PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS

LENIÉSER FAJARDO NUNES

AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS

QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO.

Cuiabá 2017

LENIÉSER FAJARDO NUNES

AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS

QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO.

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas – Área de Concentração Odontologia.

Orientador: Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro Coorientador: Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges

Cuiabá 2017

FICHA CATALOGRÁFICA

N972a Nunes, Leniéser Fajardo. Avaliação da efetividade de diferentes substâncias químicas irrigantes contra o Enterococcus faecalis. Estudo ex vivo / Leniéser Fajardo Nunes. – 2017. 64f.: il. color; 30 cm. Orientadora: Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro. Coorientador: Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá, 2017. Inclui bibliografia.

1. Ácido Etilenodiaminotetracético. 2. Endodontia. 3. Enterococcus faecalis.

4. Hipoclorito de sódio. 5. Quitosana.

CDU – 616.314.18

Dedicatória

“ Dedico esse trabalho primeiramente à DEUS, ao

meu irmão Aércio e minha cunhada Lucia, pela orientação,

incentivo, apoio, compreensão e amor. Vocês são minha base, minha

família amada. “

AGRADECIMENTOS

Ao meu Orientador Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro,

Obrigada Professor pelos ensinamentos e parceria de sempre, meu carinho é eterno.

Ao meu Coorientador Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges,

Pela oportunidade de realizar o sonho que virou realidade de fazer Mestrado, por sua paciência, sabedoria, dedicação, ensinamentos, saber o que fazer e dizer na hora certa. Obrigada pelas oportunidades, sou muito grata por tudo, levarei para a vida toda.

Ao colega de profissão e doutorando Thiago Machado Pereira, foi um anjo que o Prof. Álvaro colocou na minha vida, obrigada por sua paciência e parceria, aprendi muito com você.

Ao Professor Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato,

Por ter me presenteado com tantos ensinamentos, paciência e pela imensa emoção do meu 1° artigo publicado, obrigada por ter acreditado em mim e não ter desistido.

À querida Professora Dra Cyntia Rodrigues de Araújo Estrela,

Por me acolher; foi um imenso prazer executar a parte laboratorial juntas em Goiânia, foi um aprendizado enriquecedor e fundamental para a montagem do trabalho.

À todos os Professores do curso de Mestrado, pelos ensinamentos transmitidos, vocês são incríveis: Alessandra Nogueira Porto, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Andreza Maria F. Aranha, Evanice Menezes Vieira, Mateus Rodrigues Tonetto, Matheus Bandeca, Orlando Aguirre Guedes, Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff.

Ao Diretor da Faculdade São Paulo-FSP de Rolim de Moura - RO e Professor Paulo Jacob Strieder, pelo incentivo, apoio e liberação para que eu pudesse realizar meu sonho do Mestrado.

À Coordenadora Pedagógica da Faculdade São Paulo-FSP de Rolim de Moura-RO Osana Scalzer, pelo carinho, apoio e ajuda nas minhas ausências.

Aos colegas e amigos da turma do Mestrado 2015: Christiane Lima Mondin, Cleiner Naves, Edinei Bocardi, Elâine Patricia, Everton Silva, Gilberto Siebert Filho, Gislaine F. Zarza Gonçalves, Joana Freitas, Kellin Pivatto, Leticia Fantin, Natalino Francisco Silva, Panmella Alegria, Thaise Ayres Bezerra Zulli e Valéria Teixeira de Andrade. Obrigada pela parceria, paciência, troca de experiência, amizade, #Tamojunto.

Agradeço à amiga Valéria Teixeira de Andrade, pela amizade, carinho, oportunidade de conhecê-la, companheira de viagem e que me acolheu na hora que mais precisei, que Deus te conserve sempre assim, uma querida.

À Coordenadoria de pesquisa e pós-graduação,

Na pessoa da Coordenadora Lucélia de Oliveira Santos.

À Diretoria de pesquisa e pós-graduação,

Na pessoa do Diretor Hélio Hiroshi Suguimoto.

À Faculdade de Odontologia de Cuiabá da Universidade de Cuiabá (FOC-UNIC),

Na pessoa do Coordenador Fábio Luís Miranda Pedro.

À Universidade de Cuiabá (UNIC),

Na pessoa do Reitor Fernando Ciriaco Dias Neto.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior–CAPES,

Pelo incentivo à pesquisa científica, indispensável ao desenvolvimento deste trabalho.

Obrigado a todos que, de alguma forma, colaboraram para realização deste trabalho!

“Educa a inteligência e atingirás a Sabedoria.

Educa as mãos e acentuarás a Competência.

Educa a palavra e acolherás a Simpatia e Cooperação.

Educa o pensamento e conquistarás a ti mesmo.”

Chico Xavier

RESUMO

RESUMO

NUNES, LF. AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO. 2017. 64f. Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas) Programa de Pós-Graduação, Universidade de Cuiabá – UNIC, Cuiabá 2017.

O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade de diferentes substâncias químicas irrigantes contra o Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Foram utilizados 40 dentes bovinos, distribuídos nos seguintes grupos: NaOCl a 2,5%; EDTA a 17%; Quitosana a 0,2%; NaOCl 2,5% + Quitosana a 0,2% e NaOCl 2,5% + EDTA 17%). Inicialmente, as coroas dentárias foram removidas e os comprimentos radiculares padronizados em 16 mm e os espécimes mecanicamente preparados. Após isso, todos os espécimes foram inseridos individualmente em tubos de prolipropileno do tipo Eppendorf contendo Brain Heart Infusion (BHI) e autoclavados por 30 min, a 120°C. Cinco mililitros de BHI foram misturados a 5 mL do inóculo bacteriano, e os grupos experimentais foram inoculados durante 60 dias, em meio úmido a 37˚C. A avaliação da eficácia antimicrobiana das soluções experimentais foi realizada com o emprego em dispositivo formado por Bomba Peristáltica com circulação das soluções irrigadoras pelo aparato em fluxo constante durante 10 min. A análise de variância e teste de Tukey (α=0,05) foram aplicados para análise dos grupos. Os resultados mostraram a presença de E. faecalis após a utilização dos diferentes protocolos de irrigação, sem diferença entre os mesmos (p>0,05). Foi possível concluir que as diferentes substâncias químicas irrigantes não foram efetivas para eliminação completa da contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.

Palavras-chave: Ácido Etilenodiaminotetracético, Endodontia, Enterococcus faecalis, Hipoclorito de sódio, Quitosana.

ABSTRACT

ABSTRACT

NUNES, LF. EFFECTIVENESS ASSESSMENT OF DIFFERENT IRRIGATION CHEMICAL SUBTANCES AGAINST ENTEROCOCCUS FAECALIS. EX VIVO STUDY. 2017. 64f. Dissertation (Master’s Degree in Integrated Dental Clinic) Post-Graduate Program, University of Cuiabá – UNIC, Cuiabá 2017.

The aim of this study was to evaluate the effectiveness of different irrigation protocols against Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Forty bovine teeth were divided into the following groups: 2.5% NaOCl; 17% EDTA; 0.2% Chitosan; 2.5% NaOCl + 0.2% Chitosan and 2.5% NaOCl + 17% EDTA. Dental crowns were removed. Root lengths standardized at 16 mm and mechanically prepared specimens. All specimens were individually inserted into Eppendorf polypropylene tubes containing Brain Heart Infusion (BHI) and autoclaved for 30 min at 120 ° C. Five milliliters of BHI were mixed with 5 ml of the bacterial inoculum. The experimental groups were inoculated for 60 days in a humid medium at 37 ° C. The evaluation of the antimicrobial efficacy of the experimental solutions was carried out using a device formed by Peristaltic Pump with circulation of the irrigating solutions by the apparatus in constant flow for 10 min. The analysis of variance and Tukey's test (α = 0.05) were applied to analyze the groups. The results showed the presence of E. faecalis after the use of different irrigation protocols, with no difference between them (p>0.05). Thus, different irrigation protocols were not effective for complete elimination of bacterial dentin contamination with E. faecalis.

Keywords: Chitosan, Endodontics, Enterococcus faecalis, Ethylenediaminetetraacetic Acid, Sodium Hypochlorite.

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Distribuição dos Grupos de acordo com as soluções experimentais.

43

Tabela 2 Eficácia antibacteriana de soluções irrigadoras em canais radiculares infectados por E. faecalis.

48

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Vista geral do aparato empregado na avaliação do efeito antimicrobiano das soluções irrigadoras. (a) Elemento dental acoplado em tubo tipo Eppendorf; (b) Sistema de irrigação com bomba peristáltica; (c) solução irrigadora circulando em fluxo constante de 50 mL min-1 por 10 min.

45

Figura 2 Imagens MEV (3.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.

49

Figura 3 Imagens MEV (5.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.

50

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA American Dental Association

ATCC American Type Culture Collection

AASF

BHIA

Espectrofotometria

Brain Heart Infusion Agar (Agar de Infusão de Coração e Cérebro)

Ca(OH)2 Hidróxido de Cálcio

CChAgNpFNc

CDTA

Quitosana coloidal-nanopartícula de prata-nanocompósito de flúor

Ácido transciclohexanodiaminotetracético

CHX

CNPs

Crti

Cu

Co

CTR

Clorexidina

Nanopartícula de quitosana

Centro Regional para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação

Cobre

Cobalto

Cetrimide

EDTA

EDTAC

EDTA-T

EGTA

Ácido etilenodiaminotetracético

Ácido etilenodiaminotetracético+brometo de cetiltrimetilamônio

Ácido etilenodiaminotetracético+ sulfato de éter de lauril e sódio

Ácido etilenoglicotetraacético

E. faecalis Enterococcus faecalis

et al. Colaboradores

EUA

Fe

Estados Unidos da América

Ferro

G Grupo

MEV

MHA

Microscopia eletrônica de varredura

Placa de ágar Muller Hinton

min Minuto

mg

Mg

Miligrama

Magnésio

mL Mililitro

mm

MTAD

MTT

Milímetro

Isômero de tetraciclina+ácido+detergente

Microcultura de tetrazólio

N Amostra

NaOCl Hipoclorito de sódio

Ni Níquel

Nm Nanômetro

pH Potencial hidrogeniônico

S. aureus

UFC

Staphylococcus aureus

Unidades formadoras de colônias

UFG Universidade Federal de Goiás

°C Graus Centígrados Celsius

Zn

µm

Zinco

Micrômetro

% Porcentagem

®

#

Marca Registrada

Número

SUMÁRIO

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 21

2 REVISÃO DE LITERATURA 25

2.1 SOLUÇÕES IRRIGANTES 26

2.2 PROPRIEDADES DA QUITOSANA 35

3 MATERIAIS E MÉTODOS 41

3.1 INDICADOR BIOLÓGICO 42

3.2 MATERIAIS 42

3.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES 42

3.4 DESENHO EXPERIMENTAL 43

3.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO DA SOLUÇÃO IRRIGADORA

44

3.6 PREPARO PARA ANÁLISE NO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

46

4 RESULTADOS 47

5 DISCUSSÃO 51

6 CONCLUSÃO 55

7 REFERÊNCIAS 57

ANEXOS 63

1. INTRODUÇÃO

22

1. INTRODUÇÃO

O sucesso do tratamento endodôntico está relacionado à desinfecção do

sistema de canais radiculares (ESTRELA et al., 2012), proposto pela ação mecânica

de instrumentos endodônticos associada às propriedades das soluções irrigantes

que, reduzindo agentes irritantes como bactérias e seus subprodutos, restos de

tecido pulpar e dentina contaminada, geram ambiente favorável ao reparo dos

tecidos periapicais (SIQUEIRA Jr. et al., 1997; FERREIRA et al., 2004; DE-DEUS et

al., 2014; BORGES et al., 2016).

O canal radicular é ambiente acessível para várias espécies microbianas,

possibilitando a fixação na superfície dentinária e consequente formação de

biofilmes bacterianos densos (ESTRELA et al., 2009). As etapas de organização

estrutural do biofilme, sua composição e as atividades dos microrganismos

colonizadores em vários ambientes podem ser diferentes (ESTRELA et al., 2009).

Porém, o estabelecimento do biofilme segue essencialmente a mesma série de

estágios de desenvolvimento, incluindo a deposição de condicionamento, adesão e

colonização de microrganismos planctônicos na matriz polimérica e co-adesão de

outros organismos (ESTRELA et al., 2009). A sanificação dos canais radiculares

depende da inativação de microrganismos presentes no biofilme e no ambiente

planctônico, sendo que o preparo de canal radicular com agentes antimicrobianos,

como irrigantes químicos e/ou curativos intracanais, contribui para a redução da

microbiota endodôntica (SHENOI et al., 2016; VATKAR et al., 2016).

Dentre os microrganismos presentes nessa microflora, o Enterococcus

faecalis (E. faecalis) tem papel principal como agente patogênico relacionado ao

insucesso da terapia endodôntica (MORAGO et al., 2016). São microrganismos

gram-positivos que estão organizados em biofilme, com diversos fatores de

virulência, anaeróbios facultativos, com capacidade de invadir túbulos dentinários e

de se multiplicarem em condições extremas com pH elevado (KAYAOGLU e

ORSTAVIK, 2004; HOLLENBECK e RICE, 2012; ALSHWAIMI et al., 2016). No

entanto, a presente patogenicidade de E. faecalis, em infecções endodônticas

persistentes, promove a necessidade de maiores investigações neste contexto.

Durante o preparo de canais radiculares, independentemente do tipo de

instrumento utilizado ou da técnica preconizada, ocorre deposição de

remanescentes de tecidos dentinários nas paredes dos canais radiculares, o que

23

determina a formação de estrutura amorfa denominada smear layer (MORAGO et

al., 2016). A remoção da smear layer do canal radicular faz parte do processo da

terapêutica endodôntica (DE-DEUS et al., 2014). Para isso, instrumentos

ultrassônicos, aplicação de laser e agentes quelantes têm sido utilizados tanto para

sua remoção química quanto mecânica (TORABINEJAD et al., 2003).

O hipoclorito de sódio (NaOCl) é atualmente a substância mais

comumente utilizada na prática endodôntica devido às suas propriedades tais como:

capacidade de dissolução de matéria orgânica, lubrificação e neutralização de

conteúdo tóxico (HÜLSMANN et al., 2003; TORABINEJAD et al., 2003;

MARENDING et al., 2007; CHAITANYA et al., 2016). Apesar de sua atividade

antimicrobiana e capacidade de prevenir a formação da smear layer, em associação

com agentes quelantes, o NaOCl demonstrou ter efeito citotóxico no tecido vital, ao

atingir o periápice (ROSSI-FEDELE et al., 2010; CHAITANYA et al., 2016). Além

disso, foi demonstrado que o NaOCl causa alteração negativa na força necessária

para a fratura da dentinária (BERUTTI et al., 2006). O ácido

etilenodiaminotetracético (EDTA) foi o primeiro agente quelante utilizado na

Endodontia com a finalidade de facilitar a instrumentação de canais atrésicos

(NYGAARD-ØSTBY, 1957). A ação desses agentes quelantes permite a redução da

presença da smear layer, e a sua eficiência depende de muitos fatores, tais como:

tempo de aplicação, pH, concentração da solução, temperatura e da quantidade da

solução disponível (GOLDBERG e SPIELBERG, 1982; ÇALT e SERPER, 2002;

HÜLSMANN et al., 2003; CHAITANYA et al., 2016).

A investigação pela solução irrigadora para os canais radiculares de

maneira acessível, biocompatível e de baixo custo, que promova a eliminação da

camada da smear layer das paredes dentinárias tem sido alvo da pesquisa de vários

estudos (ESTRELA et al., 2007; CARVALHO et al., 2008; PRADO et al., 2011;

MORAGO et al., 2016). A quitosana é um polissacarídeo natural obtido por

desacetilação da quitina, a qual é obtida das carapaças de caranguejo, camarão e

siri (PENG HU et al., 2013). Possui capacidade quelante, e também

biocompatibilidade, biodegradabilidade, bioadesão e atoxidade às células

(URAGAMI et al., 2003; KURITA, 2006; AKNCBAY et al., 2007; PENG HU et al.,

2013).

24

A quitosana possui alta capacidade quelante por vários íons metálicos

(incluindo Ni2+, Zn2+, Co2+, Fe2+, Mg2+ e Cu2+) em condições ácidas, e tem sido

aplicado para remoção ou recuperação dos íons metálicos em diferentes setores da

indústria (KURITA, 1998). Na odontologia vem sendo estudada, na área da

Endodontia, como opção ao EDTA para a irrigação dos canais radiculares na

concentração de 0,2% por 3 min (KUMAR, 2000; SILVA et al., 2012; SILVA et al.,

2013). As alternativas de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato de poder

manipular a quitosana em diferentes formas como: soluções de viscosidade

controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA-

FILHO et al., 2007).

Alguns aspectos são relevantes ao sucesso do tratamento endodôntico,

como a técnica empregada, propriedades físico químicas das soluções irrigantes,

qualidade da sanificação e promoção da obturação tridimensional (ESTRELA et al.,

2012). Além disso, a complexidade anatômica interna do sistema de canais

radiculares torna a completa remoção bacteriana praticamente impossível, mesmo

quando o preparo biomecânico é realizado com os mais elevados padrões técnicos

(SIQUEIRA-JUNIOR et al., 1997; KELEŞ et al., 2016). Baseado na dificuldade do

controle do biofilme endodôntico pela técnica convencional de preparo biomecânico,

é necessária a investigação de substâncias biocompatíveis que sejam eficazes

contra patógenos resistentes, como o E. faecalis (ESTRELA et al., 2012;

ALSHWAIMI et al., 2016; CHAITANYA et al., 2016; JAIN et al., 2016; KELEȘ et al.,

2016; MORAGO et al.,2016; SHENOI et al., 2016; VATKAR et al., 2016; ZAND et al.,

2016). Dessa forma, foi objetivo deste estudo ex vivo avaliar a efetividade de

diferentes substâncias químicas irrigantes do sistema de canais radiculares contra o

microrganismo Enterococcus faecalis.

2. REVISÃO DE LITERATURA

26

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Soluções irrigantes

Orstavik e Haapasalo (1990) avaliaram os efeitos de diferentes soluções

irrigantes e curativos endodônticos em amostras de dentina bovina infectadas

experimentalmente com E. faecalis, Streptococcus sanguis, Escherichia coli ou

Pseudomonas aeruginosa. Foram preparados cilindros de dentina, os quais foram

padronizados e sanificados por tratamento ultrassônico, EDTA e NaOCl. Os

espécimes foram infectados por períodos de até 14 dias. A avaliação do grau de

infecção nos túbulos ocorreu por meio do método Brown e Brenn, microscopia

eletrônica de varredura (MEV) e cultura de pó de dentina. Medicações endodônticas

foram aplicadas às amostras infectadas para comparar a capacidade antibacteriana.

Os resultados mostraram que o paramonoclorofenol canforado foi mais eficiente que

o Calasept®. Dentre as soluções estudadas, o iodeto de potássio apresentou maior

eficácia que o NaOCl e clorexidina (CHX). Os autores salientaram que a presença

de smear layer retardou, mas não eliminou o efeito das medicações.

Garberoglio e Becce (1994) analisaram o efeito de seis irrigantes na

smear layer criada pela instrumentação endodôntica in vitro. As soluções irrigantes

avaliadas foram NaOCl a 1%, NaOCl a 5%, combinação de ácido fosfórico a 24% e

ácido cítrico a 10%, EDTA 0,2%, EDTA 17% e EDTA 3%. Os dentes, após preparo e

irrigação, foram avaliados por MEV para verificar a presença ou ausência da smear

layer. As duas soluções de NaOCl não removeram a smear layer. A solução de

EDTA 0,2% foi mais eficiente que o NaOCl, mas não removeu totalmente a smear

layer, especialmente na entrada dos canalículos dentinários. As outras três soluções

removeram a smear layer efetivamente, mas sem diferenças estatísticas

significantes entre elas. A solução de EDTA a 3% foi tão efetiva quanto o ácido

fosfórico, o ácido cítrico e o EDTA a 17%, porém o EDTA não mostrou o significante

efeito desmineralizante dentinário como a solução ácida.

Berutti et al. (1997) analisaram a capacidade de algumas soluções

irrigadoras de penetrar nos túbulos dentinários. Os autores utilizaram vinte e quatro

incisivos centrais superiores, que foram esterilizados e, posteriormente, incubados

com E. faecalis por 20 dias. A instrumentação dos dentes foi realizada em ambiente

asséptico, irrigando os canais radiculares, entre cada instrumento com NaOCl a

27

5,25% e EDTA a 10%. Na metade da amostra, além das soluções irrigadoras

citadas, foi utilizado um detergente aniônico (Triton-X®). Os dentes foram

descalcificados e analisados por meio de microscopia óptica, onde foi observada a

presença de bactérias nos túbulos dentinários, em diferentes profundidades. No

grupo no qual não foi utilizado o tensoativo, houve a presença maciça de bactérias

na profundidade de 300 µm; enquanto no grupo no qual o tensoativo foi utilizado,

houve camada livre de bactérias, a partir da luz do canal, que se estendeu por 130

µm. Abaixo dessa zona livre de bactérias, houve contaminação. Os autores

concluíram que o tensoativo auxilia a penetração do NaOCl no interior dos túbulos

dentinários.

Buck et al. (2001) avaliaram a penetração de algumas soluções

irrigadoras no interior dos túbulos dentinários utilizando NaOCl a 5,25%, EDTA a

0,2% e CHX a 0,12%. Os canais radiculares de doze dentes anteriores foram

esterilizados e contaminados com E. faecalis por 12 h, recebendo em seguida, por 1

min, as soluções testadas. Usando brocas de baixa rotação, os autores recolheram

raspas de dentina, a partir da superfície externa da raiz, em profundidades de 0,5 e

1,0 mm, incubando-as em meio de cultura. Os resultados mostraram maior ação do

NaOCl, seguido pelo EDTA e CHX, com resultados semelhantes. Os autores

concluíram que, embora o NaOCl seja capaz de eliminar bactérias dentro dos

túbulos dentinários, maiores tempos de exposição à solução irrigadora são

necessários para a desinfecção completa do canal radicular.

Spanó et al. (2001) realizaram um estudo avaliando o efeito de 4

concentrações de NaOCl (0,5; 1,0; 2,5; e 5,0%) em tecido pulpar bovino. Níveis de

cloro residual, pH e tensão superficial, antes e depois da dissolução, foram

estudados in vitro. Um fragmento de polpa bovino foi submerso em NaOCl que

circulou em um aparelho com uma bomba peristáltica e seringa Luer Lock. Quanto

maior a concentração de NaOCl mais rápida será a dissolução da celulose do tecido

pulpar. Todas as concentrações de NaOCl reduziram o pH e a tensão superficial,

sendo que as concentrações mais elevadas necessitaram de menor consumo

durante a dissolução do tecido. Assim, este estudo indicou que o cloro residual era

diretamente proporcional à concentração no processo de dissolução de celulose e

tecidos e que não havia cloro residual em todas as concentrações utilizadas.

28

Çalt e Serper (2002) avaliaram seis dentes unirradiculares

endodonticamente instrumentados, os quais tiveram, posteriormente, o terço cervical

e médio foram cortados e desprezados. A porção referente ao terço médio foi

cortada longitudinalmente em dois segmentos iguais. Utilizaram-se 10 mL de EDTA

17% para irrigação das metades pertencentes à mesma raiz, durante 1 e 10 min,

respectivamente. Todos os dentes tiveram irrigação final com 10 mL de NaOCl 5%.

Os resultados evidenciaram que com apenas 1 min de ação, a solução de EDTA

mostrou-se eficiente na remoção da smear layer. Entretanto, a aplicação da solução

de EDTA durante 10 min, causou erosão excessiva da dentina peritubular e

intertubular. Os pesquisadores sugeriram que este procedimento não deveria ser

prolongado por mais de um min durante a terapêutica endodôntica.

Guerisoli et al. (2002) avaliaram a capacidade de diferentes soluções

irrigadoras, quando energizadas pelo ultrassom, na remoção da smear layer. Os

autores realizaram o preparo biomecânico em 03 grupos, utilizando como soluções

irrigadoras a água destilada, o NaOCl e esta solução associada ao EDTAC a 15%.

No grupo 04, os canais foram apenas irrigados com NaOCl e EDTAC. Foi utilizado

lima K #15, energizada pelo ultrassom, em todos os espécimes, com movimentos de

limagem de pequena amplitude. Os dentes foram cisalhados e observados por meio

de MEV, onde foi constatada a permanência da smear layer nos canais irrigados

com água destilada ou NaOCl e a remoção desta nos canais onde houve a

associação com EDTAC. Os autores concluíram que o uso de NaOCl associado ao

EDTAC, sob agitação ultrassônica, é capaz de remover a smear layer, enquanto que

as outras soluções testadas deixam mais resíduos aderidos às paredes do canal

radicular.

Menezes et al. (2003) avaliaram a limpeza de canais radiculares

instrumentados e irrigados com NaOCl a 2,5%, clorexidina a 2,0% e soro fisiológico.

A associação dessas soluções com o EDTA também foi estudada. Para tanto,

cinquenta dentes unirradiculares humanos foram instrumentados com as soluções

testadas e clivados no sentido de seu longo eixo para observação por meio de MEV.

Exceto para o grupo em que a CHX foi utilizada durante a instrumentação, a

irrigação com EDTA diminuiu significantemente a quantidade da smear layer

observada. Os autores concluíram que se faz necessária à utilização do EDTA a fim

de promover melhor limpeza das paredes dos canais radiculares.

29

Scelza et al. (2003) estudaram a capacidade de remoção da smear layer

após o uso de diferentes soluções irrigantes variando-se o tempo de irrigação.

Noventa dentes caninos foram distribuídos em 09 grupos, conforme a solução

empregada na irrigação final. Utilizaram-se 20 mL das soluções de EDTA-T, EDTA

17% e ácido cítrico 10% no período de 3, 10 e 15 min. Após os tratamentos os

espécimes foram analisados por meio de MEV. Os resultados apontaram que o

ácido cítrico 10% por 3 min foi significantemente melhor que nos tempos de 10 e 15

min de irrigação. No grupo do EDTA 17% a irrigação por 3 min também foi mais

eficiente que a de 15 min, apresentando maior quantidade de canalículos abertos.

Não houve diferença significante entre os 3 períodos no grupo do EDTA-T. Os

pesquisadores concluíram que as soluções avaliadas foram eficientes em curto

intervalo de tempo não melhorando o efeito com o aumento do tempo.

Torabinejad et al. (2003) avaliaram, por meio da MEV, a capacidade de

limpeza do MTAD®, uma substância composta de isômero de tetraciclina, ácido e

detergente, como um irrigante final na superfície dos canais radiculares. Quarenta e

oito dentes humanos unirradiculares receberam, após a biomecânica, 5 mL de uma

das seguintes soluções: água destilada, NaOCl 5,25%, EDTA 17% e MTAD®. A

quantidade de smear layer, assim como o grau de erosão sobre a superfície dos três

terços do canal radicular foi avaliado. Os resultados mostraram que MTAD® foi

eficiente na remoção da smear layer, não alterando a estrutura dos túbulos

dentinários.

Perez et al. (2005) avaliaram a eficiência do EDTA a 8% na remoção da

smear layer do canal radicular observando as paredes dentinárias por meio de MEV.

A análise das fotomicrografias revelou paredes limpas e túbulos dentinários abertos

nos grupos onde foram utilizadas soluções quelantes. O EDTA a 8%, utilizado por 1

min no interior do canal radicular, foi capaz de remover a smear layer; enquanto a

utilização por 3 min mostrou ação semelhante ao EDTA a 15% usado por 1 min. Os

autores concluíram que a utilização do EDTA a 8% por 1 min pode limpar as

paredes do canal radicular com menor erosão dentinária.

Marques et al. (2006) avaliaram a capacidade de remoção da smear layer

e de íons cálcio da dentina radicular após irrigação com três soluções quelantes.

Dezesseis dentes caninos foram instrumentados e a cada troca de lima utilizou-se 1

mL de solução quelante conforme os grupos: G1- EDTAC 17%; GII- CDTA 17%;

30

GIII- EGTA 17%. Ao final do preparo biomecânico foram coletados 8 mL de cada

solução, os quais foram levados ao espectrofotômetro de absorção atômica para

análise da quantidade de íons cálcio presentes. As raízes foram seccionadas

longitudinalmente e preparadas para avaliação em MEV. Os resultados mostraram

que o EDTAC e CDTA removeram a smear layer e íons cálcio da dentina de forma

mais eficiente que a solução de EGTA. Em relação à limpeza entre os terços, não

houve diferença entre eles.

Pérez-Heredia et al. (2006) avaliaram, por meio de MEV, a capacidade de

limpeza de 3 soluções irrigantes ácidas após a instrumentação rotatória e manual.

Oitenta dentes humanos foram distribuídos aleatoriamente em 08 grupos. Quatro

grupos foram preparados com instrumentação manual e os outros quatro com

rotatória. As soluções irrigantes utilizadas foram: ácido cítrico 15% e NaOCl 2,5%;

EDTA 15% e NaOCl 2,5%; ácido ortofosfórico e NaOCl 2,5%; e NaOCl 2,5%

(controle). As soluções ácidas associadas com o NaOCl 2,5% foram eficientes na

eliminação da smear layer e debris não havendo diferença significante na remoção

de smear layer entre as técnicas. O NaOCl 2,5% não foi capaz de promover a

limpeza.

Baumgartner et al. (2007) comparando a eficiência antimicrobiana do

protocolo de irrigação, utilizando NaOCl a 1,3% associado ao MTAD® versus

irrigação com NaOCl a 5,25% associado à EDTA a 17%, constataram que a

irrigação alternada com NaOCl e EDTA era capaz de produzir canais radiculares

livres de unidades formadoras de colônia, enquanto a associação entre NaOCl e

MTAD® não conseguia produzir canais assépticos em cerca de 50% das amostras

testadas. Desta forma, concluíram que a irrigação alternada utilizando NaOCl e

EDTA é mais eficiente na descontaminação de canais radiculares.

Naaman et al. (2007) realizaram estudo in vitro avaliando a eficiência da

capacidade de eliminação da smear layer e de debris da solução de NaOCl a 5,25%,

isolado e associado ao ácido cítrico e ao EDTA e associados ao ultrassom, após a

remoção do hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) do canal radicular. Os autores concluíram

que a utilização do ácido cítrico é eficiente na remoção dos debris e da smear layer

das paredes do canal, sendo menos eficiente do que o EDTA. Eles concluíram que a

aplicação de Ca(OH)2 dificulta a remoção dos debris e da smear layer.

31

Carvalho et al. (2008) avaliaram, por meio da MEV, a capacidade de

limpeza de diferentes soluções utilizadas para irrigação. Trinta e dois dentes

unirradiculares foram distribuídos em 04 grupos de acordo com a solução irrigante

empregada na biomecânica: G1- NaOCl 2,5%+EDTA 17%; G2- CHX em gel

2%+EDTA 17%; G3- Canal Plus (associação de EDTA com peróxido de

hidrogênio)+NaOCl 2,5%; G4- soro+EDTA 17%. Os resultados mostraram grande

quantidade de túbulos dentinários abertos no G1 e G3. Em todos os grupos, a

limpeza obtida no terço cervical foi melhor que a dos terços apical e médio, com

diferença estatística significante no grupo da clorexidina.

Khedmat e Shokouhinejad (2008) compararam, por meio da MEV, a

eficácia do Smear Clear na remoção da smear layer. Quarenta e nove dentes

unirradiculares foram preparados com instrumentos rotatórios de níquel titânio Mtwo.

Os dentes foram distribuídos em 04 grupos de acordo com o protocolo de irrigação

final por 1 min: G1– NaOCl 5,25% (controle); G2– Smear Clear; G3– EDTA 17%;

G4– ácido cítrico 10%. Os resultados mostraram que as soluções avaliadas

limparam o canal radicular de forma semelhante entre si. Em relação aos terços, não

houve diferença significante nos grupos do EDTA 17% e Smear Clear. Entretanto, o

ácido cítrico 10% limpou os terços cervical e médio de forma mais eficaz que o

apical. Os autores concluíram que as soluções não foram totalmente eficientes na

remoção da smear layer, especialmente no terço apical. A adição de um surfactante

ao EDTA não resultou em maior eficácia desta substância.

Spanó et al. (2009) avaliaram a capacidade de remoção da smear layer

promovida pela ação de agentes quelantes e desmineralizantes e quantificaram a

concentração de íons cálcio presentes nas soluções após a utilização. Quarenta e

dois incisivos centrais superiores foram instrumentados e a cada troca de

instrumento os espécimes receberam 2 mL de NaOCl 1%. Posteriormente, os dentes

foram distribuídos em 07 grupos, conforme a irrigação final estabelecida: G1-EDTA

15%; G2- ácido cítrico 10%; G3- citrato de sódio 10%; G4- vinagre de maçã; G5-

ácido acético 5%; G6- ácido málico 5%; G7- sem irrigação final (controle). Durante a

irrigação, as soluções foram simultaneamente coletas, após o extravasamento

apical, e encaminhadas à análise espectrométrica. Os autores verificaram que o

EDTA 15% e o ácido cítrico 10% removeram smear layer de forma semelhante entre

si. As demais soluções não foram eficientes para esta finalidade. A maior quantidade

32

de íons cálcio removidos foi observada no grupo do EDTA 15%, seguido do ácido

cítrico 10%. O citrato de sódio 10% apresentou as menores quantidades do íon.

Şen et al. (2009) verificaram, por meio de MEV, a capacidade de limpeza

e a erosão decorrente do uso do EDTA em diferentes concentrações na superfície

da dentina radicular. Quarenta dentes unirradiculares foram preparados pela técnica

Step Back e irrigados com NaOCl 2,5% a cada troca de instrumento. Os espécimes

foram distribuídos em 04 grupos de acordo com a solução quelante utilizada como

irrigação final: G1- EDTA 15 %; G2- EDTA 10%; G3- EDTA 5%; G4-EDTA 1%.

Utilizaram-se 5 mL de cada concentração de EDTA por 1 min. Os resultados

mostraram que todas as soluções limparam, de forma estatisticamente semelhante,

as paredes do canal radicular. O terço cervical mostrou-se com menor quantidade

de smear layer que o apical. As soluções de EDTA 15, 10 e 5 % apresentaram

erosões similares entre si, não havendo diferença entre os terços da raiz. Os autores

concluíram que o EDTA em pequena concentração pode ser recomendado

clinicamente, uma vez que impede a erosão excessiva da parede dentinária.

Mello et al. (2010) compararam, por meio da MEV, a capacidade de

remoção da smear layer após utilização de duas técnicas de irrigação com EDTA

17%. Sessenta dentes humanos unirradiculares foram instrumentados e distribuídos

conforme o protocolo de irrigação: G1– irrigação contínua com 5 mL EDTA 17%, por

3 min; G2– irrigação inicial de 1 mL de EDTA 17% por 6 s, seguida da inundação do

canal com EDTA 17%, por 2 min e meio, mais irrigação final com 4 mL da mesma

solução, por 24 segundos. Os autores verificaram que o grupo com irrigação

contínua apresentou maior superfície livre de smear layer quando comparado ao

outro grupo. Conclui-se que a irrigação contínua de 5 mL de EDTA 17% por 3 min

pode remover de forma eficiente a smear layer.

Zou et al. (2010) avaliaram trinta dentes superiores anteriores humanos,

instrumentados com o sistema ProTaper, seccionados e removidos seus terços

coronários e apicais. Os blocos preparados foram tratados com NaOCl a 1%, 2%,

4% e 6% por 2, 5 e 20 min, em temperaturas de 20°C, 37°C e 45°C

respectivamente. Os resultados foram medidos pela mancha de clareamento

formada através de microscópio de luz com aumentos de 20 e 40 vezes. Os autores

concluíram que a concentração, o tempo e a temperatura têm influência sobre a

33

capacidade da penetração do NaOCl na dentina, sendo que a temperatura é o fator

que afeta menos esta capacidade.

Baca et al. (2011) avaliaram a atividade antimicrobiana residual e a

capacidade de erradicar o E. faecalis de diferentes soluções irrigadoras, sozinhas ou

em combinação, num teste volumétrico de dentina humana. As soluções de NaOCl a

2,5%, CHX a 2%, cetrimida a 0,2% (CTR), EDTA a 17%, ácido maleico a 7% (MA), e

os regimes de associações do NaOCl a 2,5%, seguido por 17% de EDTA ou MA 7%,

CTR 0,2% ou CHX 2%, foram selecionados. Para determinar a atividade residual

dos regimes de irrigação propostos, foi criado biofilme de E. faecalis sobre os blocos

de dentina após 24 h de incubação a 37°C. Os resultados da atividade residual

antimicrobiana dos regimes-teste foram expressos como a taxa de inibição da

formação e eliminação do biofilme, respectivamente. CHX 2% e CTR 0,2%

apresentaram 100% de inibição do biofilme; NaOCl a 2,5% apresentou a menor

atividade residual (18,10%). A percentagem de morte bacteriana do NaOCl a 2,5% e

CTR a 0,2% foi 100% seguida por MA a 7% e CHX a 2%, enquanto que 17% EDTA

foi o menos eficaz (44%). MA 7% ou EDTA 17% seguido de CTR a 2% ou CHX a 2%

apresentaram atividade residual e antimicrobiana de 100%. Os resultados

mostraram que a solução CTR 0,2% e as combinações em que CTR 0,2% ou CHX

2% foram as soluções finais de irrigação que promoveram atividade residual

antimicrobiana máximas.

Giardino et al. (2014) compararam o poder antibacteriano de NaOCl a 1%

com ácido acético a 1%, NaOCl a 5,25% e dois NaOCl comercialmente disponíveis,

modificados com surfactantes em dentina de raiz bovina. Um total de 120 tubos de

dentina preparados a partir de incisivos bovinos intactos foram infectados durante 21

dias com E. faecalis e distribuídos aleatoriamente em 06 grupos: NaOCl a 5,25%;

Hypoclean; Chlor-Xtra; NaOCl a 1% com ácido acético a 1%; Dentina infectada

(controle positivo); e dentina estéril (controle negativo). Em tempos experimentais de

0, 7, 14, 21 e 28 dias, as microplaquetas de dentina foram colhidas utilizando brocas

redondas sequenciais com diâmetros crescentes em tubos de ensaio separados

contendo 3 mL de BHI recentemente preparado. A análise estatística foi realizada

por meio de métodos paramétricos (ANOVA unidirecional e teste de comparações

múltiplas de Bonferroni, α = 0,01). Após a cultura, o número de unidades formadoras

de colônias (UFC) foi mensurado. Todas as soluções de NaOCl apresentaram um

34

número pequeno de UFC ao longo de 28 dias. ChlorXtra e Hypoclean apresentaram

o menor número de UFC em todos os momentos com maior eficácia antimicrobiana

do que NaOCl a 5,25% e solução de NaOCl a 1% com ácido acético a 1%.

Chaitanya et al. (2016) examinaram a eficácia antibacteriana de Morinda

Citrifolia e extrato de cúrcuma com NaOCl a 3% como irrigante do canal radicular,

contra E. faecalis e S. aureus. A eficácia antimicrobiana foi avaliada in vitro

utilizando o método de difusão em ágar. As placas de ágar foram preparadas

utilizando BHI. As culturas de E. faecalis e S. aureus foram cultivadas a 37°C,

incubadas durante 24 h e as zonas de inibição microbiana foram registadas. NaOCl

a 3% apresentou zonas de inibição maiores comparados aos grupos experimentais

contra ambos os microrganismos. NaOCl a 3% mostrou atividade máxima

antibacteriana contra E. faecalis, seguido por Morinda citrifolia e extratos de

cúrcuma. Considerando o potencial para propriedades indesejáveis de NaOCl, uso

de plantas medicinais alternativas em endodontia pode revelar-se vantajoso.

Morago et al. (2016) avaliaram a influência do smear layer sobre a

atividade antimicrobiana da solução de NaOCl a 2,5% / 9% de ácido etidrônico

(HEBP) contra bactérias nos túbulos da dentina. Os túbulos dentinários foram

infectados com E. faecalis por centrifugação. Após 5 dias de incubação, o smear

layer se formou em metade das amostras, as quais foram então tratadas com NaOCl

a 2,5%, sozinho ou combinado com HEBP a 9%, durante 3 min. A porcentagem de

células mortas em túbulos dentinários infectados foi medida utilizando microscopia

confocal de varrimento a laser e a técnica viva/morta. A smear layer também foi

observada por microscopia eletrônica de varredura. Na ausência de smear layer,

NaOCl a 2,5% sozinho e combinado com 9% de HEBP apresentaram uma atividade

antimicrobiana elevada sem diferenças significativas entre os dois. A smear layer

reduziu significativamente a atividade antimicrobiana de NaOCl a 2,5%, ao passo

que a solução com HEBP não foi infectada. Não foram obtidos túbulos dentinários

livres de smear layer no grupo NaOCl a 2,5%. No caso de NaOCl/HEBP,

95,40%±3,63% dos túbulos dentinários foram limpos. A combinação de

NaOCl/HEBP exerceu atividade antimicrobiana que não foi reduzida pela smear

layer.

35

Zand et al. (2016) compararam a eficácia antibacteriana do gel de NaOCl

a 2,5% e das soluções de NaOCl a 5,25% e 2,5%, em biofilme de E. faecalis. Os

canais radiculares de sessenta dentes unirradiculares extraídos de humanos foram

contaminados com E. faecalis e incubados durante 6 semanas. As amostras foram

distribuídas aleatoriamente em 03 grupos experimentais e 01 grupo de controle. O

protocolo do estudo, nos grupos experimentais, consiste de injeção de 5 mL de cada

irrigante em canais radiculares. As amostras foram recolhidas a partir das paredes

do canal radicular e 1:10 diluições em série foram preparadas e adicionadas a

placas de ágar Muller Hinton (MHA) e incubou-se a 37° C durante 48 h. Foi utilizada

a técnica clássica de contagem de colônias para determinar as contagens

bacterianas vitais de E. faecalis em placas de MHA. O efeito antimicrobiano das

soluções irrigantes nos 03 grupos experimentais foi significativamente maior do que

o grupo de controle, sem diferença significativa entre as soluções de NaOCl a 2,5%

e 5%. O efeito das soluções de NaOCl foi significativamente superior comparado ao

do gel de NaOCl a 2,5%. Com as limitações deste estudo, o gel de NaOCl a 2,5% foi

eficaz na redução da contagem de E. faecalis; contudo este efeito foi inferior ao das

soluções de NaOCl.

2.2 Propriedades da Quitosana

Elsaka e Elnaqhy (2012) tiveram como objetivo investigar a atividade

antibacteriana do Ca(OH)2 combinado com soluções de quitosana na dentina do

canal radicular infectado com E. faecalis e o efeito deste novo medicamento

intracanal sobre a resistência adesiva do selante RealSeal à dentina radicular.

Preparou-se um medicamento intracanal experimental misturando diferentes

concentrações de solução de quitosana (25%, 50% e 100%) a pó de Ca(OH)2. A

atividade antibacteriana foi avaliada e o número total de unidades formadoras de

colônias foi determinado. A capacidade de ligação do selante RealSeal à dentina

radicular foi avaliada utilizando o teste de força de tração. Os dados foram

analisados utilizando a análise de variância unidirecional (ANOVA) e os testes de

comparação múltipla de Tukey. O Ca(OH)2 combinado com diferentes

concentrações de soluções de quitosana apresentou melhor atividade antibacteriana

do que Ca(OH)2 misturado com solução salina, sem afetar significativamente a

resistência adesiva do selante RealSeal à dentina radicular. Os resultados sugerem

36

que Ca(OH)2 combinado com quitosana é medicamento intracanal promissor e pode

ser eficaz na terapia endodôntica.

Silva et al. (2012) avaliaram os efeitos da quitosana, em diferentes

concentrações, na remoção da smear layer e na estrutura da dentina, após 3 e 5 min

de aplicação. Doze dentes caninos superiores, recém extraídos, foram

instrumentados pela técnica crown-down e irrigados com hipoclorito de sódio 1%. Os

espécimes foram distribuídos em seis grupos conforme o tempo e a concentração da

solução irrigante final: G1: quitosana 0,1% por 3 min; G2: quitosana 0,2% por 3 min;

G3: quitosana 0,37% por 3 min; G4: quitosana 0,1% por 5 min; G5: quitosana 0,2%

por 5 min; G6: quitosana 0,37% por 5 min. Todas as amostras foram preparadas

para avaliação em MEV. Os resultados mostraram que o G1 apresentou remoção da

smear layer, mas não da smear plug. O G2 mostrou túbulos visíveis e abertos com

ligeira erosão da dentina peritubular. A limpeza no G3 foi semelhante à do G2, no

entanto, o efeito erosivo foi maior. No G4 houve ampliação do diâmetro dos túbulos

e no G5 e G6, severa erosão com deterioração da superfície dentinária. De acordo

com a metodologia aplicada pode-se concluir que a quitosana 0,2% por 3 min foi

eficiente na remoção da smear layer, ocasionando pequena erosão.

Silva et al. (2013) avaliaram por meio de espectrofotometria (AASF) e

MEV, a eficácia da remoção da smear layer utilizando quitosana comparado a

diferentes agentes quelantes. Foram utilizados vinte e cinco canais radiculares de

caninos, preparadas pela técnica crown-down e irrigados com NaOCl a 1%. Os

dentes foram distribuídos aleatoriamente em 05 grupos, de acordo com o tipo de

irrigação final: EDTA 15%, quitosana 0,2%, ácido cítrico 10%, ácido acético 1% e de

controle (sem irrigação final). O volume total de cada solução quelante foi recolhido

a partir dos canais e analisadas por AASF para quantificação de íons de cálcio das

soluções. Em seguida, as raízes foram seccionadas longitudinalmente e examinadas

por MEV para avaliação da remoção da smear layer nos terços, médio e apical.

EDTA 15%, quitosana 0,2% e ácido cítrico 10%, apresentaram capacidade de

remoção de smear layer semelhante com diferença significativa comparado ao ácido

acético a 1% e o grupo de controle. Não houve diferença significativa entre a smear

layer remanescente nos terços médio e apical. A concentração de íons cálcio mais

elevada foi observada com EDTA 15% (121,80 ± 5,13) e quitosana 0,2% (104,13 ±

19,23), sem diferença significativa. A concentração de íons de cálcio mais baixa foi

37

obtida com ácido acético a 1% (25,62 ± 7,68), enquanto que o ácido cítrico a 10%

(70,38 ± 11,15) obteve resultados intermédios, diferindo significativamente das

outras soluções. Se conclui que o EDTA 15%, quitosana 0,2% e ácido cítrico a 10%

removeram efetivamente a smear layer dos terços médio e apical do canal. O EDTA

15% e a quitosana 0,2%, foram associados com o maior efeito sobre a

desmineralização da dentina da raiz, seguido de ácido cítrico a 10% e ácido acético

a 1%.

Grover e Shetty (2014) avaliaram a liberação de íons cálcio e mediram a

variação do pH do ambiente que ocorreu quando o Ca(OH)2 foi combinado com

diferentes veículos (água destilada, propilenoglicol, Ca(OH)2, contendo guta-percha e

quitosana) em diferentes períodos de tempo. Foram utilizados quarenta dentes pré-

molares inferiores com raiz foram escolhidos para este estudo. O comprimento de

trabalho foi estabelecido e os canais radiculares foram ampliados e a irrigação foi

realizada com 2 ml de solução de NaOCl após cada estocagem. Os dentes foram

então divididos aleatoriamente em 04 grupos. Os canais foram então embalados

com diferentes preparações de Ca(OH)2 utilizando os seguintes veículos: água

destilada, propilenoglicol, pontos de guta-percha e quitosana. A libertação de íons de

cálcio em diferentes grupos foi analisada utilizando um espectrofotômetro ultravioleta

a 220 nm. A alteração no pH foi determinada usando medidor de pH. Os resultados

foram estatisticamente avaliados utilizando um teste ANOVA de sentido único. Para

liberação de íons cálcio, o grupo 2 apresentou liberação cumulativa de fármaco de

81,97% ao final de 15 dias, enquanto que os grupos 1, 3 e 4 apresentaram liberação

de 99,53, 17,98, 74,93%, respectivamente, com diferença significativa entre todos os

grupos. O grupo 1 atingiu o maior nível de Ca+2 (39,79%) ao final de 1 dia, mas

apresentou liberação quase completa de Ca(OH)2 ao final de 15 dias. O grupo 3

apresentou menor liberação de íons cálcio (17,98%) aos 15 dias. O grupo 4 mostrou

liberação prolongada de íons Ca+2 de 74% aos 15 dias para 95% no final dos 30

dias. Após a primeira hora; o grupo 1 apresentou o nível de pH mais alto (11,8). No

entanto, o pH foi reduzido para 7,8 no final de 30 dias neste grupo. O grupo 2

apresentou o valor de pH mais alto (10,35), seguido do grupo 4 (10,32), após 30

dias. A quitosana pode ser utilizada como veículo promissor para o Ca(OH)2 manter

pH alcalino e permitir a libertação sustentada de íons cálcio no sistema de canais

radiculares.

38

Del Carpio-Perochena et al. (2015) estudaram a capacidade da

nanopartícula de quitosana (CNPs) na remoção da smear layer e inibição da

recolonização bacteriana sobre a dentina. Foram usadas cem secções de dentina

bovina distribuídas em cinco grupos. As soluções irrigantes utilizadas foram NaOCl

2,5% durante 20 min, EDTA 17% durante 3 min e 1,29 mg/mL de CNPs durante 3

min. As amostras foram irrigadas com água destilada (controle), NaOCl,

NaOCl+EDTA, NaOCl+EDTA+CNPs e NaOCl+CNPs. Após o tratamento, metade da

amostra foi utilizada para avaliar o efeito quelante das soluções usando MEV,

enquanto a outra metade foi infectada intraoralmente para examinar a capacidade

de formação de biofilme bacteriano pós-tratamento. O volume e viabilidade celular

dos biofilmes foi analisado sob Microscopia Confocal. A smear layer foi

significativamente reduzida em todos os grupos, exceto o grupo NaOCl e controle.

CNPs apresentou resistência à formação de biofilme significativamente superior

comparado aos outros grupos de tratamento. CNPs pode ser usado como um

irrigante final durante o tratamento do canal radicular com a dupla vantagem de

remover a smear layer e inibir a recolonização bacteriana sobre a dentina da raiz.

Geethapriya et al. (2016) avaliaram a eficácia da quitosana e quitosana-

EDTA (3:1, 1:1, 1:3) em comparação com NaOCl 5,2% na desinfecção de biofilme

em E. faecalis na dentina do canal radicular e na remoção da smear layer com

erosão mínima. Foram selecionados neste estudo, setenta pré-molares inferiores

unirradiculares extraídos. Quarenta amostras de dentes foram biomecanicamente

preparados, cortados verticalmente, e esterilizados em autoclave. As seções de

dentes foram artificialmente infectadas com E. faecalis (ATCC 29212 e isolado

clínico [SBEF2]) para formar biofilme dentinária madura in vitro. As amostras de

dentes foram tratadas com as soluções de ensaio: quitosana e quitosana-EDTA (3:1,

1:1, 1:3), e o tempo de morte bacteriana foi determinado. A capacidade de remoção

de smear layer das soluções de teste (grupo A: quitosana-EDTA [1: 1]; grupo B:

EDTA; grupo C: controle) foi avaliada. A quitosana e quitosana-EDTA (3:1, 1:1, 1:3)

exibiu atividade antibacteriana contra ambas as estirpes de E. faecalis. A quitosana

e quitosana-EDTA causaram redução de log 3 na contagem viável das células

sésseis de E. faecalis em 15 min, enquanto o NaOCl 5,2% exibiram inibição 99,98%

em 15 min. A quitosana-EDTA (1:1) foi eficaz na remoção da smear layer e mostrou

menor erosão comparada ao EDTA nas porções coronais e médias. Quitosana-

39

EDTA (1:1) é um potencial irrigante para o canal radicular que executa um duplo

papel - desinfecção do canal e remoção de smear layer.

Shenoi et al. (2016) compararam a eficácia antimicrobiana dos irrigantes

BioPure MTAD, quitosana 0,2%, quitosana 1%, CHX 2% e NaOCl 3% contra E.

faecalis, frequentemente isolado de infecções persistentes do canal radicular. O

método de difusão de ágar-ágar foi utilizado para medir as atividades

antimicrobianas destes irrigantes. Soro fisiológico foi utilizado como controle

negativo. A ordem de eficácia foi determinada pela medição de zonas de inibição.

BioPure MTAD apresentou zona de inibição média significativamente maior contra E.

faecalis do que os outros irrigantes. Embora quitosana 0,2% não apresentasse

quaisquer zonas de inibição, quitosana 1% apresentou eficácia semelhante ao

NaOCl a 3%, e ambos os irrigantes apresentaram eficácia significativamente maior

do que CHX a 2%. Assim, quitosana 1% pode ser substituto antimicrobiano natural

eficaz para irrigantes sintéticos.

Freire et al. (2016) avaliaram a atividade antimicrobiana e citotoxicidade

da quitosana coloidal - nanopartículas de prata - nanocompósitos de flúor

(CChAgNpFNc), com diferentes formas e tamanhos de nanopartículas de prata. As

sínteses de CChAgNpFNc foram realizadas com nitrato de prata adicionado a

solução de quitosana, solução de boro-hidreto de sódio e fluoreto de sódio sólido.

Solução de ácido ascórbico foi adicionada para sintetizar nanopartículas de prata

maiores. CChAgNpFNc obtido: S1- 100% esférica, 8,7 ± 3.1nm; S2- esférica 97%,

15.0 ± 2.5% e 7.9nm triangular, 22,2 ± 9.5nm; S3- 77,3% esférico, 31,8 ± 10.4nm,

15,9% triangular, 27,1 ± 10.1nm e 6,8% elíptica, 33,2 ± 7.8nm; S4- e 75,2% esférica,

43,2 ± 14.3nm; 23,3% triangular 38,2 ± 14.8nm, e 1,5% elípticas 38,4 ± 11.6nm.

CChAgNpFNc mostrou atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, E. faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. A

influência sobre o crescimento de microrganismos foi avaliada usando ensaio de

fluorescência, demonstrando aumento da fase retardamento e diminuição da fase

log bacteriana. A citotoxicidade foi investigada usando ensaios de Artemia salina e

MTT. As amostras S3 e S4 apresentaram baixa citotoxicidade. As amostras S1 e S2

inibiu macrófagos e revelou dose letal acima de concentrações de 1000 mg/mL, que

foram classificados como moderadamente tóxico. Assim, CChAgNpFNc são

40

potenciais opções para o controle de microrganismos resistente a múltiplos fármacos

e não representam riscos substanciais para a saúde humana.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

42

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Indicador Biológico

No presente estudo foi utilizado o microrganismo obtido da American

Type Culture Collection, E. faecalis (ATCC 29212). A cepa foi inoculada em 7 mL de

BHI (BHI; Difco Laboratories, Detroit, EUA) e incubada a 37°C por 24 h. O

microrganismo foi cultivado na superfície do Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Difco

Laboratories, Detroit, EUA) sob as mesmas condições da incubação. Células

microbianas foram suspensas em solução fisiológica para dar concentração final de

cerca de 3 X 108 células/mL, semelhante ao tubo no 1 da escala MacFarland.

3.2 Materiais

Foram utilizados quarenta dentes incisivos inferiores bovinos obtidos

através da empresa Mondelli por meio da Faculdade de Odontologia de Bauru -USP

de acordo com Anexo I. As coroas foram removidas, com disco diamantado

(American Burrs, São Paulo, Brasil) em peça reta com baixa rotação, num ângulo de

90º com o longo eixo do dente. Os comprimentos radiculares foram padronizados

em 16 mm e os canais radiculares esvaziados até o zero apical com instrumento K-

Flex #15 (Maillefer, Ballaigues, Suíça), com irrigação convencional com 3 mL de

NaOCl 2,5% (Longevitá, Goiânia, Brasil) recém-preparada. A seguir, os canais

radiculares foram secos com pontas de papel esterilizadas (Tanari, Tanariman

Indústria Ltda., Manacaru, Brasil) nº 45 e preenchidos com EDTA 17% (pH 7.2 –

Biodinâmica, Ibiporã, Brasil) por 5 min para remoção da smear layer e secos

novamente de acordo com o método descrito anteriormente. Todos os espécimes

foram colocados individualmente em tubos de polipropileno do tipo Eppendorf com

capacidade de 1,5 mL (Cral, São Paulo, Brasil) contendo BHI e autoclavados por 30

min a 120˚C.

Em todos os grupos experimentais foi realizada coleta inicial (antes dos

procedimentos endodônticos) para checar a viabilidade bacteriana de cada amostra.

A coleta foi realizada de forma idêntica a descritas anteriormente para os controles

positivo e negativo.

3.3 Preparo das soluções

As soluções testadas neste experimento foram o NaOCl a 2,5%

(Longevitá, Goiânia, Brasil), EDTA 17% (Longevitá, Goiânia, Brasil) e quitosana

43

0,2% (Longevitá, Goiânia, Brasil).

3.4 Desenho Experimental

Cinco mililitros de BHI foram misturados a 5 mL do inóculo bacteriano, e

os grupos experimentais foram inoculados durante 60 dias empregando-se seringas

esterilizadas com volume suficiente para preencher o canal radicular. Este

procedimento foi repetido a cada 72 h, sempre utilizando cultura pura com 24 h. As

raízes foram mantidas em meio úmido a 37˚C. Cinco espécimes não contaminados

formaram o grupo controle negativo. Foram incubados a 37ºC durante o período de

contaminação, para testar a esterilidade das amostras, enquanto 05 espécimes

contaminados serviram como controle positivo. Os espécimes foram aleatoriamente

distribuídos em 08 grupos experimentais (n=05) (Tabela 1).

Após o período de contaminação, foi realizada coleta em todos

espécimes. Os canais radiculares foram preenchidos com água destilada

esterilizada e pontas de papel esterilizadas nº 45 foram introduzidas no canal

radicular e mantidas por 1 min. Foram realizadas três coletas de cada espécime e as

pontas foram imersas em 7 mL de Letheen Broth (BHI, Difco Laboratories, Detroit,

EUA), e meio acrescido de neutralizantes [Lecitina, Tween 80 e Tiossulfato de sódio

(P.A., Art Laboratories, Campinas, Brasil), seguido de incubação a 37˚C por 48 h. A

coleta foi realizada com o objetivo de confirmar a presença ou ausência bacteriana

pela turvação do meio de cultura.

Tabela1. Distribuição dos Grupos de acordo com as soluções experimentais:

Grupos Soluções Experimentais Concentração de Diluição

C-*

C+**

G1

Controle Negativo

Controle Positivo

Solução de H20 destilada

G2 NaOCl 2,5%

G3 EDTA 17%

G4 Quitosana 0,2%

G5 NaOCl + Quitosana 2,5% + 0,2%

G6 NaOCl + EDTA 2,5% + 17%

* C- (Controle negativo): Amostra sem contaminação. **C+ (Controle positivo): Amostra contaminada sem utilização de material experimental.

44

3.5 Modelo Experimental

A avaliação da eficácia antimicrobiana das soluções experimentais foi

realizada com o emprego de dispositivo formado por bomba peristáltica (Sarlo 90,

São Paulo, Brasil) ligada a uma mangueira plástica esterilizada adaptada a um tubo

do tipo Eppendorf, conectado ao dente através da entrada dos canais radiculares

(ESTRELA et al., 2007). A entrada deste aparato foi o tubo plástico conectado ao

tubo do tipo Eppendorf e a saída correspondeu ao ápice dos canais radiculares (Fig.

1a–c). As soluções irrigantes circularam pelo aparato em fluxo constante durante 10

min sob uma pressão de 50 mL/min-1.

45

Figura 1 Vista geral do aparato empregado na avaliação do efeito antimicrobiano das soluções

irrigadoras. (a) Elemento dental acoplado em tubo tipo Eppendorf; (b) Sistema de irrigação com

bomba peristáltica; (c) solução irrigadora circulando em fluxo constante de 50 mL min-1 por 10 min.

46

Após o intervalo de 10 min, cada dente foi removido do aparato sob

condições assépticas e, realizada irrigação com 5 mL de água destilada esterilizada.

Foi feita a coleta, conforme descrito anteriormente, seguida de incubação a 37˚C por

48 h. Após a avaliação do meio de cultura, um inoculo de 0,1 mL foi transferido para

7mL de BHI, subsequentemente, incubado sob as mesmas condições. Após 48 h, foi

realizada a avaliação visual da presença ou ausência de turbidez pelo meio de

cultura.

3.6 Preparo para análise no microscópio eletrônico de varredura

A determinação qualitativa da contaminação dos blocos de dentina foi

realizada utilizando MEV. Após o experimento foi feito um sulco longitudinalmente ao

longo eixo sentido cérvico-apical com disco diamantado para exposição de toda a

extensão do canal radicular, sem penetrar no canal radicular. Para a exposição de

toda a extensão do canal radicular, o seccionamento foi feito com um cinzel e um

martelo. Após separação longitudinal, os fragmentos ficaram com 2 metades. Os

fragmentos foram fixados em solução tamponada de formalina por 7 dias. A

desidratação foi realizada em solução crescente de etanol 70%, 95% e 100% com

três trocas de 10 min, em cada solução. Os fragmentos foram submetidos ao

preparo metalográfico para análise no MEV (MEV, JEOL, JSM-IT300, Tokyo, Japan).

As amostras foram fixadas em fita adesiva de carbono sobre porta amostras de

alumínio e recobertas com ouro, como material condutor e analisadas no MEV de

alto vácuo com magnificação 3.000 e 5.000 vezes. As imagens foram analisadas

para verificar o padrão de contaminação presente após o experimento.

4. RESULTADOS

48

4. RESULTADOS

A eficácia antibacteriana das substâncias químicas estudadas está

presente na tabela 2. Nenhuma substância irrigante testada foi efetiva para eliminar

a contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.

Tabela 2. Eficácia antibacteriana de soluções irrigadoras em canais radiculares

infectados por E. faecalis.

Grupos/ Período Antes Depois

Controle Negativo - -

Controle Positivo + +

Solução de H20 destilada + +

NaOCl + +

EDTA + +

Quitosana + +

NaOCl + Quitosana + +

NaOCl + EDTA + +

(+ : presença de bactéria; - : ausência de bactéria)

As fotomicrografias com magnificação de 3.000x (Figura 2) e 5.000x

(Figura 3), demonstram o padrão de contaminação por meio da presença de E.

faecalis nos respectivos grupos.

49

Figura 2. Imagens MEV (3.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.

50

Figura 3. Imagens MEV (5.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.

5. DISCUSSÃO

52

5. DISCUSSÃO

A ação mecânica de instrumentos endodônticos associada às

propriedades químicas das soluções irrigantes reduz agentes irritantes e proporciona

ambiente favorável para o reparo tecidual (FERREIRA et al., 2004; DE-DEUS et al.,

2014; BORGES et al., 2016).

A escolha de dentina bovina para testes de infecção e desinfecção tem

sido indicada comumente (ORSTAVIK E HAAPASALO, 1990; GIARDINO et al.,

2014; DEL CARPIO-PEROCHENA et al. 2015). Fatores como facilidade de obtenção

e manuseio, assim como a utilização em testes similares relacionados com a

remoção da smear layer alicerçaram essa indicação (ORSTAVIK E HAAPASALO,

1990). A topografia é fator relevante à sobrevivência de biofilmes, uma vez que as

superfícies irregulares melhoram a adesão e a retenção microbiana, fornecendo

pontos de fixação para os microrganismos e seus nutrientes (DEL CARPIO-

PEROCHENA et al., 2015). Com relação à metodologia empregada, a utilização do

dispositivo formado por bomba peristáltica conectada à entrada dos canais

radiculares simula o processo de irrigação de canais radicular (ESTRELA et al.,

2007) e em sequência a avaliação visual de turbidez do meio de cultura de

microrganismos coletados nos canais radiculares possibilita relação entre a

proporção de crescimento de microrganismos (ESTRELA et al., 2007). Estudos

investigaram a eficácia antimicrobiana de soluções irrigantes em diferentes modelos

experimentais, tais como, método de difusão em ágar (SHENOI et al., 2016), ensaio

de fluorescência (FREIRE et al., 2016) e avaliação por meio de MEV

(GEETHAPRIYA et al., 2016). Contudo, diferenças metodológicas entre estes

métodos são susceptíveis a apresentar resultados que não possam ser comparados

e tão pouco extrapolados para as condições clínicas.

O NaOCl, solução irrigante utilizada na desinfecção dos canais

radiculares, pode ser aplicada em variadas concentrações (CHAITANYA et al.,

2016). Embora soluções menos concentradas tenham demonstrado eficácia

antimicrobiana, concentrações mais elevadas apresentam efeito bactericida mais

rápido e maior, no entanto, elevam seu efeito citotóxico (CARVALHO et al., 2008). A

ação antimicrobiana de NaOCI ainda não foi totalmente compreendida. O cloro ativo

formado na dissociação do NaOCl em meio aquoso consiste em poderoso agente

oxidante que produz efeito antimicrobiano por oxidação irreversível da célula

53

bacteriana (ESTRELA et al., 2012). A literatura aponta aumento no efeito

antimicrobiano do NaOCI quando utilizado alternadamente com solução de EDTA

(TARTARI et al., 2017). Isto está relacionado com a ação de desmineralização do

EDTA, que previne a formação de camada de smear layer durante a instrumentação,

resultando na penetração aumentada de NaOCI nos túbulos dentinários (BACA et

al., 2011; TARTARI et al., 2017). No entanto, estudos relatam que esta associação

pode proporcionar erosão da estrutura dentinária comprometendo sua integridade

(BERUTTI et al., 2006).

Neste cenário, estudos relacionados às propriedades quelantes da

quitosana na dentina do canal radicular (SILVA et al., 2013) encorajaram o estudo

de outras propriedades, como sua capacidade antimicrobiana (DEL CARPIO-

PEROCHENA et al., 2015; SHENOI et al., 2016). A quitosana apresenta além de

propriedade quelante, biocompatibilidade, biodegradabilidade, bioadesão e

atoxidade às células humanas (KURITA, 1998; AKNCBAY et al., 2007). O

mecanismo quelante da quitosana na dentina não foi totalmente elucidado. No

entanto, este biopolímero bioativo é amplamente utilizado como agente quelante

para absorver metais pesados de águas residuais (DEL CARPIO-PEROCHENA et

al., 2015). Esta substância pode ser alternativa viável dentre as soluções irrigantes

utilizadas na Odontologia, buscando ação eficaz contra microrganismos e menor

ação citotóxica.

E. faecalis foi escolhido como marcador biológico devido ao seu papel

microbiano na infecção persistente do canal radicular (DEL CARPIO-PEROCHENA

et al., 2015). Por ser encontrado com maior frequência em infecções endodônticas

secundárias assintomáticas, ser capaz de invadir os túbulos dentinários, possuir

capacidade de competição com outros microrganismos, ser gram-positivo e

anaeróbico facultativo, adquiriu papel fundamental na investigação endodôntica

(ESTRELA et al., 2012). A resistência do biofilme de E. faecalis pode ser atribuída a

uma série de fatores microbiológicos inerentes à complexidade anatômica do

sistema radicular e à estrutura da dentina (ESTRELA et al., 2012). CAMACHO-

ALONSO et al. (2017) relata que este microrganismo chama a atenção por sua

capacidade de sobrevivência com nutrição limitada, de manter seu nível de pH

devido à capacidade de bloqueio do citoplasma e sua capacidade de adesão ao

túbulo dentinário. A presença deste microrganismo gera a necessidade de estudos

54

que elucidem seu comportamento dentro dos túbulos dentinários e que ofereçam

meio de eliminação deste no sistema de canais radiculares.

A avaliação qualitativa da contaminação dos blocos de dentina bovina

realizada por MEV e a avaliação visual da turbidez do meio de cultura evidenciaram

que os diferentes protocolos de irrigação e as substâncias testadas neste estudo

não foram efetivos para completa eliminação da contaminação dentinária bacteriana

pelo E. faecalis. Embora alguns autores relatem eficácia limitada tanto do NaOCl

associado ao EDTA quanto da quitosana (SONG et al., 2013; GEETHAPRIYA et al.,

2016; SHENOI et al., 2016; CAMACHO-ALONSO et al., 2017; YADAV et al., 2017),

não houve relato destes autores de ação totalmente eficaz destas soluções contra o

E. Faecalis, o que aponta necessidade de novas investigações e aplicação de novas

metodologias neste contexto. Os resultados de estudos ex vivo são importantes para

determinação de parâmetros de condutas clínicas. Considerando os resultados

previamente descritos, novos avanços e pesquisas relacionados à sanificação

poderão sanar infecções persistentes do sistema de canais radiculares contribuindo

com a recuperação do periápice.

6. CONCLUSÃO

56

6. CONCLUSÃO

Baseado na metodologia empregada, foi possível concluir que as

diferentes substâncias químicas irrigantes testadas não foram efetivos para eliminar

a contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.

7. REFERÊNCIAS

58

7. REFERÊNCIAS

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ANEXOS

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Anexo 1