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Cours Pasteur

ANALYSE DES GENOMES

PROGRAMME 2019-2020

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Cours Pasteur

ANALYSE DES GENOMES 2019-2020

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Codirecteurs du Cours:

Stéphane LE CROM & Didier MAZEL

Chef de Travaux :

Lionel FRANGEUL

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LE COURS SE DEROULE DU 4 NOVEMBRE AU 20 DECEMBRE 2019

AU CENTRE D’ENSEIGNEMENT DE L’INSTITUT PASTEUR BATIMENT SOCIAL 6 – MODULE 4 – SALLE 3

28, RUE DU DOCTEUR ROUX, 75015 PARIS

CONFERENCES ET COURS : -DU 4 NOVEMBRE AU 20 DECEMBRE 2019 : SALLE DE COURS 3 (BATIMENT SOCIAL 06) TRAVAUX PRATIQUES : SALLE DE TP 2EME ETAGE DU CENTRE D’ENSEIGNEMENT

(PLM, BATIMENT 09)

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PRESENTATION DU COURS

Préambule au cours d’Analyse des Génomes 2019-2020 La Génétique est la Science qui étudie l’hérédité. Or, quiconque s’interroge sur les différences entre un objet physique, par exemple un nuage, et un organisme vivant, par exemple une souris, arrivera tôt ou tard à la conclusion inévitable qu’il n’y en a qu’une: l’hérédité car, comme les nuages, les organismes vivants suivent les lois de la physico-chimie (voir Schrödinger, 1944). Ils sont constitués des mêmes atomes. Mais, alors qu’un nuage se forme à une date et en un lieu donnés comme la conséquence d’un ensemble de valeurs précises d’humidité, de pression et de température sans souvenir de la présence éventuelle d’un autre nuage, similaire ou non, à une date antérieure, une souris naît à partir de deux autres souris préexistantes qui, elles-mêmes, avaient des parents, etc … Pour sa formation à partir des atomes et des molécules qui la constitueront, une souris hérite, dès l’oeuf, du fruit de l’évolution de tous ses ancêtres, proches et lointains, tandis que le nuage part de zéro. Les êtres vivants ont donc, en plus de la physique, une histoire portée de génération en génération par le matériel héréditaire. Connaître ce matériel héréditaire et son fonctionnement c’est donc lire l’histoire des êtres vivants, comprendre leur complexité et, finalement, appréhender ce qui les distingue du monde inanimé. C'était toujours l’objet même de la Génétique depuis son origine même si les méthodes d’analyse n’ont longtemps permis de lever que quelques pans du voile. Avec l’analyse des génomes, notre connaissance du matériel héréditaire devient exhaustive et, s’éloignant progressivement des systèmes modèles qui furent si précieux à la Génétique, la Génomique explore maintenant le monde vivant dans son intégralité et, progrès techniques aidant, à travers tout le spectre d'échelles qui relie les molécules élémentaires aux populations naturelles. Des horizons insoupçonnés se découvrent. Les notions classiques font place à des visions nouvelles qui nous permettent même d’imaginer des mondes que la Biologie synthétique essai de construire. Pour bien appréhender ces idées, un bref retour en arrière s’impose. On mesurera d’autant mieux l’impressionnant chemin parcouru que l’année 2015 marquera le 150ème anniversaire de la présentation des travaux de Mendel (Mendel, 1866),

La Génétique, science des génomes

Les bases de la génétique moléculaire Au cours du siècle dernier, nos connaissances sur le matériel héréditaire ont progressé d’une

manière considérable. Depuis les chromosomes eucaryotes, corpuscules observables au microscope au cours des divisions cellulaires dont le comportement trahissait leur rôle dans l’hérédité pour ceux qui connaissaient les lois de Mendel, on est passé à l’ADN grâce aux bactéries (Avery et al., 1944, Watson et Crick, 1953). Puis, on a décrit la structure fine du gène grâce aux bactériophages (Benzer, 1961) et déchiffré le code génétique grâce essentiellement à la Biochimie (Crick et al., 1961, Nirenberg et al., 1961, Nishimura et al.,1965). Avec les opérons bactériens, on découvrait des principes de régulation de l'expression des gènes qui semblaient universels (Jacob et Monod, 1961). On savait, grâce aux champignons, qu’à chaque gène correspondait une protéine (Beadle et Tatum, 1941). Et le dogme central de la Biologie moléculaire (datant de 1953, voir figure 1) nous indiquait comment les ARN, jouant le rôle d'intermédiaires, étaient impliqués dans l'expression des gènes pour former ces protéines. Nul ne

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doutait alors que ces principes étaient universels et certains, pensant que l'on avait compris l'essentiel, se détournèrent à ce moment de la biologie moléculaire des gènes pour s'intéresser au développement des organismes, au fonctionnement du système nerveux ou à d'autres problématiques jugées plus complexes.

Les ARN: pas uniquement de simples messagers Pourtant, la Génétique moléculaire devait révéler encore bien d'autres surprises sans lesquelles

l’analyse des génomes aujourd’hui serait incompréhensible. D'abord, on découvrit que les ARN peuvent être retrotranscrits sous forme d'ADN pouvant être intégré au matériel génétique et donc transmis à la descendance (Temin et Mizutani, 1970, Baltimore, 1970). Dès lors, les ARN n'étaient plus seulement des intermédiaires de l'expression des gènes, ils pouvaient donner naissance au matériel héréditaire. Ensuite, dès que l'on a pu étudier directement la structure moléculaire des gènes, grâce aux techniques de l’ADN recombinant et du Génie génétique (développées à partir de 1973), celle-ci est immédiatement apparue beaucoup plus complexe qu'on ne l'imaginait. Et même surprenante. On découvrit les introns, séquences internes des ARN transcrites de l'ADN mais éliminées des molécules d'ARN finales par épissage des séquences qui les entourent, les exons (Berget et al. 1977, Chow et al., 1977, Glover et Hogness, 1977, Jeffreys et Flavell, 1977, Gilbert, 1978). On parlait de gènes mosaïques que l’on commençait à séquencer en essayant toujours d’interpréter les résultats selon les principes du dogme central de la biologie moléculaire.

En réalité, on était en train de mettre en lumière le rôle central des ARN, les gènes n’en étant que le reflet. On sait maintenant qu'il existe plusieurs catégories d'introns et les différents mécanismes de l'épissage des ARN ont été décrits. On découvrit que, dans la plupart des cas, ce sont les ARN eux-mêmes qui catalysent ces réactions d’épissage (voir plus loin) même si, pour ce faire, ils sont parfois associés à des protéines. Sans entrer dans les détails pourtant très significatifs, l'idée importante ici est qu'entre le gène et son produit s'intercalent une série de réactions qui modifient, souvent considérablement, les séquences des populations de molécules d'ARN présentes dans la cellule. Or, pour des raisons techniques, c’est le séquençage de l’ADN qui s’est développé et non celui de l’ARN dont les molécules chimiquement très réactives permettent mal le séquençage direct (sans faire une copie ADN). Actuellement, le séquençage massif d’ARN (voir plus loin) passe par un intermédiaire ADNc.

Les débuts du séquençage de l’ADN Les premières méthodes qui permirent de déterminer rapidement l'ordre de succession des nucléotides le long des molécules d'ADN (séquencer l'ADN) datent de 1977 (Sanger et al., 1977, Maxam et Gilbert, 1977). C’est une date critique. Avant, on savait conceptuellement ce que devait être un gène et ses mutations, mais sans espoir d’en connaître réellement le contenu informatif précis. Après, on allait pouvoir déchiffrer ce contenu, vieux rêve de tous les généticiens. Ces méthodes sont aujourd'hui reléguées aux musées (voir plus loin), mais il s'agissait alors d'un progrès considérable qui faisait suite à des années de recherches au cours desquelles avaient été explorées différentes pistes permettant de déterminer des séquences courtes d’ADN comme, par exemple, les opérateurs bactériens. Ce n’est donc qu’à partir de 1977 que l’on a commencé à connaître l'information génétique contenue dans les gènes. Une accélération considérable des découvertes de la génétique moléculaire s'ensuivit. Les mutations n'étaient plus uniquement des signatures conceptuelles associées à des phénotypes particuliers dans des conditions définies du laboratoire. On en découvrait maintenant la nature chimique et, en conséquence, on allait pouvoir les créer chimiquement de façon déterminée. Toute l'histoire de la

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mutagénèse dirigée débutait, suivie plus tard de celle de la synthèse chimique des gènes et maintenant de celle des génomes entiers (voir plus loin).

Comme le dogme central de la biologie moléculaire et le code génétique permettent de prédire les séquences des protéines à partir de celles des gènes (aux modifications près introduites au niveau des ARN), au début des années 1980s on séquençait les gènes pour avoir la séquence des protéines. Mais le séquençage d’ADN restait laborieux et le souci était d’éviter la duplication des efforts. Naissaient alors les premières bases de données permettant de mettre à la disposition de la communauté scientifique les séquences d'ADN et celles, déduites, de protéines. Peu à peu, comme ces répertoires s'enrichissaient, les comparaisons de séquences devenaient possibles. Graduellement, elles allaient prendre le pas sur les expériences. En même temps, on s'intéressait aux séquences régulatrices de l'expression des gènes que l'on pouvait maintenant manipuler dans des systèmes artificiels d'expression génétique. On s'intéressait évidemment aussi aux premiers gènes morbides identifiés chez l'homme. On espérait en tirer rapidement des traitements (et des retombées financières !). On s'intéressait aux génomes des organelles, des plasmides et des virus dont les tailles limitées permettaient d'obtenir les séquences complètes en seulement quelques années de travail ! C’était l’époque du Génie génétique triomphant. Certains, pensant alors que l’on avait tout compris, ne rêvaient que d’applications. Elles furent décevantes pour la plupart car très prématurées.

L’ingénierie génomique C'est pourtant à cette époque que furent découverts les premiers outils d'ingénierie des génomes.

Des endonucléases dont la spécificité de séquence permettait d'envisager cibler un site unique dans un génome entier. La première catégorie d'enzymes de cette nature, appelée maintenant homing endonucleases, avait été découverte à partir d' un intron mobile d'un gène mitochondrial de levure présentant des anomalies de transmission héréditaire lors des croisements (Jacquier et Dujon., 1985, Colleaux et al., 1986, Colleaux et al. 1988). Il s’agissait de l’aboutissement totalement imprévu de plus de quinze ans de recherches sur un phénomène surprenant dont le seul intérêt était son existence même (Dujon, 2005a), tout sauf le chemin direct avec rapports d’étapes souhaité par les tenants actuels de la recherche sur projets prédéfinis répondant à un défi sociétal ! A cette époque, grâce au CNRS et à la liberté qui régnait dans les universités françaises, on pouvait découvrir ce que l’on ne cherchait pas, simplement parce que c’était possible de le faire, un peu comme on vainc le sommet d’une montagne. De très nombreuses homing endonucleases ont ensuite été découvertes issues d'une variété d'organismes ou ont été synthétisées artificiellement pour des applications précises. Plus tard (1996) est apparue une deuxième catégorie d'endonucléases site-spécifiques dites « à doigt de zinc ». Le principe en était très différent puisque, au lieu d’exploiter ce que fournissait la nature, il s’agissait d’une ingénierie moléculaire, joignant une endonucléase bactérienne classique à une combinaison de motifs protéiques élémentaires capable de conférer à l’ensemble une reconnaissance spécifique d’un fragment de séquence suffisamment long pour assurer son unicité dans un génome. Sur le même principe général, sont nées plus récemment (2010) une troisième catégorie d'endonucléases site-spécifiques appelées TALE nucleases ou TALEN. Enfin, très récemment (2012) une quatrième catégorie d'endonucléases site-spécifiques a pu être développée à partir d’observations faites chez des bactéries chez lesquelles une « immunité » antiphagique est obtenue par activation d’une endonucléase protéique non-spécifique par un petit ARN qui, lui, permet la reconnaissance parfaite d’un fragment de séquence suffisamment long pour assurer son unicité dans un génome. La facilité avec laquelle on peut synthétiser artificiellement des petits ARN, comparée à la synthèse de protéines recombinantes, a assuré un

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enthousiasme immédiat pour ce dernier système appelé CRISPR. Avec ces outils, on entre dans une nouvelle ère de Génie génomique qui ouvre les plus grands espoirs (voir figure 2).

Les multiples fonctions des ARN Pendant ce temps, les ARN continuèrent de nous surprendre. D'abord, on découvrit qu'ils subissent des éditions, c'est-à-dire que leur séquence est modifiée de façon précise et déterminée, changeant ainsi l'information génétique qu'ils étaient censés véhiculer. On connaît maintenant beaucoup de mécanismes différents d'édition. Dans certains cas, l'édition peut être tellement massive qu'elle crée des messagers traduits en protéines là où il n'y a pas de gène reconnaissable correspondant. C’est le cas des mitochondries dans le grand groupe eucaryote des Excavates (voir figure 3). Mais surtout on découvrit que les ARN sont capables de catalyser des réactions chimiques (Cech et al., 1981, Altman, 1981). D’abord celles concernant leur propre structure (transesterifications permettant l'épissage des introns, hydrolyse des liaisons phosphodiester permettant la maturation des ARN précurseurs). Mais aussi toute une variété d'autres réactions biochimiques. Aujourd'hui on sait que les ARN sont impliqués, comme catalyseurs ou comme co-facteurs, dans une variété de réactions essentielles à la vie cellulaire telles que la synthèse protéique au niveau du ribosome, l'élongation des télomères (Greider and Blackburn, 1989), le transport des protéines, les processus de maturation ou de modifications chimiques d'autres ARN et, bien sûr, le contrôle de l’expression d’autres gènes ainsi que des éléments mobiles, des séquencs virales ou des séquences répétées dans les génomes. On découvrit des machineries complexes chez les eucaryotes, impliquant des petits ARN, pour ces dernièrs types d’activités (Fire et al., 1998). Le nombre des petits ARN et la variété de leurs propriétés ont augmenté très vite grâce, en particulier, aux nouvelles méthodes de séquençage.

Le séquençage des génomes et le développement de la Génomique

Les motifs Au milieu des années 1980s, les applications potentielles du génie génétique et d’autres

considérations plus stratégiques, voire politiques, allaient motiver le séquençage des génomes entiers, à commencer par celui de l'homme. Plusieurs années s'ensuivirent au cours desquelles hésitations, conflits et rebondissements ne furent pas rares. Contrairement aux idées simples, les progrès les plus décisifs ne vinrent pas toujours de là où on les attendait. Comme dans toute recherche véritable d'ailleurs. Des bactéries (comme Haemophilus influenzae), la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae et le nématode Caenorhabditis elegans devaient jouer, chacun à leur manière, des rôles essentiels dans le programme "génome humain" alors qu'ils étaient des initiatives indépendantes (lire, par exemple, Vassarotti et al.,1995, Goujon, 2001, Brown, 2003). Ironiquement, alors que certains ne voyaient dans ces génomes que des tremplins technologiques pour le génome humain, c’est sur le plan conceptuel que les choses commençaient à bouger.

Les surprises Les premiers génomes séquencés (Fleischmann et al. 1995, Goffeau et al. 1996) nous

rappelèrent rapidement à quel point des connaissances fondamentales nous manquaient. Avec le génome de la levure, trois surprises majeures attendaient les généticiens. D’abord, il y avait dans le génome beaucoup plus de gènes pour chaque fonction que ce que la génétique laissait prévoir. En d’autres termes, les cribles génétiques classiques mêmes les plus systématiquement appliqués

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n’arrivaient jamais à l’exhaustivité. Ensuite, beaucoup de gènes avaient des séquences entièrement nouvelles, sans similarité dans les bases de données existantes. Une explication triviale était que ces bases de données étaient très incomplètes, ce qui n’était pas faux. Mais même aujourd’hui chaque nouveau génome séquencé fait apparaître une fraction non nulle de tels gènes qu’on désigne donc comme « orphelins ». Une autre explication commune à l’époque était que ces gènes orphelins n’étaient pas des vrais gènes. Ce qui n’est pas nécessairement faux non plus pour certain d’entre eux. Mais leur nombre élevé exclu la généralisation de cette hypothèse. Une réalité plus intéressante, comprise seulement maintenant, est que certains des gènes orphelins sont en réalité des gènes créés de novo dans les différentes lignées évolutives. Enfin, la troisième surprise était que nombre de gènes étaient dupliqués. Ceci était incompréhensible dans la vision classique de mutations aléatoires soumises à la sélection naturelle. On sait maintenant que cette redondance est vraie pour tous les génomes, même si le cas de la levure était particulier. En d'autres termes, la nature ne connaît pas les génomes minimums dont rêvent les ingénieurs. La raison est à rechercher dans la perpétuelle dynamique évolutive des génomes (voir plus loin).

Les chiffres Actuellement, de nombreux génomes bactériens ont été séquencés entièrement ou partiellement

(plus de 219 000 projets sont mentionnés sur le site GOLD (http://www.genomesonline.org/). Il en va de même d'environ deux mille génomes d'Archaea (un déficit important comparé aux bactéries) et d'un nombre rapidement croissant d’eucaryotes (environ 14 500 sont terminés ou en cours). Historiquement, ce fut la levure Saccharomyces cerevisiae avec son génome d'environ 13 millions de nucléotides (Mb) le premier eucaryote séquencé (Goffeau et al. 1996, 1997). Puis, alors que le nombre de génomes bactériens augmentait, on a vu apparaître successivement les séquences de génomes eucaryotes plus grands tels que ceux de Caenorhabditis elegans, (97 Mb, Sulston, Waterston et Consortium, 1978), un nématode servant de modèle expérimental, et d'Arabidopsis thaliana (115 Mb, Arabidopsis Genome Initiative, 2000), une crucifère modèle. Ces débuts étaient très laborieux. Ils nécessitaient plusieurs années de travail de consortiums de laboratoires qui établissaient d'abord une cartographie détaillée des génomes avant un séquençage ordonné des segments par la méthode de Sanger. Chacun de ces projets marquait une étape importante de la génomique naissante.

Le génome humain Au tournant de l'an 2000, un premier assemblage du génome de Drosophila melanogaster (160

Mb) était publié, démontrant la faisabilité d'un séquençage aléatoire total, dit shotgun (Adams et al., 2000). Il s'agissait d'une étape importante dans la course au génome humain. Celui-ci (environ 3,100 Mb) a été déclaré terminé dans une première version en 2001 (Collins et al., 2001, Venter et al., 2001). C'était un travail considérable qui avait impliqué pour l'International Human genome Consortium, le séquençage chromosome par chromosome, par l'intermédiaire de clones BAC ancrés sur une cartographie génétique, et qui s'est terminé par une compétition contre un groupe privé travaillant par séquençage total aléatoire. Compétition biaisée car, alors que les séquences chromosome par chromosome du Consortium international étaient rendues immédiatement publiques, celles du groupe privé restaient confidentielles. Une version plus complète et révisée du génome humain fut publiée par l'International Human genome Sequencing Consortium (2004). Il s'agissait toujours d'un "génome théorique", c'est-à-dire d'un équivalent haploïde de plusieurs individus. Depuis, les génomes de plusieurs personnes vivantes ont été séquencés et certains scientifiques connus ont souhaité voir leurs génomes publiés les premiers. Après plusieurs autres génomes de représentants de différentes populations ayant permis les premières comparaisons, un vaste projet d'étude du polymorphisme a été lancé impliquant le

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séquençage de plus d'un millier d'individus appartenant à 14 populations (The 1000 Genomes Project Consortium, Abecassis et al., 2012). Avec les génomes individuels, on découvre qu'au-delà des SNPs et indels, le polymorphisme génétique entre les individus implique de grandes variations structurales dont l'importance était sous-estimée, telles que de larges délétions, duplications ou inversions (Korbel et al., 2007) et des réarrangements balancés (Chen et al., 2008). Les variations du nombre de copies de segments de chromosomes (CNVs) sont maintenant reconnues comme une source majeure de polymorphisme des génomes et il est maintenant devenu clair que, chez les eucaryotes au moins, les altérations chromosomiques dépassent en fréquence les mutations ponctuelles. L'analyse des données de polymorphisme est en train de nous apporter de nombreuses informations sur les variations entre individus (Abecassis et al., 2012), l'origine des indels (Montgomery et al., 2013), les évènements de rétroduplications (Abyzov et al., 2013) ou encore les variations fonctionnelle d'expression des gènes (Lappalainen et al., 2013) pour ne citer que quelques exemples. Des espoirs considérables apparaissent dans le domaine des cancers (Khurana et al., 2013) en particulier grâce à la possibilité d'identifier des allèles à faible pénétrance (Whiffin et al., 2013).

Les grands génomes Après la première version du génome humain apparurent les génomes d'autres vertébrés qui

devaient jouer un rôle fondamental dans l'interprétation du génome humain. Il s'agit du Fugu (365 Mb, Aparicio et al., 2002), un poisson téléostéen, et de son cousin Tetraodon negroviridis (Jaillon et al., 2004). C'est avec ce dernier que, par comparaison détaillée, l'on réussit à déduire que le génome humain devait compter seulement 23,000 gènes environ. Vinrent aussi les génomes du riz (420-466 Mb, Goff et al. 2002, Yu et al., 2002, Yu et al., 2005), d’Anopheles gambiae (278 Mb, Holt et al., 2002), un moustique vecteur de la malaria, d'autres nématodes (Stein et al., 2003, Mitreva et al., 2005), de la souris (Waterston et al., 2002, Mouse genome consortium, 2002), du rat (Gibbs et al., 2004), du poulet (Hillier et al., 2004), du chimpanzé (Mikkelsen et al., 2005) et d'autres grands primates. Ensuite, apparurent les génomes du peuplier, du chien, de la vigne, du cheval, du bananier, de l'ornithorhynque, du concombre, de la papaye, du ver à soie pour ne citer que quelques exemples datant encore de la période Sanger (voir plus loin). Il est devenu impossible de suivre cette accélération. Malgré cette abondance, chaque nouveau génome continue de nous révéler des surprises. Tous ces génomes ne sont pas nécessairement séquencés de manière complète. À cause de leur taille même, ou des difficultés inhérentes à leur complexité, on réalise le séquençage à un certain niveau de couverture moyenne 1, variable selon les besoins. Il reste des trous ou des zones de basse qualité dans les séquences déposées dans les bases de données. Il faut s'en souvenir même si les progrès de la Génomique comparée permettent de s'en accommoder. Et surtout les méthodes de séquençage ayant considérablement évolué (voir plus loin), les problèmes se posent aujourd’hui de manière totalement différente pour les nouveaux génomes étudiés.

La génomique évolutive

1 Dans un séquençage aléatoire, la couverture est donnée par le nombre de nucléotides totaux séquencés rapporté à la taille du génome. Si L est la longeur moyenne (en nucléotides) de chaque lecture, N le nombre total de lectures effectuées et G la taille du génome (en nucléotides), la couverture C s'exprime par C= NL/G). On a l'habitude d'exprimer ce rapport par un nombre de X (ex. 3X: couverture typique d'un séquençage exploratoire, 6X: couverture typique d'un brouillon assemblé de séquence (draft), 10 -12 X: couverture standard d'une séquence qui sera soumise à finition). Tous ces chiffres correspondent aux séquençages génomiques réalisés selon la méthode de Sanger jusqu’en 2007 env iron. Avec l'arrivée des nouvelles technologies, des couvertures beaucoup plus élevées sont obtenues et le problème des finitions est abandonné faute de pouvoir le traiter (voir chapitre).

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En parallèle des grands génomes cités, le séquençage total ou partiel de beaucoup d'autres génomes eucaryotes de taille plus modeste était devenue chose courante au début des années 2000 en utilisant la méthode Sanger. Ceci a ouvert la voie à un nouveau champ de recherches dans lequel la dimension évolutive prenait de plus en plus de place par rapport à la dimension fonctionnelle. Les nouvelles méthodes de séquençage ont considérablement accéléré le phénomène. Plusieurs dizaines d'espèces de levures ont été séquencées, (Souciet et al., 2000, Wood et al., 2002, Cliften et al., 2003, Kellis et al., 2003, Jones et al., 2004, Dujon et al., 2004, Dietrich et al, 2004, Kellis et al., 2004, Loftus et al., 2005, Dujon, 2005b, 2006, Novo et al, 2009, Dujon, 2010), et autant de champignons divers (Galagan et al., 2003, 2005, Machida et al., 2005, Nierman et al., 2005, Dean et al., 2005, Kaiper et al., 2006, Martin et al., 2008, 2010, Ma et al., 2009). On a séquencé des microsporidies (la première était Encephalitozoon cuniculi, Katinka et al., 2001), des parasites comme le Plasmodium falciparum (Gardner et al, 2002), agent de la malaria et son cousin P. yoelii yoelii (Carlton et al., 2002) et d'autres Apicomplexes comme Cryptosporidium hominis (Xu et al., 2004), les trypanosomes Trypanosma brucei (Berriman et al., 2005) et T. cruzi (El-Sayed et al., 2005), la leishmanie Leshmania major (Ivens et al., 2005), des amibes comme Entamoeba histolytica (Loftus et al., 2005) ou Dictyostelium discoideum (Eichinger et al., 2005) etc ... A mesure que l’efficacité de séquençage augmentait, la génomique évolutive a pu également s’adresser aux organismes pluricellulaires. Douze espèces de Drosophiles ont été séquencées et comparées pour comprendre l'évolution de ce groupe d'insectes (Drosophila 12 genomes consortium, 2007). Le point critique était l’existence de centres de séquençage capables de générer et de traiter des grands volumes de données.

Le Génoscope En France, le Génoscope d'Evry, qui n'est pourtant que d'une taille modeste vis-à-vis de ses

concurrents étrangers, a réalisé le séquençage complet du chromosome 14 humain (Heilig et al., 2003), du poisson Tetraodon (Jaillon et al., 2004), de la Paramécie (Aury et al., 2006), de la vigne (Jaillon et al., 2007), d'une algue brune Ectocarpus silicosus (Cock et al., 2010), de l'urochordé Oikopleura (Denoeud et al. 2010), pour ne citer que les plus grands projets. Depuis une quinzaine d’années, il a réalisé plusieurs centaines de projets génomes au service de la communauté scientifique française et européenne, en plus du séquençage de régions génomiques d'intérêt particulier, de la recherche de mutations, de banques d'ADN complémentaires etc ... Aujourd’hui, le Consortium France Génomique coordonne les activité de génomique en France.

Les curiosités biologiques Avec les génomes, la Biologie traditionnelle redevient d'actualité. Par exemple, on a séquencé

les nucléomorphes de symbiontes récents tels que Guillardia theta, une Cryptophyte considérée à tort comme une algue rouge (Douglas et al., 2001) et Bigelowiella natans, un Chlorarachniophyte considéré à tort comme une algue verte (Gilson et al., 2006). Ces nucléomorphes représentent en réalité les restes des noyaux d’algues rouge ou verte, respectivement, après leur absorption par d’autres eucaryotes unicellulaires ayant ainsi acquis la photosynthèse de manière endosymbiotique (Curtis et al., 2012). De la même façon, on a séquencé le génome d'une ascidie, Ciona intestinalis pour explorer la base évolutive des Chordés (Dehal et al., 2002). On s'intéresse aussi aux annélides et aux mollusques car ce sont des Lophotrochozoaires, une branche animale longtemps inexplorée au niveau génomique et qui présente de nombreuses caractéristiques intéressantes au plan de la formation du corps. Ou encore aux rotifères bdelloïdes, minuscules métazoaires asexués et résistants à la dessiccation, dont le génome partiellement tétraploïde et hybride, montre une structure entièrement nouvelle avec les deux allèles du parent diploïde portés par le même chromosome, inimaginable d’après la génétique mendélienne classique (Flot et al.

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2013). Loin d'être une activité réductionniste à l'extrême comme certains l'imaginent, l'étude des génomes ouvre des voies nouvelles, d'une efficacité inconnue auparavant, pour tous ceux qui connaissent l'Histoire naturelle et ses remarquables observations. On s'intéresse aux symbioses, au parasitisme, et à toutes les interactions des organismes dans la nature, dont la formation de nouveaux pathogènes.

Génomique populationnelle et métagénomique De plus, pour un nombre croissant d’organismes on séquence, pour les comparer, de nombreux

individus d’une même espèce. On parle de re-séquençage. C’est évidemment le cas pour l’homme, mais aussi pour de nombreux microorganismes (voir par exemple Liti et al., 2009). Avec cette stratégie, la génomique rejoint la génétique des populations, en l'enrichissant d'une quantité de données que cette dernière ne pouvait pas obtenir par les méthodes traditionnelles. C'est là, l'un des défis majeurs de l'enseignement de la Biologie moderne, tant ces disciplines sont restées trop longtemps séparées (voir Lynch, 2007). De même, l'analyse des génomes nous affranchit de la nécessité d'isoler les organismes étudiés, ce qui n'est pas toujours possible. Au contraire, on peut s'intéresser directement à des populations naturelles, ou même des écosystèmes. On parle de métagénomique. Actuellement, on découvre plus d'espèces nouvelles par le séquençage métagénomique que par les méthodes traditionnelles. L'étendue de la biodiversité des espèces devient accessible aux nouvelles méthodes de séquençage (Sogin et al., 2006). Les océans deviennent des champs d'exploration systématique. Un projet piloté par des équipes françaises et le Génoscope (Tara Océans) a été lancé pour cataloguer des virus, des bactéries et des eucaryotes unicellulaires des océans du monde entier (Karsenti et al., 2011). Plusieurs centaines de prélèvements ont été effectués et les échantillons sont caractérisés par le séquençage et l’analyse des morphologies cellulaires (Karsenti, 2012). Les échantillons océaniques montrent de nombreux virus dont l’importance écologique et évolutive est probablement beaucoup plus grande qu’on ne l’imaginait (Hingamp et al., 2013). A titre d’exemple, on se rappellera que les Mammifères sont devenus placentaires à l’époque Crétacé par capture de gènes d’enveloppe rétroviraux (Cornelis et al., 2014). Les sols aussi sont évidemment étudiés pour leur importance agronomique ou forestière mais également pour suivre les effets de diverses pollutions (Monier, et al., 2011). Au fur et à mesure que les résultats arrivent, on mesure l'ampleur de ce qui nous reste à découvrir, même dans des systèmes limités comme les flores intestinales de l'homme ou des animaux pour lesquels des programmes internationaux ont déjà livrés leurs premiers résultats (Qin et al., 2010). On parle maintenant couramment de microbiome pour désigner les flores microbiennes dont les compositions peuvent maintenant être intégralement décrites par la métagénomique sans nous limiter aux micro-organismes cultivables. il y a actuellement plus de 11 000 métagénomes séquencés, qui ont permis l’assemblage de près de 1 800 génomes d’organismes non cultivés (voir par exemple Bolotin et al. 2014). C’est une véritable révolution par la puissance d’analyse déjà offerte à présent, qui devrait encore être amplifiée par l’application de méthodes de séquençage incluant l’organisation tridimensionnelle des génomes (Chromosome Conformation Capture et méthodes dérivées).

La phylogénomique Enfin, c'est tout l'arbre du vivant qui est revu (et souvent corrigé) avec les données des génomes.

Il suffit pour s'en convaincre de regarder l'arbre actuel des eucaryotes (Baldauf et al., 2003, Keeling et al., 2005, voir figure 3) et de le comparer avec les versions antérieures, même relativement récentes. A la phylogénétique succède une phylogénomique dont les principes sont encore objet d'actives recherches, vu la complexité du problème. La congruence des topologies des arbres devient un problème très compliqué si l'on souhaite y intégrer toutes les données des génomes. Les arbres obtenus

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dépendent du lot de gènes utilisé pour établir la phylogénie. Les raisons de ce phénomène sont complexes et encore mal comprises. Les hybrides naturels et les transferts génétiques horizontaux sont probablement beaucoup plus fréquents qu'on ne l'imagine comme le montrent les microorganiemes.

Chez les bactéries, on constate que de nombreux segments de génomes varient entre isolats d'une même espèce, reflets d'intenses échanges génomiques au sein des populations. La notion même d'espèce s'estompe. On en vient à considérer un génome bactérien en deux parties, le "cœur" formé des gènes à transmission verticale (donc propres à la phylogénie) et les "ajouts" reflets d'une intense dynamique horizontale. Les propriétés biologiques de l'organisme, ses capacités à s'adapter à des niches écologiques ou, par exemple, à devenir pathogènes, sont la résultante finale des deux parties (Danchin et al., 2007). Évidemment, certains organismes, dont l'homme, ont une reproduction sexuée obligatoire, structurant les populations selon les lois de la génétique classique. Mais beaucoup d'autres, surtout les microorganismes ou les champignons mais aussi les plantes ou même certains animaux, ont des phases d'expansion clonale considérable dont on retrouve la signature dans les génomes. Avec la perte fréquente de la sexualité dans de nombreuses lignées de microorganismes eucaryotes, la notion d'espèce s'estompe encore plus.

Le problème de l’échantillonage taxonomique A mesure que se précise l'arbre du vivant, on réalise à quel point nos connaissances actuelles

sur les génomes sont biaisées. Si l'on reporte les nombres de génomes connus sur les différentes branches évolutives des eucaryotes, on s'aperçoit que l'essentiel des données correspond à deux grandes divisions évolutives, celle des Opisthokontes qui rassemble tous les animaux et les champignons et celle des Viridiplantae c’est-à-dire les plantes et les algues rouges et vertes. Si un nombre raisonnable de données existent pour les Chromalveolata regroupant les Apicomplexes, les Ciliés, les Algues brunes, les Oomycètes et quelques autres lignées, en revanche très peu, voire pratiquement rien, est connu des génomes des deux autres grands groupes, Excavata et Rhizaria, alors que les rares données disponibles suggèrent que beaucoup de surprises nous attendent. Les modes actuels de financement de la recherche ne sont pas étrangers à ce phénomène. En privilégiant la recherche finalisée, on n’étudie que ce que l’on est capable d’imaginer en se privant des surprises importantes. Or la véritable recherche consiste à étudier ce que l’on ne connaît pas déjà !

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Les nouvelles méthodes de séquençage

La période Sanger (1977-2007) La méthode de Sanger était basée sur la synthèse in vitro de copies d'ADN complémentaire à un brin matrice par les polymérases. La méthode de Maxam et Gilbert était basée sur la dégradation chimique des molécules d'ADN. Les deux méthodes impliquaient le marquage terminal des molécules et leur séparation selon leur taille par électrophorèse à haute résolution. Toutes les molécules d'une même réaction de séquençage ayant une extrémité commune (origine) et l'autre dépendant de la nature du nucléotide terminal, en les séparant par la taille, on lisait la séquence. Malgré leur apport considérable à la Biologie, les méthodes initiales de séquençage ne permettaient pas une augmentation d'échelle significative car elles nécessitaient trop d'interventions manuelles. Plusieurs perfectionnements techniques, couplés aux progrès parallèles de l'informatique, allaient graduellement changer le paysage jusqu’au milieu des années 2000. On peut citer la mise au point, puis l'utilisation de nucléotides fluorescents qui, couplée à l'électrophorèse capillaire, allait permettre la construction de toute une génération d'automates (séquenceurs) dont certains existent encore aujourd'hui dans certains laboratoires où ils sont confinés à des tâches spécialisés. Avec les machines les plus puissantes de cette génération technologique, on pouvait déterminer en parallèle 96 séquences d'environ 750 nucléotides de long chacune, soit environ 70,000 nucléotides par "run" de deux à trois heures. Ce sont

2313 84

8

7485666

Viridiplantae

UnikontsChromalveolata

Excavata

Rhizaria

Figure 3 : L'arbre phylogénétique des eucaryotes compte neuf lignées principales regroupées ici en cinq branches majeures (Keeling et

al, 2005). Le nombre de projets génomiques (rouge gras) répertoriés dans Genome On Line database (GOLD, octobre 2014) montre un fort

déséquilibre entre les cinq principales branches. La génomique a encore un long travail d’exploration à faire avant qu’une description

équilibrée du monde vivant ne devienne disponible.

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ces méthodes de séquençage appliquant les principes fondamentaux de la méthode Sanger qui, associées à des développements informatiques adaptés permettant d'assembler, finaliser et annoter de très grands génomes, ont permis l'extraordinaire développement de la génomique jusqu’à il y a quelques années.

Les nouvelles méthodes de séquençage Mais la situation a radicalement changée au milieu des années 2000 (voir par exemple, Seo et al., 2005, Margulis et al., 2005, Shendure et al., 2005) avec l'arrivée de nouvelles méthodes de séquençage souvent appelées NGS (pour Next Generation Sequencing). Contrairement aux perfectionnements techniques précédents ces nouvelles méthodes appliquent des principes différents de ceux des méthodes historiques. Elles ont été rendues possibles autant par les progrès de la biologie moléculaire (nouvelles molécules, nouvelles réactions) que par ceux de l'ingénierie (miniaturisation, traitement des images). Avec le NGS, la Biologie est entrée dans une nouvelle ère pour plusieurs raisons. D’abord, les quantités de séquences produites sont beaucoup plus élevées que celles obtenues par la méthode Sanger. Le pyroséquençage qui a ouvert cette période (maintenant également lui-même presque abandonné) permettait en un seul "run" de lire un million de séquences de longueur moyenne 500 nucléotides, soit un total de plus de 500 millions de nucléotides (à comparer aux 70,000 nucléotides des méthodes précédentes). Avec les nouvelles méthodes utilisant la synthèse en phase solide, un "run" peut produire plusieurs milliards de lectures de longueur de 100 nucléotides ou plus, soit un total de plusieurs centaines de milliards de nucléotides. C’est actuellement cette dernière technologie qui est la plus utilisée dans le monde. Sa puissance est telle que, souvent, plusieurs échantillons sont mélangés, après étiquetage moléculaire, pour être soumis à un séquençage unique. Les séquences élémentaires sont ensuite aisément triées en utilisant les étiquettes avant d’être traitées. C’est le volume des résultats de cette technique qui la rend incontournable. Ses défauts sont la taille limitée de chaque séquence élémentaire, rendant les assemblages problématiques en présence de séquences répétées ce qui est très souvent le cas, et le besoin d’amplification des molécules par PCR avant le séquençage. D’autres techniques, basées sur l'analyse de molécules uniques, permettent d’étudier les molécules d’ADN telles qu’elles existent dans les cellules et non plus seulement leurs copies. Ces techniques sont encore en développement, bien que déjà utilisées. Même si le volume de données produites n’atteint pas les performances dus séquençage par synthèse en phase solide, elles offrent l’avantage d’allonger considérablement la longueur de chaque lecture, point essentiel pour l'assemblage de novo de génomes inconnus, et de réduire encore davantage le coût du séquençage. Il est vraisemblable que ces techniques seront complémentaires les uns des autres.

La profondeur de lecture, élément critique Avec ces nouvelles techniques, on entend souvent dire que le coût du séquençage a chuté en

quelques années de plus de 5 ordres de grandeur. Une performance rarement atteinte dans un domaine économique ! C’est ce qui a permis au séquençage d’ADN de devenir une technologie centrale pour de nombreuses applications (agronomie, environnement, cancer, génétique médicale, recherche d’empreintes, criminologie etc …). On commence même à voir son application en routine dans certains hôpitaux (en particulier pour l’analyse des tumeurs cancéreuses) et rien ne s’oppose à étendre ces applications aux simples laboratoires d’analyse médicale. Il faudra ajuster les budgets de santé en conséquence. Mais ce n’est pas cet aspect économique qui est le plus intéressant. Avec les nouvelles techniques de séquençage, la multiplication des lectures est telle qu’elle permet enfin d’atteindre des nombres comparables à ceux des molécules d’ARN dans une cellule ou au nombre de molécules d’ADN d’un organisme pluricellulaire ou d’une population de microorganismes. L’étude exhaustive se substitue

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à l’échantillonnage aléatoire. Ensuite, les méthodes NGS n'utilisent plus le clonage de l'ADN dans des vecteurs d'E. coli qui fut la signature universelle du génie génétique depuis plus de 35 ans et celle de la génomique pendant une quinzaine d'années. La séparation des molécules d'ADN à séquencer et leur amplification se fait maintenant entièrement in vitro par PCR dans des micelles ou sur des supports solides. Avec les nouvelles technologies à molécules uniques, il n'y a même plus d'amplification par PCR. Ce sont les molécules d'ADN présentes dans l'organisme étudié qui sont directement séquencées. Avec l'énorme avantage de pouvoir identifier, en plus de la séquence des 4 nucléotides fondamentaux, les modifications chimiques que ces molécules peuvent porter et qui sont effacées par l'amplification par PCR.

Une révolution épistémologique Evidemment, les bases de données et les logiciels d’analyse doivent s'adapter aux énormes quantités de données produites par ces nouvelles méthodes. Il n'est plus envisageable de stocker les données brutes de manière pérenne. Ces méthodes ont déplacé les limites des problèmes techniques vers des problèmes d'informatique. Dans cette nouvelle Biologie qui émerge, la composition des équipes de recherche et la formation de leurs membres, donc des étudiants, changent totalement. L’effort d’analyse des données surpasse celui de la production des données. Mais les véritables changements ne se limitent pas au volume des données à traiter. Le changement d'échelle induit un changement de nature des questions étudiées. Les systèmes modèles traditionnels des laboratoires (bactéries, levures, drosophile, souris, etc …) perdent de leur importance. Tous les organismes existants deviennent étudiables. Ce sont leurs particularités biologiques qui font le degré d'intérêt de leur étude. Les populations naturelles elles-mêmes deviennent accessibles à l'étude génomique, sans se limiter aux espèces cultivables. L'évolution, les structures des populations, leur histoire, les forces de sélection auxquelles elles ont été soumises deviennent lisibles dans les génomes. La génomique de la biodiversité révolutionne notre connaissance des écosystèmes et des relations entre organismes au sein de ces derniers. La métagénomique dépasse le catalogue existant d'espèces déjà identifiées (très incomplet) pour nous ouvrir des mondes entièrement inconnus. Les ADN fossiles deviennent analysables sans avoir besoin, d'abord, de les recopier en ADN moderne. En résumé, le changement quantitatif a induit un changement qualitatif dans nos façons d’aborder la Biologie. En ce qui concerne les applications médicales, quand chacun de nous aura son génome séquencé dès la naissance (ou même avant), le problème restera celui de l’interprétation des données car les déterminismes simples de type monogénique sont davantage l’exception que la règle et, de plus, le polymorphisme génétique est beaucoup plus varié qu’on ne l’imaginait en étudiant seulement les SNP dans les exons codants qui représentent moins de 2% de notre génome.

Retour sur les bases du système génétique Avec le nouveau séquençage, la transcriptomique cesse d'être essentiellement quantitative

(mesure des quantités de transcrits par hybridation sur des arrays ou par séquençage d'étiquettes) pour devenir analytique (les molécules d'ARN présentes dans une cellule sont séquencées directement et quantitativement). Au lieu de se contenter de considérer les ARN comme de simples intermédiaires de l'expression des gènes, ce sont les multiples formes de ceux-ci qui deviennent analysables, y compris celles à courte durée de vie (Jacquier, 2009, Pelechano et al., 2013) qui correspondent au fait que la transcription des génomes eucaryotes est générale et non limitée aux gènes que l'on sait définir. Le séquençage massif d'ARN (par l'intermédiaire d'ADN complémentaire soumis à séquençage massif) devient donc l'outil de choix pour annoter les génomes (Denoeud et al., 2008). De nouveaux petits ARN

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non codants sont découverts. Et même les variations stochastiques intercellulaires deviennent analysables grâce aux nouvelles méthodes de séquençage. (Newman et al., 2006).

La génomique fonctionnelle

Le problème Si déterminer les séquences des génomes devient de plus en plus facile, il ne s'agit toujours que du point de départ d'une recherche, pas de son but. Dans la plupart des cas, on aura besoin de relier ces séquences à des fonctions biologiques, domaine plus complexe parce que moins bien défini. Eliminons ici tout de suite toutes les recherches qui s'adressent à la fonction d'un gène ou d'un petit groupe de gènes dans un système expérimental particulier. C'est le domaine de la génétique classique, pas celui de la génomique. Aujourd'hui on dispose, si on le veut, de tous les gènes. Le problème n'est donc plus de connaître les fonctions de certains gènes, ni même de chacun, mais de comprendre comment, ensemble, ils déterminent un phénotype. On entre dans une nouvelle science (en réalité le cœur historique de la Génétique, savoir comment le génotype détermine le phénotype) que l'on tend maintenant à appeler "Systems Biology" et dans laquelle on essaie de reconstituer toutes les interactions fonctionnelles à tous les niveaux de complexité hiérarchiques, du gène à l'organisme. Ceci implique naturellement un effort de modélisation théorique pour intégrer des données de nature, de complexité, de précision et fiabilité différente. La génomique fonctionnelle est la partie expérimentale nécessaire pour l'acquisition de ces données. Elle est très diversifiée et s'applique, selon les modèles étudiés, avec plus ou moins de facilité et de succès.

Transcriptome classique Parce qu'elle était le premier eucaryote séquencé complètement, mais aussi et surtout parce qu'elle permet des expériences plus aisées qu'ailleurs, la levure Saccharomyces cerevisiae a joué un rôle important dans l'émergence des nouvelles méthodes de génomique fonctionnelle. C'est avec cette levure que l'on a d'abord validé la méthode SAGE (Velculescu et al., 1995, 1997) puis les "microarrays" (DeRisi et al., 1997, Laskari et al., 1997), utilisés pour quantifier les transcrits, mais aussi maintenant pour les hybridations génomiques comparatives (CGH) qui permettent d'identifier les variations du nombre de copies de gènes qui sont un élément essentiel de l'évolution et du polymorphisme entre individus (Lage et al., 2003). Les "microarrays" permettent aussi l'étude des séquences de régulation ou la sélection (ChIp-CHIP) de séquences fixées à des protéines (Harismendy et al., 2003) ou encore, avec les "tiling arrays", de déterminer tous les polymorphismes de séquences entre individus. En combinant ces méthodes avec la génétique classique (croisement et étude des descendants), on obtient ce que l'on désigne par "genetical genomics", la stratégie la plus puissante actuellement pour identifier les déterminants des caractères complexes tellement important pour l'agronomie, les biotechnologies ou la médecine, sans oublier l'étude des processus essentiels de la vie cellulaire (méiose, réplication, recombinaison, conversion, réparation).

Interactome et mutants systématiques C'est encore avec la levure que les premières cartes d'interactions de protéines ont été établies (Fromont-Racine et al., 1997, Uetz et al., 2000, Ito et al., 2000, 2001, Zhong et al. 2003) à partir de la technique de double-hybride (Fields et Song, 1989) ou en utilisant de nouvelles méthodes de marquage et de purification des protéines et des complexes (Gavin et al., 2002, Ho et al., 2002). Pour ces raisons,

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et d'autres, tous les gènes de levure ont été clonés dans des vecteurs d'expression qui permettent, avec des marquages fluorescents d'examiner la localisation intracellulaire des protéines, ou de développer des matrices ("protein chips") de toutes les protéines (Zhu et al., 2001, Kumar et al., 2002a, Michaud et al., 2002, 2003, Ghaemmaghami et al., 2003,). La levure était le premier organisme pour lequel on a disposé d'une collection quasi-complète de mutants de délétion de chaque gène. Des collections équivalentes existent maintenant pour certaines bactéries et d’autres levures. Dans ces collections, chaque mutant est marqué moléculairement, permettant ainsi de le repêcher à partir de populations (Shoemaker et al., 1996, Winzeler et al., 1999, Giaever, 2002). La collection de mutants de levure a été utilisée directement pour cribler des phénotypes divers (Birrel et al., 2001, Aburatani et al., 2003) y compris ceux qui sont importants pour rechercher des gènes morbides chez l'homme (Steinmetz et al., 2002). De plus, d'astucieuses constructions moléculaires faites à partir de transposons permettent des expériences de mutagenèse aléatoire à partir desquelles les gènes mutés et les protéines correspondantes deviennent immédiatement identifiables car marqués moléculairement (Ross-Macdonald et al., 1999, Bidlingmaier et al., 2002). Chez les autres eucaryotes pour lesquels de telles collections sont difficiles à construire, on a construit des collections d'ARN interférant qui permettent de cribler tout un génome en éteignant les gènes un à un sans avoir besoin de les déléter.

Interactions génétiques C'est toujours avec la levure, grâce à la puissance de sa génétique, que l'on a développé les

cribles de phénotypes synthétiques les plus perfectionnés, c'est-à-dire des cribles nous permettant de rechercher toutes les interactions fonctionnelles entre un gène muté donné et tous les autres gènes de la cellule (Tong et al., 2001). Grâce à l'accumulation de larges collections de données sur les réseaux transcriptionnels, les interactions protéiques, les complexes macromoléculaires ou les interactions génétiques, la levure permet maintenant d'envisager la modélisation des interactions dynamiques qui ont lieu dans une cellule eucaryote et d'imaginer leur évolution (voir, par exemple, Tavazoie et al., 1999, Friedman et al., 2000, Schwikowski et al., 2000, Ideker et al., 2001, Edwards et al., 2002, Harrison et al., 2002a, Jansen et al., 2002, Tong et al., 2002, Werner-Washburne et al., 2002, Bar-Joseph et al., 2003, Famili et al., 2003, Forster et al., 2003, Herrgard et al., 2003, Kelley et al., 2003, Milo et al., 2002, Qian et al., 2003, Ranish et al., 2003, Segal et al., 2003, Stuart et al., 2003, Vasquez et al., 2003, Wagner, 2003, Wuchty et al., 2003, Yu et al., 2003). Cette liste, qui n'est pas exhaustive et qui ne tient pas compte des résultats les plus récents, suffit à illustrer l'ampleur des changements en cours de la Biologie (voir par ex. Costanzo et al., 2010).

Le cœur du problème Ce bref tableau ne doit cependant pas nous faire croire qu'il ne reste plus qu'à assembler les

éléments. Plus on approfondi l'étude et plus on s'aperçoit que les éléments eux-mêmes sont plus complexes qu'on ne le pensait. Même le gène devient difficile à cerner. Avec le projet d'analyse fonctionnelle du génome humain (ENCODE Project Consortium, 2007), on s'est immédiatement aperçu à quel point la complexité des transcrits fait qu'il devient impossible de définir les limites des gènes (Gerstein et al. 2007). Chez l’homme comme chez la levure, on voit maintenant que, loin du concept initial un gène – un produit, les génomes sont transcrits en une multitude d’isoformes d’ARN partiellement chevauchants et de durée de vie extrêmement variable (Pelechano et al., 2013). Les molécules d’ARN qui, finalement, serviront d’intermédiaires pour la synthèse protéique (le premier dogme central de la Biologie moléculaire) ne représentent qu’une infime partie de la population de molécules d’ARN produites dans la cellule. En d’autres termes coder des protéines n’est pas le rôle principal des gènes !

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Et d’ailleurs dans notre propre génome, seules 2% des séquences servent à cette fonction, nous laissant 98 % à mieux comprendre.

Epilogue épigénétique Et puis l’on entend souvent prononcer le mot « épigénétique » comme si, pour certains, il s’agissait d’un concept nouveau tendant à effacer les bases d’une génétique considérée comme arrogante. L’histoire est beaucoup plus intéressante. Se cache sous le mot épigénétique un ensemble de phénomènes divers qui introduisent une étape supplémentaire entre le génotype et le phénotype d’un individu avec pour résultat que le phénotype ne dépend pas seulement du génome de cet individu mais de ceux des ses ancêtres, parfois lointains. Au début du XXème siècle, on parlait de caractères non-mendéliens, expression qui cachait également une grande diversité de phénomènes dont l’hérédité, pourtant classique dans ses principes, était apportée par les génomes des mitochondries et des chloroplastes. Plus tard, la naissance de la Biologie moléculaire devait beaucoup à l’étude des bactériophages dont certains, tel lambda, sont de magnifiques exemples d’épigénétique. Ils peuvent traverser, silencieux, des centaines ou milliers de générations de bactéries avant de réapparaitre soudainement. On parlait alors de « genetic switch » contrôlé par des mécanismes moléculaires décrits avec une précision qui force encore l’admiration. Plus récemment, progrès techniques aidant, ce sont les modifications chimiques de la chromatine qui ont été élucidées. Ces modifications sont très importantes pour l’expression des gènes des régions chromosomiques correspondantes et, grâce à des boucles de rétroaction, elles créent des états métastables capables de traverser les générations cellulaires successives (et donc importantes au cours du développement des organismes pluricellulaires). Mais il y a plus, et ceci nous ramène à l’importance des ARN. Les régulations post-transcriptionnelles dépendant des petits ARN sont souvent qualifiées d’épigénétique, même quand il s’agit d’interactions classiques aboutissant à des régulations qui ne transcendent pas les générations. Mais c’est la transmission de molécules d’ARN au travers des générations qui offre les phénomènes les plus intéressants. Chez les Ciliés par exemple, après méiose et fécondation des noyaux normaux (micronoyaux), sont formés des macronoyaux qui correspondent à des amplifications massives d’une grande partie de l’information génétique contenue dans les micronoyaux, mais pas toute. Des gènes fonctionnels sont formés pendant ce phénomène tandis que des séquences (répétées ou non) sont spécifiquement éliminées. Or il est devenu clair maintenant que les « guides » qui permettent ces réarrangements minutieux proviennent de la comparaison des séquences entre ARN issus du macronoyau de la génération précédente et ceux issus du micronoyau de la nouvelle génération (Duharcourt et al., 1998, Mochizucki et al., 2002). Ce phénomène, pour l’instant circonscrit aux Ciliés chez lesquels il crée une hérédité épigénétique de caractères essentiels comme par exemple le type sexuel (Singh et al.,2014), interpelle quant à son évolution.

Qu’est-ce qu’un génome ?

Le texte des génomes Quand on a séquencé un génome, on dispose du texte intégral qui détermine l’ordre, la complexité et le fonctionnement de l’organisme qui le porte. Ce texte contient de plus en trace l’histoire de ses ancêtres et les limites de ses possibilités évolutives futures. Les variations d’expression dites épigénétiques ne changent rien à ce déterminisme fondamental: les mécanismes épigénétiques sont eux-mêmes déterminés génétiquement. Ce qu’il est important de comprendre est que le déterminisme génétique n’est pas nécessairement simple et direct et encore moins monogénique. Il nous reste à interpréter le texte des génomes en termes fonctionnels et ceci est loin d'être résolu. La difficulté est

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encore accrue par les variations entre individus d’une même population. Croire que l’on dispose du génome d’une espèce parce qu’on a séquencé l’un de ses représentants est une erreur commune. Combien de gens ont clamé qu’après l’annonce du génome humain, on allait (enfin) passer à la post-génomique ? Et se sont évidemment retrouvés frustrés par l’absence de retombées immédiates. Mais que pouvait-on conclure d’une référence ? Sauf de jouer son rôle de référence comme on le voit maintenant que l’on dispose des variations individuelles.

Combien de gènes ? De plus, à la simple question: combien de gènes dans un génome particulier séquencé avec le

plus grand soin, la réponse est rarement précise. Chez l'homme, le débat fut même vif il y a quelques années (Roest-Crollius et al. 2000) avant que l'on comprenne que le déterminisme génétique n'est pas une relation simple et univoque entre un gène et sa fonction. Mais même chez la levure, près de vingt ans après la première séquence intégrale et malgré l'intensité des études fonctionnelles, on en est encore à modifier le nombre de gènes car on en avait oublié quelques centaines, surtout les plus courts, et annotés quelques centaines d'autres qui, après analyse, se sont révélés ne pas exister (Blandin et al., 2000, Zhang et Wang, 2000, Harrison et al., 2002b, Kumar et al., 2002b, Oshiro et al., 2002, Kessler et al., 2003, Kellis et al., 2003). Une partie de ces problèmes est à relier au fait que la limite est floue entre un gène, un pseudogène et un proto-gène (Carvunis et al., 2012). Quelques mutations peuvent suffire pour passer de l’un à l’autre. Chez la levure, on estime à près de 1900 (un tiers du génome environ) le nombre de proto-gènes capables en quelques mutations de donner naissance à des nouveaux gènes fonctionnels. On voit que les projets de Biologie synthétique, pourtant extrêmement prometteurs en termes de possibilité de synthèse de génomes (Dymond et al., 2011, Cooper et al., 2012, Annaluru, N., et al. (2014), ont peut-être encore des progrès à faire avant d’être compétitifs avec la nature. Mais s’il est si difficile de définir les modèles de gènes, il ne faut pas oublier qu’en définitive chaque génome n’est en réalité que l’instantané d’un processus de changements permanents. Et cette dynamique évolutive devra être prise en compte pour interpréter les génomes.

Des références à revoir Actuellement, beaucoup des génomes entièrement séquencés sont mal annotés. C'est l'un des

problèmes importants que l'on doit résoudre. L'augmentation très rapide du nombre de séquences disponibles, due aux nouvelles technologies devrait nous y aider en mettant la génomique comparative à l'échelle nécessaire pour étudier le monde vivant réel et non plus seulement les systèmes modèles. La généralisation du "RNA seq" devrait aussi considérablement aider. En même temps, ce sont les ordinateurs qui, seuls, seront capables d'interpréter les textes des génomes tant ils seront nombreux dans le futur. Les utilisateurs, eux, ne pourront qu'interroger ces derniers, qui ne pourront répondre que dans un vocabulaire standardisé, à condition qu'on leur en ait donné un. Quand on parle de fonctions, les efforts actuels de standardisation du vocabulaire sont donc indispensables (Reference Genome Group of the Gene Ontology Consortium, 2009). Mais on reste loin du compte car la notion même de fonction est imprécise. En Biologie, elle représente souvent davantage l’idée que l’on se fait d’un phénomène que le phénomène lui-même.

Le gène Si, à force de mieux connaître les gènes, on ne sait plus très bien ce qu'ils sont, c'est peut-être qu'en réalité, ils n'existent pas. Du moins pas comme objet moléculaire précisément définissable. A ce sujet, l’étudiant pourra consulter utilement un récent ouvrage qui retrace la notion de gène au cours du développement de la Génétique (Deutsch, 2012). Après tout, comme le disait Johanssen lui-même quand il proposa le terme en 1906 pour désigner les facteurs mendéliens, « le gène n’est rien d’autre

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qu’un petit mot facile à utiliser ». C’est l’intégration physique des gènes le long des chromosomes et leur intégration fonctionnelle au sein des génomes, c’est à dire la génomique, qui fait leur intérêt. On notera d’ailleurs que, contrairement à ce que l’usage actuel tend à suggérer, le mot génome n’est pas récent. Il a été proposé pour la première fois par H. Winckler en 1920 pour désigner le lot complet de tous les facteurs héréditaires d’un organisme vivant, observable à l’époque sous la forme des chromosomes qui les portent (Winckler, 1920). Plus que dans les avancées technologiques indéniables de la génomique, c’est dans ce caractère intégré qu’il faut rechercher la véritable dimension nouvelle de la génomique.

Le cours d’Analyse des Génomes

Le bref historique ci-dessus n’a pour but que d’essayer de mieux faire comprendre aux étudiants l’origine et la signification des concepts qu’ils seront appelés à manipuler. Le cours a pour finalité d’amener les étudiants à comprendre les principes fondamentaux de la Génomique, à découvrir ses méthodes et à réfléchir à ses implications dans tous les aspects de la Biologie. Pour des raisons pratiques, seules quelques unes des technologies modernes de la génomique pourront être abordées expérimentalement. Les nouvelles technologies qui mettent l'accent sur les volumes de résultats obtenus se prêtent malheureusement mal à des démonstrations de salles de travaux pratiques et il est possible que certains étudiants attirés par les expériences « à la paillasse » en éprouvent une frustration. Plusieurs systèmes biologiques distincts ont été choisis pour illustrer ces principes et méthodes. Dans tous les cas, on insistera sur les bases fondamentales des stratégies mises en jeu. Le traitement des résultats servira à illustrer l’utilisation des méthodes de l’informatique sans lesquelles aucune analyse des génomes ne pourrait être possible. Étant donné la spécificité de ce domaine, des notions de bases en Informatique elle-même seront données aux étudiants. Les conférences théoriques ont été choisies pour illustrer différentes facettes de la Génomique appliquées à des questions biologiques fondamentales et pour compléter les thèmes qui ne pourront pas être abordés expérimentalement. Elles seront données par des spécialistes renommés du domaine que je voudrais remercier vivement ici de bien vouloir consacrer un peu de leur temps et de leur talent à cet enseignement.

2020 2030 2040 2050

Genomicengineering

Synthe corganisms

2014 2060

Ar ficialevolu on

Thirdgenomicrevolu on

Singlecellsequencing

Singlemoleculesequencing

Novelassemblyandmappingalgorithms(repeatedsequences)

Non-structuredproteindomains

Ra onaldatastorageandaccess

Singlecellphenotypicdiversityandnoise

«Duringthecourseofthatwork,itbecameincreasinglyclearthatsequenceshadanessentialroleinlivingsystems».FredSanger,2001«TheearlydaysofDNAsequence»NatureMedicine7:267-268

Figure 4 : Une vision hypothétique du futur de la génomique, inspirée de ce que l'on entrevoit des développements actuels. Mais n'oublions pas ce que

disait Jean Dutourd "La seule chose dont on soit sûr, en ce qui concerne l'avenir, c'est qu'il n'est jamais conforme à nos prévisions".

Ar ficialecosystems

Cancergenomics Agingandrejuvena on

Biologicaldiversityexplored

20

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Zhu H, et al.,. (2001) Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105

Bernard Dujon

29

1re SEMAINE

Travaux Pratiques 1: Assemblage et caractérisation d’un métagénome Etude du microbiote intestinal de la souris MM

Romain KOSZUL, Agnès THIERRY, Martial MARBOUTY

Bioinformatique et traitement des données issues du séquençage génomique Lionel FRANGEUL, Corinne MAUFRAIS, Christophe RUSNIOK

Lundi 4 novembre 2019

9h00-10h00 Accueil et Présentation du Cours Didier MAZEL & Stéphane Le CROM (Codirecteurs)

Lionel FRANGEUL (Chef de travaux)

10h00-12h30 Cours : Introduction à l'étude des génomes Didier MAZEL (Institut Pasteur)

13h30-17h30 Cours : Introduction à la bioinformatique Lionel FRANGEUL (Institut Pasteur)

Mardi 5 novembre 2019

9h00-10h00 Présentation de la salle de TP et des conditions de manipulations

10h00-12h00 Travaux Pratiques 1 : Présentation du TP

13h00-17h30 Cours : Unix 1 Cours : Les bases de données relationnelles Lionel FRANGEUL (Institut Pasteur)

Mercredi 6 novembre 2019

9h00-12h00 Travaux Pratiques 1 : Lancement incubation

Conférence : Organisation spatiale des chromosomes Romain KOSZUL chez les bactéries (Institut Pasteur)

13h00-19h00 Travaux Pratiques 1 : Incubation

Cours : Unix 2 Lionel FRANGEUL (Institut Pasteur)

Jeudi 7 novembre 2019

9h00-18h00 Travaux Pratiques

30

Vendredi 8 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Métagénomique Emmanuelle MAGUIN (INRA – Jouy en Josas)

10h45-12h15 Cours : Les banques de données biologiques Corinne MAUFRAIS (Institut Pasteur)

13h30-18h00 Cours : Unix 3 Travaux Pratiques Bioinfo : Recherche multicritère Lionel FRANGEUL dans les banques de données biologiques (Institut Pasteur)

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2e SEMAINE

Travaux Pratiques 1: Assemblage et caractérisation d’un métagénome Etude du microbiote intestinal de la souris MM

Romain KOSZUL, Agnès THIERRY, Martial MARBOUTY

Bioinformatique et traitement des données issues du séquençage génomique Lionel FRANGEUL, Corinne MAUFRAIS, Christophe RUSNIOK

Travaux Pratiques 2 : Analyse de petits et grands ARN dans la lignée germinale de drosophile Antoine BOIVIN, Valérie DELMARRE et Laure TEYSSET

Mardi 12 novembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 1 : Préparation des banques

13h30-17h30 Cours : Unix 4 Lionel FRANGEUL Travaux Pratiques Bioinfo : Exercices pratiques Unix (Institut Pasteur)

Mercredi 13 novembre 2019

9h00-18h00 Travaux Pratiques 1 : Préparation des banques et séquençage

Jeudi 14 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Eléments Transposables : Laure TEYSSET Impact sur l’expression des génomes (Sorbonne Université, Paris)

10h45-12h15 Conférence : Epigénome et alternative splicing Eric BATSCHE (Institut Pasteur)

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Exercice Unix appliqués à la biologie

Vendredi 15 novembre 2019

9h00-12h00 Travaux Pratiques 1 : Analyse Informatique

13h00-17h30 Travaux Pratiques 2 : Croisement des Drosophiles

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3e SEMAINE

Travaux Pratiques 1: Assemblage et caractérisation d’un métagénome Etude du microbiote intestinal de la souris MM

Romain KOSZUL, Agnès THIERRY, Martial MARBOUTY

Bioinformatique et traitement des données issues du séquençage génomique Lionel FRANGEUL, Corinne MAUFRAIS, Christophe RUSNIOK

Travaux Pratiques 2 : Analyse de petits et grands ARN dans la lignée germinale de drosophile Antoine BOIVIN, Valérie DELMARRE et Laure TEYSSET

Lundi 18 novembre 2019

9h00-12h30 Cours : Alignements de 2 séquences

Cours : Blast

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Blast

Mardi 19 novembre 2019

9h00-10h00 Présentations des thèmes scientifiques pour l’examen oral

10h00 PHOTO

10h00-12h00 Cours/TP : Awk

13h30-17h30 Cours : Alignements multiples, recherche de motifs, HMM

17h30-18h00 Travaux Pratiques 2: Surveillance des croisements des drosophiles

Mercredi 20 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Transcription pervasive Cosmin SAVEANU

(Institut Pasteur)

10h45-12h15 Conférence : Dynamique et organisation du génome Mireille BETERMIER

de la paramécie (CGM, CNRS, Gif-sur-Yvette)

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Alignements, recherche de motifs

Jeudi 21 novembre 2019

9h30-13h00 Travaux Pratiques 1 : Analyse informatique

14h00-18h00 Travaux Pratiques Bioinfo : R

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Vendredi 22 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Systems analysis of Leishmania environmental Gérald SPAETH

adaptation (Institut Pasteur)

10h45-12h15 Conférence : Annotation Damien MORNICO

(Institut Pasteur)

13h30-17h30 Travaux Pratiques Bioinfo : R

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4e SEMAINE

Travaux Pratiques 1: Assemblage et caractérisation d’un métagénome Etude du microbiote intestinal de la souris MM

Romain KOSZUL, Agnès THIERRY, Martial MARBOUTY

Bioinformatique et traitement des données issues du séquençage génomique Lionel FRANGEUL, Corinne MAUFRAIS, Christophe RUSNIOK

Travaux Pratiques 2: Analyse de petits et grands ARN dans la lignée germinale de drosophile Antoine BOIVIN, Valérie DELMARRE et Laure TEYSSET

Lundi 25 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Protéogénomique Charles PINEAU (Irset, Protine, Inserm, Rennes)

10h45-12h15 Conférence : Analyse de données CHIP-seq Morgane THOMAS-CHOLLIER (ENS, Paris)

13h30-18h00 Travaux Pratiques Bioinfo : Analyse informatique

Mardi 26 novembre 2019

9h00-18h00 Travaux Pratiques : Analyse informatique

Mercredi 27 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Evolution des Génomes eucaryotes Gilles FISHER (Sorbonne Université)

10h45-12h15 Conférence : Analyse Statistique des données de RNA-seq Emeline PERTHAME Pour la recherche de gènes différentiellement exprimés (Institut Pasteur)

13h30-17h30 Travaux Pratiques Bioinfo : Comparaison génomes annotés

Jeudi 28 novembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Evolution des génomes bactériens Frédérique LE ROUX (Ifremer, Roscoff)

10h45-12h15 Conférence : Partenariat hôte-microbe et symbiose Gérard EBERL (Institut Pasteur)

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Usage du code, ACP

Vendredi 29 novembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques : Annotations des séquences Eucaryotes 13h30-17h30 Travaux Pratiques : Usage du code, ACP

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5e SEMAINE

Bioinformatique et traitement des données issues du séquençage génomique Lionel FRANGEUL, Corinne MAUFRAIS, Christophe RUSNIOK

Travaux Pratiques 2 : Analyse de petits et grands ARN dans la lignée germinale de drosophile Antoine BOIVIN, Valérie DELMARRE et Laure TEYSSET

Lundi 2 Décembre 2019

9h00-12h30 Cours : Annotations relationnelles Travaux Pratiques : Dotter

13h30-17h30 Travaux Pratiques 2 : Dissection des ovaires

Mardi 3 Décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques Bioinfo : Annotations des séquences Eucaryotes

13h30-15h30 Travaux Pratiques 2 : Analyse par coloration

15h30-17h30 Cours : qPCR

Mercredi 4 Décembre 2019

9h00-17h30 Travaux Pratiques 2 : Extraction ARN, dosage, RT

Jeudi 5 décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 2 : qPCR

13h30-17h30 Travaux Pratiques Bioinfo : Mapping - clustering

Vendredi 6 Décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 2 : Analyse qPCR

13h30-17h30 Travaux Pratiques Bioinfo : Mapping - clustering

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6e SEMAINE

Travaux Pratiques 2 : Analyse de petits et grands ARN dans la lignée germinale de drosophile Antoine BOIVIN, Valérie DELMARRE, Stéphane LE CROM, Laure TEYSSET

Lundi 9 Décembre 2019

9h00-10h30 Conférence : Organisation du génome en 3D Olivier ESPELI (Collège de France, Paris)

10h45-12h15 Conférence: Frameshift et ribosome profiling Olivier NAMY (Institut Pasteur)

13h30-17h30 Travaux Pratiques 2 : Analyses Galaxy Christophe ANTONIEWQKI (IBPS, Sorbonne Université, Paris)

Mardi 10 Décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 2 : Analyse Galaxy

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Analyse lectures longues (Nanopore)

Mercredi 11 Décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 2 : Analyse Galaxy

13h30-17h30 Travaux Pratiques : Analyse lectures longues (Sequel)

Jeudi 12 Décembre 2019

9h00-13h00 Travaux Pratiques : Cahier de labo électronique & Analyse Galaxy

14h00-15h00 Visite Musée Pasteur

15h00-17h30 Travaux Pratiques 2 : Analyses Galaxy

Vendredi 13 décembre 2019

9h00-12h30 Travaux Pratiques 2 : Analyse Galaxy

13h30-15h00 Conférence : Virus, Archaea and the origin of eukaryotes Patrick FORTERRE Mining genomes and metagenomes to decipher the (Institut Pasteur)

History of life, bonus and pitfalls

15h00-16h30 Bilan final du cours

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7e SEMAINE

Lundi 16 décembre 2019

9h00-12h00 Examen écrit : Bioinformatique

Mardi 17 décembre 2019

Journée libre

Mercredi 18 décembre 2019

9h00-18h00 Examens oraux

Jeudi 19 décembre 2019

9h00-18h00 Examens oraux