1/18/2010

1

PROTEINI

Prof dr Ivan Stankovi

PROTEINI proteos - prvi, najvaniji prisutni u svim ivim organizmima od virusa do biljaka i

ivotinja ulaze u sastav svake elije: protoplazama, jedro

(nukleoproteini) uloga u organizmu: gradivna (primarna funkcija) kontraktilna (miogen) katalitika (enzimi) regulatorna (hormoni) transportna (hemoglobin) imunoloka (antitela) energetska (17.2 kJ/g)

1/18/2010

2

elementarni sasatav: C, O, H, N, S, (P)

hemijska definicija: Proteini su makromolekulska jedinjenja izgraena od

polipeptidnih lanaca koji se sastoje iz -L-aminokiselinapovezanih peptidnom vezom.

Proteini omoguavaju rast i regeneraciju organizma, kao i pravilan tok metabolikih procesa.

Ljudski organizam moe da izgrauje sopstvene proteine iz proteina hrane, odnosno aminokiselina.

Telesni sastav mukarca (25 god., 70kg) i ene (25 god., 58kg)pol mukarac ena

telesni sastav kg % kg %

proteini 11.90 17.0 4.93 8.5

masti 9.45 13.5 12.76 22.0

ugljeni hidrati 1.05 1.5 0.87 1.5

voda 43.4 62.0 35.96 62

mineralne mat. 4.20 6.0 3.48 6.0

ukupno 70.0 100 58 100

1/18/2010

3

Distribucija proteina u organizmu (% ukupnih telesnih proteona)tkivo %

krv 10

masno tkivo 3-4

koa 9-9.5

kosti 18-19

miii 46-47

Preporuen dnevni unos (RDA) proteina za razliite starosne grupe i posebna stanja

starost (godine)ili stanje

RDA(g proteina/dan)

0.0-0.5 telesna masa (kg) x 2.20.5-1 telesna masa (kg) x 2.01-3 234-6 30

7-10 3411-14, mukarci 45

15-51+, mukarci (70kg) 5611-18, ene 46

19-51+, ene (55 kg) 44graviditet +30laktacija +20

1/18/2010

4

individualni faktori:1. veliina tela vilje i krupnije osobe imaju vee potrebe2. starost za vreme rasta potrebe su 2-3 puta vee po jedinici telesne mase3. pol mukarci imaju vee potrebe po jedinici mase jer imaju razvijeniju

muskulaturu4. nutricioni status pothranjene osobe i osobe na dijeti sa niskim sadrajem ugljenih

hidrata imaju vee potebe5. Graviditet i laktacija vee potrebe za razvoj fetusa i sintezu proteina mleka6. klima pri niskim temperaturama nije potreban povean unos proteina

ukoliko se energija obezbeuje iz ugljenih hidrata. pri visokim temperaturama potrebno je malo poveati unos proteina

zbog poveanog gubitka azota tanspiracijom

7. fizika aktivnost osobe koje treniraju ili se oporavlju posle mirovanja imaju vee potrebe8. dijetarne komponente ishrane osobe koje unose proteine niske bioloke vrednosti moraju da ih unose u

veoj koliini vaan je i odnos ugljenih hidrata i proteina u hrani jer ugljeni hidrati tede

proteine

9. emocionalna stabilnost pokazano je da stresna stanja dovode do izluivanja vee koliine azota i

promena u hormonskom profilu

10. bolesti uglavnom poveavaju potrebu za proteinima zbog regeneracije tkiva,

poveanog bazalnog metabolizma kod hipertermije, poveane siteze antitela, perspiracije

1/18/2010

5

Sadraj proteina u namirnicama

namirnica sadraj (%)meso 18-20

ribe 18-20

jaja 12.5mleko 3.5

itarice 10-12

suve leguminoze 25-37

svee povre 1-3

svee voe oko 1

masno voe (lenik, orah, badem i dr.) 15-50

KLASIFIKACIJA PROTEINA (po Osborn-u):A. Prosti proteini (homoproteini) sastoje se iskljuivo od

aminokiselina:

1. albumini rastvorljivi u vodi i razblaenim rastvorima soli taloe se u zasienom rastvoru amonijumsulfata koaguliu na toploti siromani su u glikokolu rasprostranjeni su u biljnom i ivotinjskom svetu.

2. globulini nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u razblaenim rastvorima soli koaguliu na toploti taloe se dodatkom zasienog rastvora amonijumsulfata

(poluzasienje), kao i uklanjanjem soli iz rastvora (dijaliza) nalaze se u krvi, belancu jajeta, mleku i dr.

1/18/2010

6

3. prolamini rastvorljivi u 70-80% etanolu, nerastvorljivi u vodi, razblaenim

rastvorima soli, neutralnim rastvaraima i apsolutnom etanolu. imaju visok sadraj glutaminske kiseline i prolina, a siromani su u

lizinu - spadaju u delimino nepotpune proteine nalaze se u zrnu itarica gde sa glutelinima ine gluten koji sa

vodom gradi lepak koji omoguava tehnoloku obradu testa ipecivost: glijadin (penica), sekalin (ra), hordein (jeam), avenin(ovas), zein (kukuruz) i rizin (pirina)

4. glutelini nerastvorljivi u vodi i razblaenim rastvorima soli, rastvorljivi u

razblaenim rastvorima kiselina i alkalija nalaze se u itaricama: glutenin (penica). Sa prolaminima ine

glutensku proteinsku frakciju koja sa vodom gradi lepak

5. globini prosti proteini koji se jedine sa pigmentima (hem) i daju

hromoproteine (hemoglobin, mioglobin i dr.) sadre histidin u veoj koliini pH oko 7

6. skleroproteini (albuminoidi) nerastvorljivi, ivotinjskog porekla po fizikim i hemijskim osobinama dele se u tri grupe:

a) keratini rastvorni u koncentrovanim rastvorima kiselina i baza uz zagrevanje,

ali i uz razlaganje i u sulfidima alkalnih i zemnoalkalnih metala. svi vrsti keratini imaju aminokiseline histidin, lizin i arginin u

odnosu: 1:4:12 glavni sastojci egzoskeletnih struktura: koa, kosa, nokti, rogovi,

perje

1/18/2010

7

b) kolageni imaju oblik dugakih, delimino kristalnih vlakana sastojci vezivnog tkiva, kostiju, ila, hrskavice kuvanjem se rastvaraju, pri emu se hidrolizom oslobaa jedan deo

aminokiselina i nastaje elatin koji hlaenjem rastvora prelazi u gelkoji se lako vari i dobro iskoriava

elatin spada u nepotpune proteine Karakteristine aminokiseline: hidroksiprolin i hidroksilizin

c) elastini razlikuju se od kolagena po tome to kuvanjem ne daju elatin sastojci utih elastinih vlakana vezivnog tkiva

7. histoni rastvorljivi u vodi, razblaenim kiselinama i alkalijama, a nerastvorni

u razblaenom rastvoru amonijumhidroksida toplota ih ne koagulie bogati su u argininu alkalni proteini, obino se nalaze u obliku soli sa kiselim jedinjenjima

(npr. nukleinskim kiselinama) ima ih u ikri riba

8. protamini slino se rastvaraju kao histoni s tim to se rastvaraju i u amonijum

hidroksidu male molekulske mase (peptidi) toplota ih ne koagulie bogati su u argininu alkalni proteini, obino se nalaze u obliku soli (nukleoproteini) taloe druge proteine iz rastvora ima ih u ikri riba: salmin (ikra lososa)

1/18/2010

8

B. Sloeni proteini (heteroproteini) sastoje se, pored aminokiselina i izneproteinskog dela (prostetine grupe):

1. fosfoproteini sadre fosfornu kiselinu najee vezanu za aminokiselinu serin

kazein (mleko), vitelin, vitelenin i fosfitin (umance jajeta) kazein se u mleku nalazi kao so Ca-kazeinat. Taloi se

zakieljavanjem mleka do njegove izoelektrine take (pH 4.6)

P

HO

HOO

O

CH2 CH COOH

NH2

fosfoserin

Ca-kazeinat + 2H+ kazein + Ca2+

Dejstvom enzima renina iz sirila (ekstrakt sluzokoe goveegeludca) na mleko taloi se Ca-parakazeinat, proizvod degradacijeCa-kazeinata:

2. glikoproteini satoje se iz proteina i heksoza ili heksozamina teko hidrolizuju mukoidi (ovomukoid belanceta) i mukoproteini (hondro-mukoprotein

hrskavice)

3. lipoproteini kompleksi proteina sa lipidima znaajni za transport lipida lipovitelin, lipovitelenin

Ca-kazeinat Ca-parakazeinat + peptidrenin

1/18/2010

9

4. nukleoproteini sastoje se iz alkalnih proteina protamina i histona i RNA i DNA nalaze se u ikri riba, kvascu, klici itarica

5. hromoproteini sastoje se iz prostih proteina npr. globina i neke obojene supstance

(prostetina grupa) hemoglobin, mioglobin, citohromi, flavoproteini, hlorofil, rodopsin,

karotenoproteini

Proteinski sastav nekih namirnicanamirnica proteini Vrsta % u namirnici

meso miogenmioalbumin

miozinaktin

mioglobinostali

albuminalbuminglobulinglobulin

hromoprotein....

ukupno

2.01.2

10.44.20.22.0

20.0

mleko kazeinlaktoalbuminlaktoglobulin

fosfoproteinalbuminglobulinukupno

2.70.20.43.3

jaje ovoalbuminlizozim

ovoglobulinovomukoid

vitelinfosfitinostali

albuminglobulinglobulin

glikoproteinfosfoproteinfosfoproteinlipoproteini

ukupno

6.10.40.40.55.10.40.5

13.4

1/18/2010

10

namirnica proteini vrsta % u namirnicipasulj fazeolin

fazelinostali

globulinglobulin

....

ukupno

20.52.01.0

23.5graak legumilin

leguminvicilin

proteozeostali

albuminglobulinglobulinproteoze

....

ukupno

2.010.010.01.01.5

24.5penino brano glijadin

gluteninglobulinleukozinproteoze

ostali

prolaminglutelinglobulinalbuminproteoze

....

ukupno

3.94.20.60.40.41.1

10.6kukuruzno brano zein

zeaninmajsinglobulinproteoze

ostali

prolaminglutelinalbuminglobulinproteoze

.....

ukupno

3.03.20.50.60.42.39.0

Podela proteina prema obliku molekule:

1. globularni odnos duina-irina molekule manji od 10 kompaktno izuvijani polopeptidni lanci insulin, albumini, globulini, enzimi

2. fibrilarni odnos duina-irina molekule vei od 10 dugaki polipeptidni lanci uvrnuti u spiralu popreno

povezani disulfidnim ili vodoninim vezama keratin, kolagen, miozin

1/18/2010

11

AMINOKISELINE aminokiseline su jedinjenja koja sadre najmanje jednu amino i

jednu karboksilnu grupu (prolin i hidroksiprolin sadre imino grupukoja takoe gradi peptidnu vezu)

sve aminokiseline koje ulaze u satav proteina su -amino-kiseline imogu da se prikau formulom:

sve aminokiseline biljnih i ivotinjskih proteina su L-konfiguracije kapsule nekih bakterija izgraene su od D-aminokiselina, pa poto

digestivni sokovi ne mogu da ih hidrolizuju, one prolaze prekodigestivnog trakta u organizam.

zbog hiralnog C atoma aminokiseline su optiki aktivne i mogu dabudu dekstrogirne (+) ili levogirne (-)

R CH COOH

NH2

-L-AMINOKISELINE PROTEINA1. a l ifa t i~ne monoamino-monok arbosk e k ise l ine :

gl ikokol i l i gl ic in, G ly -a minos ir} e tna k is e l ina

a la nin, Ala -a minopropionsk a k ise l ina

va l in, V a l -a minoiz ov a le ri ja nsk a k ise l ina

le uc in, Le u -a minoiz ok apronsk a k is e l ina

iz ole uc in, I le -a mino- -me t il - -e t ilpropions ka k is e l ina

se rin, S e r -a mino- -hidrok s ipropions ka k is e l ina

t reonin, T hr -a mino- -hidrok s ibute rna k ise l ina

CH2 COOH

NH2

CH COOH

NH2

CH3

CH COOH

NH2

CHCH3

CH3

CH COOH

NH2

CH2CHCH3

CH3

CH COOH

NH2

CH2CHCH3

C2H5

CH COOH

NH2

CH2

OH

CH COOH

NH2

CH

OH

CH3

1/18/2010

12

2. monoamino-dika rbons ke k ise l ine:

as para gins ka k ise l ina , As p - amino} i l ibarna k ise l ina

as para gin, As namid a s pa ra gins ke k ise l ine

gluta minsk a k is e l ina , G lu - aminogluta rna k ise l ina

gluta min, G lnamid glutamins k e k is e l ine

3. dia mino-monoka rbons ke k ise l ine

l iz in, Ly s ,,,, -dia minoka prons ka k ise l ina

arginin, Arg - amino- -gv anidinov ale ri jans ka k is e l ina

his t idin, H is - amino- - imidaz ol i lpropionsk a k is e l ina

CH COOH

NH2

CH2CH2HOOC

CH COOH

NH2

CH2CH2CH2CH2

NH2

CH COOH

NH2

CH2CH2CH2NH

C NH

NH2

CH COOH

NH2

CH2

HN N

CH COOH

NH2

CH2HOOC

CH COOH

NH2

CH2H2NOC

CH COOH

NH2

CH2CH2H2NOC

4 . a minok is e l ine s a sumporom:

c is te in, Cy s -a mino- - t iopropionska k ise l ina

c is t indi- ( - amino- - t iopropionska k ise l ina )

met ionin, M e t -a mino- -me t i l t iobute rna k is e l ina

5 . a roma t i~ne a minok is e l ine

f e ni la la nin, P he -a mino- - f eni lpropionska k ise l ina

t iroz in, T yr -a mino- -p-hidroks i fe ni lpropions ka k ise l ina

6 . he teroc ik l i~ne aminok ise l ine

t riptofan, T rp -a mino- - indol i lpropions kak ise l ina

prol in, P ropirol idin-2 -karbonsk a k ise l ina

hidrok s iprol in, Hpr4 -hidrok s ipirol idin-2 -k arbonska k ise l ina

CH COOH

NH2

CH2CH

S CH3

CH COOH

NH2

CH2

SH

CH COOH

NH2

CH2

SS

CH2CHHOOC

NH

CH2 CH COOH

NH2

NHCOOH

NHCOOH

HO

CH2

NH2

COOHCH

CH2

NH2

COOHCH

OH

1/18/2010

13

Osobine aminokiselina ne zavise samo od NH2 i COOH grupe ve i od R koji moe da bude:- H (glicin)- alifatini ugljovodonini niz (alanin, valin, leucin, izoleucin)- alkohol (serin, treonin)- tiol (cistein)- tioetar (metionin)- fenol (tirozin)- heterociklus (histidin, triptofan)- organska kiselina (asparaginska kiselina, gltaminska kiselina)- amid organske kiseline (asparagin, glutamin)- alifatini amin (lizin)- derivat gvanidina (arginin)- umesto slobodne amino grupe mogu da imaju imino grupu u sastavupirolidinskog prstena: prolin, hidroksiprolin

Aminokiselina treonin ima dva C* atoma, pa ima etiri stereoizomera:

Prema mogunosti sinteze u organizmu aminokiseline se dele na:1. esencijalne - u organizmu ne mogu da se sintetiu i moraju da se unose hranom2. poluesencijalne - pod odreenim uslovima mogu da zameneesencijalne aminokiseline, neophodne su u deijem uzrastu3. neesencijalne - organizam ih sintetie

CH3

COOHNH2

OHHH

CH3

COOHH

HOHNH2

CH3

COOHNH2

HOHH

CH3

COOHNH2

HOHH

L-treonin D-treonin L-alotreonin D-alotreonin

(enantiomeri) (enantiomeri)

1/18/2010

14

esencijalne aminokiseline

poluesencijalne aminokiseline

neesencijalne aminokiseline

metionin arginin alaninvalin histidin asparaginfenilalanin asparaginska kiselina

treonin cistein

triptofan cistin

izoleucin glutamin

leucin glutaminska kiselina

lizin glicin

prolin

serin

tirozin

FIZIKE OSOBINE AMINOKISELINA jedinjenja male molekulske mase 75-240 imaju visoku taku topljenja iznad 200oC, a neke i iznad

300oC, pri emu se zagrevanjem na visokimtemperaturama esto i raspadaju

rastvorljivost u vodi je razliita i zavisi od njihoveizoelektrine take i polarnosti radikala

optiki aktivne (+) i (-) zbog hiralnog C atoma veina aminokiselina je slatkog ukusa, leucin je bez

ukusa, a arginin i izoleucin su gorki. Glutaminska kiselinai njene soli su prijatnog ukusa i koriste se kao pojaivaiaroma.

1/18/2010

15

HEMIJSKE OSOBINE AMINOKISELINA

I Amfoternost aminokiselina kisela (karboksilna) i bazna (amino) grupa u molekuli

aminokiselina odgovorne su za njihovo ponaanje kao organskih kiselina i baza

prema Bronsted-u kiselina je svako jedinjenje koje moe da poslui kao donor, a baza je svako jedinjenje koje moe da bude akceptor protona.

aminokiseline sadre kiselu karboksilnu grupu koja moe da otputa proton i baznu amino grupu koja moe da ga primi.

otputanjem protona anjonski oblik aminokiseline stieodlike baze jer moe da primi natrag proton, a isto tako,primanjem protona u amino grupu katjonski oblikaminokiseline stie odlike kiseline jer taj proton moe daotpusti.

H2N-CHR-COOH H2N-CHR-COO- + H+kiselina

H2N-CHR-COO- + H+ H2N-CHR-COOH baza

H2N-CHR-COOH + H+ +H3N-CHR-COOH baza

+H3N-CHR-COOH H2N-CHR-COOH + H+kiselina

1/18/2010

16

U kristalnom stanju monoamino monokarbonske kiselineimaju oblik dvopolnog, hibridnog jona - zwitter jon

+H3N-CHR-COOH +H3N-CHR-COO- H2N-CHR-COO-

H2N-CHR-COOH(pH < pI) (pH = pI) (pH > pI)

zwitter jon je oblik koji sadri isti broj pozitivnog inegativnog naelektrisanja, a dipolnost molekule jeizraena samo unutranjim premetanjem protona

zwitter jon se ne kree u elektrinom polju i taloi se izrastvora. Ima odlike slabe kiseline zbog jae kiselostikarboksilne grupe (Ka = 1.6x10-9)

nejonizovani oblik se nalazi samo u tragovima, dokjonizacija zavisi od pH rastvora.

dodatkom kiseline u vodeni rastvor aminokiseline suzbijase disocijacija NH3+ grupe zwitter jona i pomera seravnotea u smeru stvaranja katjonskog oblikaaminokiseline:

+H3N-CHR-COO- + HCl +H3N-CHR-COOH + Cl-

dodatkom baze oslobaa se H+ jon iz NH3+ grupe iravnotea se pomera u pravcu nastajanja anjonskogoblika aminokiseline:

+H3N-CHR-COO- + NaOH H2N-CHR-COO- + Na+ + H2O

1/18/2010

17

ako se aminokiseline rastvore u istoj vodi vrednosti zaizoelektrini i izojonski pH e se podudarati. Meutim,poto su aminokiseline slabo rastvorljive naizoelektrinom pH, moraju da se rastvaraju u prisustvurazliitih pufera (soli), gde e usled reakcije sa jonima izpufera da nastane razlika izmeu izojonskog iizoelektrinog pH.

kod peptida i proteina koji sadre slobodne amino ikarboksilne grupe (iz bonih nizova i terminalnihaminokiselina) uticaj prisustva soli na razliku izmeuizojonskog i izoelektrinog pH je daleko izraeniji npr. u0.15 M NaCl izojonska taka goveeg albumina je na pH5,37, a izoelektrina taka je na pH 4,40

Zbog toga postoje teoretske i eksperimentalne definicijeizojonske i izoelektrine vrednosti pH:

a) teoretske (neoperativne): izojonski pH je ona vrednost pH pri kojoj je broj protona

koje supstanca (aminokiselina, peptid ili preotein) otpusti uvodeni rastvor jednaka broju protona koje iz rastvoraprima

izoelektrini pH je ona vrednost pH pri kojoj je ukupanelektrini naboj supstance jednak nuli

b) eksperimentalne (operativne): izojonska taka je vrednost pH koju daje rastvor iste

supstance u istoj vodi izoelektrina taka je vrednost pH pufera definisanog

sasatava pri kojoj supstanca ne migrira u elektrinom polju

1/18/2010

18

izoelektrini pH aminokiselina: neutralne: 4.8-6.3 kisele: 2.7-3.2 bazne: 7.8-10.8

poznavanje vrednosti izoelektrinog pH proteina jeznaajno za njihovo odvajanje taloenjem ielektroforetskim tehnikama.

II Reakcije amino grupe1. graenje soli bazni karakter amino grupe omoguava graenje soli sa

drugim kiselinama: pikrati lizina i hidroksilizina, flavinatilizina, histidina i arginina i.t.d.

2. alkilovanje dobijaju se N-mono, -di i -tri alkil (metil, etil) derivati. eksperimentalno se ove reakcije teko kontroliu zbog

mogunosti supstitucije alkil radikalima i vodonikovihatoma van amino grupa

1/18/2010

19

3. arilovanje dinitro fenil derivati (DNP) aminokiselina se koriste za

identifikaciju N-terminalnih aminokiselina peptida u tokuodreivanja sekvence aminokiselina proteina

F

NO2

NO2

+ COOHCH

R

H2N

NO2

NO2

NH

CHCOOH

R

-HF

N-aril sulfonil derivati se esto koriste za identifikaciju N-terminalnih aminokiselina. Hidrolizom peptidnih veza izdvajaju se aminokiseline od kojih je samo N-terminalna supstituisana

J

SO2Cl

+ CO NHCH

R

H2N

CHCO

R'

J

SO2 NHCH

R

CO NH

CH

R'

CO

-HCl

1/18/2010

20

4. dezaminacija dejstvom HNO2 u prisustvu NaNO3 nastaju hidroksi

aminokiseline uz oslobaanje azota.R CH COOH

NH2

+ HONO + N2 + H2ONaNO3 R CH COOH

OH

reakcija je kvantitativna i predstavlja osnovu Van Slyke-ove metode odreivanja azota -amino grupaaminokiselina, peptida i proteina

oksidativnom dezaminacijom pod dejstvom oksidacionihsredstava kao to su KMnO4, H2O2 ili u tkivimakatalitikim dejstvom enzima dehidrogenaza nastajuprvo -iminokiseline, a zatim -ketokiseline uzoslobaanje amonijaka

R CH COOH

NH2

R C COOH

NHdehidrogenaza -NH3

R C COOH

O

III reakcije karboksilne grupe1. Sorensen-ova formol titracija Aminokiseline ne mogu da se u vodenom rastvoru

direktno titriraju bazom jer zwitter jon sporo reaguje, adodata baza trenutno utie na promenu boje indikatora.Formaldehid dodat rastvoru aminokiselina u velikomviku vezuje se za aminogrupu i spreava vezivanjeprotona iz karboksilne grupe. Tada aminokiselina moeda se titrira bazom uz indikator na uobiajen nain.

CH COO-+H3N

R

+ 2HCHO CH COOHN

RHOH2C

HOH2C

ova reakcija se primenjuje za odreivanje proteina u mleku

1/18/2010

21

2. estri aminokiselina

dejstvom alkohola na aminokiseline u prisustvu HCl,nastaju estri hidrohlorida amino kiselina iz kojih dejstvomrazblaenih alkalija, nastaju estri aminokiselina:

H2N CH COOH

R

+ HO R' HCl NaOH

ClH3N CH COOR'

R

-H2O -NaCl-H2O

H2N CH COOR'

R

estri aminokiselina se koriste za sintezu dipeptida prekodiketo-piperazina.

Hidrolizom jedne peptidne veze diketopiperazinapomou HCl nastaje smesa dva izomerna peptida:

H2N CH COOC2H5

CH3

H2N CH COOC2H5

CH2OH

HOH

CH CONH

CH3

CH

CH2OH

CONH

H2N CH CONH

CH3 CH2OH

COOHCH H2N CH CONH

CH2OH

CH

CH3

COOH

diketopiperazin

alanilserin serilalanin

1/18/2010

22

3. hloridi aminokiselina dobijaju se dejstvom fosfopentahlorida na aminokiselinuija je amino grupa prethodno zatiena (acetil ilikarbobenzoksi grupom):

CHCH3CONH COOH

R

+ PCl5 CHCH3CONH

R

COCl + POCl3 + HCl

CHCH3CONH

R

COCl + HCl CHClN3H

R

COCl

hlorid hidrohloridaaminokiseline

ako se za zatitu aminogrupe upotrebikarbobenzoksihlorid pri hloriranju sa fosfopentahloridomdobie se karbobenzoksihlorid aminokiseline koji sekoristi za sintezu polipeptida.

4. dekarboksilacija aminokiselina

dekarboksilacijom aminokiselina, pri zagrevanjuu prisustvu barijumhidroksida, ili u tkivima uprisustvu enzima karboksilaze aminokiselina,nastaju amini sa jednim C atomom manje:

HN N

CH2-CH(NH2)-COOH -CO2

N N

CH2-CH2-NH2

histidin histamin

H

1/18/2010

23

5. stvaranje helata joni metala: Cd2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Co2+ i dr. sa

aminokiselinama obrazuju koordinativne komplekse -helate.

pored karboksilne grupe u stvaranju helata uestvuju idruge grupe (NH2, SH).

glikokol sa Cu2+ jonom gradi kompleksno jedinjenje kodkoga je Cu2+ jon vezan za karboksilne grupe kovalentnim,a za amino grupe koordinativnim vezama:

CH2H2N C

O

OH

CH2H2N C

O

OH

CH2H2N C

O

OCu

O

OCH2N

CH2

Cu2+

IV reakcije funkcionalnih grupa sa sumporom

funkcionalne grupe sa sumporom sadre : cistein - tiolska (sulfhidrilna) grupa (-SH) cistin - disulfidna grupa (-S-S-) metionin - metilovana tiolska grupa (-S-CH3)

1. oksidacija tiola do disulfida

4R-SH 2R-S-S-R + 2H2O O2

1/18/2010

24

2. formiranje tioestara

3. reakcije disulfida sa tiolimaR-S-S-R + 2R-SH 2R-SH + R-S-S-R

R C

O

OH + R' SH R C

S

R'

OH

OH R C

O

S R' + H2O

4. reakcije izmene disulfidaR-S-S-R + R-S-S-R R-S-S-R + R-S-S-R

5. formiranje kompleksa sa metalnim jonima Co2+, Cu2+, Mn2+, Cd2+ i dr.

6. reakcije sa sulfitima raskidanje disulfidne veze

R-S-S-R + SO32- R-S- + R-S-SO3 veina proteina optimalno uestvuje u ovim reakcijama

tek posle denaturacije, to se objanjava na dva naina: 1. aktivne grupe su skrivene usled konformacije nativne molekule 2. aktivne grupe uestvuju u formiranju labilnih hemijskih veza koje se raskidaju denaturacijom

1/18/2010

25

V bojene reakcijeaminokiselina reagensi trivijalni naziv

glicin o-ftalaldehidarginin -naftol, hipobromit Sakaguci-jeva reakcijametionin jodoplatinathistidin diazosulfanilna kiselina Pauli-jev testhistidin bromfenol plavo, merkuri-hloridtriptofan p-dimetilaminobenzaldehid Ehrlich-ova reakcijatirozin Hg soli, azotna kiselina Millon-ova reakcijatirozin -nitrozo--naftolprolin izatinhidroksi kiseline perjodna kis., Nessler-ov reag.cisteop nitroprusidsve a.k. ninhidrinpeptidna veza bakar-sulfat, hidroksid biuretska reakcija

Ninhidrinska reakcija Ninhidrin se redukuje do hidrindantina, aminokiselina preko imino I

keto kiseline dekarboksilacijom prelazi u odgovarajui aldehid.Oslobieni amonijak, hindrindantin i viak ninhidrina formiraju plavokondenzaciono jedinjenje

1/18/2010

26

PEPTIDI Peptidna veza nastaje kondenzacijom karboksilne grupe

jedne i amino grupe druge aminokiseline.

Karbonilna (C=O) i imino (N-H) grupa lee u istoj ravni jer peptidna veza ima delimino karakter dvogube veze ime je praktino onemoguena rotacija

Kod veine aminokiselina kondenzacija je linearna Izuzetak je prolin

1/18/2010

27

Sinteza peptida nije jednostavna i vri se prevoenjemkarboksilne grupe u njen hlorid, pri emu je potrebnopredhodno zatititi amino grupu npr. acetil grupom ilikarbobenzoksihloridom

peptd dobjaju onovno me prema C termnalnoj amnokeln, aotale amnokelne e znavu k radkal v od Ntermnalne amnokelne npr. trpeptd glutaton je glutaml-ctenl-glcn

tidn nz da bude zltg oblka:1. linran2. rvt zbog prutva damnomonokarbonkh i monoamnodkarbonkh

kelna3. mkln uled tvaranja ntramolekulkh vdninh veza

4. ciklian usled stvaranja intramolekulskih peptidnih veza

1/18/2010

28

molekule protena atoje e z jednog l v polpeptdnh ln, abroj amnokeinkh ostataka k e do nekoiko deetnahljada.

truktura protena da e izuv n t nvoa:

1.rmrn truktura redoled (ekvenca) amnokelnkh otataka u molekul protena odrevanje prmarne trukture je dugotrajna loen procedura prvo e vr rakdanje (hdroliz) dufdnh veza permravjom

kelnom l merkaptoetanolom pr mu e odvajaju polpeptdnlanc

prmarna truktura e zatm odreuje hemjkm enzmatkmmetodama koje e zanvaju na potepanoj hdrolz protena dentfkovanju olobodenh amnokelna.

TRUKTURA PROTENA

N termnalna analzaa) angerov potupak (dntrofenl potupak)

DNP derivat aminokiseline je uto obojen i moe da se ekstrahuje etrom i identifikuje hromatografski

1/18/2010

29

b) Edman-ova degradacija

Feniltiohidantoinski derivati aminokiselina se ekstrahuju etilacetatom i odreuju hromatografski

C terminalna analizaa) Enzimska metoda Enzim karboksipeptidaza katalizuje hidrolizu peptidne

veze kojom je vezana C terminalna aminokiselina

Sekvencioniranje DNK Sekvencioniranje DNK gena koji kodira ispitivani protein

Zbog analitikih problema najbolje je koristiti vie tehnika

1/18/2010

30

Prvi protein ija je primarna struktura bila potpunorasvetljena je hormon insulin 2 lanca povezana sa 2 -S-S- mosta lanac A: 21 a.k.,1 -S-S- most, kiseo (2 Glu) lanac B: 30 a.k., bazan (1 Lys, 1 Arg, 2 His, 2 Glu

Redosled aminokiselina u goveem insulinu

1/18/2010

31

2. Sekundarna struktura prostorni raspored aminokiselina koje su u primarnoj strukturi blizu

jedna drugoj i periodino ponavljanje strukture. ispituje se fizikim metodama (difrakcija x zraka i dr.) peptidna veza je uvek u ravni zbog deliminog karaktera dvogube

veze

teoretski period identinosti je 7,27 , ali svaka peptidna veza moeda nagradi 2 vodonine veze sa drugim polipeptidnim lancem iliunutar samog lanca, pa se period identinosti skrauje

1/18/2010

32

Postoje tri tipa sekundarme strukture: -plisirani list, -spirala i slobodni niz

1. -plisirani list Strukturu ine dva lanca povezana vodoninim vezama Lanci mogu da budu paralelni i anti-paralelni

peptidne grupe se nalaze u istoj ravni -C atomi pripadaju susednim ravnima koje zaklapaju

odreeni ugao radikali zauzimaju vertikalni poloaj ovu strukturu imaju neki skleroproteini npr. keratin

1/18/2010

33

2. -spirala vodonine veze koje se obrazuju unutar lanca dovode do

njegovog savijanja u konformaciju spirale svaki zavoj spirale se satoji iz 3,7 ostataka aminokiselina period identinosti je oko 5,4 peptidne veze su u jednoj ravni, a CO i NH grupe koje

stoje jedna iznad druge obrazuju vodonine veze kojestabilizuju molekulu

Period identinisti keratina kose i perja je 5,1 a ne 5,4 . To jezato to su kod njega 2 ili vie polipeptidnih nizova spiralne struktureupleteni u obliku konopca to dovodi do skraivanja du osezakednikog savijanja.

Fibrile kolagena se sastoje iz 7 trostrukih spirala upredenih u oblikukonopca

1/18/2010

34

Nastajanje elatina kuvanjem i hlaenjem kolagena rezultat jeodvrtanja spirale i raskidanja vodoninih veza pri emu odvojenipolipeptidni nizovi hidratiu

Neke aminokiseline remete pravilnost strukture: imino grupa prolina je deo krutog prstena i nema rotacije oko N-C veze a.k. sa naelektrisanim ili voluminoznim R grupama elektrostatiki ili

fiziki remete formiranje heliksa3. Slobodan niz Konformacija koju poprima polipeptidna molekula u rastvoru, kada

se raskine najvei broj vodoninih veza Peptidne grupe su i dalje u istoj ravni, ali niz rotira oko C atoma za

koje su vezani radikali

3. Tercijerna struktura

- i - strukture, kao i molekule proteina koje nemajusekundarnu strukturu mogu da se savijaju i gradeglobularne, elipsaste ili vretenaste strukture

savijeni delovi polipeptidnog niza meusobno supovezani disulfidnim, vodoninim ili jonskim vezamapreko bonih ostataka aminokiselina

U odravanju stabilnosti ovih struktura mogu dauestvuju i nepolarni boni lanci aminokiselinameusobnim privlaenjem Van-der-Vals-ovim silama

1/18/2010

35

4. Kvaternerna struktura Imaju je neki oligomerni proteini koji predstavljaju asocijaciju nekoliko

globula povezanih vezama koje nisu kovalentne (peptidne ni disulfidne), npr hemoglobin

Primer: struktura hemoglobina Primarna struktura: polipeptidni niz se sastoji iz 574 a.k. u odreenom

redosledu Sekundarna struktura: polipeptidni niz je uvrnut u -spiralu Tercijerna struktura: -spirala je smotana u klupko Kvaternerna struktura: 4 klupka formiraju tetramer

1/18/2010

36

FIZIKE I HEMIJSKE OSOBINE PROTEINA Mm peptida: do 10 000 Mm proteina: 10 000 - 25 000 000 prema veliini estica (1-100 m) spadaju u koloide predstavljaju smeu vie proteinskih frakcija razliitih

Mm (npr. glijadini se nalaze u opsegu Mm 15 90 kD) za preiavanje proteina koristi se dijaliza. Ne prolaze

kroz polupropustljive membrane creva za dijalizu iji suprenici pora manji od njihovih prenika.

proteini su koloidni elektroliti i taloe se naizoelektrinom pH.

mogu da se razdvoje elektroforezom. U rastvoru iji jepH manji od izoelektrine take putuju prema katodi, akada je pH vii od izoelektrine take prema anodi.

Odreivanje Mt proteina:1. Ultracentrifugiranje (6 000 o/min)2. SDS PAGE3. Gel filtracija

1/18/2010

37

optike osobine proteina

interakcije proteina ili njihovih konstituenata (aminokiselina i peptida) i elektromagnetog zraenja deli se na:

1. neapsorptivne interakcije: polarizacija difrakcija x zraka optika anizotropija refrakcija i disperzija skatering

2. apsorptivne interakcije apsorpcija u UV oblasti apsorpcija u IR oblasti

apsorpciona kriva proteina u UV oblasti ima dva apsortivnapodruja: 180-250 nm - peptidna veza i funkcionalne grupe aminokiselina sa

sumporom (cistina, cisteina i metionina) oko 280 nm - funkcionalne grupe tirozina, triptofana, fenilalanina

fenilalanin malo utie na apsorpcioni spektar proteina jerima mali molarni ekstincioni koeficijent i nizak sadraj uproteinima (odnos Try:Tyr:Phe ~ 27:7:1)aminokiselina funkcionalna grupa maksimum apsorpcije Em

tirozin fenol 275 1340triptofan indol 280 5010fenilalanin fenil 258 206

cistin disulfid 250

cistein tiol 200

metionin alkilsulfid 200

1/18/2010

38

UV apsorpcija na 280 nm koristi se za odreivanje sadraja proteina

Apsorpcioni spektar glijadina 1 mg/ml u 1% SDS u UV oblasti od 250 do 400 nm

Standardna kriva za glijadin (Sigma) za odreivanje sadraja prolamina apsorpcijom u UV oblasti na 280 nm

1/18/2010

39

Denaturacija proteina Denaturacija je promena nativne strukture proteina Faktori koji dovode do denaturacije:

poviena ili sniena temperatura kiseline ili baze ultrazvuk UV svetlost jonizujua zraenja teki metali enzimi organski rastvarai i dr.

denaturisanjem proteini prelaze iz visoko organizovanog u neorganizovano stanje uz promenu konformacije (odmotavanje, ispravljanje molekula)

denaturisani proteini se lake hidrolizuju dejstvom enzima

pokazuju poveanu optiku rotaciju i viskozitet

poveana reaktivnost aktivnih grupa i smanjena rastvorljivost

denaturisani enzimi i peptidi gube bioloku aktivnost

1/18/2010

40

koagulacija proteina pojava kada se estice proteina taloe usled smanjenog

Braunovog kretanja pri manjim koncentracijama estice se taloe, a pri veim

dolazi do ovravanja celog sistema prelazak u gel denaturacija je jednaka koagulaciji kada nastane talog neki koagulisani proteini su svarljiviji (npr. ovoalbumin) koagulacija eliminie antivitaminsko dejstvo avidina

(antivitamin vitamina H) koagulisani gluten ne moe da vee vodu (suenje

hleba)

AZOTNA RAVNOTEA proteinske potrebe organizma obino se izraavaju

preko azotnog bilansa:1. pozitivan azotni bilans - koliina izluenog azota je

manja od koliine unetog. Karakteristian za mlade organizme, jer se uneti proteini koriste ne samo za regeneraciju tkiva, ve i za izgradnju novih tkiva -poveanja telesne mase

2. negativan azotni bilans - koliina izluenog azota je vea nego koliina unetog. Troe se sopstvena tkiva -dolazi do smanjenja telesne mase

3. azotna ravnotea - koliina izluenog azota je jednaka koliini unetog - telesna masa se ne menja

1/18/2010

41

biskoristljivost proteina zavisi od njihovog aminokiselinskog sastava

indeks efikasnosti proteina - PER pretstavlja sposobnost proteina da u datom momentu

regeneriu stara i izgrauju nova tkiva

poveanje telesne masePER =

masa unetog proteina

bioloka vrednost proteina - BV pretstavlja deo iskorienog proteinskog azota u organizmu

koliina zadranog azotaBV =

koliina unetog azota

za odreivanje BV i PER koriste se:1. bioloke metode - zasnivaju se na praenju azotnog bilansa i

promena telesne mase eksperimentalnih ivotinja2. hemijske metode - zasnivaju se na odreivanju sadraja

amino-kiselina u hidrolizatu ispitivanog proteinaFormule Block-a i Mitchel-a:

PER = 3.77 - 0.0321 xBV = 102 - 0.634 x

limitirajui faktor (limitirajua aminokiselina) je onaesencijalna aminokiselina iji je sadraj najmanji u odnosu nasadraj iste aminokiseline u ukupnim proteinima jajeta iji sesadraj dogovorno uzima kao 100%

x - procenat deficita limitirajue aminokiseline - dobija seoduzimanjem od 100 vrednosti procenta limitirajueaminokiseline (% od iste amino-kiseline proteina jajeta)

1/18/2010

42

% esencijelnih aminokiselina u proteinima jajeta (FAO)

lizin 6,88

Treonin 5,01

Valin 6,75

Metionin 5,71

Izoleucin 8,70

Leucin 6,20

Tirozin 4,10

fenilalanin 5,65

primer: u proteinima pasulja limitirajua a.k. je metionin 1.92 % (5.71 % u proteinima jajeta)1.92 100 / 5.71 = 33.6 %100 - 33.6 = 66.4 - procenat deficita limitirajue a.k.BV = 102 - 0.634 66.4 = 59.9PER = 3.77 - 0.0321 66.4 = 1.64

Podela proteina prema biolokoj vrednosti:1. potpuni proteini (BV > 75)

- omoguavaju normalan rast i regeneraciju organizma- proteini: mesa (sem proteina vezivnog tkiva), mleka, jaja

2. delimino nepotpuni proteini (BV = 55-75)- omoguavaju samo odravanje telesne mase- veina biljnih proteina: proteini itarica su deficitarni ulizinu, a proteini leguminoza u metioninu

3. nepotpuni proteini (BV < 55)- ne omoguavaju ni odravanje telesne mase- proteini vezivnog tkiva: kolagen, elastin. - zein iz kukuruza je veoma deficitaran u lizinu

1/18/2010

43

Poboljanje bioloke vrednosti proteina

komplementacija kombinovanjem proteina dodavanje deficitarnih a.k. u dijetetske proizvode genetske modifikacije hibridi sa veim sadrajem deficitarnih a.k.

UTICAJ TERMIKOG TRETMANA NA BIOISKORISTLJIVOST PROTEINA Denaturacija i koagulacija proteina imaju povoljno dejstvo na

digestivnu iskoristljivost proteina zbog promene konformacijepolipeptidnih lanaca to omoguava laki pristup enzimima

Formiranje unutranjih peptidnih veza izmeu -amino grupelizina i amidne karboksilne grupe glutaminske i asparaginskekiseline pri veoma visokim temperaturama usled sternih smetnjionemoguava pristup digestivnim enzimima.Digestivna iskoristljivost proteina pasterizovanog mleka je veanego UHT sterilizoivanog.

Racemizacija aminokiselina usled uticaja alkalne sredine prilikomtehnolokih procesa pripremanja proteinskih koncentrata (kazeinata,proteina kvasca, soje) dovodi do smanjenja bioskoristljivosti jer seD-aminokiseline ne metaboliu u organizmu

1/18/2010

44

Nastajanje lizinoalanina (LAL) tretiranjem proteina alkalijama navisokoj temperaturi smanjuje digestibilnost proteina i iskoristljivostlizina, a kod eksperimentalnih ivotinja izaziva renalna oteenja.

LAL se satoji iz lizina ija je -amino grupa vezana za metil grupuostataka alanina, nije dipeptid i hidrolizom ne daje dveaminokiseline.

U alkalnoj sredini lizin se vezuje sa ostatkom dehidroalanina kojinastaje reakcijom -eliminacije iz cisteina i serina

CisteinSerin

baza

-H2S

CH2C

dehidroalaninski ostatak

+L-lizin C-H(CH2)4 NH

CH2*C-H

LAL

-H2O

interakcija proteina i ugljenih hidrata Pri zagrevanju dolazi do reakcije neenzimskog tamnjenja - Millard-ove reakcije.

Lizin najvie uestvuje u ovoj reakciji jer su slobodne i terminalne amino grupe najaktivnije. Zbog toga pri reakciji neenzimskog tamnjenja dolazi do smanjenja iskoristljivosti proteina jer je deo lizina blokiran.

H-C-OH H-C-OHHO-C-H H-C-OH H-C H2C-OH

O

aldoza aldozamin

R-NH2

H-C-NHR H-C-OHHO-C-H H-C-OH H-C H2C-OH

O

H-C-OHHO-C-H H-C-OH H-C-OH H2C

H-C=OHO-C-H H-C-OH H-C-OH H2C-OH

O

1-amino-1-dezoksi-2-ketoza

Amadorijevopremestanje

CH2-NHR

CH2-NHRU prvoj fazi kondenzuje se karbonilna grupa eera i slobodnaamino grupa proteina (lizina ili terminalna) pri emu se formiraaldozamin ili ketozaminDruga faza je Amadorijevo premetanje pri emu nastaje N-supstituisana-1-amino-1-dezoksi-2-ketozaU treoj fazi dolazi do stvaranja vie stotina razliitih jedinjenjakoja su odgovorna za za brojne arome boju i ukus termikitretirane hrane, a na kraju nastaju tamni pigmenti melanoidini.

1/18/2010

45

interakcija proteina i masti Oksidativnom razgradnjom nezasienih masnih kiselina i

holesterola nastaju proizvodi koji mogu da reaguju saamino grupama proteina, naroito lizina, ime sesmanjuje njihova iskoristljivost.

DIGESTIBILNOST PROTEINAFaktori koji utiu na digestibilnost proteina: poreklo (biljni proteini imaju manju digestibilnost zbog manje

digestibilnih elijskih memebrana) fizikohemijski faktori (konformacija molekula, tipovi veza) prisustvo sastojaka hrane koji modifikuju digestiju (vlakna, tanini) prisustvo antifiziolokih faktora koji utiu na digestiju (tripsin

inhibitori, lektini) termiki tretman (Millard-ova reakcija, stvaranje lizinoalanina,

racemizacija i dr.)Izraunavanje digestibilnosti:

[Ni - (Nf - Ne)] x 100Ni

Ni - uneti azotNf - fekalni azotNe - endogeni fekalni azot (na dijeti bez proteina, oko 14mg/kg za

odrasle, 20 mg/kg za decu)

1/18/2010

46

Namirnica Digestibilnost proteina (%)Belance jajeta 97Celo jaje, govedina, ivina, riba 95Penino belo brano 95Soja protein izolat 94Polirani pirina 88Sojino brano 86Integralna penica 86Kukuruzni proizvodi 86Integralni pirina 84pasulj 69

DIJETE Digestibilnost proteina (%)SAD 96Kina 94Kolumbija (via klasa) 93Filipini (urbana) 88ile (srednja klasa) 82Meksiko (ruralna) 80Gvatemala (ruralna) 79Brazil (ruralna) 78Indija (vegetarijanska) 78

Izraunavanje digestibilnosti proteina meovitog obroka od pirina pasulja, penice i jaja

Namirnica digestibilnost proteina zastupljenost u obroku (%)Poliran pirina 88 40Crni pasulj 69 35Integralna penica 86 15Celo jaje 95 10Digestibilnost: (0,88 x 40) + (0,69 x 35) + (0,86 x 15) + (0,95 x 10) = 82%

1/18/2010

47

DIGESTIJA PROTEINA1. usta

mehaniko usitnjavanje hrane2. eludac

pepsin - prekurzor: pepsinogen, aktivator: HCl, pH 1-2 raskida endogene peptidne veze proteina, naroitoizmeu aromatinih i dikarbonskih kiselina pri emunastaju proteoze i peptoni

renin - potrebno prisustvo Ca2+, pH 4 dovodi dokoagulacije mleka pri emu kazein prelazi uparakazein pa se due zadrava u eludcu. Vaan jekod dece dok ga kod odraslih nema. Koristi se uproizvodnji sira.

3. tanko crevoa) enzimi pankreasnog soka: tripsin (prekurzor: tripsinogen, aktivator: enterokinaza, pH 7.9) -

raskida endogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona,naroito izmeu baznih aminokiselina pri emu nastaju polipeptidi idipeptidi

himotripsin (prekurzor: himotripsinogen, aktivator: tripsin, pH 8) -raskida endogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona,naroito izmeu neutralnih aminokiselina pri emu nastaju polipeptidii dipeptidi

elastaza (prekurzor: proeleastaza, aktivator: tripsin, pH 8) - raskidaendogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona, naroitoizmeu malih aminokiselina (glicin, alanin, serin) pri emu nastajupolipeptidi i dipeptidi

karboksipeptidaza (prekurzor: prokarboksipeptidaza, aktivator:tripsin, pH 8) - raskida egzogene peptidne veze polipeptida naslobodnom karboksilnom delu lanca pri emu nastaju aminokiseline ipeptidi

1/18/2010

48

b) enzimi crevnog soka aminopeptidaza raskida egzogene peptidne veze

polipeptida na slobodnom amino kraju lanca pri emu nastaju aminokiseline i peptidi

dipeptidaze raskidaju peptidnu vezu dipeptida pri emu nastaju aminokiseline

APSORPCIJA PROTEINA D-aminokiseline se apsorbuju prostom difuzijom L-aminokiseline (prirodni izomeri) se apsorbuju aktivnim

transportom u kome ima ulogu vitamin B6 u apsorpciji postoji kompeticija izmeu aminokiselina

tako da suvie velika koliina jedne aminokiseline moe da uspori apsorpciju druge

apsorbovane aminokiseline putuju portalnim venskim krvotokom do jetre

mogue je da poneki polipeptidni lanac, koji iz odreenih razloga ne moe da se digestira, bude apsorbovan. Te molekule ne mogu da se koriste u sintezi proteina, ve dovode do razvoja imunosti i preosetljivosti na proteine pojedinih namirnica (nutritivni alergeni)

1/18/2010

49

METABOLIZAM PROTEINA biljni i ivotinjski proteini izgraeni su od oko 20

aminokiselina

esencijalne aminokiseline: izoleucin, leucin, lizin,metionin, fenilalanin, treonin, triptofan i valin (arginin ihistidin su poluesencijalne) ne mogu da se sintetiu uorganizmu i moraju da se unose hranom

neesencijalne aminokiseline mogu da se sitetiu izdrugih aminokiselina, Ac-koenzima A ili piruvatareakcijama aminovanja, transaminacije, dezaminacije idefosforilacije koje su enzimski katalizovane

1/18/2010

50

Sinteza proteina

1/18/2010

51

ANALITIKA PROTEINA1. odreivanje ukupnih proteina- metoda po Kjeldahl-u koncentrovana sumporna kiselina vri razaranje

materijala pri emu se ugljenik oksidie do ugljen-dioksida, vodonik do vode, a azot se redukuje doamonijaka koji se destilie vodenom parom i hvata uodreenu zapreminu kiseline poznatog titra, nakon egase viak kiseline se retitrira bazom

U zavisnosti od sadraja azota u proteinima pojedinihnamirnica (FAO tablice) sadraj proteina se izraunavamnoenjem dobijenog sadraja azota faktorom iz tablice(npr. 5.7 za proteine penice, 6.25 za proteine drugihitarica)

- odreivanje belanevina mleka formol titracijom dodatkom formaldehida blokiraju se amino grupe belanevina, a

karboksilne grupe mogu da se titriraju bazom

R CH

NH2

COOHCH

H

OR CH

N(CH2OH)2

COOH+

2. odreivanje odreenih frakcija proteina- taloenje na izoelektrinom pH npr. kazein se izdvaja iz mleka taloenjem na pH 4.6 i moe da se

odredi po Kjeldahl-u- ekstrakcija odreenim rastvaraima (po Osborn-u) ekstahovani proteini mogu da se odrede po Kjeldahl-u ili metodama

za odreivanje proteina u rastvoru: po Lowry-u, BCA, Biuret-skom metodom, merenjem apsorpcije u UV oblasti i dr.

- elektroforezom i gel filtracijom izdvojene frakcije mogu da se odrede pomenutim metodama

1/18/2010

52

3. odreivanje aminokiselinskog sastava i bioloke vrednosti proteina

Proteini se hidrolizuju do aminokiselina kiselom ili baznomhidrolizom.

Baznom hidrolizom dolazi do razlaganja veeg broja aminokiselina. Kiselom hidrolizom triptofan se potpuno razlae, a dolazi i do

deliminog razlaganja aminokiselina sa sumporom, ali, obzirom dase sadraj aminokiselina odreuje u odnosu na kiselo hidrolizovanstandard ovi gubitci se eliminiu.

Kisela hidroliza se izvodi 6M HCl u zatopljenim ampulama na 110oCu toku 20h. Viak kiseline se ukloni viestrukim ispiranjem iuparavanjem, a hidrolizat se rastvara u citratnom puferu pH 2.2 isadraj aminokiselina odreuje aminoanlizatorom (ninhidrinskareakcija), ili HPLC tehnikom nakon PTC derivatizacije (UV detektor)

Iz sadraja esencijelnih aminokiselina izraunavaju se parametrihranljive vrednoeti proteina: BV, PER, EAAI

4. odreivanje primarne, sekundarne, tercijarne i kvaternerne strukture proteina

sekvenciona analiza rentgenske metode

5. ispitivanje imunogenosti proteina namirnica vano je kod ispitivanja dijetetskih preparata za pojedine

grupe preosetljivih osoba: npr. gluten-free preparati zacelijane bolesnike

imunohemijske metode: ELISA, imunobloting tehnike,imunoprecipitacija RIA i dr.