PROTEINELE

• Proteinele se clasifica în: –homoproteiene, alcătuite numai din

aminoacizi şi –heteroproteine, alcătuite dintr-o

parte peptidică (apoproteienă) şi o parte prostetică.

PROTEINELE

• Cele mai importante funcţii ale proteinelor sunt:– Cataliza enzimatică.

– Stocare şi transport.

– Mişcarea coordonată.

– Protecţie şi suport mecanic.

– Imunitatea.

– Generarea şi transmiterea impulsului nervos.

– Reglarea activităţii celulare şi fiziologice.

– Controlul creşterii şi al diferenţierii.

Structura proteinelor Nivele de organizarea structurală

Există 4 nivele de organizarea structurală:Structura primară Structura secundară Structura terţiarăStructura coaternară

Structura primarăÎn 1953 Sanger a făcut prima determinare de secvenţa completă a

insulinei. • Pregătirea proteinei pentru secvenţiere.

– Determinarea numărului de catene polipeptidice distincte ale proteinei;

– Ruperea legăturilor disulfurice inter şi intracatenare;– Separarea catenelor şi determinarea compoziţiei în aminoacizi a

acestora.• Secvenţierea.

– Clivajul unei catene în fragmente destul de mici pentru a putea fi secvenţiate;

– Separarea fragmentelor; – Secvenţierea fragmentelor;– Repetarea clivajului catenei cu un agent cu specificitate diferită

urmată de separarea şi secvenţierea noilor fragmente.• Deducerea secvenţei întregii proteine.

– Ordonarea fragmentelor prin metoda suprapunerii; – Determinarea poziţiei punţilor disulfurice.

Structura primarăClivajul unei catene în fragmente.

• Clivajul se face cu endopeptidaze care "recunosc" legătura peptidică în funcţie de radicalii care o flanchează.

Enzima –HN–CH(Rx-1)–CO–NH–CH(Rx)–CO–

Tripsina Rx-1= Arg, Lys; Rx ≠ Pro

Chimotripsina Rx-1= Phe, Trp, Tyr; Rx≠Pro

Elastaza Rx-1= Ala, Gly, Ser, Val; Rx≠Pro

Pepsina Rx-1 ≠Pro; Rx = Leu, Phe, Trp,Tyr

Structura primarăSecvenţierea fragmentelor se efectuează prin ciclarea degradării Edman

S

CC

NC

H

N C S + H2N CH C OH

R1O

OH-

CH C OH

R1O

NH C NH

S

N

CC

NC

H

R1 O

NH

R1 OH+

H

S

Fenilizotiocianat

Derivat de feniltiohidantoinã

Structura primară

• Ordonarea fragmentelor peptidice se face prin aşa-zisa metodă a suprapunerii

Asp Trp Ser Met Gly Ala Lys Leu Pro Met Asp Phe Arg Cys Ala GluAgentul I de clivaj Agentul I de clivajAgentul II de clivaj Agentul II de clivaj

Fagmente peptidice IFagmente peptidice II

Structura primarăDeterminarea poziţiei punţilor disulfurice

Structura secundară

Structura secundară

Structura colagenului

Structura colagenului

CH

CHO

CH2 CH2 CH2 CH2 NH2

OH

OH

CH2CH2CH2CH CHO

OH

CH2CH2CH2CH CHO

CH2CH2CH

OH

C CH CH2CH2CH2 CH

OH

NH2CH2CH2CH2CH2CH

CHCH2CH2

OH

CH2OHC

CHCH2CH2

OH

CH2CH2CH2CH2CH2CH

OH

N CH

HidoxiLizina

HidroxiAllizina

Produs de condesare crotonicã

HidoxiLizina

HidroxiAllizina

Dehidrodihidroxilizinonorleucinã

bazã Schiff

Structura elastinei

(CH2)3

OC

(CH2)2

(CH2)4

N+

(CH2)2

CH

CHCH

CH

HN

HN

HN

NH

CO

CO

CO

Structura terţiară

Structura terţiară

• Forţele ionice.

• Forţele van der Waals

• Punţile de hidrogen • Forţele hidrofobe

• Legăturile disulfurice

Structura cuaternară

ProteineleSepararea proteinelor

Extracţia din celule.Pentru izolarea unei proteine este necesară alegerea unei

surse.Clonarea moleculară pe baza căreia poate fi produsă

aproape orice proteină codificată genetic. Dacă proteina este citosolară, citoliza care se poate face

pe cale osmotică, enzimatică, sau citoliza mecanică.Principalul criteriu în alegere a condiţiilor de purificare este

menţinerea sub control a factorilor denaturanţi. După extracţia din celule se trece la separarea proteinei de

celelalte molecule dizolvate.

ProteineleSepararea proteinelor

• Solubilitatea proteinelor.• Întrucât proteinele sunt polielectroliţi, solubilitatea lor

depinde de • concentraţia sărurilor, • pH • constanta dielectrică ale mediului de dizolvare.

– Concentraţia sărurilor este exprimată prin forţa ionică, la forţă ionică mică solubilitatea proteinelor creşte cu concentraţia sărurilor, atinge o valoare maximă după care scade. Cea mai folosită, în precipitarea salină, este cea cu (NH4)2SO4.

– Efectul pH-ului depinde de natura proteinelor deoarece au pI diferit (precipitarea izoelectrică).

– Solvenţii organici cum sunt acetona şi etanolul precipită proteinele au constanta dielectrică mică .

ProteineleSepararea proteinelor

Gel-filtrarea

ProteineleSepararea proteinelor

Cromatografia de afinitate

ProteineleSepararea proteinelor

Separarea proteinelor ca polielectroliţi

ProteineleSepararea proteinelor

Electroforezăbidimensională