7/31/2019 Proteoma Mitocondrial de saccharomyces cerevisiae

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Proteoma mitocondrial de

Saccharomyces cerevisiae

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PNAS, 23: 13207-13212 (2003)

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Orgnulos celulares presentes en casi todas las clulaseucariotas.

La mitocondria desempea un papel principal en mltiplesfunciones celulares:

Bioenergtica

Apoptosis

Metabolismo de cidos grasos, lpidos, hierro

Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales.

El conocimiento de las funciones fisiolgicas de la mitocondria

es limitado, y muchas enfermedades mitocondriales no puedenser analizadas a nivel molecular.

Mitocondria

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Mitocondria

IM - membrana interna

IMS- espacio intermembrana

OM- membrana externa

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Hongo ascomiceto unicelular que se utiliza ampliamente en laelaboracin de vino, cerveza, pan y otros alimentos.

Muchos genes humanos implicados en enfermedades tienenhomlogos en levaduras.

Excelente accesibilidad de las levaduras al anlisis gentico ybioqumico.

Principal organismo modelo para la identificacin ycaracterizacin de funciones proteicas y rutas celulares eneucariotas.

Primer genoma eucariota completamente secuenciado: 12 Mb,organizado en 16 cromosomas.

Saccharomyces cerevisiae

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Saccharomyces cerevisiae

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=6251374&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=1574125&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8196765&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8091229&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=7813418&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=7731988&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=7670463&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=7654346&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8641269&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8849441&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169872&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169871&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169873&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169870&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169874&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169869&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169868&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169867&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9169875&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9872396&dopt=Abstract

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Identificacin de protenas mitocondrialesde S. cerevisiae

El anlisis del proteoma mitocondrial proporcionar unaimportante base de datos para:

Anlisis de funciones asociadas a la mitocondria

Anlisis de nuevas funciones mitocondriales

Caracterizacin de enfermedades mitocondriales

Objetivo

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Aislamiento de mitocondrias a partir de lisados celulares deS. cerevisiaemediante:

Centrifugacin diferencial

Dos gradientes de sacarosa consecutivos

Utilizacin de cuatro mtodos de separacin de protenas en

paralelo, para minimizar el problema de que una fraccinsignificativa de protenas pueda escapar a la deteccin:

1D-PAGE

2D-PAGE Digestin con 4 proteasas seguida de

cromatografa lquida multidimensional(MDLC, multidimensional liquid cromatography)

Generacin de fracciones asociadas a mitocondriasmediante tratamiento con sales o tripsina.

Purificacin de mitocondrias

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Mitocondrias purificadas:

a. 2D-PAGE y MALDI-TOF-MS o n-LC-MS/MS (nano liquidchromatography-MS/MS).

b. Cromatografa lquida multidimensional y ESI-MS.

c. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.

Fracciones asociadas a mitocondrias generadas mediantetratamiento con sales o tripsina:

a. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.

b. 1D-HPLC y n-LC-MS/MS.

En total, se obtuvieron de ms de 20 millones de espectros demasas que se analizaron posteriormente en las bases de datos.

Separacin de protenas y anlisis MS

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Separacin de protenas y anlisis MS

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Busqueda automtica en la base de datos completa de S. cerevisiaeutilizando el algoritmo SEQUEST.

Identificacin de un total de 750 protenas mitocondriales diferentesen S. cerevisiae (aprox. 90% del total): indica la implicacin de lamitocondria en mltiples procesos celulares.

Anlisis con el programa MitoProt: prediccin de una presecuenciamitocondrial clsica en 320 protenas (43%).

Anlisis con el programa TMHMM: prediccin de al menos un

segmento -hlice transmembrana en 255 protenas (34%).

Separacin de protenas y anlisis MS

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Separacin de protenas y anlisis MS

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Mediante 2D-PAGE se identificaron 209 spots, que permitieron laidentificacin de 109 protenas diferentes: 13 protenas tenanfuncin desconocida.

De las 750 proteinas mitocondriales identificadas:

436 protenas (58%) mitocondriales conocidas

208 protenas de funcin desconocida 106 protenas previamente descritas como localizadas en

otros compartimentos celulares.

Se ha descrito una localizacin doble (mitocondria y otrocompartimento celular) para al menos 30 protenas mitocondrialesconocidas.

Separacin de protenas y anlisis MS

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Identificacin de todas las subunidades conocidas del complejopiruvato deshidrogenasa.

Identificacin de los complejos de la membrana interna de lamaquinaria de fosforilacin oxidativa.

El estudio no est sesgado hacia protenas de membrana.

Tampoco est sesgado hacia protenas pequeas o grandes:distribucin de los MWs de las protenas identificadas.

Las protenas mitocondriales identificadas representan aprox. el92% de las proteinas mitocondriales conocidas de S. cerevisiaeen

la base de datos MITOP.

Cobertura del proteoma

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Difcil identificar el 100% de las protenas de un organulo celularmediante un anlisis protemico.

Algunas protenas slo se expresan en condiciones de crecimientoparticulares, por lo que no existe una nica condicin decrecimiento en la que se expresen todas la protenas

simultaneamente.

Adems, algunas protenas escapan a la deteccin mediante losmtodos de separacin e identificacin disponibles.

La identificacin de protenas mitocondriales en S. cerevisiaemediante la combinacin de mltiples aproximaciones est

prxima a la saturacin.

Cobertura del proteoma

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Ms de 650 protenas mitocondriales identificadas con losprimeros 5 millones de espectros.

La mayor parte de las protenas restantes identificadas en los

siguientes 10 millones de espectros.

Cobertura del proteoma

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En base a las funciones conocidas o predichas de las proteinasmitocondriales, diferentes clases funcionales:

Slo un 14% de las protenas actuan directamente en elmetabolismo energtico:

Maquinaria de fosforilacin oxidativa

Ciclo del cido tricarboxlico Piruvato deshidrogenasa

Un 25% de las protenas implicadas en el mantenimiento yla expresin del genoma mitocondrial.

El 25% de la protenas identificadas tiene una funcin

desconocida.

Clasificacin funcional

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Clasificacin funcional

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La base de datos del proteoma mitocondrial de S. cerevisiaerepresenta una fuente global para estudios de:

Caracterizacin de nuevas funcionesmitocondriales.

Caracterizacin de nuevas funciones asociadas a

la mitocondria. Rutas de sealizacin.

Sistemas proteolticos.

Identificacin molecular de las bases de lasenfermedades mitocondriales.

Perspectivas

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