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PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATIEMOGLOBINA E MIOGLOBINALegano reversibilmente l’OSSIGENO.
L’emoglobina (tetramerica) è presente negli eritrociti, e trasporta ossigeno nel sangue
La mioglobina (monomerica) è presente nelle cellule muscolari.
Aumenta la solubilità dell’ossigeno nel plasma, da 3ml/L a 220 ml/L.
Essenziale per la loro funzione è il legame con un gruppo prostetico: Il gruppo EME in cui è presente lo ione ferroso Fe2+ che funziona da sito di legame per l’O2
La mioglobina
e l’emoglobina
sono proteine
coniugate
GRUPPO EME
4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici (protoporfirina IX), struttura coniugata e planare che coordina il FERRO nello stato ferroso -Fe(II) (Fe2+)-Esso è coordinato dai 4 atomi di azoto dell’anello tetrapirrolico
5 | 3Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014
Il gruppo EME è alloggiato in una «tasca», formata dal ripiegamento della catenapolipeptidica (globinica), in cui si affacciano diversi residui amminoacidici idrofobici(Val, Leu, Iso, Phe, Met) che interagiscono con l’anello tetrapirrolico dell’EME e lomantengono in sede.
interazioni idrofobiche, contatti di van der Waals e legami H
Nella tasca idrofobica è impedito l’ingresso
all’H2O e il Fe2+ è protetto dall’ossidazione
irreversibile.
Istidina prossimaleHis93 (His F8)
Piano dell’anello porfirinico
Lo ione Fe2+ è coordinato dai 4 atomi di azoto dell’anello tetrapirrolico, e formaaltri 2 legami di coordinazione: con l’ossigeno molecolare (O2) e con l’istidinaprossimale (His93; His F8)
Elica F della Catena
globinica,
Lo ione ferroso Fe2+
può legare O2
J. M. Berg et al. BIOCHIMICA 7/E Zanichelli editore S.p.a Copyright © 2012
L’interazione tra Ferro e Ossigeno è descritta dalla combinazione di 2 strutture di risonanza
Lo ione ferrico Fe3+ non può legare O2
La Mb o l’Hb SI OSSIDANO(Meta-Mb o Meta-Hb)
La struttura della Mb o delle catene globiniche di Hb sono fatte in modo da proteggere il ferro dall’ossidazione, ed evitare la
formazione di ioni superossido
La tasca dell’EME è idrofobica e quindi è impedito l’ingresso di acqua
Esiste un sistema anti-ossidante che rimuove le specie reattive dell’ossigeno (ROS) basato sull’attività del glutatione.
Nella tasca dell’EME esiste un secondo residuo di ISTIDINA chiamato DISTALE che interagisce con l’ossigeno e indebolisce il legame fra ossigeno e ferro
Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)
His-93 (F8)prossimale
His-64 (E7)distale
His prossimale
His distale
Phe
Val
Val-68 e Phe-43 aiutano a mantenere
l’EME in posizione
La formazione e il rilascio dell’anione superossido è impedito da un LEGAME H fra l’O2 e l’Istidina DISTALE (His64, E7).
Questo legame impedisceanche l’ossidazione dello ione Fe2+ a Fe3+
Il legame H fra O2 e His-64(distale) assicura chel’interazione O2/Fe2+ siareversibile, abbassa l’affinitàdell’eme per il suo ligando
La tasca dell’EME può accogliere anche altre piccole molecole, come per es. il MONOSSIDO DI CARBONIO (CΞO)
Il monossido di carbonio blocca i siti di legame per l’ossigeno nell’Hb e nella Mb, rendendola non-funzionale.
Si blocca la respirazione per intossicazione da CO.
Il legame è molto forte ma reversibile,il CΞO può essere rilasciato in condizioni di alte pressioni di O2
(camera iperbarica)
il CΞO lega il Fe2+ dell’EME con un’affinità molto maggiorerispetto all’O2 (CO e Fe2+ sono perfettamente allineati).
Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve)
La Mb ha un solo gruppo EME, può legare 1 molecola di O2.
Si forma un complesso MbO2
secondo un rapporto di 1:1. Il legame fra Mb e O2 è
reversibile ed è regolato secondo un equilibrio da una costante di dissociazione:
Mb + O2 MbO2Mb + O2 MbO2Kdiss
La concentrazione di proteina ossigenata (legata all’ossigeno, MbO2) rispetto allaconcentrazione totale di Mb (Mb + MbO2), varia al variare della concentrazione diossigeno (ligando) fornito alla proteina. Questo rapporto è chiamato FRAZIONE DISATURAZIONE DELLA Mb (si esprime in % o in frazione)
Mb + O2 MbO2Mb + O2 MbO2Kdiss
[Mb] [O2 ]Kdiss =
[MbO2]
[Mb] [O2 ]Kdiss =
[MbO2]
[MbO2]Y =
[MbO2] + [Mb]
[MbO2]Y =
[MbO2] + [Mb]
2) dall’affinità che la proteina ha per il suo ligando, cioè dalla costante di dissociazione (Kdiss) del complesso MbO2
LA FRAZIONE DI SATURAZIONE DIPENDE DA: 1) dalla concentrazione del ligando [O2] che si esprime come pO2
Se la Kdiss è piccola l’affinità proteina/ligando è elevata
Kdiss= p50
Il valore della Kdiss corrisponde al valore di pO2
che consente di saturare la Mb al 50% (Y = 0.5).Questo valore di pO2 è detto p50
pO2
Y = p50 + pO2
pO2
Y = p50 + pO2
pO2
Y = p50 + pO2
La frazione di saturazione Y, la concentrazione di O2, e la Kdiss sono legate da una relazione matematica:
Y = Kdiss+
Y = Kdiss+
pO2Y =
Kdiss+ pO2
Y = Kdiss+
Y = Kdiss+
pO2Y =
Kdiss+ pO2
Eq. di HILL
[O2] = pO2 (pressione parziale di ossigeno)
[O2]Kdiss + [O2]
Y =
Kdiss+ pO2 = 2pO21 pO2
2 Kdiss + pO2
Y = = Kdiss = 2pO2 - pO2 = pO2
La p50 è il parametro che misura l’AFFINITA’ di unaemoproteina per il suo ligando (l’OSSIGENO).
Più è grande il valore della p50 più è grande la Kdiss equindi minore l’affinità dell’emoproteina per l’O2
Il valore della p50 e quindi della Kdiss si ricava sperimentalmente utilizzando il grafico di
ossigenazione della Mb.
Y
QUANDO SI MISURA la FRAZIONE di SATURAZIONE (Y) della Mb a DIVERSI VALORI di pO2 si OTTIENE UNA CURVA di LEGAME o OSSIGENAZIONE
IPERBOLICA
[MbO2]Y =
[MbO2] + [Mb]
[MbO2]Y =
[MbO2] + [Mb]
Pressione parziale di O2
Tutti i siti di legame della Mb sono
OCCUPATI
Tutti i siti di legame della Mb sono
LIBERI4
O2
O2
O2
O2
Y
la Mb rilascia EFFICACEMENTE
l’ossigeno che aveva legato.
Fase di deossigenazione
minore consumo di O2: la pO2 intracellulare è in equilibrio con quella del sangue capillare
p50 della mioglobina è ~ 4 mmHg, la sua affinità per l’O2 è molto elevataÈ una caratteristica necessaria affinchè Mb sia funzionale: DEVE ESTRARREO2 DAL SANGUE E ACCUMULARLO NEL TESSUTO MUSCOLARE
Nelle cellule muscolari metabolicamente
attive:
si consuma O2: la pO2cellulare diminuisce
< 10 mmHg
Nelle cellule muscolari a riposo:
Mb è quasi satura: accumula O2
Fase di ossigenazione
pO2 nei capillari ~ 30 mmHg
Emoglobina (Hb): tetramero (le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α1β1 e α2β2) che si associano a formare un tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini. Le interazioni si formano nell’interfaccia α1β1 e α2β2 e α1β2 e α2β1
Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME,
quindi l’Hb può legare e trasportare 4 molecole di O2
2 catene globiniche α (7 α-eliche) e 2 catene globiniche β (8 α-eliche)
Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla pO2 e dalla Kdiss
del complesso Hb(O2)4.
Frazione di saturazione: % di Hbossigenata (di siti EME occupati
dall’O2) rispetto all’Hb totale
Kdiss = p50n
Hb + 4[O2] Hb[O2]4Hb + 4[O2] Hb[O2]4
[Hb(O2)4]Y =
[Hb(O2)4] + [Hb]
[Hb(O2)4]Y =
[Hb(O2)4] + [Hb]
[Hb(O2)4]Y =
[Hb(O2)4] + [Hb]
La Frazione di saturazione è legata alla pO2 e alla Kdiss
secondo la seguente relazione:
n
n n
pO2
Y=p50 + pO2
n
n n
pO2
Y=p50 + pO2
Equazione di HILL
[Hb] [O2][Hb(O2)4]
Kdiss =
pO24
Y = Kdiss+ pO2
4
pO24
Y = Kdiss+ pO2
pO2
Y = Kdiss+ pO2
4
pO24
Y = Kdiss+ pO2
4
pO2
Y = Kdiss+ pO2
n
pO2n
Y = Kdiss+ pO2
1,00
0.75
0.50
0.25
0.0
Y
20,0 40,0 60,0 80,0
pO2 (mmHg)
Graficamente la relazione esistente fra Y e pO2 è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O2 è di tipo COOPERATIVO.
a) L’AFFINITA’ DELL’Hb PER L’OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O2
OCCUPANO I GRUPPI EME.
b) Esiste una cooperativitàpositiva fra i siti di legame dell’ossigeno (fra i gruppi EME)
c) Il legame di 1 molecola di O2 ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O2 agli altri gruppi EME
p50 ~ 26 mm Hg, valore di pO2
che satura il 50% dei siti dilegame dell’Hb
STATO R
Hb a bassa affinità, poco ossigenata
STATO T
Hb semisatura, con minimevariazioni di pO2 sideossigena e si ossigenaquasi completamente
Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione
Qual’è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l’O2 in modo cooperativo?
Hbrilascia e lega
efficientemente l’ossigeno
HbMb
1,00
0.75
0.50
0.25
0.0
Y
pO2 (mmHg)20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
pO2 presente nei capillari tissutali
pO2 presente nei capillari polmonari
“n” o nH = Coefficiente di Hill = indica il grado di cooperatività dei sitidi legame per l’O2.
Se l’Hb avesse nH = 4, vorrebbe dire che tutte le molecole di Hb sono o completamente legate o completamente dissociate e il legame con l’O2
avviene contemporaneamente in tutti i siti. QUESTO NON AVVIENE.
Cos’è n?
• Per la Mb n = 1 (NON COOPERATIVA) • Per l’Hb n > 1 ma MAI uguale al numero dei siti per l’O2, • Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di
mutazioni) possono avere un grado di cooperatività (nH) differente
In realtà in condizioni fisiologiche nH dell’Hb è ~ 31< nH <N° siti >> la proteina è Cooperativa e grazie alla cooperatività dei siti dilegame subisce una transizione fra stato a bassa affinità (T) e stato ad alta affinità(R).Ciò vuol dire che, in uno stesso momento, avremmo una miscela di molecole di Hbcompletamente ossigenate, altre non ossigenate e altre parzialmente ossigenate.
nH = 1 >> Non cooperativa (Mioglobina)
nH < 0 >> Cooperatività negativa
La cooperatività di legame dell’emoglobina è possibile perché lo stato di ossigenazione di un sito può essere comunicato agli altri
siti (SONO COOPERATIVI) attraverso un cambiamento della struttura dell’Hb.
La transizione fra stato T e stato R è possibile perché quando l’Hb si ossigena cambia struttura in funzione del legame con le molecole del
suo ligando (O2) e quindi della sua concentrazione (pO2).
Infatti, Hb è una proteina ALLOSTERICA e l’ O2 è il suo effettore allosterico omotropico
1) Ha più siti di legame per il suo ligando2) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di legame
della proteina influisce sull’affinità degli altri siti liberi3) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della struttura
3aria e anche della struttura 4aria della proteina che modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso.
4) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l’affinità della proteina verso il suo
ligando5) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre
REVERSIBILE
7 | 23J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2012
Modello simmetrico o MWC (Monod-Wyman-Changeaux):Una proteina allosterica è un oligomero che può esistere in due stati conformazionali (T e R) in equilibrio tra loro.
Poiché il ligando si lega con maggiore affinità all’oligomero in conformazione R,l’equilibrio si sposta verso quest’ultima: gli oligomeri con conformazione T sonocostretti ad assumere quella R, dopo aver legato l’ossigeno.
Cambiamenti conformazionali contemporanei in tutte le subunità
7 | 24J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2012
Modello sequenziale (Koshland):
Una proteina allosterica è un oligomero in cui il legame con il ligando induce lamodificazione conformazionale della subunità a cui si lega. Grazie alla cooperatività ealle interazione fra le subunità, la transizione conformazionale è trasmessa anchealle atre subunità.
Cambiamenti conformazionali sequenziali man mano che viene legato l’ossigeno
In realtà nell’Hb la transizione conformazionale rispetta entrambi i modelli: - le variazioni nella struttura terziaria (T > R) causate nel primo sito di legame allo
stato T quando vi si lega la prima molecola di ossigeno è sequenziale, - la variazione strutturale quaternaria da T a R avviene di concerto
α1
β1 α2
β2
STATO THb a bassa affinità
+ O2
Legame con la molecola di O2 >> cambia la struttura 3aria della subunità legata
CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sitooccupato dall’O2 in ciascuno dei 2 dimeri αβ) l’interaproteina modifica la sua struttura 4aria assumendouna struttura piu’ disponibile ad accettare altremolecole di O2 .
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
+ O2
+ O2
α1
β1 α2
β2
+ O2
α1
β1 α2
β2
STATO RALTA AFFINITA’
La Transizione idealmente si completa: quando sono occupati gli ultimi siti e tutte le molecole di
Hb sono nella forma ad alta affinità
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
α1
β1 α2
β2
LA DEOSSI-Hb (STATO T) ÈSTABILIZZATA DA UNARETE DI LEGAMIIDROGENO E INTERAZIONIIONICHE INTRA- E INTER-CATENA.
COSA SUCCEDE ALLA STRUTTURA DELLA EMOGLOBINA QUANDO AVVIENE LA TRANSIZIONE T↔ R?
Nell’interfaccia α1/β2 e α2/β1 si stabiliscono dei ponti salini fra l’Asp94 e
l’His146 delle catene β e la Lys40 delle catene α
C-term.
Lys C5 o 40 His HC3
o 146
Asp FG1 o 94
Il legame fra l’EME e l’O2 produce il cambiamento strutturale nella proteina e il passaggio dallo stato T allo stato R.
EME convesso
Deossi-Hb:Il legame con l’His prossimale trascina il Fe2+ al di sotto del
piano dell’EME.
Stato T
Stato R
Ossi-Hb: Il Fe2+, trascinato all’interno dell’EMEdopo il legame con l’O2, si tira dietro l’Hisprossimale, tutta l’elica F e i segmenti adiacentirompendo le interazioni che stabilizzavano lostato T.
EME appiattito
(146)
(146)
Quando l’Hb inizia a ossigenarsi, il legame EME/O2 provoca un CAMBIAMENTO sia DELLA STRUTTURA TERZIARIA sia DELLA QUATERNARIA: un dimero α/β ruota e
scivola rispetto all’altro dimero α/β , questo movimento distorce e indebolisce la rete di legami H e ponti salini che stabilizza lo stato T, le catene beta si avvicinano e si
restringe la cavità centrale
(146)
Nello stato R l’estremità C-terminale (His-146, HC3) delle catene β è ruotato verso la cavità centrale e non può più formare ponti salini
Effettori eteroallosterici dell’emoglobina
H+ (pH)CO2
2,3-bisfosfoglicerato
Regolano la transizione allosterica tra statoad alta affinità e bassa affinità,aumentando l’efficienza dell’Hb nelrilasciare ossigeno ai tessuti.
SONO EFFETTORI ALLOSTERICI NEGATIVI: diminuiscono l’affinità dell’Hbper l’ossigeno
SITI REGOLATORI:
H+ SI LEGANO SU CATENE LATERALI IONIZZABILI E SUI GRUPPI N-TERMINALI
DELLE GLOBINE ALFA
CO2 SI LEGA SUI GRUPPI N-TERMINALI LIBERI DELLE GLOBINE BETA
2,3-bisfosfoglicerato SI LEGA NELLA CAVITA’ CENTRALE DEL TETRAMERO DI Hb
Effetto del pH: EFFETO BOHR
La diminuzione di pH nei capillari abbassa l’affinità dell’Hb verso l’O2
rendendone più efficiente il rilascio.La p50 sale da 26 a ~ 40 mm Hg
TESSUTI
POLMONI
Hb · 4O2 + nH+ Hb · nH+ + 4O2Hb · 4O2 + nH+ Hb · nH+ + 4O2
COME SPIEGARE IL MECCANISMO DELL’EFFETTO BOHR?
+-
-
+
COO- terminale delle catene β
La DEOSSI-Hb ha una maggiore tendenza a protonarsi della OSSI-Hb, ha un pI più alto. L’Hb ha vari siti di legame per gli ioni H+ come:
1) ammino-gruppi N-terminali delle catene alfa 2) His 146, residuo C-terminale, delle catene β3) altri……..
DEOSSI-HbSTATO T
Nei capillari tissutali, quando l’Hbinzia a deossigenarsi, l’His-146
delle catene β diventa più basica, il suo pKR aumenta (> 7.2)
α-2 Lys40
β-1 His146 β-1 Asp94
Nei capillari tissutali il pH è ~6.8
L’His-146, acquista un H+ e forma un ponte salino intra-catena con l’Asp 94, che stabilizza la forma
deossi-Hb (stato T)
Questo contribuisce al cambiamento strutturale
che favorisce l’ossigenazione completa
della Hb.
A livello polmonare l’Hb inizia a legare O2: inizia la transizione
allosterica (T > R), l’His-146 delle catene β diventa più acida, il suo
pKR diminuisce (~6.5 )
Nei capillari polmonari il pH è ~7.6, nel torrente circolatorio è ~7.2 (maggiore rispetto al pKR
dell’His-146).
L’His-146 si trova nella sua forma DEPROTONATA e
NON può formare il ponte salino con l’Asp 94
Hl94
―C ―lCH
2lC=OlO-
Hl94
―C ―lCH
2lC=OlO-
Hl146
¯ OOC―C ―
lCH2
l H
C―N
CH
C―N
H H
+
Hl146
¯ OOC―C ―
lCH2
l H
C―N
CH
C―N
H H
+
ANIDRIDE CARBONICA (CO2)La CO2 viene liberata nel circolo sanguigno alivello periferico durante i processi metabolicicellulari. È trasportata nel sangue in tre forme:
1) Parte della CO2 si lega all’Hb nelle estremità N-terminali libere delle catene globiniche β formando CARBAMMATI = gruppi carichi negativamente che stabiliscono interazioni elettrostatiche con i residui di Arg-141 delle catene α stabilizzando la forma T
CO2 + H2O HCO3- + H+ (reazione catalizzata dall’ANIDRASI
CARBONICA)
2) disciolta: obbedisce alla Legge di Henry come l'O2 ma è 20 volte piùsolubile di questo. In questa forma costituisce il 10% del gas liberato dalsangue venoso nel polmone.
Gli ioni H+ si legano alla DEOSSI-Hb (che più basica della forma
OSSI-Hb ed è quindi un accettore di protoni migliore)
il bicarbonato, quando aumenta di concentrazione, diffonde dal
globulo rosso al plasma scambiandosi con ioni Cl-
Contribuisce all’effetto BOHR e quindi al rilascio di O2
3) Diffonde all’interno degli eritrociti dove è convertita in bicarbonato:
CO2Effettore allosterico negativo per l’Hb
1,00
0.75
0.50
0.25
0.0
Y
20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
pO2 (mmHg)
Se la pCO2 diminuiscel’affinità aumenta(p50 + bassa) Se la pCO2 aumenta
l’affinità diminuisce(p50 + alta)
