Universitatea din BacauFacultatea de Inginerie

Sectia: Inginerie Chimica

Preparate enzimatice. Preparate enzimatice cu activitate celulazica.

Conf. Dr. Ing. Studenti:

Rusu Lacramioara Balanuca Brindusa Strat Florin Danca Dragos Bogdan

- 2008 -

Cuprins

1. Enzimele …………………………………………………..3

1.1. Clasificarea enzimelor…………………………………..…41.2. Cataliza enzimatica……………………………………...…41.3. Purificarea enzimelor………………………………………5

2. Preparate enzimatice…………………………………......6

2.1. Schita tehnologica generala de obtinere a preparatelor enzimatice din diverse surse…………………………………………………....92.2. Unitatile de masura ale activitatii enzimatice………...…...9

3. Preparate enzimatice cu activitate celulazica……..…10

4. Bibliografie…………………………………………………14

2

1. Enzimele

Enzimele sau fermentii sunt combinatii chimice complexe de natura organica – proteino coloidal solubile – elaborate in plante, animale si microorganisme, care catalizeaza reactiile de sinteza si descompunere ce au loc in celula vie, fara sa se consume in cursul lor.

In anul 1877 catalizatorilor reactiilor din organismele vii li s-a atribuit numele de „en zima = in levuri” (in l. greaca); aceasta denumire, alaturi de cea de „biocatalizatori”, se utilizeaza si in prezent. Denumirea mai veche a fost cea de „fermenti” (legata si ea de procesele fermentative).

Procesele enzimatice, cum sunt fermentarea vinului, dospirea painii, acidificarea painii etc., sunt cunoscute din cele mai indepartate timpuri. De patru decenii, enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocupa cu studiul enzimelor, s-a dezvoltat exploziv pe baza unor cercetari ample privind structura enzimelor, mecanismele de reactie studiate la nivel electronic si cuantic, reglarea proceselor enzimatice in cadrul metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vietii.

Prin actiunea lor catalitica, enzimele fac posibila, in conditii compatibile cu viata, realizarea unei intregi serii de reactii chimice, care in vitro nu se pot realiza decat in conditii foarte dure, improprii vietii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimica se realizeaza la 37oC, numai in mediu puternic acid si intr-un interval de timp foarte lung (3luni); in organism in schimb, aceasta degradare are loc foarte rapid si in mediu slab acid. Pentru a realiza in vitro tot asa de repede aceasta hidroliza, este necesara o temperatura de 120-140oC si o mare aciditate, deci conditii de incompatibilitate cu viata organismelor. In mod similar, arderea glucozei in organismele vii, cu producerea apei, bioxidului de carbon si a energiei, se realizeaza prin intermediul enzimelor, in conditii specifice vietii celulare. In absenta enzimelor, aceste transformari necesita temperaruri de 180-200oC. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental in procesele vietii.

In lipsa enzimelor, majoritatea covarsitoare a reactiilor chimice din organism nu s-ar produce, si deci nu ar putea exista procese metabolice si nici fenomene de viata.

Din punct de vedere chimic, enzimele sunt proteine sau proteide cu rol functional foarte important, de natura coloidala, din care cauza ele au insusirile substantelor proteice, fiind astfel influentate de conditiile de mediu. Ele sunt produse numai de organismele vii si isi pot manifesta activitatea enzimatica atat in interiorul, cat si in afara organismului. Substanta asupra careia actioneaza enzima se numeste substrat. Bogate in enzime sunt semintele in stare de germinatie, plantute, frunze, fructe etc. in general, plantele tinere au un continut mai ridicat de enzime decat plantele batrane. Puterea catalitica a enzimelor din organismele in crestere este mai mare decat a celor batrane.

Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizeaza prin urmatoarele proprietati generale: actioneaza in cantitati extrem de mici, dar manifesta o activitate extrem de intensa; nu se consuma si nu se transforma in reactiile catalizate; orienteaza si maresc viteza reatiilor biochimice, determinand scaderea energiei de activitate a moleculelor de substrat asupra carora actioneaza; determina reactii extrem de rapide; se disting printr-o

3

specificitate de actiune; asigura coordonarea, reglarea si controlul proceselor biochimice la care participa.

1.1. Clasificarea enzimelor

Această clasificare a enzimelor este realizată de comisia de enzime a uniunii internaţionale de chimie pură şi aplicată(IUPAC):1. Oxido-reductaze - catalizează reacţiile de oxidă reducere prin transfer de H2 sau electroni prin combinarea unui substrat de O2.

2. Transferaze - catalizează transferul unei grupări chimice, alta decât protonul de la un substrat la altul.

3. Hidrolaze - catalizează hidroliza legăturilor peptidice, glucozilice, a esterilor din diferite substraturi prin adiţia apei.

4. Liaze - catalizează scindarea legăturilor din molecule pe alte căi decât în prezenţa apei.

5. Izomeraze - catalizează izomerizarea optică, geometrică şi în funcţie de tipul de rearanjare moleculară racemaze, cistrans, izomeraze, etc

6. Ligaze - catalizează formarea legăturilor covalente dintre molecule cu consum energetic preluat din compuşi.

1.2. Cataliza enzimatică (biocataliza)

Enzimele sunt constituite din macromolecule de natură proteică, specific structurate, astfel încât să poată fixa, prin legături slabe, moleculele substratului care reacţionează. Asemenea tuturor catalizatorilor, enzimele nu modifică echilibrul chimic sau proprietăţile termodinamice ale sistemului.

Fiecare reacţie metabolică este catalizată de o singură enzimă. Specificitatea enzimelor arată că aceasta prezintă o porţiune superficială, numită centru activ, pe care se pot absorbi slab, într-o poziţie favorabilă reacţiei, moleculele substratului. Între conformaţia centrului activ al enzimei şi conformaţia aptă pentru a reacţiona a moleculelor substratului există o corespondenţă geometrică specifică, capabilă cu ce care există intre o cheie şi broasca la care aceasta se potriveşte. În general, intersecţia enzimei E cu substratul S presupune parcurgerea următoarelor etape : difuzia moleculelor substratului din soluţie către suprafaţa enzimei; orientarea moleculei sub acţiunea forţelor de atracţie şi fixarea acesteia la nivelul

centrului activ; desorbţia produşilor de reacţie de pe suprafaţa enzimei şi eliberarea centrului activ

care poate relua seria transformărilor. Forţele de intersecţie substrat – centru activ

4

trebuie să fie suficient de puternice pentru a asigura menţinerea moleculei în poziţie potrivită, un timp suficient de îndelungat pentru producerea reacţiei.

Viteza reacţiilor catalizate cu enzime depăşesc cu 8 până la 11 ordine de mărime viteza celor necatalizate. Activitatea enzimelor depinde de temperatură, de pH, precum şi de alte proprietăţi ale mediului pe care celula le reglează în vederea controlării procesului metabolic.

Din cele prezentate rezultă că descifrarea mecanismului biocatalizei este esenţial pentru înţelegerea proceselor metabolice şi al chimismului vieţii în general.

1.3. Purificarea enzimelor

Testele de purificare a enzimelor se bazează pe proprietăţile fizico-chimice : comportarea la ultracentrifugare, în câmp electric, solubilitatea lor etc.

Dacă un preparat enzimatic este supus ultracentrifugării şi sedimentează un singur component există posibilitatea de a fi pur omogen. Nu trebuie pierdut din vedere însă că constantele de sedimentare ale enzimelor nu sunt distincte ci tind către anumite valori probabile.Proteinele cu proprietăţi fizico-chimice asemănătoare vor fi purificate concomitent, iar la analiza lor ultracentrifugală pot sedimenta ca un singur component. Cu toate acestea forma, lăţimea şi viteza de difuzie a unui maxim proteic, separat prin ultracentrifugare pot da informaţii preţioase asupra purităţii enzimei. Impurităţile pot fi puse în evidenţă atât sub forma unei maxime separate, cât şi ca urmare la maximul principal, prin profiluri asimetrice sau printr-o lăţime a maximului mai mare decât ceea calculată conform constantei de difuziune a enzimei. Se recomandă pentru siguranţa interpretării rezultatelor experimentale obţinute prin analize ultracentrifugale, ca acestea să fie conduse la diferite pH şi tării ionice ale preparatului enzimatic.

Un alt test de puritate este electroforeza prin care diferite componente dintr-un preparat enzimatic pot fi puse în evidenţă datorită mobilităţilor lor electroforetice diferite. Astfel un preparat enzimatic obţinut din muşchiul de iepure se dovedeşte a fi format din două componente proteice prin analiza ultracentrifugală şi din opt prin analiza electroforetică. Cu toate acestea sunt cazuri în care două sau mai multe enzime posedă mobilităţi electroforetice similare. Pentru siguranţa rezultatelor, în cazul în care un preparat enzimatic migrează ca o singură proteină este recomandabil să se repete experimentul la diferite valori de pH. În cazul în care mai multe electroforegrame conţin o singură bandă există o mare posibilitate ca preparatul să fie pur.

Unul dintre cele mai sigure teste de purificare îl reprezintă natura curbei de solubilitate a unui preparat enzimatic, criteriu propus de Northrop şi colaboratorii săi în cercetările lor asupra enzimelor. Curbele de solubilitate se obţin prin determinarea experimentală a concentraţiei proteice din soluţie în funcţie de concentraţia proteinei solide adăugate în soluţie. Practic cantităţi crescânde de preparat enzimatic solid sunt adăugate într-un volum mic şi constant de solvent, probele sunt centrifugate, iar în supernatant este dozată concentraţia proteică sau activitatea enzimatică.

În cazul preparatului pur, curba de solubilitate este compusă din două segmente de dreaptă. Primul cu o pantă finită corespunde creşterii cantităţii de enzimă în soluţie proporţional cu cantitatea de proteină adăugată, al doilea cu o pantă egală cu zero corespunzător saturaţiei în enzimă a soluţiei. Punctul de intersecţie ale celor două segmente de

5

dreaptă este punctul de saturaţie. Prezenţa impurităţilor în preparatul brut de pepsină (b) modifică forma curbei de solubilitate dând indicaţii asupra eterogenităţii unui preparat enzimatic. În cazul în care în soluţie există două proteine cu solubilităţi diferite, soluţia se va satura în ele la momente diferite şi curba de solubilitate a preparatului impur va avea mai multe puncte de intersecţie. Pentru acurateţea rezultatelor şi mai ales pentru siguranţa interpretării se recomandă ca aceste puncte de solubilitate să fie realizate în diferiţi solvenţi. Sunt extrem de rare cazurile în care două proteine au aceiaşi solubilitate într-un solvent oarecare şi este mai puţin probabil ca doua proteine să aibă solubilităţi egale în diferiţi componenţi.

Testele imunologice sunt deosebit de specifice şi sensibile. Astfel dacă în sângele animalelor imunizate cu proteina de cercetat apare un singur tip de anticorp, proteina este unitară.

Dacă se compară rezultatele experimentale obţinute prin diferite metode ( compoziţia în aminoacizi, măsurarea presiunii osmotice, microscopie electronică, analiză de sedimentare viteză-difuziune, echilibru de sedimentare, gel cromatografie) pentru determinarea masei moleculare a preparatului enzimatic purificat se obţin valori mult deosebite este un indiciu asupra heterogenităţii acestuia.

Evidenţierea unor impurităţi prin teste funcţionale este un procedeu de punere în evidenţă a unor cantităţi mici de substanţe contaminante în cazul în care acestea au proprietăţi biologice specifice (enzime, hormoni). În situaţii rare în care o dingură proteină are două sau mai multe activităţi biologice, raportul lor trebuie să rămână constant pe tot parcursul procedeului de purificare.

2. Preparate enzimatice

Industria alimentară este în fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi implicit conservarea lor până la procesare sau până la consum implică controlul şi monitorizarea riguroasă a activităţii enzimelor proprii ţesuturilor vegetale şi animale, sau a activităţii enzimelor elaborate de microflora specifică.

Biotehnologia este un domeniu de o vastă interdisciplinaritate, situându-se la interferenţa dintre biologie, microbiologie, biochimie şi inginerie genetică.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care materiile prime folosite în industria alimentară le parcurg până la produsul finit(ex: maturarea fructelor şi legumelor, germinarea seminţelor folosite ca materii prime în industria panificaţiei sau a berii, maturarea brânzeturilor şi a preparatelor din carne, maturarea vinurilor şi a băuturilor distilate aromate).

Enzimele pot avea şi un rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracterelor senzoriale şă implicit cu pierderea valorii nutritive şi tehnologice a materiilor prime agroalimentare.

Alături de enzimele existente în ţesuturile vegetale şi animale netratate termic un rol important îl joacă şi microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi selecţionate, se adaugă într-un mediu de cultură în mod intenţionat, iar activitatea lor este exploatată şi direcţionată către obţinerea unui produs alimentar cu valoare biologică

6

ridicată (produse lactate acide, vin, bere, oţet, alcool etilic, brânzeturi, preparate din carne, produse farmaceutice, etc).

Altă categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a produselor alimentare. Acest motiv stă la baza impunerii unor norme de igienă foarte riguroase.

În ultima perioadă, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendinţe moderne aplicate sub formă de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene în industria brânzeturilor, preparatelor din carne, etc. În egală măsură, şi nu mai puţin importante, în conturarea tendinţelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub formă de culturi starter, singulare sau mixte, în industria laptelui, cărnii, etc.

Enzimele se mai numesc şi biocatalizatori de natură proteică, solubili, coloidali, sensibili la acţiunea căldurii şi puternic dependenţi de condiţiile de mediu. Enzimele sunt sintetizate de celule vii.

Într-un metabolism desfăşurarea secvenţială a fiecărei etape este posibilă numai sub acţiunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană (fungică sau bacteriană).

Activitatea catalitica a enzimelor, extrem de importanta din punct de vedere fiziologic, prezinta si o deosebita importanta practica. O serie de industrii care prelucreaza materii prime de origine vegetala sau animala, au de-a face in procesele lor tehnologice cu reactii catalizate de enzime, care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de microorganismele ce se dezvolta in/pe ele.

Reactiile enzimatice similare pot avea loc insa si cu enzime izolate sau cu sisteme extrase din diferite surse bogate in enzime si introduse apoi in procesele tehnologice in scopul realizarii unor transformari dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate din speciile in care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se caracterizeaza printr-o puritate mai mica sau mai mare enzimatica, in functie de calitatea si tipul compusilor ce le insotesc, proveniti din aceeasi sursa enzimatica. Cu alte cuvinte, preparatele pot fi mai mult sau mai putin pure (purificate).

Pentru obtinerea unor preparate enzimatice, trebuie ales un material biologic bogat in enzime, cu o puternica activitate catalitica si care sa se prelucreze usor. Materiile prime folosite la obtinerea preparatelor enzimatice, pot fi de natura vegetala, animala sau microbiana. La plante, concentratii mari de enzime se intalnesc in seminte, in boabele de cereale germinate si negerminate, in fructe, in radacini, in seva si in frunze. La animale, enzimele se gasesc in toate celulele, insa concentratii mari de anumite enzime se gasesc localizate in anumite organe si tesuturi, specializate in producerea de enzime, asa cum sunt glandele salivare, mucoasa stomacului, pancreasul, mucoasa intestinala.

Avantajele prelucrării surselor de enzime de origine animală şi vegetală: sunt sigure din punct de vedere a inoculităţii şi permit obţinerea certă a enzimelor singulare (a unui singur tip de enzimă).

Dezavantaje: - vegetalele şi animalele prezintă un ciclu de viaţă lung, prin urmare obţinerea enzimelor este limitată din punct de vedere cantitativ;- preparatele enzimatice obţinute din aceste surse sunt mai termosensibile.

7

Microorganismele reprezină cea mai bună sursă de preparate enzimatice deoarece:-ciclul de dezvoltare (viaţă) este mult mai scurt decât în cazul plantelor sau a

animalelor;-se pot obţine în cantităţi mari denumite şi biomase prin cultivare în instalaţii cu

un principiu constructiv simplu şi folosind medii de cultură relativ ieftine cum ar fi: tărâţe, zer, extracte de porumb, melasă;

- producţia de enzime generată de microorganisme poate fi optimatizată cu folosirea unor tulpini mutante, înalt performante, obţinute în urma dorinţei de a eficientiza parametrii procesului fermantativ;

- preparate enzimatice obţinute, în unele cazuri, prezintă stabilităţi mai bune la temperaturi ridicate, acest avantaj vizează transferuri enzimatice care se impun ca desfăşurare la temperaturi situate la 75-900C (industria spirtului);

În cazul adoptării ca sursă a microorganismelor se impun câteva condiţii: preparatele enzimatice de origine microbiană trebuie să fie libere de toxine sau de substanţe cu efect antibiotic, prin urmare trebuie să fie produse de microorganisme nepatogene fără potenţial alergent, toxicogen, antibiotic.

Procesul de extractie al materiilor prime enzimatice este precedat, cu exceptia enzimelor extracelulare elaborate de microorganisme, intotdeauna de operatia de dezintegrare a celulelor, cu aparate speciale, pentru eliberarea enzimelor. Dupa operatia de dezintegrare celulelor, urmeaza operatia de extractie a lor, care consta in amestecarea materialului cu solventi care dizolva enzimele, urmata de separarea solutiei de enzime, de toate particulele in suspensie. Solubilizarea se realizeaza prin tratarea cu apa sau solutii de saruri, asa cum enzima sau grupul de enzime intereseaza, este solubil in apa sau in diferite solutii. Molaritatea solutiilor si pH-ul mediului de extractie, precum si timpul necesar unei extractii optime se stabilesc experimental.

Amestecul de material si solvent este centrifugat, iar supernatantul reprezinta extractul enzimatic brut care poate fi utilizat ca atare, dupa concentrare, sau dupa uscare, sau este supus operatiei de purificare.

In extracte, enzimele se gasesc alaturi de o multime de substante care au fost extrase in acelasi timp, deoarece au fost solubile si ele, in solventii de extractie folositi. De obicei,metodele de purificare se refera fie la indepartarea impuritatilor din extract, fie la indepartarea enzimei din extract prin precipitare, adsorbtie sau extractie.

Dupa aceasta operatie se obtin preparate enzimatice partial purificate. Cand preparatul enzimatic a fost adus intr-o stare avansata de puritate este posibila cristalizarea lui. Pentru aprecierea puritatii preparatelor enzimatice se utilizeaza curbele de solubilitate, care stabilesc variatia cantitatii de enzima solubilizata in functie de cantitatea de enzima introdusa.

In scopul utilizarii repetate a unei enzime si pentru desfasurarea in instalatii continue sau semicontinue a reactiilor enzimatice, in practica industriala, au inceput sa se utilizeze in ultimul timp, preparatele enzimatice imobilizate. Aceste preparate prezinta o serie de avantaje, putandu-se prelucra o cantitate mai mare de substrat cu aceeasi enzima,

8

enzima care nu ramane in produs, existand posibilitatea opririi reactiei la momentul dorit, printr-o simpla operatie mecanica.

2.1. Schema tehnologica generala de obtinere a preparatelor enzimatice din diverse surse

2.2. Unitati de masura ale activitatii enzimatice

Practic activitatea enzimatică se poate determina în trei variante:

- măsurarea cineticii de reacţie într-un anumit interval de timp- măsurarea gradului de consumare a substratului- determinarea concentraţiei produsului/produşilor de reacţie

9

Ţesuturi vegetaleŢesuturi animaleMicroorganisme(+enzime extracelulare)

Preparat enzimaticde uz industrial

Condiţionare

Standardizare

Concentrarea

Uscarea

Liza pereţilor celulari(omogenizare)

Extracţia Fracţionare

Preparate parţial purificate

Preparat enzimatic

Preparat brut

Activitatea enzimatică poate fi caracterizată prin două noţiuni:- activitatea enzimatică specifică- reprezintă numărul de unităţi enzimatice

conţinute într-un proteină.-activitatea enzimatică molară- reprezintă numărul de molecule de substrat transformate de către o moleculă de enzimă în unitatea de timp

Practic activitatea enzimatică se poate determina în trei variante - unităţile de măsură admise în activitatea evaluării enzimatice sunt:- unitatea de de activitate enzimatică(u) reprezintă cantitatea de enzime care

catalizează transformarea a 1 substrat în timp de 1min în condiţii standard (T=50C, p= valoarea optima pentru categoria de enzime testate)

- K - reprezintă cantitatea de enzime ce catalizează transformarea a 1 substrat în timp de 1sec în condiţii standard

Măsurarea cineticii de reacţie într-un anumit interval de timp

- măsurarea gradului de consumare a substratului- determinarea concentraţiei produsului/produşilor de reacţie

3. Preparate enzimatice cu activitate celulazica

Celulazele sunt enzime care intra in structura complexului celulozolitic si care folosesc drept substrat macromolecule de celuloza.

Din 1950 s-a pus problema daca hidroliza enzimatica a celulozei se obtine ca rezultat al actiunii individuale succesive a unor enzime sau prin actiunea concomitenta a enzimelor din componenta complexului celulozolitic.

Principalele enzime implicate in hidroliza celulozei sunt:- endo-glucanaza ─ 1,4-β-D-glucanaza, endo 1,4-D-β-glucan hidrolaza,

celulaza, carboximetilcelulaza;- exo-glucanaza ─ 1,4-β-D-glucan celobiohidrolaza, celolozo 1,4-β-

celobiozidaza;- glucan 1,4-β-glucozidaza;- exo-1,4-β-glucozidaza

Ca urmare a importantei pe care o prezinta hidroliza celulozei, numerosi cercetatori au urmarit selectionarea de microorganisme (bacterii si mucegaiurii) capabile sa produca toate enzimele din complexul celulozolitic.

Desi un numar mare de microorganisme sunt capabile sa produca biodegradarea celulozei in conditi naturale, numai cateva microorganisme se adapteaza cultivarii in conditii controlate, fiind capabile de a supersintetiza enzimele celulozolitice. Acestea apartin fungilor filamentosi si bacteiilor.

Complexele enzimatice celulozolitice ale microorganismelor se caracterizeaza prin specificitate in ceea ce priveste natura si concentratia enzimelor componente, insa

10

toate contin endo-1,4-β-glucanaza, enzima identificata prin capacitatea de hidroliza rapida a substratului solubil carboximetilceluloza. Astfel, Clostridium stercorarium sintetizeaza o endo-1,4-glucanaza termostabila si o exo-β-glucanaza. Tulpina are si propprietati fermentative, in conditii anaerobe producand acid acetic, acid lactic si etanol. Sistemul enzimatic celulozolitic al tulpinii Cellulomonas fimii ATCC 484 este compus din 3-4 enzime: doua endoglucanaze si cel putin o exoglucanaza.

Substratul natural al celulazelor este celuloza. Preparatele enzimatice comerciale de tipul celulaze sunt preparate in care predomina endo β-1,4 celulazele cu proprietatea de a produce hidroliza legaturilor 1,4 β glucozidice din interiorul macromoleculei de celuloza.

In prezent cercetarile privind biosinteza complexului enzimatic celulozolitic sunt orientate in directia valorificarii pe cale biotehnologica a deseurilor celulozice din agricultura, zootehnie, industrie.

Microorganismele au capacitatea de a produce hemicelulaze cu rol in hidroliza substraturile hemicelulozice. Microorganismele agenti producatori de hemicelulaze sunt:

- bacterii: genurile Streptomyces, Bacillus, Cytophaga, Acchromobacter, Pseudomonas;

- mucegaiuri: genurile TRIchoderma, Thrichotecium, Chaetomium, Aspergillius.

Hemicelulazele microbiene sunt de doua tipuri, in functie de modul lor de actiune si anume:

- endohemicelulaze – scindeaza legaturile β 1,4 din interiorul catenei poliglucidice;

- exohemicelulazice – elibereaza monomeri sau dimeri de la extremitatile polimerului.

In general, microorganismele produc complexe enzimatice in care xilanazele sunt asociate cu celulaze, β-glucozidaze etc.

Enzimele hemicelulozice prezinta importanta in procesele biotehnologice de valorificare a deseurilor vegetale pentru obtinerea de produse cu valoare economica deosebita: alcool carburant SCP (Single Cell Protein), solventi (acetona, butanol, propanol).

Utilizarea α-amilazelor si proteazelor in panificatie a fost stabilita cu 10-20 ani ianinte, dar potentialul hemicelulazelor a fost previzionat la inceputul acestui deceniu. Enzimele xilanolitice, denumite, adeseori, pentozanaze, reprezinta un grup de hemicelulaze, care hidrolizeaza legaturile variate din arabinoxilani. Cunoasterea modului loor de actiune a crescut cu cativa ani in urma, ceea ce a condus la utilizarea lor in practica.

Folosirea pentozanazelor este importanta in fabricare painii integrale si a painii imbogatite in fibre, corectand capacitatea de legare a apei. Impreuna cu celulazele rezolva problemele de calitate la painea cu continut ridicat de fibre. Mai tarziu, celulazele si pentozanazele au fost folosite la faina de secara care are pentozani greu hidratabili in cantitate mare.

Doze mici de xilanaza purificata, adaugata in faina de grau dau o crestere a volumului painii de pana la 10%, dar aluatul a fost slab, lipicios; doze mai amri au produs aluaturi foarte slabe (moi), o structura grosiera si o scaderii a volumului painii.

11

In aluaturi care contin multe fibre, adaugarea pentozanazei este ceruta pentru a ameliora culoarea cojii, structura si volumul: chiar daca absorbtia apei este scazuta, umiditatea painii coapte este neschimbata.

In cateva studii asupra gelului obtinut din faina, celulaza a fost una din enzimele studiate,

Kulp (1968) a folosit trei preparate de celulaza si a aratat ca efectele pe care le-a observat au fost date si de interferenta pentozanazelor.

Utilizarea pentozanazelor se face in functie de tipul si calitatea fainii utilizate si de compozitia aluatului. Acestea sunt utilizate in panificatia moderna ca adaosuri amelioratoare, sub forma de preparate obtinute din speciile Aspergillius.

Celulazele si hemicelulazele sunt enzime care actioneaza asupra celulozei si respectiv, hemicelulozelor. Enzimele care actioneaza asupra celulozei sunt celulazele, care degradeaza celuloza cristalina (celuloza microgranulara, hartia de filtru, fibrele de bumbac), celobioza (glucozidaza), care degradeaza rapid celuloza si mai lent celohexoza.

Utilizarea celulazelor ca preparate enzimatice sunt urmatoarele:- pentru hidroliza celulozei din diferite surse vegetale pana la glucoza care, la

randul sau, este folosita ca sursa de carbon pentru diferite procese de biosinteza: obtinerea de acizi organici, productia de alcool etilic, productia de biomasa

- impreuna cu hemicelulozele si enzimele pectolitice, celulazele se mai utilizeaza pentru cresterea gradului de extractie a sucurilor (sucuri de fructe, must de struguri) si pentru limpezirea sucurilor sau a berii,Pentru hidroliza hemicelulazelor se utilizeaza pentozanaze si galactomanaze.

Hemicelulazele se utilizeaza pentru extragerea mai buna a colorantilor din fructe si struguri si pentru usurarea filtrarii mustului si berii.

Activitatea endopolimerazelor (celulaza, amilaza, proteaza) a fost determinata conform actiunii filtratului de cultura asupra substantelor corespunzatoare prin metoda vascozimetrica. Activitatea celulazica a fost determinata colorimetric prin dozarea zaharurilor reducatoare formate in urma actiunii enzimelor asupra solutiei de 1% a carboximetilcelulozeide sodium (CMC-Na) timp de 30 minute la temperatura de 50oC si asupra hartiei de filtru timp de 60 de minute la temperature de 50oC. reactia enzimatica se stopeaza prin fierbere la baie de apa timp de 10 minute, activitatea enzimatica aflandu-se prin diferenta dintre cantitatea de zahar reducator rezultata in conditii standard de activitate.

Ca unitate de activitate enzimatica s-a considerat acea cantitate de enzima, care in conditii specifice dupa 30 minte, respectiv 1 ora de actiune asupra filtratului formeaza 1 mg de glucoza.

Determinarea activitatii sumare a comlexului celulazic in baza hidrolizei hartiei de filtru (HF) este o metoda pe larg utilizata si acceptata datorita simplitatii de realizare a acesteia si faptul, ca hartia de filtru reprezinta celuloza nativa, rezistenta la degradare. In acelasi timp, activitatea inalta a complexului celulazic in baza hidrolizei hartiei de filtru nu coincide in timp cu viteza maxima de formare a glucozei rezultata din degradarea carboximetilcelulazei substituite.

12

Activitatea maxima de zaharificare a hartiei de filtru in prezenta inductorului (coji de floarea-soarelui) a fost stabilita pentru P. astreanus in 6 zile si in 11 zile de cultivare.

Unele tulpini ale speciei de P. ostreatus manifesta o inalta activitate celulazica si pe substratul ce nu contine coji de floarea soarelui in calitate de inductor, ceea ce denota prezenta caracterului constitutiv de sinteza a hidrolazelor. Manifestarea ambelor caractere: inductiv si constitutiv- sunt specifice tulpinilor P. ostreatus .

La determinarea activităţii unei enzime trebuie păstrate riguros condiţiile de lucru prevăzute de metoda de determinare: temperatură, pH-ul, natura tamponului care asigură pH-ul şi alţi factori pe care îi prevede metoda.

La stabilirea unei metode de determinare a activităţii unei enzime se are grija ca tamponul ales pentru asigurarea pH-ului optim, să nu influenţeze prin componentele sale activitatea enzimei în cazul reacţiilor enzimatice lente, care trebuie urmărite timp mai îndelungat, se produce contaminarea mediului de reacţie cu microorganisme care pot să descompună atât enzima cât şi substratul. Pentru prevenirea contaminării se folosesc diferiţi antiseptici, astfel aleşi încât să nu influenţeze activitatea enzimei. Influenţa negativă a unui antiseptic asupra unei enzime se stabileşte separat pentru fiecare enzimă în parte. Antisepticii cei mai mult folosiţi în cazul reacţiilor enzimatice sunt: toluenul, timolul, cloroformul, fenolul, iodoformul şi fluorura de sodiu.

13

Bibliografie

www.regielive.rowww.facultate.regielive.rowww.onlinebioterra.evonet.ro

14