods of composite descriptions. In: E. K.Balon (ed.): Early life histories of fishes, pp 33-55. - Dr W. Junk Publishers, Dordrecht, 280 pp. Bartsch P, Gemballa S, Piotrowski T (1997) The embryonic and larval development of Polypterus senegalus Cuvier 1829: Its staging with reference to externaland skeletal features, behaviourand locomotory habits. Acta Zoologica. 78, 309-328. Berkovitz BKB (1977) The order of tooth development and eruption in the rainbow trout (Salmo gairdneri). Journal of Experimaental Zoology. 201, 221-226. Berkovitz BKB (1978) Tooth ontogeny of the upper jaw and tongue of the rainbow trout (Salmo gairdneri). Journal de Biologie Buccale. 6(3):205-15. Bjerring HC (1985) Facts and thoughts on piscine evolution. In: Evolutionary Biology of Primitive Fishes (eds. R. E. Foreman, A. Gorbman, J. M. Dodd and R. Olsson), pp. 31-57. New York: Plenum Press. Botella H, Blom H, Dorka M, Ahlberg PE & Janvier P (2007) Jaws and teeth of the earliest bony fishes. Nature. 448, 583-586. Cavender, T. M. (1991). The fossil record of the Cyprinidae. In Cyprinid Fishes: Systematics, Biology and Exploitation (ed. I. J. Winfield and J. S. Nelson), pp. 34-54. New York: Chapman & Hall. Chui C, Dewar K, Wagner GP, Takahashi K, Ruddle F, Ledje C, Bartsch P, Scemama J-L, Stellwag E, Fried C, Prohaska SJ, StadlerPF, Amemiya CT (2004) Bichir HoxA cluster sequence reveals surprising trends in ray-finned fish genomic evolution. Genome Reserch. 14, 11-17. Cubbage CC Mabee PM (1996) Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). Journal of Morphology. 229, 121-160. Debiais-Thibaud M, Borday-Birraux V, Germon I, Bourrat F, Metcalfe CJ, Casane D and Laurenti P (2007) Development of oral and pharyngeal teeth in the medaka (Oryzias latipes): comparison of morphology and expresion of eve1 gene. Journal of Experimental Zoology B (MOL DEV EVOL). 308, 693-708.

Použitá literatúra

46

Debiais-Thibaud M, Germon I, Laurenti P Casane D and Borday-Birraux V (2008) Low divergence in Dlx gene expresion between dentitions of the medaka (Oryzias latipes) versus hight level of expresion shuffling in osteichthyans. Evolutions & Development. 10 : 4, 464-476 Dickinson AJG & Sive H (2006) Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Developmental Biology. 295,700-713. Dingerkus G & Uhler LD (1977) Enzyme clearing and alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage. Staining Technology. 52, 229-232. Donoghue PCJ & Sansom IJ (2002) Origin and early evolution of vertebrate skeletonization. Microscopy Research and Techique. 59, 352–372. Edwards LF (1929) The origin of the pharyngeal teeth of the carp (Cyprinus carpio Linnæus). The Ohio Journal of Science 29, 93-130. Engeman JM, Aspinwall N, Mabee PM (2009) Development of the pharyngeal arch skeleton in Catostomus commersonii (Teleostei: Cypriniformes). Journal of Morphology. 270, 291-305. Fink WL (1981) Ontogeny and phylogeny of tooth attachment modes in Actinopterygian Fishes. Journal of Morphology. 167, 167-184. Fraser GJ, Graham A, Smith MM (2004) Conserved deployment of genes during odontogenesis across osteichthyans. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 271, 2311-2317. Fraser GJ, Berkovitz BK, Graham A, Smith MM (2006) Gene deployment for tooth replacement in the rainbow trout (Oncorhynchus mykkis): a developmental model for evolution of the osteichthyan dentition. Evolution & Development. 8, 446-457. Fraser GJ, Graham A, Smith MM (2006) Developmental and evolutionary origins of vertebrate dentition: molecular controls for spatio-temporal of tooth sites in osteichthyans. Journal of Experimental Zoology B (MOL DEV EVOL). 306, 183-203. Fraser GJ, Bloomquist RF and Streelman JT (2008) A periodic pattern generator for dental diversity. BMC Biology. 6: 32. Fraser GJ, Hulsey CD, Bloom quist RF, Uyesugi K, Manley NR and Streelman JT (2009) A ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaw. PLoS Biology. 7 (2). Goodrich ES (1928) Polypterus a palaeoniscid? Palaeobiologica. 1, 87-92. Grande L. & Bemis WE (1998) A comprehensive phylogenetic study of amiid fishes (Amiidae) based on comparative skeletal anatomy. An empirical search for interconnected

Použitá literatúra

47

patterns of natural history. Society for Vertebrate Paleontology Memoir 4. Journal of Vertebrate Paleontology. 18(suppl.):1–690. Graveson AC, Smith MM & Hall BK (1997) Neural crest potential for tooth development in a urodele amphibian: developmental and evolutionary significance. Developmental Biology 188, 34-42. Hall BK (2001) John Samuel Budgett (1872-1904) : In pursuit of Polypterus. BioScience 51, 399-407. Harris MP, Rohner N, Schwarz H, Perathoner S, Konstantinidis & Nüsslein-Volhard C (2008) Zebrafish eda and edar Mutants Reveal Conserved and Ancestral Roles of Ectodysplasin Signaling in Vertebrates. PLoS Genet. 4(10) Hertwig 0 (1874) Ueber Bau und Entwickelung der Placoidschuppen und der Zahne der Selachier. Jenaische Zeitschrift für Medizin und Naturwissenschaf. 8, 331-404. Hulsey CD (2006) Function of a key morphological innovation: fusionof the cichlid pharyngeal jaw. Proceedings of The Royal Society. 273, 669–675. Huxley TH (1861) Preliminary essay upon the systematic arrangement of the fishes of the Devonian epoch. Memoirs of the geological survey of the United Kingdom 421-460. Citované podľa Patterson (1984). Huysseune A Sire JY (1997a) Structure and development of teeth in three armoured catfish Corydoras arcuatus, C. aeneus and Hoplosternumlittorale (Siluriformes, Callichthyidae). Acta Zoologica Stockholm.78, 69–84. Huysseune A Sire JY (1997b) Structure and development of firstgeneration teeth in the cichlid Hemichromis bimaculatus (Teleostei, Cichlidae). Tissue Cell. 29, 679–697. Huysseune A & Sire J-Y (1998) Evolution of patterns and processes in teeth and tooth-related tissues in non-mammalian vertebrates. European Journal of Oral Science. 106(suppl 1),437–481. Huysseune A, Sire J-Y, Witten EP (2009) Evolutionary and developmental origins of the vertebrate dentition. Journal of Anatomy. 214(4), 465-476. Imai H, Osumi-Yamashita N, Ninomiya Y and Eto K (1998) Contribution of foregut endoderm to tooth initiationof mandibular incisor in rat embryos. European Journal of Oral Science. 106 (suppl. 1), 19-23. Imms AD (1905) On the oral and pharyngeal denticles of elasmobranch fishes. Proceedings of The Zoological Society London. 1, 41-49. Inoue JG, Miya M., Tsukamoto K, & Nishida M. (2003) Basal actinopterygian relationships: a mitogenomic perspective on the phylogeny of the ancient fish. Molecular Phylogenetic and Evolution. 26, 110-120.

Použitá literatúra

48

Iwamatsu T (2004) Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mechanisms of Development. 121, 605-618. Jackman WR, Draper BW and Stock DW (2004) Fgf signaling is required for zebrafish tooth development. Developmental Biology. 274, 139-157. James CT, Ohazama A, Tucker AS, Sharpe PT (2002) Tooth development is independent of a Hox patterning programme. Developmental Dynamics. 225, 332–335. Janvier P (1996) Early Vertebrates. Oxford University Press, New York. Jarvik E (1964) Specializations in early vertebrates. Annales de la Societe Royale Zoologique de Belgique. 94, 11-95. Johnston JB (1910) The limit between ectoderm and endoderm in the mouth and the origin of taste buds in amphibians. American Journal of Anatomy. 10,41-67. Jollie M (1984) Development of the head and pectoral skeleton of Polypterus with a note on scales (Pisces : Actinopterygii). Journal of Zoology, London. 204, 469-507. Kardong KV (1995) Vertebrates. Comparative anatomy, function, evolution. (ed. Kemp MJ) Wm. C. Brown Publishers, Dubuque. Kaufman LS & Liem KF (1982) Fishes of the suborder Labroidei (Pisces: Perciformes): phylogeny, ecology and evolutionary significance. Breviora 1982, 472:1-19 Kerr JG (1902): The development of Lepidosiren paradoxa III. Development of the skin and its derivatives. Quarterly Journal of Microscopical Science. 46,418-459. Kerr JG (1907) The development of Polyppterus sevegalus Cuv. In: The Work of John Samuel Budgett, Balfour Student of the University of Cambridge: Being a Collection of His Zoological Papepers, together with a Biographical Sketch by A. E. Shipley,F:R.S:, and Contributions by Richard Assheton, Edward J. Bless, Edward T. Browne, J. Herbert Budgett and J. Graham Kerr ( ed. Kerr JG), pp. 195-290. Cambridge: Cambridge University Press. Kerr JG (1910) On certain features in the development of the alimentary canal in Lepidosiren and Protopterus. Quarterly Journal of Microscopical Science 54, 483-518. Kerr JG (1919) Textbook of Embryology. Vol. II. Macmillan, London. Kerr T (1959) Development and structure of some actinopterygian and urodele teeth. Proceedinds of the Zoological Society of London. 133, 401-422. Kikugawa K, Katoh K, Kuraku S, Sakurai H, Ishida O, Iwabe N, Miyata T, (2004) Basal jawed vertebrate phylogeny inferred from multiple nuclear DNA-coded genes. BMC Biology. 2, 3.

Použitá literatúra

49

Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B and Schilling T (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203(3), 253-310. Laurenti P, Thaeron C, Allizard F, Huysseune A and Sire J-Y (2004) Cellular expression of eve1 suggests its requirement for the differentiation of the ameloblasts and for the initiation and morphogenesis of the first tooth in the zebrafish (Danio rerio). Developmental Dynamics. 230, 727-733. Liem KF, Grande L & Bemis WE (2000) Functional anatomy of the vertebrates: an evolutionary perspective. Thomson Brook, 3rd Ed. Long WL & Ballard WW (2001) Normal of embryonic stages of the Longnose Gar, Lepisosteus osseus. BMC Developmental Biology. 1:6. Lund (1985) The morphology of Falcatus falcatus St. John & Worthen, a Mississippian stethacanthid chonddrichthyan from the Bear Gulch Limestone of Montana. Journal of Vertebrate Paleontology.5. 1-19. Mehta RS & Wainwright PS (2009) Raptorial jaws in the throat help moray eels swallow large prey. Nature. 449, 79-82. Nakajima T (1984) Larval versus adult pharyngeal dentition in some japaneese cyprinid fishes. Journal of Dental Research. 63 (9), 1140-1146. Nakajima T (1991) The appearance of tooth germs in the round crucian carp (Carassius auratus grandoculis). Japaneese Journal of Ichthyology. 38 (2), 219-225. Nelson GJ (1969) Gill arches and phylogeny of fishes. with notes on the classification of vertebrates. Bulletin of the American Museum of Natural History. 141, 479-552. Nelson GJ (1970) Pharyngeal denticles (placoid scales) of sharks, with notes on the dermal skeleton of vertebrates. American Museum Novitates. 2415, 1–26. Nelson JS (2006) Fishes of the world. 4th edition. Hoboken,NJ: Wiley. Ørvig T (1967). Phylogeny of tooth tissues: evolution of some calcified tissues in earlyvertebrates. In: Structural and chemical organization of teeth (ed. A. E. W. Miles), pp. 45–100. Academic Press, New York. Ørvig T (1977) A survey of odontodes (‘dermal teeth’) from developmental, structural,functional and phylogenetic points of view. In: Problems in Vertebrate Evolution (eds.Andrews SM, Miles RS, Walker AD). pp. 53-75. Academic Press, New York. Reisinger E (1933) Entwicklungsgeschichtliche Untersuchungen am Amphibienvorderdarm (Gleichzeitig ein Beitrag zur Keimblattspezifität und zur prospektiven Bedeutung des Mesektoderms). Wilhelm Roux’ Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen 129,445-501.

Použitá literatúra

50

Reiss JO (1997) Early development of chondrocranium in the tailed frog Ascaphus truei (Amphibia: Anura): Implications for anuran palatoquadrate homologies. Journal ofMorphology 231, 63-100. Reisz RR & Smith MM (2001) Developmental biology: Lungfish dental pattern conserved for 360 Myr. Nature. 411,548. Romer AS (1946) The early evolution of fishes. Quarterly Review of Biology. 21, 33-69. Schoch RR (2001) Can metamorphosis be recognised in Palaeozoic amphibians? Neues Jahrbuch fur Geologie und Palaontologie. Abhandlungen. 220, 335–367. Schilling TF, Piotrowski T, Grandl H, Brand M, Jiang Y-J, Heisenberg C-P, Beuchle D, van Eeden FJM, Furutani-Seiki M, Granato M, Haffter P, Hammerschmidt M, Kane DA, Kelsh RN, Mullins MC, Odenthal J and Nüsslein-Volhard C (1996) Mutations affecting the development of the jaw and branchial arches I: Gill arches. Development. 123, 329-344. Senior HD (1909) The development of the heart in shad (Alosa sapadissima, Wilson). American Journal of Anatomy. 10(2), 212-262. Sire J-Y, Davit-Beal T, Delgado S, Van Der Heyden C & Huysseune A (2001) First-generation teeth in nonmammalian lineages: Evidence for a conserved ancestral character? Microscop Research and Technique. 59, 408 - 434. Smith BG (1937) The anatomy of the frilled shark, Chlamydoselachus anguineus Garman. pp. 335–505 figs 1–27 pls 1–7 in Gudger, E.W. (ed.). The Bashford Dean Memorial Volume. Archaic fishes. New York : American Museum Natural History Vol. 6 (314) Smith MM (2003) Vertebrate dentition and the origin of jaws: when and how pattern evolved.Evolution & Development. 5, 394-413. Smith MM & Coates MI (2000) Evolutionary origins of teeth and jaws: developmental models and phylogenetic patterns. In: Development, Function and Evolution of Teeth (eds. Teaford MF, Smith MM, Ferguson MWJ). pp. 133-151. Cambridge University Press, Cambridge. Smith MM & Coates MI (2001) The evolution of vertebrate dentitions: phylogenetic patternand developmental models. In: Major Events in Early Vertebrate Evolution (Paleontology,Phylogeny, Genetics and Development) (ed. Ahlberg PE). pp. 223-240. Taylor and Francis,London and New York. Smith MM & Johanson Z (2003) Separate evolutionary origins of teeth from evidence infossil jawed vertebrates. Science 299, 1235-1236. Smith MM & Hall BK (1993) A developmental model for evolution of the vertebrate exoskeleton and teeth: the role of cranial and neural trunk neural crest. Evolutionary Biology. 27, 387-447.

Použitá literatúra

51

Smith MM, Fraser GJ and Mitsiadis TA (2009) Dental lamina as source of odontogenic stem cells: evolutionary origins and developmental control of tooth generation in gnatostomes. Journal of Experimental Zoology B (MOL DEV EVOL). 312B, (Epub ahead of print). Smith MM, Okabe M, Joss J. (2008) Spatial and temporal pattern for the dentition in the Australian lungfish revealed with sonic hedgehog expression profile. Proceeding of The Royal Society London B. 276,1-9. Steinhard O (1903) Ueber Placoidschuppen in der Mund- und Rachenhohle der Plagiostomen. Archiv Für Naturgeschicthe. 69, 1-46. Stock DW (2001) The genetic basis of modularity in the development and evolution of the vertebrate dentition. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B 356, 1633-1653. Stock DW Jackman WR Trapani J (2006) Developmental genetic mechanisms of evolutionary tooth loss in cypriniformfishes. Development. 133, 3127–3137. Stock DW (2007) Zebrafish dentition in comparative context. Journal of Experimental Zoology (MOL DEV EVOL). 308B, 523–549. Soukup V, Epperlen H-H, Horáček I and Cerny R (2008) Dual epithelial origin of vertebrate oral teeth. Nature. 455, 795-798. Springer VG & Johnson GD (2000) Use and advantages of ethanol solution of alizarin red s dye for staining bone in fishes. Copeia.1, 300-301. Takahama H, Sasaki F & Watanabe K (1988) Morphological changes in the oral (buccopharyngeal) membrane in urodelan embryos: Development of the mouth opening. Journal of Morphology 195, 59-69. Taylor WR (1967) An enzymemethod of clearing and staining small vertebrates. Proceedings of The United State National Museum. 122, 1-17. Trapani J , Yamamoto Y and Stock DW (2005) Ontogenetic transition from unicuspid to multicustid oral dentition in a teleost fish Astyanax mexicanus, the Mexican tetra (Ostariophysi, Characidae). Zoological Journal of the Linnean Society. 145, 523-538. Tucker A & Sharpe P (2004). The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5, 499-508. Wacker K, Bartsch P, Clemen G (2001) The development of the toothed pattern and dentigerous bones in Polypterus senegalus (Cladistia, Actinopterygii). Annals of Anatomy. 183, 37-52. Wilde CEJr (1955) The urodele neuroepithelium: I. The differentiation in vitro of the cranial neural crest. Journal of Experimental Zoology 130, 573-591.

Použitá literatúra

52

Van der Brugghen W Janvier P (1993) Denticles in the thelodonts. Nature 364, 107. Van der heyden C &Huysseune A.(2000). Dynamics of tooth formation and replacement in the zebrafish (Danio rerio) (Teleostei, Cyprinidae). Developmental Dynamics. 219, 486–496. Vandewalle P,Focant B, Huriaux F, Chardom M (1992) Early development of cephalic skeleton of Barbus barbus (Teleostei, Cyprindae). Journal of Fish Biology. 41, 43-62. Vandewalle P,Parmentier É, & Chardon M (2000) The branchial skelet in teleost feeding. Cybium. 24(4), 319-342. Venkatesh B, Ning Y & Brenner S (1999) Late changes in spliceosomal introns define clades in vertebrate evolution Prceedings of National Academy of Sciences of The United States of America. 96, 10267-10271. Waterman RE & Kao R (1982) Formation of the mouth opening in the zebrafish embryo. Scanning Electron Microscopy. 3, 1249-1257. Westneat MW (2004) Evolution of levers and linkages in the feeding mechanisms of fishes. Integrative and Comparative Biology. 44, 378-389.

Prílohy

53

8. PRÍLOHY

8.1. Zoznam obrázkov

Prílohy

70

8.2. Č lánok Kralovic et al ., 2009, submitted to a special issue of Journal of Applied Ichthyology ; IF: 0,638 Mouth development in the Senegal bichir does not involve oropharyngeal membrane: possible implications for the ecto-endoderm boundary and tooth ini tiation Martin Kralovic, Ivan Horáček and Robert Cerny Department of Zoology, Charles University in Prague, Czech Republic; e-mail: cerny8@natur.cuni.cz Summary Polypterid fishes are considered the basal-most group of extant actinopterygians and thus may serve as a direct link to understanding the evolution of the first bony fishes. Their embryonic and larval material, however, is extremely scarce what makes it difficult to study their developmental patterns and processes. During past few years we collected many embryos and larvae of the bichir Polypterus senegalus and in this paper we will describe some novel observations concerning the supposed ecto-endoderm border in the mouth of the Senegal bichir and consecutive initiation of dental development. Mouth of the Senegal bichir does not develop throughout a classical oropharyngeal membrane but instead, opening the mouth occurs via a schizocoelic-like separation of the upper and lower jaws that are being connected by the epithelial bridges. These structures are bilaterally symmetrical and are found invariantly at places of the earliest tooth bud development. It is suggested here that the epithelial bridges, possibly representing the ecto-endoderm bordering zone, are both structurally and functionally homologous to oropharyngeal membrane and consequently it is hypothesize that the epithelial bridges and the developmental factors producing them play a key role in initiation and early distribution of the particular dental domains. Introduction The oral cavity of vertebrates is generally thought to arise as an ingrowth of the oral ectoderm called the stomodeum (Balinsky, 1975; Kardong, 1995; Liem et al., 2000). Between stomodeum and the lumen of the foregut alimentary canal, a transient barrier is formed, which is known as the oral, stomopharyngeal or buccopharyngeal membrane. It is generally believed that opening the mouth in vertebrates proceeds by thinning of this membrane, cell-intercalation and finally by breaking-through (Dickinson and Sive, 2006). It has been recognized, however, that after the rupture and disappearance of this membrane it is not possible to locate such ecto-endoderm border anymore (Soukup et al., 2008). The ecto-endoderm boundary zone, however, is often considered to play a serious role in dentition initiation and/or patterning (e.g., Smith and Coates, 2001; Smith 2003; Huysseune et al., 2009) what is consistent with the classical experiments in amphibian developmental biology showing that epithelia of both ectoderm and endoderm origin are

Prílohy

71

necessary tissues for the production of teeth (e.g., Sellman, 1946; Wilde, 1955; Graveson et al., 1997). Other piece of evidence, however, advocates that the cells of neural crest origin rather than epithelium constitute a major agent of dental development (Soukup et al., 2008). We decided to analyse early oral and dental morphogenesis of the Senegal bichir (Polypterus senegalus) with a special attention to the ecto-endoderm boundary and tooth initiation. Bichirs, as the basalmost lineage of Actinopterygian fishes (Noack et al., 1996; Kikugawa et al., 2004) possess the key position in vertebrate phylogeny and therefore they are uniquely well suited for assessing the ancestral states of Osteichthyes and Actinopterygii, as well as the divergence of developmental patterns between e.g., fishes and tetrapods (Takeuchi et al., 2009). Moreover, as the extant chondrichthyans (Neoselachii and Holocephali) are quite derived and their dental system is distant from the presumed primitive state (Carroll, 1988; Janvier, 1996), bichirs might be considered the most pertinent taxon for revealing the Gnathostome bauplan and its respective developmental dynamics. In this paper, we will briefly describe some novel observations concerning the supposed ecto-endoderm border in the mouth of the Senegal bichir and consecutive initiation of dental development. Materials and Methods Embryos of the Senegal bichir (Polypterus senegalus) were obtained from our breeding colony at Department of Zoology, Charles University in Prague. Embryos were anaesthetized in a solution of tricaine methane-sulfonate (MS-222, Sandoz) and fixed in 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate-buffered saline (PFA/PBS) at least overnight. After washing in PBS, specimens were dehydrated through a graded series of ethanol and embedded in JB4 (Polysciences, Inc.). Sections (5 µm) were cut with a Reichert-Jung microtome (Biocut 2035), stained with Azure B–Eosin (Serva) and mounted in DPX (Serva). Sections were investigated under Olympus BX 51 microscope with a SPOT camera and optimized in Adobe Photoshop software. In total, 28 bichir embryos at particular stages have been utilised for the purpose of this study. Since bichir staging tables (Kerr, 1907; Bartsch et al., 1997) are uncomplete and not detailed, we have prepared our own embryonic and larval staging system, which, however, will be comprehensively published elsewhere. Here, we will only briefly describe those stages utilized for this study. All our stages roughly correspond to Bartsch's yolk-sac larva (free embryonic stage, day 6) (Bartsch et al., 1997). The outer distinguishing characteristics for the stages utilised here are the following: Stage 1: total length (TL) between 5,5-6 mm; the mandibular arch is still not distinguishable from the ventral view. Stage 2: TL=6,5-7 mm; the first signs of the opercular fold; stage 3: TL=7-7,5 mm, lower jaws start to be anteriorly elongated, cement glands get reduced. Results & Discussions For the purpose of this study, 28 embryos of the Senegal bichir at particular stages have been thoroughly analysed on frontal, horizontal as well as on paramedial plastic sections (see Material and Methods). However, from the earliest stages investigated (embryonic period, pre-hatchling step of Bartsch et al., 1997), the mouth of the Senegal bichir was closed and no cavitation was observed (not shown). At stage 1 (Fig. 1A,B) the first, mandibular arch is already prominent, mouth epithelia are significantly budded and mesenchyme cells are oriented perpendicularly to the oral epithelia (Fig. 1A). Epithelia at these early embryonic stages are double-layered as a rule, however, just in the mouth, only the basal epithelial layers can be observed with no apical

Prílohy

72

layers distinguishable (Fig. 1B, asterisks). At the following stage the mandibular arch gets even more prominent and many more mesenchymal cells are observed to condense under oral epithelium (Fig. 1C). Inside the mouth, the zone in between basal layers of the oral epithelia gets more spaced and several small cavities can be seen (Fig. 1D; arrows). This process of the oral cavity opening by means of stretching the oral epithelia apart can be better observed on frontal sections (Fig. 2). At stage 2, in between the upper and lower parts of the mouth basal layer's epithelia, there are only few small cavities there (Fig. 2A; arrows). Soon later, however, when epithelia of the upper and lower parts of the mouth are separating more apart, the vacuities enlarge and the commisures interconnecting epithelial surfaces of the lower and upper jaws appear. We call these structures here the epithelial bridges (Fig. 2B; arrows). Finally, when mouth gets open (Fig. 2C), it is noticeable that the epithelial bridges are situated just at the positions of the earliest oral tooth buds (compare Fig. 2B and C; arrowheads). For example, at the particular stage 2-3, in total three epithelial bridges can be observed (Fig. 3). The first one, situated at the rostro-lateral edge of the mandibular arch (Fig. 3A), represents the area of future maxillary teeth (notice the budding tooth on the upper jaw; arrowhead). The second epithelial bridge, situated more posteriorly and medially (Fig. 3B) represents the area of future dentary tooth field (notice the budding dentary tooth epithelium on the lower jaw; arrowhead). On Fig. 3C, there are two epithelial bridges visible: the anterior one represents some remnants of the dentary epithelial bridge (compare Fig. 3B and C) and the third bridge represents prospective coronoid tooth area (arrowhead). Fig. 3D shows a section very close to the midline of the embryo where, at the posteriormost edge of the mandibular arch, the posterior part of the third epithelial bridge is seen (Fig. 3D; arrowhead). Just in the midline of the embryo, however, there is clearly a free entrance to the alimentary canal (60-80 µm thick; not shown). These epithelial bridges therefore clearly represent precisely bilateral characteristics, i.e. they are situated accurately at the identical positions on both sides of the embryo. During the process of mouth development in the Senegal bichir, no ectodermal ingrowth was observed that would develop into a classical stomodeum, as seen e.g., in frogs (Dickinson and Sive, 2006). Consequently, no clear oropharyngeal membrane arises that would represent a single ecto-endoderm border and opening the mouth therefore does not happen via breaking of a vertical membrane. Instead, from the earliest stages investigated, the upper and lower parts of the mouth are closely apposed. Later, during the process of mouth cavitation, several narrow epithelial columns develop that connect the upper and lower mouth parts, which are described here as the epithelial bridges. These bridges seem to be formed from the apical lining of the oral epithelium and during the process of mouth opening are protracting to finally tear across. It is of a great interest, however, that these epithelial bridges are invariantly positioned at places of the earliest tooth bud development (Fig. 3). As yet, we are unable to establish the germ layer origin of the oral epithelia for sure. The contextual topographic settings, however, suggest that oral epithelial linings derive from both the ectoderm (the anterior layer) and endoderm (the posterior layer). We therefore suggest that these epithelial bridges represent the ecto-entodermal boundaries that are structurally homologous to the classical oropharyngeal membrane. Instead of "rupture" of a single membrane, however, mouth opening in the bichir occurs by schizocoelic-like separation of the both mouth parts via fissure-like vacuities temporarily connected by the above reported epithelial bridges. We put forward a hypothesis here that the epithelial bridges and/or the developmental factors producing them play a key role in initial

Prílohy

73

topographic constitution of the particular dental domains (maxillary, dermopalatium, dentary and coronoid tooth fields). The process of early mouth formation described here for the Senegal bichir is quite different from the expected general vertebrate mode (e.g., Balinsky, 1975; Kardong, 1995; Dickinson and Sive, 2006). The bichir mouth development, however, resembles the developmental mode known from Urodele amphibians (e.g., Johnson, 1910; Adams, 1924; deBeer, 1947; Takahama et al., 1988). In the Mexican axolotl, for example, the oral ectoderm does not invaginate, but instead, only the basal layer of the oral ectoderm moves inwards to cover the surface of the mouth endoderm as the so called stomodeal collar. Opening the mouth then leads to the formation of epithelia, which consist of the ectodermal basal layer and the endodermal apical layer, however, intercalation of cells from different germ-layers was also observed (Soukup et al. 2008). Mouth formation via stomodeal collar also takes place in lungfishes, according to many authors (e.g., Kerr, 1902; Adams, 1924), In the South American lungfish Lepidosiren paradoxa, Kerr (1902) did not observe a true stomodeum, the epithelium of the oral cavity seemed to him to be formed from the endoderm layer and opening the mouth cavity appeared by a process of "degeneration and breaking down" of some anterior cells (Kerr 1902). It is, however, quite difficult to get a more detailed view on lungfish mouth development, simply because there are no such data available. Even more interestingly, in Ascaphus truei, a basal frog species with unusual ventrally placed sucker mouths, it was observed that there are some ectodermal bands running back along the gut wall from the mouth corners, what, together with a shallow stomodeum, clearly resembles a situation in Urodeles (Reiss, 1997). Moreover, a comparable morphodynamics was also observed during gill slits formation in carp pharynx (Edwards 1929). Here, during the opening of the branchial membranes the ectoderm lining spreads into the whole oropharyngeal cavity over the surface of the endoderm epithelium resulting in the formation of double-germ-layer epithelium with the apical ectoderm layer and basal endoderm layer, i.e. a reciprocal situation to the axolotl oral epithelium (Soukup et al. 2008). In any case, the mode of the earliest development of mouth cavity in the Senegal bichir differs from the situation in the other vertebrate taxa studied (e.g., Dickinson and Sive, 2006). The essential differences are as following: (i) mouth opening forms by a schizocoelic-like split of the epithelial layers forming simultaneously the epithelial bridges, (ii) there is a clear positioning effect of the bridges (i.e., the presumptive ectodem-endoderm bordering zone) to the eariest tooth buds that constitute the first elements of the respective tooth fields. At the moment we do not know which of the observed phenomena have something to do with true plesiomorphic conditions of the gnathostome dental development, however, in respect to the prominent phylogenetical position of bichir, even these preliminary data are undoubtedly worth of attention. Acknowledgements: We would like to thank organizers of the IAFSB meeting in Tavira for invitation and organizing of this meeting; we are grateful to Vladimir Soukup and David Jandzik for their comments on the manuscript. The research reported here was supported by MŠMT project 0021620828 and GACR 206/09/1007.

Prílohy

74

References: Adams, A.E., 1924: An experimental study of the development of the mouth in the amphibian embryo. The Journal of Experimental Zoology 40,311-379. Balinsky, B.I., 1975: An introduction to embryology. W.B. Saunders, Philadelphia, 4th Ed. Barlow, L.A.; Northcutt, R.G., 1995: Embryonic origin of amphibian taste buds. Developmental Biology 169,273-285. Bartsch, P.; Gemballa, S.; Piotrowski, T., 1997: The embryonic and larval development of Polypterus senegalus Cuvier, 1829: its staging with reference to external and skeletal features, behaviour and locomotory habits. Acta Zoologica 78,309-328. Carroll, R.L., 1988: Vertebrate paleontology and evolution. W.H. Freeman, New York. de Beer, G.R., 1947: The differentiation of neural crest cells into visceral cartilages and odontoblasts in Amblystoma, and a re-examination of the germ-layer theory. Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences 134,337-406. Dickinson, A.J.G.; Sive, H., 2006: Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Developmental Biology 295,700-713. Edwards, L.F., 1929: The origin of the pharyngeal teeth of the carp (Cyprinus carpio Linnæus). The Ohio Journal of Science 29,93-130. Graveson, A.C.; Smith, M.M.; Hall, B.K., 1997: Neural crest potential for tooth development in an urodele amphibian: developmental and evolutionary significance. Developmental Biology 188,34-42. Huysseune, A.; Van der heyden, C.; Verreijdt, L.; Wautier, K.; Van Damme, N., 2002: Fish dentitions as paradigms for odontogenic questions. Connective Tissue Research 43,98-102. Huysseune, A.; Sire, J-Y.; Witten, P.E., 2009: Evolutionary and developmental origins of the vertebrate dentition. Journal of Anatomy 214,465-476. Janvier, P., 1996: Early vertebrates. Oxford Univ. Press, Oxford. Johnston, J.B., 1910: The limit between ectoderm and endoderm in the mouth and the origin of taste buds in amphibians. American Journal of Anatomy 10,41-67. Kardong, K.V., 1995: Vertebrates. Comparative anatomy, function, evolution. Brown. Kerr, J.G., 1902: The development of Lepidosiren paradoxa III. Development of the skin and its derivatives. Quarterly Journal of Microscopical Science 46,418-459. Kerr, J.G., 1907: The development of Polypterus senegalus Cuv. by J. Graham Kerr, University of Glasgow. In: The work of John Samuel Budgett, Balfour Student of the University of Cambridge: Being a Collection of His Zoological Papers, together with a Biographical Sketch by A. E. Shipley, F.R.S., and Contributions by Richard Assheton, Edward J. Bles, Edward T. Browne, J. Herbert Budgett and J. Graham Kerr. J. G. Kerr (Ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 195-290.

Prílohy

75

Kikugawa, K.; Katoh, K.; Kuraku, S.; Sakurai, H.; Ishida, O.; Iwabe, N.; Miyata, T., 2004: Basal jawed vertebrate phylogeny inferred from multiple nuclear DNA-coded genes. BMC Biology 2,1-11. Liem, K.F.; Grande, L.; Bemis, W.E., 2000: Functional anatomy of the vertebrates: an evolutionary perspective. Thomson Brook, 3rd Ed. Noack, K.; Zardoya, R.; Meyer, A., 1996: The complete mitochondrial DNA sequence of the bichir (Polypterus ornatipinis), a basal ray-finned fish: Ancient establishment of the consensus vertebrate gene order. Genetics 144,1165-1180. Reiss, J.O., 1997: Early development of chondrocranium in the tailed frog Ascaphus truei (Amphibia: Anura): Implications for anuran palatoquadrate homologies. Journal of Morphology 231,63-100. Sellman, S., 1946: Some experiments on the determination of the larval tooth in Amblystoma mexicanum. Odont Tidskr 54,1-128. Smith, M.M.; Coates, M.I., 2001: The evolution of vertebrate dentitions: phylogenetic pattern and developmental models. In: Major Events in Early Vertebrate Evolution (Paleontology, Phylogeny, Genetics and Development). P.E. Ahlberg (Ed.). Taylor and Francis, London and New York, pp. 223-240. Smith, M.M., 2003: Vertebrate dentitions and the origin of jaws: when and how pattern evolved. Evolution and Development 5,394-413. Soukup, V.; Epperlein, H.H.; Horácek, I.; Cerny, R., 2008: Dual epithelial origin of vertebrate oral teeth. Nature 455,795-798. Takahama, H.; Sasaki, F.; Watanabe, K., 1988: Morphological changes in the oral (buccopharyngeal) membrane in Urodelan embryos: development of the mouth opening. Journal of Morphology 195,59-69. Takeuchi, M.; Okabe, M.; Aizawa, S., 2009: The genus Polypterus (Bichirs). A fish group diverged at the stem of Ray-finned fishes (Actinopterygii). In: Emerging model organisms: A laboratory manual Vol. 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 447-467. Wilde, C.E., 1955: The urodele neuroepithelium: I. The differentiation in vitro of the cranial neural crest. Journal of Experimental Zoology 130,573-591. Figure description: Fig. 1: The earliest stages of mouth opening in the Senegal bichir, as seen on paramedial sections, head to the left, at stages 1 (A+B) and 2 (B+C). Asterisks (B) indicate non-distinguishable apical epithelial layers in the mouth. Arrows (D) indicate developing cavities in between the upper and lower mouth parts. e, eye; ot, otic; og, outer gills; cg, cement gland; y, yolk; mes, mesenchyme; epi, epithelium. Fig. 2: Mouth cavitation and epithelial bridges as seen at stages 2 (A), 2-3 (B) and 3 (C). Frontal sections, the right sides of sections are shown only. Arrows (A) indicate developing cavities in the mouth, arrows (B) point to protracting epithelial bridges.

Prílohy

76

Arrowheads (B, C) point to developing tooth buds. cg, cement gland; mes, mesenchyme; epi, epithelium; max. t.b., maxillary tooth bud; den. t.b., dentary tooth buds. Fig. 3: Relative topography of the epithelial bridges and tooth initiation as seen on paramedial sections taken from one particular specimen at stage 2-3, head to the left. The sectiones are ordered from the most lateral (A) to the most medial (D). m.a., mandibular arch; h.a., hyoind arch; y, yolk; cg, cement gland; ahy, adenohypophysis; max.t.b., maxillary tooth bud; den.t.b., dentary tooth buds; dpt. t.b., dentary tooth bud; cor. t.b., coronoid tooth bud.