DefiniţieDefiniţie: enzimele sunt constituenţi proteici (heteroproteici) ai celulelor vii (animale, vegetale sau microbiene), care catalizează reacţiile metabolice de catabolism sau anabolism (sunt responsabile de majoritatea reacţiilor chimice dintr-un organism).

PROPRIETATI GENERALE: Biocatalizatori cu eficienţă maximă, în cantităţi extrem de mici (10 -6 sau chiar 10-9)

catalizează reacţii cu viteze foarte mari;

Enzimele au specificitate de acţiune (induc un anumit tip de reacţii: oxidoreducere, hidroliza, sinteză etc.) şi de substrat (acţionează numai asupra unui reactant sau grup de substanţe reactante);

Condiţiile în care se produc reacţiile catalizate enzimatic sunt compatibile cu viaţa (temperatură, presiune normală, pH neutru sau slab acid/alcalin);

Intervin în mecanismele de coordonare, reglare şi control a reacţiilor metabolice celulare.

Toate procesele semnificative ale vieţii sunt dependente de activitatea enzimatică (au rol de menţinere a procesului vieţii - folosite tot mai mult în diagnoză şi terapeutică).

Componentele macromoleculare ale majorităţii enzimelor sunt proteine.

A) După criteriul structural:Enzime de natură proteică (pepsina, tripsina, papaina etc);Enzime de natură heteroproteică, alcătuite dintr-o porţiune proteică şi o componentă neproteică (denumită coenzimă sau cofactor enzimatic care poate fi reprezentată de derivaţi ai hemului, ai unor vitamine din complexul B, nucleotide, ioni metalici). Cele două componente separate sunt inactive din punct de vedere catalitic. In urma cuplarii lor rezulta complexul molecular apoenzimă-coenzimă (holoenzima), care manifestă activitate catalitică.

B) După organizarea lor:Enzime monomerice - constituite dintr-un lanţ polipeptidic;Enzime oligomerice - alcătuite din mai multe lanţuri polipeptidice, care în urma disocierii sau asocierii devin catalitic active.Complexe multienzimatice - formate din enzime legate prin interacţiuni necovalente, care participă la producerea unor secvenţe de reacţii biochimice consecutive şi înlănţuite, unde produsul rezultat în reacţia catalizată de prima enzimă (I) devine substratul celei de a doua enzime (II), iar produsul rezultat din această reacţie va reprezenta substratul enzimei III, şi astfel până la realizarea întregului şir de reacţii prin care este metabolizat un component biochimic.  enzima I enzima II enzima lll SUBSTRAT A SUBSTRAT B SUBSTRAT C etc.

In reacţiile catalizate enzimatic, într-o fază iniţială, enzima formează cu substratul un complex intermediar, instabil, care se transformă rapid, rezultând produsul de reacţie şi enzima care poate iniţia o altă reacţie.

Unele enzime, însă, pot cataliza reacţii în care interacţionează mai multe substraturi. In această categorie se încadrează transferazele, care catalizează transferul unei grupări chimice de pe un substrat (donor), pe un alt substrat (acceptor).

Sunt următorii factori: concentraţia enzimei, concentratia substratului, afinitatea enzimei fată de substrat, temperatură, pH, efectori (activatori sau inhibitori), radiaţii, etc.

concentraţia enzimei - între anumite limite, viteza reacţiilor catalizate enzimatic este direct proporţională cu concentraţia enzimei, dar la concentraţii mari de enzimă, viteza rămâne constantă;

concentraţia substratului - creşterea concentraţiei de substrat, induce iniţial, creşterea rapidă a vitezei de reacţie, apoi această creştere este lentă, iar la concentraţii mari de substrat, viteza de reacţie atinge valoarea maximă, rămânând constantă. Relaţia dintre viteza de reacţie catalizată enzimatic şi concentraţia substratului, este dată de ecuaţia Michelis-Menten:

Vmax [S]

V= KM + [S]în care, V este viteza reacţiei la un moment dat; VMAX este

viteza maximă de reacţie (la concentraţii mari de substrat), când enzima este saturată de substrat; [S] este concentraţia substratului, iar KM este constanta Michelis-Menten, moli/l.

Ecuaţia Michelis-Menten se prezintă grafic sub forma unei hiperbole din care se poale constata:

- faza când viteza reacţiei este dependentă deconcentraţia substratului,

- faza independentă de concentraţia substratului, cândviteza devine maximă şi enzima este saturată de substrat.

- la 1/2 din viteza maximă, corespunde o anumită valoare a concentraţiei substratului, denumită KM, sau constanta Michelis-Menten, exprimată în moli/l şi care indică afinitatea enzimei faţă de substrat. Cu cât KM are o valoare mai mică, cu atât afinitatea enzimei faţă de substrat este mai mare şi invers, cu cât KM are o valoare mai mare cu atât afinitatea enzimei fată de substrat este mai mică.

afinitatea enzimei faţă de substrat;

Graficul concentraţiei Graficul concentraţiei substratului faţă de viteza substratului faţă de viteza reacţieireacţiei

Temperatura - până la 60- 80°C, viteza reacţiilor chimice creşte direct proporţional cu temperatura. Temperatura optimă de acţiune a enzimei este valoarea temperaturii la care viteza de reacţie catalizate enzimatic, are valoare maxima. La valori superioare temperaturii optime de acţiune a enzimei, viteza de reacţie scade rapid, datorită denaturării termice a enzimei. Temperatura optimă a enzimelor este dependentă de structura chimică a enzimei, a substratului şi de concentraţia lor în sistemul de reacţie. Activitatea majorităţii enzimelor scade la temperaturi de peste 50 - 60°C, totuşi unele enzime îşi menţin activitatea şi la valori ale temperaturii peste 60°C.› Ex: papaina este o protează vegetală activă la 80°C;

peroxidaza din hrean, rămâne activă la peste 100°C.

pH - ul mediului influenţează activitatea enzimelor. Există două valori optime de pH:

- pH optim de activitate - Valoarea pH-uluila care activitatea enzimei este maximă - pH optim de stabilitate - Valoarea pH-ului la

care enzima îşi păstrează activitatea în cele mai bune condiţii.

Cei doi parametri pot avea valori apropiate, egale sau valori diferite.

efectori (activatori sau inhibitori). Efectorii sunt reprezentaţi de substanţe chimice din mediul în care se desfăşoară reacţia şi care influenţează activitatea enzimei. Activatorii influenţează pozitiv reacţia, pe când inhibitorii o influenţează negativ. Inhibiţia enzimatică poate fi ireversibilă, reversibilă (competitivă şi necompetitivă) şi alosterică.

Nomenclatura enzimelor utilizează 2 tipuri de denumiri:- nume uzuale sau tradiţionale care se bazează pe utilizarea denumirii substratului urmat de sufixul ază şi- nume sistemice (recomandate de Comisia de Enzime) formate din numele substratului (substraturilor), tipul de reacţie catalizată, urmate de sufixul ază şi însoţite de un cod. Codul este format din 4 cifre care reprezintă clasa, subclasa, sub-subclasa şi numărul de ordine, urmate de iniţialele EC (Enzyme Commission).

  CLASA REACŢIILE CATALIZATE

  oxido-reductaze-catalizează reacţiile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular;

  transferaze-catalizează transferul diferitelor grupări chimice de la un substrat donator la un alt substrat acceptor;

ENZIME hidrolaze-catalizează scindarea hidroliticâ a diferitelor substraturi, prin adiţia apei la nivelul diferitelor grupări chimice;

liaze-catalizează scindarea unor substraturi, prin mecanisme diferite faţă de hidroliză;

  izomeraze-catalizează rearanjări intramoleculare; sunt mai multe tipuri: racemaze, cis/trans izomeraze, enzime ce produc transformări aldoză/cetoză.

  ligaze sau

sintetaze

-catalizează sinteza unor noi legături prin unirea a doi compuşi într-unui singur, utilizând ca sursă energetică ATP-ul.

Clasificarea enzimelor în 6 clase

EC nr. Nume sistemice Nume uzuale1.1.3.4. β-D-Glucoz: 02 oxidoreductaza Glucozoxidaza notatina1.11.1.6. H202:H202 oxidoreductaza Catalază2.1.1.6. S-Adenosil metionin: catechol

O-metiltransferazaCatecholmetil transferaza

3.1.1.3. Glicerol ester hidrolaza Lipaza3.2.1.1. a-1,4-Glucan glucanohidrolaza a -Amilaza3.2.1.2. a-1,4-Glucan maltohidrolaza β -Amilaza

3.2.1.3. a-1,4-Glucan glucohidrolaza Glucoamilaza, a-amiloglucozidaza

3.2.1.4. β -1,4-Glucan 4-glucano-hidrolaza Celulaza

3.2.1.20 β- D-Glucozid glucohidrolaza a-Glucozidaza3.2.1.21 β -D-Glucozid glucohidrolaza β -Glucozidaza

3.2.1.23 β -D-Galactozid galacto-hidrolaza β -Galactozidaza, lactaza

3.2.1.26 β-D-Fructofuranozid-fructo-hidrolaza Invertaza

3.4.4.1. - Pepsina3.4.4.3. - Rennina, labferment,

chimozină

3.4.4.4. - Tripsina3.4.4.5. - Chimotripsina3.4.4.10. - Papaina3.4.4.16   Subtilpeptidaza A, subtilizina,

proteaza

5.3.1.5. D-GIucozo-6-fosfatcetol izomeraza

Nomenclatura enzimelor

Preparatele enzimatice libere Preparatele enzimatice libere (neimobilizate) sunt obţinute din ţesuturi animaleţesuturi animale (organe: ficat, cord, creier, rinichi, pancreas sau mucoasă stomacală sau intestinală), produse vegetale produse vegetale (seminţe, cereale, rădăcini, frunze, coajă, sevă sau latex) şi microorganismemicroorganisme (bacterii, drojdii şi mucegaiuri).

Avantajele oferite de utilizarea preparatelor enzimatice de origine microbiană, sunt următoarele:Intervalul între generaţii este scăzut, comparativ cu plantele sau animalele;Obţinerea culturilor microbiene implică costuri reduse;Stimularea sintezei de enzime prin optimizarea condiţiilor de cultivare;Posibilităţi multiple de selecţie a tulpinilor înalt productive.

Selecţionarea tulpinilor microbiene pentru obţinerea de preparate enzimatice urmăreşte o serie de criterii:Sa nu fie patogene;Să sintetizeze cantităţi mari din enzima sau complexul enzimatic urmărit;Să nu sintetizeze antibiotice;Să nu posede proprietăţi alergene;Să nu manifeste exigenţe nutritive crescute (să se dezvolte pe medii uzuale).

Preparatele enzimatice brute sau parţial purificate, sunt utilizate în industria alimentară ca atare, fiind introduse în mediile asupra cărora vor acţiona.Activitatea enzimatică poate fi oprită, în momentul dorit, prin diferite procedee: tratament termic, modificarea pH-uIui (acidifiere sau alcalinizare).Uneori enzimele pot rămâne active în produsul finit.

Aceste preparate se obţin prin fixarea unei enzime sau a unui complex enzimatic la un suport insolubil în apă, fără modificarea mecanismului, specificităţii şi condiţiilor de acţiune iniţiale.

Avantajele oferite de preparatele enzimatice imobilizate:economie de biocatalizatori;puritatea produşilor de reacţie;posibilitate de control a reacţiei enzimatice;productivitate crescută într-un interval de timp scurt; acest lucru este foarte important în industria alimentară, când substraturile sunt perisabile sau labile din punct de vedere chimic.

Procesul de imobilizare poate interesa numai enzimă izolată sau întreaga celulă care sintetizează enzimă sau numai organite celulare.

Majoritatea enzimelor utilizate la scară industrială, sunt de obicei enzime extracelulare sintetizate de microorganisme. Acest lucru rezidă din simplitatea izolării lor din mediul de fermentare. In plus, enzimele extracelulare sunt mai stabile la variaţiile de mediu, comparativ cu cele intracelulare. Totuşi, peste 90% din enzimele produse de celule sunt intracelulare.

Metodele de separare a acestor enzime sunt scumpe şi laborioase. Din acest motiv, a fost imaginată metoda permeabilizării celulelor ca sursă de enzime.

Permeabilizarea este o soluţionare a difuziei substratului/ produşilor de reacţie prin învelişul celular.

Celulele permeabilizate pot fi utilizate sub formă imobilizată, ca sursă de enzime intracelulare care intervin în reacţii simple ca hidroliza, oxidarea, izomerizarea, care nu necesită un sistem de regenerare de co-factor.

Utilizarea celulelor imobilizate sub formă viabilă sau neviabilă, depinde de scopul urmărit.

› Astfel, celulele permeabilizate de Kluyveromyces fragilis, care sunt neviabile, transformă lactoza din lapte în glucoza şi galactoză, în timp ce celulele viabile (nepermeabilizate) transformă lactoza în etanol şi sunt utilizate pentru obţinerea laptelui fară glucide.

Enzimă Sursa Tehnica/suportInverlaza Saccharomyces cerevisiae înglobare în poliacrilamidă, alginat

Invertaza Saccharomyces cerevisiae Adsorbţie la fibre de bumbac, lână

Inulinaza Saccharomyces marxianus Incorporare în gelatină

Catalază Saccharomyces cerevisiae înglobare în poliacrilamidă

Catalază Trigonopsis variabilis înglobare în poliacrilamidă

D-aminoacidoxidaza Trigonopsis variabilis înglobare în poliacrilamidă,alginat, gelatină

Penicilinacilaza Escherichia coli înglobare în poliacrilamidă

Urează Celule ureolilicc Aderare la fibre de bumbac

L-histidin amonio-liază Achrommobacter liquidium înglobare în poliacrilamidă

Fumaraza mitocondrii hepatice înglobare în poliacrilamidă

Fumaraza Brevibacteriub flavus înglobare în carrageenan

Aspartaza Escherichia coli înglobare în carrageenan

Lactaza Kluyveromyces fragilis Diferite suporturi

Suporturi utilizate pentru imobilizarea enzimelor:Suporturi de natură anorganică:

o Silicea coloidală; o Caolinita;o Perle de sticlă cu porozitate controlată; o Oxizi metalici: alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, cărbune etc.

Suporturi de natura organică: Celuloză şi derivaţi celulozici; Amidon; Agaroză; Dextran; Colagen; Polimeri de acril-amidă; de acid metacrilic; Răşini formaldehidice etc.

Procedeele de imobilizare sunt fizice şi chimice: Procedeele fizice utilizează forţe fizice pentru fixarea enzimei la

suport:ENZIMA forte fizice SUPORT

Forţele de legare pot fi:› interacţiuni electrostatice,› legături ionice,› legături de hidrogen,› interacţiuni de tip proteină-proteină etc.› Adsorbţia pe suporturi insolubile în apă (cărbune, clei, celuloză, răşini

schimbătoare de ioni: DEAE-celuloză, DEAE-Sephadex, sticlă, amidon, colagen etc.

› Includere în structuri macromoleculare (formarea unor polimeri în prezenţa enzimei respective);

› Microcapsulare în membrane semipermeabile; › Imobilizare în celule de ultrafiltrare.

Procedee chimice se bazează pe formarea unor legături covalente sau parţial covalente între enzima şi un suport activat chimic, insolubil în apă. 

ENZIMA legături covalente/ SUPORT parţial covalenteLegarea covalentă a enzimelor de suporturi insolubile, cu grupări reactive sau activate chimic;Copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv, Reticularea.

Metode fizice de imobilizare Metode chimice de imobilizare

A. Adsorbţia. B. Includere în membrane semipermeabile. C. Includere în celule de ultrafiltrare. D. Legare covalentă la suportul insolubil. E. Copolimerizare. F. Reticulare.

 

1). Inglobarea (Includerea)Metoda de înglobare a fost utilizată mai ales

pentru imobilizarea celulelor, dar nu şi pentru enzime. Biocatalizatorii au fost înglobaţi în polimeri naturali ca agar, agaroză şi gelatină prin polimerizare, iar în alginat şi caragenan prin gelifiere (gelatinizare) ionotropă. Recent au fost folosite aşa numitele hidro-geluri şi polimerii hidrosolubili termoreactivi, ca hidrogelul de poli-albumină (etilen glicol).

2). Legarea covalentăLegarea covalentă reprezintă o tehnică mult

utilizată pentru imobilizarea enzimelor, dar nu şi pentru celule. Prin această metodă, enzimele sunt legate la suporturi prin intermediul unor grupări funcţionale enzimatice, care nu sunt esenţiale pentru activitatea catalitică a enzimei respective. Studii ample au fost efectuate asupra grupărilor funcţonale amino, carboxil şi gruparea fenolică a tirozinei.

3). Legare încrucişată (cross-linking)Cross - linking reprezintă o altă metodă de imobilizare a

enzimelor prin intermediul unor agenţi de cuplare homo sau heterobifuncţionali ( ex. glutaraldehida care interacţionează cu grupările amino printr-o reacţie bazică). Diferite enzime sau celule au fost imobilizate prin cross-linking în prezenţa unor proteine inerte ca gelatina, albumina şi colagenul. Studii recente au demonstrat că albuşul de ou (sub formă de pudră, perle sau spumă cu porii mari) reprezintă un suport bun pentru imobilizarea enzimelor sau celulelor neviabile prin intermediul glutaraldehidei. Datorită conţinutului în lizozim, suportul capătă şi proprietăţi bactericide, prevenind astfel contaminarea cu bacterii.

4). AdsorbtiaAdsorbtia este probabil cea mai simplă metodă de imobilizare.In cazul enzimelor imobilizate prin interacţiuni ionice, adsorbtia şi desorbţia enzimei depind de bazicitatea schimbătorului de ioni.A fost imaginată o tehnică ce utilizează polietilenimina care conferă caracter de policationi unor suporturi neutre pe bază de celuloză sau materiale anorganice. Enzime cu pH scăzut ca invertaza, glucozoxidaza, urează, catalază şi altele au fost legate prin adsorbţie urmată de cross-linking pe suport acoperit cu polietilenimina.

Enzimele co-imobilizate se obţin prin legarea simultană Ia acelaşi suport sau prin înglobarea lor simultană în acelaşi suport.

Adesea o celulă microbiană nu conţine toate enzimele necesare unui proces. De exemplu, Saccharomyces cerevisiae, drojdie capabilă de fermentaţie alcoolică, nu poate utiliza lactoza sau amidonul, fiind lipsită de β-galactozidază şi amilază. Pe lângă ingineria genetică, o soluţie în acest sens este reprezentată de imobilzarea enzimei (enzimelor) deficitară(e) la suprafaţa celulei microbiene. Aceasta se poate realiza cu ajutorul concanavalinei A (Con A) sau cu polietilenimina, prin adsorbţie urmată de cross-linking.

O aplicaţie majoră a enzimelor imobilizate în industria alimentară este conversia siropului de glucoza în sirop de fructoză cu ajutorul glocozoizomerazei.

O aplicaţie deosebit de importantă a biocatalizatorilor imobilizaţi, în industria laptelui, o constituie obţinerea de lapte şi zer fară lactoza (hidrolizată cu ajutorul β-galactozidazei). Această realizare are o semnificaţie deosebită în ţări ca India unde prevalenta intoleranţei la lactoza este foarte ridicată. › Deja a fost comercializat lapte cu lactoza hidrolizată cu

ajutorul lactazei imobilizate. Procesul se bazează pe imobilizarea lactazei neutre obţinută din drojdii (Kluyveromyces lactis) prin încorporare în fibre sintetice. S-a obţinut zer fară lactoza (hidrolizată de lactază de origine vegetală, imobilizată).

Preparate enzimatice cu glucozoxidază imobilizată sunt utilizate pentru obţinerea acidului gluconic, îndepărtarea oxigenului din băuturi şi îndepărtarea glucozei din ouă, înaintea deshidratării pentru a preveni reacţia Maillard. Unele studii au arătat că glucoza poate fi îndepărtată din ou utilizând glucozoxidază şi catalază co-imobilizate fie pe textură de bumbac policationică sau pe spumă de albuş de ou. Un procedeu alternativ utilizează drojdii imobilizate pentru a îndepărta glucoza din melanjul de ou prin procese heterofermentative.

O alta enzima care poate fi imobilizata este catalaza utilizată pentru descompunerea peroxidului de hidrogen, folosit în sterilizarea la rece a laptelui.

Renina imobilizată sau alte proteaze pot fi folosite în procesul de coagulare continuă a laptelui, pentru obţinerea brânzeturilor.