Producción de enzimas. Producción de Enzimas Un preparado enzimático comercial contiene: –Enzima de interés –Otras proteínas (contaminantes) –Excipientes

Producción de enzimas

Producción de Enzimas

Un preparado enzimático comercial contiene:

– Enzima de interés– Otras proteínas (contaminantes)– Excipientes– Preservantes

El criterio tradicional de producción ha sido obtener la mínima pureza en el preparado, de acuerdo a la utilización del preparado

Menor costo de operación

Producción de Enzimas Esquema general de producción de enzimas:

InóculoNutrientes

Tejido

Residuo Sólido

EstabilizantesPreservantesExcipientes

Producto Liquido

Producto Sólido

1

2

3 4

5

6a 6b 6c 7

8 8

Leyenda1 – Reactor2,4 – Separación sólido-liquido3 – Extracción5 – Concentración 7 – Secado6 – Purificación 8 – Mezclado

→2→5→ Enzima Extracelular

→2→3→4→ Enzima Intracelular

Producción de Enzimas Del esquema se pueden observar 4 etapas:

1) Generación ó producción: por fermentado, en el caso de enzimas microbianas, ó producción agropecuaria ó cultivo in vitro en lo caso de enzimas de tejidos

2) Recuperación: separación, concentración y extracción

3) Purificación: varia según el tipo de catalizador enzimático y puede incluir varias etapas

4) Formulación: acabado y normalización del producto enzimático


Algunas enzimas de origen animal aun son producidas, debido a que las tentativas para reemplazarlas por enzimas microbianas han sido hasta hoy infructíferas. Ej. Renina, para la producción de quesos.

Las enzimas vegetales son en gran parte producidas como subproductos de la actividad agrícola. Ej. Papaina, extraída del látex del papayo.


La tecnología de propagación de células microbianas, bajo condiciones controladas, se encuentra en un alto grado de desarrollo.

Esta es una área fundamental de la ingeniería de bioprocesos.

De una perspectiva comercial, las bacterias, hongos filamentosos y las levaduras son los microorganismos más usados en la producción de enzimas comerciales

Crecimiento microbiano

La célula es una compleja maquinaria que transforma nutrientes en:

• Masa celular

• Productos extracelulares (ej. proteínas)

• Metabolitos terminales (CO2 y H2O en metabolismo aerobio)

Las enzimas comerciales son producto del metabolismo aerobio y, por general, cumplen una función catabólica.

Producción de metabolitos Los productos del metabolismo microbiano se

pueden calificar como:

• Metabolitos primarios – relacionados con el crecimiento celular

• Metabolitos secundarios – no se encuentran vinculados con la replicación celular

Células

Metabolito primario

Metabolito secundario

Producción de metabolitos

La mayoría de las enzimas comerciales son degradativas, asociadas al catabolismo, luego tienen un carácter de metabolito primario. Pero con cambios de la composición del medio de cultivo, pueden producirse enzimas catalíticas total ó parcialmente disociadas del crecimiento.

Controles sobre síntesis enzimática

El inductor se une a la proteína represora, imposibili-tando que ella se acople a los genes que codifican la enzima, luego permitiendo su síntesis.

Norma general: la inducción permite el ajuste rápido para el uso de sustratos metabolizables.

Ejemplo: la producción de -galactosidasa es inducible en la presencia de un azúcar de tipo -galactósido (ej., lactosa)

Inducción

Controles sobre síntesis enzimática

La presencia de un sustrato en el medio, reprime la ruta catabólica/sintética de su metabolismo.

Regla general: a represión permite el ajuste para la síntesis de una sustancia que interviene como intermediario metabólico.

Ejemplo: la E. coli crece en la ausencia de triptófano (lo sintetiza), pero su presencia en el medio inhibe su biosíntesis.

Represión Catabólica

Diseño de medios de cultivo

El medio de cultivo es la principal manipulación ambiental que se puede efectuar.

Este debe proporcionar los nutrientes necesarios al crecimiento del microorganismo y producción de la enzima deseada.

Como base inicial del diseño se puede considerar la composición elemental del microorganismo a utilizar.

Diseño de medios de cultivo

Bacterias LevadurasHongos

filamentosos

Carbono 45-52 45-52 45-5

Nitrógeno 10-14 6-9 4-7

Hidrógeno 10 10 10

Oxígeno 20 20 20

Azufre 0.2-1 0.05-0.3 0.1-0.5

Fósforo 2-3 0.8-2.5 0.5-4.5

Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.5 0.1-0.7

Composición elemental de los Composición elemental de los microorganismos (%)microorganismos (%)

Recuperación de Enzimas

Dependiendo si son enzimas extracelulares o intracelulares, la secuencia del proceso cambia:

Torta Celular

Residual

Fermentación

Sep. Sólido-Liquido

Concentración

Purificación o Formulación

ENZ. EXTRACELULARESENZ. EXTRACELULARES

Caldo Gastado

Tejido vegetal o

animal

Fermentación


(Almacenamiento)

Extracción


Concentración

Purificación o Formulación

ENZ. INTRACELULARESENZ. INTRACELULARES


Las operaciones más empleadas (clásicas) son la filtración y la centrifugación, aunque ambas ofrecen dificultades debido al diminuto tamaño, baja densidad y alta compresibilidad de las células.

Separación Sólido-LiquidoSeparación Sólido-Liquido



Filtro de plato y marcoFiltro rotativo a vacío



La centrifugación es más frecuente en m.o. unicelulares (levaduras, bacterias), siendo necesario además un cierto grado de floculación, debido al reducido tamaño de las células, que puede ocurrir naturalmente o ser provocada por adición de agentes floculantes.



Centrifuga de tipo tubular

Centrifuga de discos



Otras alternativas de separación son: filtración cruzada o tangencial y flotación.

La filtración cruzada ó tangencial, empleando membranas microporosas, es una alternativa interesante en la separación de células como también de fragmentos celulares.

Debido al flujo tangencial, estas membranas sufren un menor ensuciamiento, debido a un efecto de arrastre de los sólidos sobre ellas, sendo esta una clara ventaja en relación a la filtración clásica.



Filtración Cruzada o tangencial

Membrana ultrafiltración

Flujo del liquido filtrado

Flujo células/fragmentos

Flujo células/fra

gme

ntos

Flujo del liquido filtrado

Filtración Clásica


Extracción (Enzimas Intracelulares)Extracción (Enzimas Intracelulares)

Existen dos grandes grupos de técnicas extracción:

Métodos físicos – aplicación de esfuerzos cortantes

Métodos químicos ó enzimáticos – digestión de la pared celular

En los métodos físicos tendremos:

Presión: Existen diversos tipos de equipos para la disrupción celular por aplicación de presión, con o sin adición de abrasivos. Se destacan las prensas que aplican presión en fase liquida (prensa French, prensa Chaikoff) y en fase sólida (presa X, prensa Hughes). Son equipos esencialmente de laboratorio.



Homogenización: Estos son equipos tradicionales en la industria alimentaria, fácilmente adaptables a la disrupción celular. El principio pasa por el desplazamiento de la suspensión celular a alta presión contra una válvula de descarga ajustable, que posee un pequeño orificio tortuoso.



El proceso de extracción es sumamente marcado por la presión de operación del equipo, con la desventaja que altas presiones implican altas temperaturas (luego mayor refrigeración).



Molienda: La mayor parte de los molinos son de bolas de pequeño tamaño, donde la disrupción se logra por una combinación de esfuerzos de corte y compresión.

Sonicación: La disrupción celular por ultrasonido se debe a primero, creación de zonas de enrarecimiento en el seno del liquido, seguido de fuertes compresiones que colapsan las burbujas, lo que produce ondas de choque. El fenómeno se encuentra muy bien descrito. El sistema es muy eficaz a nivel de laboratorios, pero su escalamiento a nivel industrial a ofrecido dificultades.



En los métodos no físicos tendremos:

Digestión química: Se ha reportado ocasionalmente el uso de álcali como método de extracción. Pero esto se resume a la extracción de enzimas con alta estabilidad a extremos de pH. También se ha reportado la utilización de solventes orgánicos. Las células son tratadas con altas concentraciones de etanol, metanol e isopropanol y luego resuspendidas en tampón. Pero el efecto de inactivación y alto costo de los solventes, no torna esta técnica económicamente atractiva.

Digestión enzimática: ciertos m.o. (levaduras y algunos bacilos) son capaces de autolisar, o sea, producir enzimas en ciertas condiciones fisiológicas que producen una digestión total/parcial de la pared celular. Este método es interesante por su bajo costo y facilidad de escalamiento a nivel industrial.


ConcentraciónConcentración

Por lo general, las enzimas se encuentran muy diluidas en el caldo, después de la etapa de separación sólido-liquido, como para poder ser formulado o sometido a purificación.

El sistema tradicional de concentración es la evaporación a vacío, para minimizar las perdidas de actividad por desnaturalización térmica.

Se utilizan sistemas similares a los empleados por la industria alimentar para concentración de jugos, utilizándose presiones de operación entre 10 y 60 mm de Hg.



Otros métodos alternativos son la cristalización, la liofilización y la flotación.

La cristalización de agua y eliminación como hielo ha sido propuesto como método para separa soluciones enzimáticos, pero si el sistema de enfriamiento no es bien controlado se pueden tener perdidas significativas de enzimas por oclusión en el hielo. Este sistema se podría justificar para enzimas muy lábiles, pero no consigue competir económicamente con la evaporación.



La eliminación de agua por liofilización (congelación y sublimación a alto vacío) es una técnica muy usada en la preservación de sustancias activas lábiles, pero su apli-cación industrial es limitada por razones de costo.

La flotación (espumación) se basa en que las enzimas son sustancias tensioactivas y que, por lo tanto, tienden a acu-mular en la interfase gas-liquido que se produce al inflar aire ó un gas inerte a la solución enzimática. El principal obstá-culo a su aplicación es la inactivación que se produce por el fenómeno de espumación, que puede llegar a ser significativo.

Purificación de Enzimas

La producción masiva de enzimas se hace, por general, bajo el criterio de mínimo nivel de purificación compatible con la utilización que la enzima.

Esto significa que el proceso de purificación será, por general, muy rudimentario ó inexistente. Pero hay enzimas de uso industrial que requieren de un elevado grado de pureza (glucoamilasa o la renina microbiana).

Este criterio ha venido a cambiar debido al gran desarrollo de la tecnología de procesos de separación, pero también a la fuerte influencia de la pureza del catalizador en el costo de un proceso de catálisis heterogénea (enzimas inmovilizadas).


El costo de recuperación y purificación es muy significativo en el costo total del proceso, pudiendo mismo ser el factor más incidente. El costo es a su vez más significativo en el caso de las enzimas intracelulares, debido a la mayor complejidad del extracto celular.

A escala de laboratorio, la purificación se hace con una serie de etapas, donde los contaminantes van siendo subsecuentemente removidos, aumentando la actividad especifica de la enzima. Pero cada etapa significa, sin embargo, una perdida de actividad, lo que hace esta estrategia no ser muy adecuada a nivel industrial.


La purificación de enzimas se puede hacer con cualquier método de fraccionamiento proteico.

Ellos se basan en propiedades como sean la solubilidad (dependiente de la interacción entre sus aminoácidos y el solvente) y tamaño (peso molecular).

También pueden ser retenidas selectivamente en algún suporte (generalmente insoluble), operado en continuo o por lotes. Se basan en propiedades muy especificas de las enzimas, tales como estructura (cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico, hidrófoba) o funcionalidad biológica (cromatografía de afinidad).

AcabadoAcabado

Formulación del Preparado Final

Esta etapa tiene por objetivo dar forma al producto final y preservar la actividad enzimática durante el almacenamiento y comercialización

Las enzimas se comercializan en estado liquido ó sólido. Con enzimas de uso industrial, estas operaciones suelen ser más importantes que la purificación, incluyéndose la desalinización (diálisis, ultrafiltración, cromatografía), la esterilización (para evitar la presencia de microorganismos, y se hace por filtración en materiales fibrosos), la concentración/secado (evaporación a vacío ó ultrafiltración), la estabilización y el recubrimiento.

AcabadoAcabado


La etapa de secado se suele ocupar el secado por aspersión, pues produce un producto de alta calidad, sin embargo a un alto costo. Otros tipos de secadores empleados son los de bandeja, los de película y los rotativos a vacío.

Con el preparado en su forma final tornase necesario garantizar una vida útil razonable para su almacenamiento, distribución y consumo. Como regla, se espera obtener vidas útiles superiores a 1 año.

AcabadoAcabado


Para eso se adicionan preservantes, donde se distinguen los tiene por objetivo mantener la actividad enzimática o bien impedir el deterioro por microorganismos.

En el primer grupo se incluyen: sales (NaCl o (NH4)2SO4), proteínas inertes (ej. albúmina), otros polímeros (ej. polivinil alcohol, polietilenoglicol) y azucares y glicoles (ej. sacarosa, glicerol).

Este efecto está relacionado con la disminución de la actividad de el agua que estas sustancias provocan en el preparado.

NormalizaciónNormalización


En el producto final se debe al menos indicar su actividad específica (por unidad de peso ó volumen) y estabilidad de almacenamiento.

De forma a elaborar el producto con una actividad específica invariable, el preparado enzimático debe ser diluido con material inerte, muchas veces los propios preservantes.

La definición de actividad dada por el productor puede causar problemas al usuarios, especialmente cuando se emplean sustratos poco definidos. Por eso es deseable emplearse sustratos químicamente definidos.

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