Integrantes:

Andrea Ardila

David Cáceres

Jenny Bohórquez

Daniela Bernal

Separación y cuantificación de proteínas de la leche

Objetivos:

1. Evidenciar el efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas

hidrosolubles.

2. Evidenciar el proceso de separación de proteínas por precipitación salina.

Introducción:

Desnaturalización mediante pH

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar

a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los

grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta

alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones

electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su

precipitación. La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico,

ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión

electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados.

Caseínas

Las caseínas son las principales proteínas de la leche. Se sintetizan

exclusivamente en la glándula mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor

parte formando agregados multimoleculares conocidos como “micelas de

caseína”. En la leche de vaca, las caseínas representan alrededor del 80% del

total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche. En la leche

humana la presencia de proteínas del lacto suero es mucho mayor, de tal forma

que las caseínas son solamente del orden de la mitad de las proteínas totales,

entre 5 y 8 gramos por litro.

Reactivo de Biuret

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos

cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de

composición desconocida.

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con

tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a

violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con

polipéptidos de cadena corta.

Absorbancia

La absorbancia, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra. Está

definida como: así se cambia una información. El log no el menos logaritmo,

Siendo la intensidad después de haber habido la absorción la intensidad de la

luz que se hace incidir en la muestra. Se suele emplear en la química analítica ya

que se cumple, la llamada, Ley de Beer-Lambert: Siendo el coeficiente de

extinción molar, la concentración y distancia de la celda. La ley de Beer es una ley

aditiva en un determinado rango de concentraciones, y por tanto si se tienen

diferentes sustancias en una muestra la ley de beer se tiene como:

La absorbancia es una medida de la cantidad de luz con una longitud de onda

específica que un determinado material impide que pase a través de él. No

necesariamente mide la cantidad de luz que el material absorbe. Por ejemplo, la

absorbancia debería incluir también la luz que se dispersa por la muestra. Podría

calcularse a partir de la transmitancia, que es la fracción de luz que pasa a través

del material a prueba.

Separación de proteínas por soluciones salinas

La precipitación salina es uno de los métodos de separación de proteínas de

estado natural (actividad biológica).

El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la precipitación salina

de proteínas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a una

temperatura de 20 ºC) y el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas

iónicas.

Las proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica

y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio

((NH4)2SO4). Sin embargo, la concentración para precipitar diferentes proteínas

es variable. Esta diferencia en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar

proteínas, por ejemplo las albúminas y globulinas a, b, g de la clara de huevo. En

esta determinación la proteína blanca del huevo (clara) será separada en

fracciones de globulina y albúmina.

Sobrenadante:

Fracción homogénea que no ha sedimentado luego del proceso de centrifugación

diferencial en una muestra.

Solubilidad de las proteínas:

Las proteínas son solubles en agua cuando adoptan una conformación globular.

La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al

ionizarse, establecen enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de

agua. Así, cuando una proteína se solubiliza queda recubierta de una capa de

moléculas de agua (capa de solvatación) que impide que se pueda unir a otras

proteínas lo cual provocaría su precipitación (insolubilización). Esta propiedad es

la que hace posible la hidratación de los tejidos de los seres vivos.

Punto Isoeléctrico

El Punto Isoeléctrico (IEP) está definido como el pH en el cual las cargas positivas

igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo eléctrico.

En su calidad de proteína, la gelatina exhibe una conducta anfotérica debido a la

presencia de grupos funcionales de aminoácidos y grupos amino y carboxilo

terminales. En medios acídicos, es decir en presencia de altas concentraciones

de iones H+, la gelatina tiene carga positiva. En medios alcalinos, es decir en

presencia de iones OH-, la gelatina tiene carga negativa. En el punto isoeléctrico

(IEP) las cargas positivas de los radicales NH3+ igualan a las cargas negativas de

los radicales COO-.

El IEP es una propiedad intrínseca de la gelatina, determinada por los tratamientos

de las materias primas y el tipo de proceso:

● Las gelatinas Tipo A (ácidas) presentan un IEP que oscila entre 6 - 9.5. Sin

embargo, el tratamiento previo de ciertas materias primas (como por ejemplo el

proceso de depilado del cuero o piel) pueden bajar el IEP a menos de 6.

● Las gelatinas Tipo B (alcalinas) tienen un IEP que oscila entre 4.5 – 5.6.

La gelatina con un IEP bajo se debe al fenómeno de deamidación de aminoácidos.

Las gelatinas de Tipo A y B provenientes de materias primas tratadas o pre

tratadas con sustancias alcalinas que eliminan los grupos de amidas, presentan un

IEP bajo.

Las funcionalidades de las proteínas se ven afectadas cuando se aproximan al

IEP, debido a la atracción electroestática de los grupos con carga opuesta. De

esta manera, en el IEP las propiedades de la gelatina coinciden con los valores

máximos o mínimos. Mínimos: hidratación, viscosidad y gelificación; máximos:

turbidez, fuerza de gel, poder de espumado y sinéresis-

El IEP es útil para explicar las posibles interacciones de la gelatina con otros

ingredientes, en particular los polímeros aniónicos. Por ejemplo, una gelatina Tipo

B interactúa mejor con un polímero aniónico (ej. Carrageninas en el mousse de

chocolate) para evitar la precipitación por incompatibilidad, que depende de las

condiciones de pH.

Metodología

Se realizaron dos experimentos, en el primero se agregó en un tubo agua

destilada y reactivo de biuret se mezcló, después se calibró en el

espectrofotómetro, en otro tubo de ensayo se adiciono leche y reactivo de biuret,

se mezcló y se midió la absorbancia. En el segundo se agregó leche a un vaso

precipitado y se midió el pH, se agregó lentamente en pequeñas cantidades HCl,

se agitó magnéticamente hasta obtener un pH de 4, 7, se filtró al vacío para poder

determinar el peso de las caseínas, luego se tomó el sobrenadante con reactivo

de biuret se mezcló y se midió la absorbancia, se tomó otra parte de la

absorbancia con sulfato de amonio saturada y se mezcló por último se centrifugó y

se observó la presencia de precipitado.

Resultados:

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.20

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

f(x) = 0.210969764011799 x + 0.698485250737463

Curva de calibracion

Y=0,211X+O ,6985

Cálculos para determinar la concentración de las proteínas totales de la

leche.

( y−0,6985)0,211

=x

Absorbancia en blanco:

(0,011−0,6985)0,211

=x

x=−3,26

Absorbancia de la leche:

(0,149−0,6985)0,211

=x

x=−2,60

Determinar el porcentaje de las caseínas

pv=%

1,027g20mL

=0,05135 x100=5,135%

Cálculos para determinar la concentración de las proteinas solubles en la

leche:

(0,218−0,6985)0,211

=x

x=−2,28

Análisis:

Al adicionarle sal a una proteína hidratada se elimina el agua, dejando las

regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente,

desnaturalizándola y haciéndole perder diferentes enlaces dependiendo de

la estructura que cada proteína. La solubilidad se ve afectada por la

concentración y numero de cargas que aporte, lo que se conoce

generalmente como fuerza iónica. Las sales modifican la estructura del

agua he influyen también en la conformación de proteínas mediante

interacciones electrostáticas como función de la fuerza iónica, las sales

puedan solubilizar o precipitar las proteínas.

Al desnaturalizar una proteína se modifica la estructura tanto secundaria,

terciaria y cuaternaria haciendo que la proteína quede en estructura

primaria. Algunos factores que influyen en la desnaturalización de las

proteínas son los cambios de temperatura, Ph y radiaciones. Al

desnaturalizarse una proteína los cambios de la misma generan la

eliminación el agua volviéndola hidrofóbica y así rompiendo enlaces

dejando una estructura primaria de la proteína.

La leche es una mezcla de proteínas, lípidos y glúcidos en un medio acuoso

además de contener vitaminas y sales minerales, dichas proteínas están

formadas por aminoácidos en cadena. Según la combinación y proporción

de estos aminoácidos existen varios tipos de proteínas (caseína, beta-

lactoglobulina, alfa-lactoalbumina, lactoferrina, lactoperioxidasa,

inmunoglobulinas, lisozima), que cumplen determinadas funciones

especializadas.

-Caseína: comprende varios tipos de moléculas que son partículas sólidas

que permanecen en suspensión, cubre el mayor porcentaje de proteína en

la leche dependiendo de donde provenga, esta proteína se encuentra en un

medio acido o alcalino y se produce su desnaturalización, se produce una

reacción química alterando su estructura por lo que deja de ser soluble en

agua provocando que se precipite en forma de grumos.

Las proteínas necesitan del equilibrio de un campo eléctrico para

neutralizarlo es por esta razón que la composición de la proteína al ser

variada puede necesitar de un PH alto o bajo según la necesidad de una

base o un ácido. Un ejemplo de esto es el punto isoeléctrico de la lisozima

que es de 11.3, demostrando que precipita a un PH básico.

Para una alimentación especial, la caseína sirve para la elaboración de

preparados médicos y concentrados proteicos destinados a la alimentación

de los deportistas, especialmente después de su entrenamiento. Así, se ha

observado que la digestión de las caseínas es más lenta que la de las lacto

proteínas solubles (también denominadas seroproteínas) y, por ello, más

apropiada para reparar el anabolismo de los aminoácidos durante el

período que sigue a una comida

Conclusiones:

el proceso de separación de proteínas se puede dar por la presencia de

sales pues estas son las que ayudan a desnaturalizar las proteínas y de

esta manera saber cuál es la concentración, si no hay sales suficientes

sales no es posible saber con exactitud la concentración de las proteínas,

pero gracias a los cálculos realizados se pudo evidenciar esta separación

correctamente.

se puede decir que el pH en las proteínas hidrosolubles si puede ser

modificado esto se pudo evidenciar con las sales, pues estas modificaron

el aguad donde se encontraban las proteínas solubles y se crearon n

interacciones electrostáticas que precipitaron o solubilizar las proteínas

presentes.

Bibliografía

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