ว.วทย. มข. 43(4) 726-737 (2558) KKU Sci. J. 43(4) 726-737 (2015)

คณสมบตของเอนไซมฟนอลออกซเดสและการตอบสนองตอการเหนยวน าดวยไวรสตวแดงดวงขาวในกงขาว

Properties of Phenoloxidase and Its Response to Challenging by White Spot Syndrome Virus in Litopenaeus vannamei

นงเยาว เทพยา1 พนทพา รณแสง1 พรรณ อศวตรรตนกล1 และ ประภาพร อทารพนธ1*

บทคดยอ

เอนไซมฟนอลออกซเดสเปนรปแบบท active ของโปรฟนอลออกซเดส ซงเปนเอนไซมหลกของ ครสเตเชยน รวมทงกงทมบทบาทส าคญในการปองกนตนเองตอการตดเชอกอโรค ในงานวจยน ไดท าใหเอนไซม ฟนอลออกซเดส (phenoloxidase, PO) บรสทธบางสวนจากฮโมไซทของกงขาวโดยการแยกดวยคอลมน Q-Sepharose และการท าโพลอะครลาไมดเจล อเลกโทรฟอรซสแบบเตรยม พบวาเอนไซม PO บรสทธบางสวนมมวลโมเลกล 457 kDa เมอวเคราะหโดยโพลอะครลาไมดเจล อเลกโทรฟอรซสแบบไมแปลงสภาพ และมจลนศาสตรแบบไฮเพอรโบลา โดยมคา KM และ Vmax ส าหรบ L-DOPA (3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine) เปน 10 mM และ 0.014 A490/min ตามล าดบ และมความจ าเพาะตอสบสเตรท dopamine, catechol และ pyrogallol แตไมจ าเพาะตอ tyrosine เอนไซม PO นถกกระตนไดดวยเอนไซมทรปซน ลามนารน ลโพโพลแซคคาไรดและโซเดยมโดเดซลซลเฟต ในการศกษาการตอบสนองของเอนไซม PO ตอการเหนยวน าดวยไวรสตวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus, WSSV) พบวาแอคทวทของเอนไซม PO ในฮโมไซทของกงทถกฉดดวย WSSV เพมขนอยางตอเนองและเพมสงสดท 18 ชวโมง หลงการฉด แลวมคาลดลง ในขณะทกงชดควบคมซงฉดดวยน าเกลอมระดบแอคทวทไมแตกตางกนทเวลาตาง ๆ ผลการทดลองเหลานบงชวาเอนไซม PO สามารถถกกระตนได และอาจเกยวของในระบบภมคมกนของกงทตอบสนองตอการตดเชอไวรสกอโรค

1คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร อ าเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา 90112 *Corresponding Author; E-mail: prapaporn.u@psu.ac.th

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 727

ABSTRACT Phenoloxidase, an active form of prophenoloxidase (proPO), is a key enzyme of

crustaceans including shrimp that plays an important role in defense mechanism against pathogenic infection. In this study, phenoloxidase from the hemocytes of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei was partially purified by chromatography on Q-Sepharose column and subsequently by preparative polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Partially purified enzyme had a molecular mass of 457 kDa determined by native PAGE. It had hyperbolar kinetics for L-DOPA (3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine) with KM and Vmax values of 10 mM and 0.014 A490/min, respectively. It also showed substrate specificity to dopamine, catechol and pyrogallol except tyrosine. Partially purified enzyme could be activated by trypsin, laminarin, lipopolysaccharide and sodium dodecyl sulfate. In order to study the response of this enzyme towards pathogens, white shrimp were challenged with white spot syndrome virus (WSSV). After WSSV injection, phenoloxidase activities in the hemocytes increased continuously to reach the maximum at 18 hour post-injection and then declined. In contrast, no significant differences of phenoloxidase activities were detected in the control shrimp which were injected with 0.85% NaCl in parallel. These results indicate that phenoloxidase is inducible and may be involved in a shrimp immune response against pathogenic viruses.

ค าส าคญ: เอนไซมฟนอลออกซเดส กงขาว เชอกอโรค ไวรสตวแดงดวงขาว Keywords: Phenoloxidase, Litopenaeus vannamei, Pathogen, White spot syndrome virus

บทน า การเพาะเลยงกงทะเลเปนอตสาหกรรมท

ส าคญทางเศรษฐกจชนดหนงของประเทศไทย กงทนยมเพาะเลยงกนมากในประเทศไทยในขณะน คอ กงขาว (Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei) ซ ง เขามาแทนทก งกลาด า (Penaeus monodon) ทมการตดเชอกอโรคจนท าใหผลผลตลดลงอยางมาก ประเทศไทยไดมการพฒนาเทคนคการเพาะเลยงจนสามารถเลยงกงในระบบหนาแนนได แตกมปญหาทหลกเลยงไดยาก เพราะการเพาะเลยงแบบนท าใหกงเครยดและออนแอ จงมกเกดโรคระบาดทเกดจากการตดเชอจลนทรยกอโรคกงไดงาย ไวรสทแพร

ระบาดโดยท าใหกงเกดโรคในประเทศไทยคอโรค ตวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus, WSSV) ซ งกอโรคในก งขาวไดดวย ปจจบนเรมมรายงานการเกดโรคระบาดดวยโรคตายดวนของกงขาว ซงยงอยในระหวางการท าวจยเพอหาสาเหตทแนชด แตรายงานเบองตนพบวานาจะมาจากเชอแบคทเรยและไวรส ปจจบน โรคระบาดของกงกอใหเกดความเสยหายตออตสาหกรรมการเพาะเลยงก ง เปนอยางมาก การศกษาโปรตนหรอเอนไซมทมบทบาทเกยวของกบกลไกการปองกนตนเองจากเชอกอโรคหรอระบบอมมน (immune system) จงมความส าคญตอการเพาะเลยงกง

728 KKU Science Journal Volume 43 Number 4 Research

กงเปนสตวไมมกระดกสนหลงในกลมครสเต- เชยน (crustacean) มระบบไหลเวยนเลอด เรยกวา ฮโมลมฟ (hemolymph) เปนแบบเปด ระบบอมมนของสตวกลมน ประกอบดวยการท างานของเมดเลอดหรอเซลลฮโมไซท (hemocyte) ไดแก การเกดฟาโก- ไซโทซส (phagocytosis) การเกดโนดล (nodule formation) หรอการกกลอม (encapsulation) เชอจลนทรยทบกรก เปนตน ครสเตเชยนยงมกลไกปองกนตนเองโดยอาศยสารน า (humoral immunity) ทประกอบดวยโปรตนหลายชนด (Söderhäll and Cerenius, 1998) ซงมปรมาณเพมขนในฮโมลมฟเมอสตวเกดการตดเชอหรอถกกระตน โปรตนชนดหนงคอเอนไซมฟนอลออกซเดส (phenoloxidase, PO) ทมบทบาทส าคญเกยวของกบการปองกนตนเองของ ครสเตเชยนจ าพวกกงและแมลง (Söderhäll and Cerenius, 1992) โดยเปนเอนไซมในวถการผลตเมลา- นน (melanin) เพอตอบสนองดวยการชวยก าจดจลนทรยบกรก ในแมลงพบเอนไซม PO ในฮโมลมฟทงในเซลลเมดเลอดและพลาสมา (plasma) แตใน ครสเตเชยนพบเอนไซมนในกรานล (granule) ของเซลลฮโมไซท เอนไซม PO มบทบาทในการปองกนตนเอง (Sugumaran, 1996; Söderhäll et al., 1996; Ashida and Brey, 1997) โดยการเปลยนจากโปรตนโปรฟนอลออกซเดสไปเปนเอนไซม PO ดวยเอนไซม serine protease ซงถกกระตนไดดวยผนงเซลลของเชอจลนทรยแตละชนด เชน เบตา-1,3-กลแคน (-1,3 glucan) (Hernandez-Lopez et al., 1996; Vargas-Albores et al., 1993; Medzhitov and Janeway, 2002) หรอลโพโพลแซคคาไรด (lipopoly-saccharide, LPS) (Ashida et al., 1983) เอนไซม PO เรงปฏกรยา o-hydroxylation และ oxidation ของ phenol ซงเปนปฏกรยาทเกดในวถ

การสรางเมลานนและไปยบยงการเจรญของจลนทรยทบกรกตอไป (Söderhäll and Cere-nius, 1992)

งานวจยนเลอกกงขาวในการศกษา และเลอก WSSV เปนแบบจ าลองของการตดเชอกอโรคกง โดยมจด ประสงคทจะศกษาสมบตระดบโปรตนของเอนไซม PO ดวยการท าบรสทธเอนไซมนจากฮโมไซท และตดตามการแสดงออกของเอนไซม PO ของกงขาวทถกเหนยวน าดวยเชอไวรสกอโรค ความรทไดในเบองตนนอาจจะยงไมสามารถน าไปแกปญหาการตดโรคกงโดยตรงได แตจะเปนขอมลวจยทเปนประโยชนในการเพาะเลยงกงตอไป

วธด าเนนการวจย 1. การเตรยมเซลลฮโมไซทจากเลอดของกงขาว

ดดเลอดจากกงขาวแลวผสมกบสารกนเลอดแขงตว (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA และ 10 mM HEPES, pH 7.5) (Gollas-Galvan et al., 1999) ทนทในอตราสวน 1:1 น าไปเซนตรฟวจ

(centrifuge) ทความเรว 700 x g ท 4ซ นาน 10 นาท ลางตะกอนฮโมไซทตอโดยการแขวนลอยในบฟเฟอร 10 mM sodium cacodylate, 0.45 M NaCl, 10 mM CaCl2, 26 mM MgCl2, pH 7 แลวเซน

ตรฟวจอกคร ง เกบตะกอนท -80ซ เพอใชศกษาเอนไซม PO ตอไป

ในการเตรยมสารสกดฮโมไซทท าโดยโฮโมจไนซ (homogenize) ฮโมไซทใน 10 mM sodium cacodylate, pH 7 เซนตรฟวจทความเรว 16,000 x g

ท 4ซ นาน 10 นาท น าสวนใสหรอสารสกดฮโมไซทไปท าใหเอนไซม PO บรสทธหรอวดแอคทวท (activity) ตอไป

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 729

2. การวดแอคทวทของเอนไซม PO วดแอคทวทของเอนไซม PO ตวอยาง โดยใช

L-DOPA (3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine) เปนสบสเตรท (substrate) ดงน ผสมเอนไซมตวอยางกบ 0.5 mg/ml Trypsin ในบฟเฟอร CAC (10 mM cacodylate, pH 8 ทม 25 mM CaCl2) ทมปรมาตรรวม 250 ไมโครลตร บมทอณหภมหอง 5 นาท แลวเตม 3 mg/ml L-DOPA ปรมาตร 150 ไมโครลตร บมตออก 45 วนาท แลวเตมบฟเฟอร CAC ใหมปรมาตรครบ 1 มลลลตร วดคาดดกลนแสงทความยาวคลน 490 นาโนเมตร (A490) ทกนาท นาน 5 นาท ค านวณหาแอคทวทของเอนไซม PO โดยก าหนดใหแอคทวทของเอนไซม 1 หนวย (unit, U) คอคา A490 ทเปลยนไป 0.001 หนวย ในเวลา 1 นาท 3. การยอมแอคทวทของเอนไซม PO ใน Native PAGE

เพอหาแถบโปรตนของ เอนไซม PO น าเอนไซมตวอยางไปแยกดวยการท าโพลอะครลาไมดเจลอเลกโทรฟอรซสแบบไมแปลงสภาพ (Native polyacrylamide gel electrophoresis, Native PAGE) (Davis, 1964) หลงการท าอเลกโทรฟอรซส แบงเจลเปน 2 สวน สวนหนงน าไปยอมโปรตนดวยส คมาซบล (0.02% Coomassie blue R-250, 50% methanol, 7.5% acetic acid) เจลอกสวนยอมแอคทวทดวยการแชใน 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5 ทม 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) บมปฏกรยาทอณหภมหองนาน 30 นาท จากนนเตม 10 mM L-DOPA บมปฏกรยาตออก 60 นาท เมอเหนแถบของเอนไซมชดเจน ลางเจลดวยน ากลน 4. การท าบรสทธเอนไซม PO จากสารสกดฮโมไซท

ท าใหเอนไซม PO บรสทธจากสารสกดฮโม- ไซทดวยคอลมน Q-Sepharose (ปรมาตรเจล 5 มลลลตร) ทปรบคอลมนใหสมดลกอนดวยบฟเฟอร TB

(50 mM Tris-HCl, pH 7.5) น าสารสกดฮโมไซทผานลงในคอลมน Q-Sepharose ลางคอลมนดวยบฟเฟอรชนดเดม ปรมาตร 10 มลลลตร ดวยอตราไหล 30 มลลลตร/ชวโมง เกบสารละลายหลอดละ 0.5 มลลลตร แลวชะโปรตนออกจากคอลมนดวยบฟเฟอร TB ทม 0-0.5 M NaCl ปรมาตร 22 มลลลตร ชะคอลมนตอดวยบฟเฟอร TB ทม 0.5 M NaCl ปรมาตร 8 มลลลตร น าสารละลายแตละหลอดไปวดแอคทวทของเอนไซม PO และหาปรมาณโปรตน (Bradford, 1976) รวมสารละลายหลอดทมแอคทวทของเอนไซม PO สงเขาดวยกน ท าใหเขมขนและไดแอไลซ (dialyze) แลวท าใหบรสทธตอดวย preparative PAGE (Auttarat et al., 2006) โดยแยกสารละลายเอนไซม PO เขมขนดวย Native PAGE ในเจลทงแผน ตดเจลเฉพาะแถบโปรตนทเปนเอนไซม PO น าชนเจลทตดไปโฮโมจไนซ

เซนตรฟวจทความเรว 16,000 x g ท 4ซ นาน 10 นาท แลวน าสวนใสทไดไปทดสอบความบรสทธของเอนไซม PO ดวยการท า Native PAGE และยอมสโปรตนและยอมแอคทวท 5. การทดสอบการฉดกงดวย WSSV ทมผลตอระดบแอคทวทของเอนไซม PO

หวเชอไวรส WSSV ไดรบความอนเคราะหจากศนยวจยสขภาพสตวน า มหาวทยาลยสงขลา นครนทร ฉดกงดวย WSSV (10-7 เทาของหวเชอ/ตว) ทบร เวณกลามเนอโคนหาง กงชดควบคมฉดดวยน าเกลอ (0.85% NaCl) ปรมาตรเทากน ในการทดลองนใชกง 35 ตวในแตละกลมทดลอง และท าการทดลองกลมละ 2 ซ า จากนนน ากงไปเลยงตอตามปกต ดดเลอดจากกงแตละตวทเวลา 0, 6, 12, 18, 24, 48 และ 72 ชวโมง เวลาละ 3-5 ตว แลวน าไปเตรยมสารสกด ฮโมไซทตามวธขอ 1 เพอหาแอคทวทของเอนไซม PO

730 KKU Science Journal Volume 43 Number 4 Research

ผลการวจย 1. การท าบรสทธเอนไซม PO

ไดท าบรสทธเอนไซม PO จากเซลลฮโมไซทของกงขาว โดยแยกสารสกดฮโมไซทเรมตนทมแอคท- วทของเอนไซม PO 1,370 หนวย/มลลลตร มปรมาณโปรตน 1.61 มลลกรม เตรยมจากเลอดกงขาวปรมาตร 22 มลลลตร ดวยคอลมน Q-Sepharose จากการลางคอลมนดวยบฟเฟอร TB พบวาแอคทวทของเอนไซม PO สวนมาก (54%) หลดออกมาจากคอลมนในพคแรก Q1 (peak Q1) (รปท 1) เมอชะคอลมนดวยบฟเฟอรทม 0-0.5 M NaCl พบวาไมมเอนไซม PO หรอโปรตนถกชะออกมา แตเมอชะคอลมนตอดวย 0.5 M NaCl มเอนไซม PO ถกชะออกมานอยมาก ในขณะทโปรตนสวนนอย (0.17 มลลกรม) ไมจบกบคอลมนหลดออกมาในพค Q1 และโปรตนเกอบทงหมดถกชะออกมาจากคอลมนดวย 0.5 M NaCl ในพค Q2 (รปท 1) เมอค านวณแอคทวทจ าเพาะ (specific activity) ของสารละลายเอนไซม PO ในพค Q1 พบวามความบรสทธเพมขน 4.7 เทา และแยกเอนไซมได 54.2% ของเอนไซมในสารสกดฮโมไซทเรมตน (ตารางท 1) โดยพบแอคทวทในพค Q1 เปนหลก บงชวาเอนไซม PO สวนใหญไมจบกบคอลมน ในขณะทโปรตนปรมาณมากจบกบคอลมน จงเหมาะตอการใชคอลมน Q-Sepharose เปนขนตอนหนงในการท าใหเอนไซม PO บรสทธ

จากการวเคราะหดวยวธ Native PAGE พบวาสารสกดฮโมไซทเรมตนปรากฏแถบโปรตนหลก

สองแถบ (รปท 2 แถวท 2) คอแถบเอนไซม PO ทยอมตดสคมาซและสของสบสเตรท ณ ต าแหนงทลกศรช (แถบ PO ในรปท 2) กบอกแถบคอโปรตนฮโมไซยานน (hemocyanin, HC) (รปท 2) (อาจรย, 2552) ทไมมแอคทวทของเอนไซม PO เมอน าสารละลายเอนไซมพค Q1 ทมปรมาณโปรตนเหลอนอยมาก ไปทดสอบความบรสทธดวยวธ Native PAGE ปรากฏโปรตนเพยงสองแถบคอแถบเอนไซม PO และยงมแถบโปรตนฮโมไซยานนปนเปอนอยแมจะมปรมาณนอยลง (ไมไดแสดงผลไว ) แสดงวาคอลมน Q-Sepharose ส า ม า ร ถ ก า จ ด โ ป ร ต น ส ว น ใ ห ญ ร ว ม ท ง ฮ โ ม - ไซยานนออกไป แตยงแยกไมไดเอนไซมทบรสทธ จงน าสารละลายเอนไซมพค Q1 ไปแยกตอดวยการท า preparative PAGE ซงพบวาสามารถแยกเอนไซม PO ไดบรสทธมากขน เพราะมความบรสทธเพมเปน 6.5 เทาของเอนไซมในสารสกดฮโมไซทเรมตน แตกสญเสยแอคทวทไปมาก เพราะแยกเอนไซมไดเพยง 28.1% (ตารางท 1) รวมทงมโปรตนเหลอเพยง 0.07 มลลกรม เมอน าไปทดสอบดวยวธ Native PAGE พบแถบเอนไซม PO และยงมแถบฮโมไซยานนทตดสยอมโปรตนจาง ๆ (ไมไดแสดงผลเจลทยอมโปรตนไวเพราะรปไมชด) บงชวางานวจยนท าบรสทธเอนไซม PO จากฮโมไซทของกงขาวไดเพยงบางสวน (partially purified PO หรอ ppPO) แตอยางไรกตาม เอนไซม ppPO ทแยกไดแมมปรมาณโปรตนนอยแตมแอคทวทของเอนไซม PO มาก (รปท 2 แถวท 3 และตารางท 1) จงน าไปศกษาสมบตของเอนไซม ppPO ในขอตอ ๆ ไป

ตารางท 1 การท าบรสทธเอนไซม PO จากสารสกดฮโมไซท (เปนคาเฉลยจากการทดลอง 2 ซ า)

Preparation Specific activity (U/mg) Yield (%) Purification fold Hemocyte lysate 848 100 1 Q-Sepharose peak Q1 3,985 54.2 4.7

Preparative PAGE eluate 5,512 28.1 6.5

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 731

รปท 1 การท าบรสทธเอนไซม PO จากสารสกดฮโมไซทโดยคอลมน Q-Sepharose

รปท 2 แบบแผนโปรตนและแอคทวทของเอนไซม PO ใน Native PAGE ทยอมดวยสคมาซบล แถวท 1 โปรตนมาตรฐาน; แถวท 2 สารสกดฮโมไซท; แถวท 3 เอนไซม ppPO ทไดจากการท า preparative PAGE และยอมแอคทวท

2. การศกษาสมบตของเอนไซม PO บรสทธบางสวน (ppPO)

เนองจากเอนไซม ppPO ทแยกไดมปรมาณโปรตนนอยมาก จงไมสามารถหามวลโมเลกลโดยวธโครมาโทกราฟแบบเจลฟลเทรชน (gel filtration) ได งานวจยนจงหามวลโมเลกลของเอนไซม ppPO โดยวธ Native PAGE ท าควบคกบโปรตนมาตรฐาน 5 ชนด คอ thyroglobulin (669 kDa), ferritin (440 kDa), catalase (232 kDa), lactate dehydrogenase (140 kDa) และ bovine serum albumin (67 kDa) พบวาเอนไซม ppPO ของกงขาวมมวลโมเลกล 457 kDa

จากการศกษาผลของ pH ตอแอคทวทของเอนไซม ppPO ดวยการวดแอคทวทในบฟเฟอรทม pH ตาง ๆ ในระหวาง pH 4-11 พบวาเอนไซม ppPO ไมมแอคทวทท pH 4 แตมแอคทวทเพมขนตามล าดบจาก pH 5 จนมคาสงสดท pH 8 แลวมแอคทวทลดลง ท pH 9-11 (รปท 3)

ในการศกษาจลนศาสตรและความจ าเพาะของเอนไซม ppPO ตอสบสเตรทโดยการวดแอคทวทของเอนไซม ppPO เมอใชสบสเตรท 5 ชนด ไดแก L-DOPA, catechol, dopamine, tyrosine และ pyrogallol ทความเขมขนตาง ๆ แลวค านวณหาคา KM และ Vmax จากกราฟแบบ Lineweaver-Burk พบวาเอนไซม ppPO สามารถเรงปฏกรยาของ

732 KKU Science Journal Volume 43 Number 4 Research

สบสเตรท L-DOPA, catechol, dopamine, และ pyrogallol ไ ด แ ต ไ ม ส าม า รถ ใ ช tyrosine เ ป นสบสเตรท โดยแสดงจลนศาสตรของสบสเตรททง 4 ชนดแบบ hyperbola (รปท 4) ซงมคา KM และ Vmax สรปรวมอยในตารางท 2 เอนไซม ppPO ของกงขาวม

ความ จ าเพาะ (KM) ตอ pyrogallol มากสดแลวลดลงตามล าดบดงนคอ catechol, L-DOPA และ dopamine และเรงปฏกรยาดวยความเรวสงสด (Vmax) ส าหรบ L-DOPA ไดดกวาสบสเตรทอก 3 ชนด

รปท 3 ผลของ pH ตอแอคทวทของเอนไซม ppPO (คาทแสดงเปนคาเฉลยจาก 2 การทดลอง)

รปท 4 จลนศาสตรของเอนไซม ppPO ทใช L-DOPA เปนสบสเตรท (คาทแสดงเปนคาเฉลยจาก 2 การทดลอง)

ตารางท 2 คา KM and Vmax ของเอนไซม ppPO Substrates KM (mM) Vmax (A/min)

L-DOPA 10.0 0.014

Dopamine 23.8 0.005 Catechol 5.0 0.002

Pyrogallol 2.4 0.007

ในการศกษาผลของตวกระตน ดวยการบมเอนไซม ppPO กบกระตนแตละชนด ทความเขมขน 0.5 มลลกรม/มลลลตร เทากน ทอณหภมหอง นาน 30 นาท แลววดแอคทวทเปรยบเทยบกบแอคทวทในภาวะทไมมตวกระตน พบวา LPS กระตนแอคทวทของเอนไซม ppPO ไดดทสด (68.5 เทา) รองลงมาตามล าดบคอ เอนไซมทรปซน (trypsin) (45 เทา) SDS

(23 เทา) และลามนารน (2.6 เทา) สวน urea ไมกระตนแอคทวทของเอนไซม ppPO 3. การศกษาผลการฉด WSSV ตอระดบแอคทวทของเอนไซม PO ในเลอดของกงขาว

จากการศกษาผลของการฉดก งขาวดวย WSSV ปรมาณตวละ 1×10-7 เทาของปรมาณหวเชอ ซงเปนปรมาณทกระตนใหกงกลาด าเกดโรค (กจการ

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 733

และคณะ, 2542) พบแอคทวทของเอนไซม PO ใน ฮโมไซทเพมขนอยางตอเนองจากชวโมงท 0 จนมคาสงสดทชวโมงท 18 หลงการฉด จากนนมระดบลดลงตามล าดบทชวโมง 24-72 (รปท 5) ในขณะท เอนไซม PO ของกงชดควบคมทฉดดวยน าเกลอม แอคทวทในฮโมไซทไมแตกตางกนตลอดชวงเวลา 0-72 ชวโมง บงชวา เอนไซม PO มระดบแอคทวทเปลยนแปลงในฮโมไซทตอบสนองตอการเหนยวน าดวยไวรสกอโรค

วจารณผลการวจย งานวจยนท าบรสทธเอนไซม PO จากฮโมไซท

ของกงขาวไดเพยงบางสวน (ppPO) และแมจะมโปรตนฮโมไซยานนปนเปอนอยบาง แตฮโมไซยานน ของกงขาวไมมแอคทวทของเอนไซม PO (รปท 2 แถวท 3) ซงสอดคลองกบของกงครมา (Kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus) ทรายงานโดย Masuda et al. (2012) หรอของหอยแครง (Chlamys farreri) (Xing et al., 2012) ทพบวาฮโมไซยานนไมมแอคทวทของเอนไซม PO ดงนนการศกษาสมบตของเอนไซม ppPO จงสะทอนสมบตของเอนไซม PO จรง ไมใชของ

โปรตนฮโมไซยานนทปนเปอน มรายงานการท าบรสทธเอนไซม PO จากเซลลเมดเลอดของกงนาง (crayfish Pacifastacus leniusculus) โดยคอลมน Blue-Sepharose ตามดวยคอลมน Phenyl-Sepharose และคอลมน Superose 6 FPLC (Aspan and Söderhäll, 1991) มการท าบรสทธเอนไซม PO จากหอยสองฝา (Ruditapes philippinarum) โดยคอลมน Q-Sepharose ตามดวยคอลมน Sephacryl S-100 (Cong et al., 2005) และ Gollas-Galvan et al. (1999) ท าบรสทธโปรฟนอลออกซเดสจากกง Penaeus californiensis ไดโดยวธ ultracentri-fugation และตอดวยคอลมน Blue-Sepharose นอกจากน มการท าบรสทธเอนไซม PO จากพลาสมาของกงครมาดวยการตกตะกอนดวย ammouim sulfate ตามดวยโครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจและเจลฟลเทรชน ตามล าดบ แตรายงานดงกลาวไมไดแสดงรายละเอยดของผลการแยกเอนไซม PO ไว (Masuda et al., 2012) จะเหนวาการท าบรสทธเอนไซม PO สวนมากใชหลายขนตอน งานวจยนไมไดท าบรสทธตอจนไดเอนไซมบรสทธเพราะท าใหสญเสยเอนไซมไปในแตละขนตอนมาก

รปท 5 การเปลยนแปลงของระดบแอคทวทของเอนไซม PO ในฮโมไซทของกงทฉดดวย WSSV หรอกงชดควบคม

ทฉดดวยน าเกลอ (*มนยส าคญทระดบ p<0.5)

734 KKU Science Journal Volume 43 Number 4 Research

จากการหามวลโมเลกลของเอนไซม ppPO ของกงขาวโดยวธ Native PAGE พบวามขนาด 457 kDa ในกรณทโปรตนมขนาดใหญมาก การหามวลโมเลกลโดย Native PAGE เปนทยอมรบในวารสารระดบนานาชาต (Auttarat et al., 2006) มรายงานเกยวกบมวลโมเลกลของเอนไซม PO ในรปไมแปลงสภาพ (native form) นอยมาก มรายงานมวลโมเลกลของเอนไซม PO บรสทธทหาโดยวธเจลฟลเทรชนเฉพาะของก งค รมาเท านน ซ งมขนาด 509 kDa (Masuda et al., 2012) รายงานสวนมากหามวลโมเลกลของเอนไซม PO ดวยวธ SDS-PAGE อยางไรกตาม พบวาเอนไซม PO ของกงขาวมขนาดเลกกวาของกงครมา ในงานวจยน เนองจากเอนไซม ppPO ทแยกไดยงไมบรสทธ จงไมสามารถหามวลโมเลกลและจ านวนหน วยยอยด วยวธ SDS-PAGE (Laemmli, 1970) ได แตอยางไรกตาม เอนไซม PO ทท าใหบรสทธจากครสเตเชยนสวนใหญปรากฏโปรตนเพยงแถบเดยวของหนวยยอยทเปนโมโนเมอร (monomer) ซงมมวลโมเลกลในชวง 60-77 kDa ใน SDS-PAGE (Hara et al., 1993; Fujimoto et al., 1993; Liu et al., 2006) เชนเอนไซม PO ของกงนางเปนโมโนเมอรขนาด 76 kDa (Aspan and Söderhäll, 1991) เ อ น ไ ซ ม PO บ ร ส ท ธ จ า ก ก ง ข า ว จ น (Fenneropenaeus chinensis) เปนโมโนเมอรขนาด 133 kDa (Fan and Wang, 2002) ส าหรบของกง P. californiensis เปนโมโนเมอรขนาด 114 kDa และพบเปน aggregated form ทมขนาด 205 kDa (Gollas-Galvan et al., 1999) สวนเอนไซม PO ของกงครมาปรากฏแถบเดยวทมขนาด 80 kDa ใน SDS-PAGE บงชวา native form (509 kDa) ของเอนไซม PO ของกงครมาจดเปน hexamer (Masuda et al., 2012)

จากการศกษาผลของ pH พบวาเอนไซม ppPO ของกงขาวท างานไดดสดท pH 8 คลายกบ

เอนไซม PO บรสทธของกง P. californiensis (Gollas-Galvan et al., 1999) และกง Penaeus setiferus (Simpson et al., 1987) ทมแอคทวทสงสดท pH 8.0 และ pH 7.5 ตามล าดบ ในหอยสองฝา (R. philippinarum) มแอคทวทสงสดท pH 7.0 (Cong et al., 2005) สวนเอนไซมของกงกลาด าท างานไดดทสดท pH 6.0 (Rolle et al., 1991) กลาวไดวาเอนไซม PO สามารถท างานไดดท pH เปนกลางและเปนเบส

เอนไซม ppPO ของกงขาวมความจ าเพาะตอสบสเตรททเปน L-DOPA, catechol, dopamine และ pyrogallol และมคา KM และ Vmax ตอสบสเตรทเหลานคลายกบของกงอน ๆ อาทเชน เอนไซม PO ของกง P. californiensis มคา KM ตอสบสเตรท L-DOPA, catechol และ tyrosine เปน 2.50, 2.89 และ 4.15 mM ตามล าดบ (Gollas-Galvan et al., 1999) เอนไซม PO ของกงครมาและกงขาวจนมคา KM ตอ L-DOPA เปน 3.45 mM และ 1.99 mM ตามล าดบ (Fan and Wang, 2002) เชนเดยวกบเอนไซม PO ของ brine shrimp (Artemia sinica) มคา KM ตอ L-DOPA และ catechol เทากบ 4.20 และ 10.9 mM ตามล าดบ (Fan et al., 2011) ของปมา (Charybdis japonica) เมอใชสบสเตรท L-DOPA และ catechol มคา KM เปน 3.41 และ 7.97 mM ตามล าดบ (Liu et al., 2006) ในหอยสองฝา (R. philippinarun) เอนไซม PO มความจ าเพาะตอสบสเตรท L-DOPA และ tyrosine โดยมคา KM เทากบ 2.2 mM และ 6.0 mM ตามล าดบ (Cong et al., 2005) แตเอนไซม ppPO ของกงขาวไมสามารถใช tyrosine (monophenol) เปนสบสเตรทได บงชวาเปน diphenol oxidase ซงโดยทวไปเอนไซม PO ในกงจดเปน diphenol oxidase มากกวาเปน monophenol oxidase (Gollas-Galvan et al., 1999)

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 735

เอนไซม ppPO ของกงขาวถกกระตนไดโดย LPS ดกวาเอนไซมทรปซน SDS และลามนารน โดยไมถกกระตนโดย urea ซงตางจากรายงานของ Lai et al. (2005) ทพบวา SDS กระตนแอคทวทของเอนไซม PO ในกงขาวไดดทสด สวนเอนไซมทรปซนกระตนแอคทวทของเอนไซม PO ไดดกวาลามนารนและ LPS (Lai et al., 2005) และตางจากเอนไซม PO ของกง P. californiensis ทแอคทวทถกกระตนไดโดยลามนารน แตไมถกกระตนโดย LPS (Hernandez-Lopez et al., 1996) งานวจยนบงชวาเอนไซมทรปซน ลามนารน (หรอ เบตากลแคน) และ LPS รวมทง SDS สามารถกระตนแอคทวทของเอนไซม PO ของกงขาวได

จากการศกษาผลของการฉดกงขาวดวยไวรสกอโรคกงชนด WSSV (Lightner, 1999) ไมพบการเปลยนแปลงระดบแอคทวทของเอนไซม PO ของกงชดควบคมทฉดดวยน าเกลอ ในขณะทแอคทวทของเอนไซม PO ในฮโมไซทของกงทฉดดวย WSSV มระดบเพมขนอยางตอเนองจนมคาสงสดทชวโมงท 18 หลงการฉด บงชวาระดบแอคทวทของเอนไซม PO ทเปลยนแปลงเปนการตอบสนองตอการเหนยวน าดวยไวรสกอโรค โดยมรายงานรปแบบการตอบสนองในท านองคลายกนของเอนไซม PO ทเพมขนและลดลงตามเวลาจากการฉดกงกามกราม (Macrobra-chium rosenbergii) ดวยแบคทเรยกอโรค Vibrio harveyi (Arockiaraj et al., 2013) หรอการแสดงออกของยน proPO ทเพมขนและลดลงตามเวลาจากการฉดกงนางดวย WSSV (Liu et al., 2013) จากผลการทดลองบงชวายน PO และเอนไซม PO มบทบาทในระบบอมมนเพอชวยปองกนตนเองจากเชอกอโรคของครสเต - เชยนรวมทงกง

กตตกรรมประกาศ ง า น ว จ ย น ไ ด ร บ เ ง น อ ด ห น น จ า ก ท น

งบประมาณแผนดน และขอขอบคณโครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษาและการพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต ส านกงานคณะกรรมการอดมศกษา และโครงการความเปนเลศ สาขาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร ทสนบสนนทนการศกษาแกนางสาวนงเยาว เทพยา

เอกสารอางอง กจการ ศภมาตย และคณะ . (2542). เทคนคการตรวจ

วนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยและไวรสในกงกลาด า . เอกสารประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ . ศนยวจยสขภาพสตวน า มหาวทยาลยสงขลา นครนทร, สงขลา.

อาจรย เจยวกก. (2552). การศกษาสมบตของฮโมไซยานนในกงแชบวย . วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต , มหาวทยาลยสงขลานครนทร. สงขลา: 110 หนา.

Arockiaraj, J., Gnanam, A.J., Pothikasalam, G., Milton, J., Pasupuleti, M., Bhatt, P., Palani-samy, R., Kumaresan, V., Kuppusamy, M., Thirumalai, K., Arasu, A., Sathyamoorthi, A. and Prabha, N. (2013). A novel prophenoloxidase, hemocyanin encoded copper containing active enzyme from prawn: Gene characterization. Gene 524: 139-151.

Ashida, M., Ishizaki, Y. and Iwahana, H. (1983). Activation of prophenoloxidase by bacterial

cell walls or -1,3-glucans in plasma of the silkworm, Bombyx mori. Biochem Biophys Res Commun. 113: 562-568.

Ashida, M. and Brey, P.T. (1997). Recent advances in research on the insect prophenol-oxidase cascade. In Molecular Mechanism of Immune Responses in Insects. London: Chapman and Hell. pp. 135-172.

736 KKU Science Journal Volume 43 Number 4 Research

Aspan, A. and Söderhäll, K. (1991). Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells. and its activation by an endogenous serine proteinase. Insect Biochem. 21: 363-373.

Auttarat, J., Phiriyangkul, P. and Utarabhand, P. (2006). Characterization of vitellin from the ovaries of the banana shrimp Litopenaeus merguiensis. Comp Biochem Physiol. 143B: 27-236.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quatities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.

Cong, R.S., Sun, W.J., Liu, G.X., Fan, T.J., Meng, X.H., Yang, L.L. and Zhu, L.Y. (2005). Purification and characterization of phenoloxidase from clam Ruditapes philippinarum. Fish Shellfish Immunol. 18: 61-70.

Davis, B.J. (1964). Disc electrophoresis: II. Method and application to human serum protein. Ann New York Acad Sci. 121: 404-427.

Fan, T., Jing, Z., Fan, X., Yu, M. and Jiang, G. (2011). Purification and characterization of phenoloxidase from brine shrimp Artemia sinica. Acta Biochim Biophyc Sinica 43: 722-728.

Fan, T.J. and Wang, X.F. (2002). Purification and partial biochemical characterization of phenoloxidase from Penaeus chinensis. Acta Biochim Biophyc Sinica 34: 589-594.

Fujimoto, K., Masuda, K., Asada, N. and Ohnishi, E. (1993). Purification and characterization of prophenoloxidase from pupae of Drosophila melanogaster. J Biochem. 113: 285-291

Gollas-Galvan, T., Hernandez-Lopez, J. and Vargas-Albores, F. (1999). Prophenoloxidase from brown shrimp (Penaeus californiensis)

hemocytes. Comp Biochem Physiol. 122B: 77-82.

Hara, T., Miyoshi, T. and Tsukamoto, T. (1993). Comparative studies on larval and pupal phenoloxidase of the housefly, Musca domestica L. Comp Biochem Physiol. 106: 287-292.

Hernandez-Lopez, J., Gollas-Galvin, T. and Vargas-Albores, F. (1996). Activation of the pro-phenoloxidase system of the brown shrimp (Penaeus californiensis Holmes). Comp Biochem Physiol. 113C: 61-66.

Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structure protein during as sembly of head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Lai, C.-Y., Cheng, W. and Kuo, C.-M. (2005). Molecular cloning and characterization of prophenoloxidase from haemocytes of the white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol. 18: 417-430.

Lightner, D.V. (1999). The Penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV and YHV: Current status in the Americas, available diagnostic methods and management strategies. J App Aquacul. 9: 27-52.

Liu, G., Yang, L., Fan, T., Cong, R., Tang, Z., Sun, W., Meng, X. and Zhu, L. (2006). Purification and characterization of phenoloxidase from crab Charybdis japonica. Fish Shellfish Immunol. 20: 47-57.

Liu, Y.-T., Chang, C.-I, Hseu, J.-R., Liu, K.-F. and Tsai, J.-M. (2013). Immune responses of prophenoloxidase and cytosolic manga-nese superoxide dismutase in the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus against a virus and bacterium. Mol Immunol. 56: 72-80.

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 43 ฉบบท 4 737

Masuda, T., Otomo, R., Kuyama, H., Momoji, K., Tonomoto, M., Sakai, S., Nishimura, O., Sugawara, T. and Hirata, T. (2012). A novel type of prophenoloxidase from the kuruma prawn Marsupenaeus japonicus contributes to the melanization of plasma in crustaceans. Fish Shellfish Immunol. 32: 61-68.

Medzhitov, R. and Janeway, Jr.C.A. (2002). Decoding the patterns of self and non-self by the innate immune system. Science 296: 298-300.

Rolle, R.S., Guizani, N., Chen, J.S., Marshall, M.R., Yang, J.S. and Wei, C.I. (1991). Purification and characterization of phenoloxidase from Taiwanese black tiger shrimp (Penaeus monodon). J Food Biochem. 15: 17-32.

Simpson, B.K., Marshall, M.R. and Otwell, W.S. (1987). Phenoloxidase from shrimp (Penaues setiferus): Purification and some properties. J Agri Food Chem. 35: 918-921.

Söderhäll, K. and Cerenius, L. (1992). Crustacean immunity. Ann Rev Fish Dis. 2: 3-23.

Söderhäll, K., and L. Cerenius. (1998). Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Curr Opin Immunol. 10: 23-28.

Söderhäll, K., Cerenius, L. and Johansson, M.W. (1996). The prophenoloxidase activating system in invertebrates. In New Directions in Invertebrates Immunology. New Jersey: SOS Publications. pp. 229-254.

Sugumaran, M. (1996). Role of the insect cuticle in host defense reaction. In New Directions in Invertebrates Immunology. New Jersey: SOS Publications. pp. 355-374.

Vargas-Albores, F., Guzman-Murillo, M.A. and Ochoa, J-L. (1993). An anticoagulant solution for hemolymph collection and prophenoloxidase studies of Penaeid shrimp (Penaeus californiensis). Comp Biochem Physiol. 106A: 299-303.

Xing, J., Jiang, J. and Zhan, W. 2012. Phenoloxidase in the scallop Chlamys farreri: Purification and antibacterial activity of its reaction products generated in vitro. Fish Shellfish Immunol. 32: 89-93.