DOCENTE LIC. IVAN PEÑAFIEL

TEMA:

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS:

FASES (FINALIDAD Y OBJETIVOS), LÍQUIDOS UTILIZADOS O SUSTITUTOS

(VENTAJAS Y DESVENTAJAS),

TIEMPOS DE CADA UNO (OPCIONES Y TEMPERATURAS)

ALUMNA

PAOLA VARGAS

SEGUNDO SEMESTRE A

RIOBAMBA

2013

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

1.- RECEPCIÓN DE LA MUESTRA

El manejo y procesamiento de las biopsias y piezas quirúrgicas comienza en la sala de operaciones o en la consulta médica; la enfermera tiene la responsabilidad de preguntar con anticipación al

cirujano si el material requiere examen urgente, cultivos, fotografía o cualquier examen especial.

La realización de biopsias transoperatorias o por congelación será programada por el Servicio de Cirugía y comunicadas a Patología en el parte diario.

En quirófanos o en la consulta, se dispondrá de recipientes de diferentes tamaños, plásticos con

tapa hermética y fijador (formol buferado al 10%); por lo general el residente que asiste al acto

quirúrgico es el responsable directo de hacer los pedidos o solicitud del examen histopatológico, el nombre y sello del solicitante es fundamental para

reclamos y aclaraciones futuras.

Es muy importante que el Servicio de Patología elabore un instructivo para la toma, manejo y

envío de las muestras, los recipientes, formularios, horario etc. y sea enviado a la persona

responsable de quirófanos para su estricto cumplimiento.

La descripción macroscópica estará a cargo del patólogo y del

residente de segundo año de post-grado bajo tutoría. Deben

utilizarse términos anatómicos, palabras y frases concretas y

precisas, de tal manera que quien lea pueda reconstruir

mentalmente los datos fundamentales.

2.- DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA

L A D E S C R IP C IÓ N M A C R O S C Ó P IC A D E B E S E R L O M Á S D E TA L L A D A P O S IB L E Y

C O N C R E TA E N E L U S O D E L O S T É R M IN O S .

S E ID E N T IFIC A R Á

lugar el origen del tejido,

las medidas en sus ejes

mayores, el peso,

una descripción de la superficie

externa indicando las características

visuales,

la consistencia al tacto, el color de la superficie

y

las estructuras anatómicas adheridas,

características de la neoplasia,

etc.

LUEGO SE DESCRIBIRÁ LA

SUPERFICIE DE CORTE INDICANDO

la uniformidad del tejido o la presencia

de cavidades,

áreas de hemorragia,

necrosis,

calcificaciones, tumores, etc.

Cuando una pieza es de características difíciles para una descripción clara, se debe

recurrir al uso de esquemas o dibujos sobre imágenes anatómicas normales.

TAMAÑO, MEDIDAS Y PESOS

Las medidas se toman en los ejes

mayores, en centímetros.

Entre varias muestras se

tomará el tamaño

referencial entre el mayor y el

menor.

El peso de todo el material se

toma en gramos.

FIJADOR

3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO

Una vez extraída la pieza quirúrgica o biopsia debe ser colocada en el fijador (formol buferado al 10%) cuando la pieza quirúrgica requiere de fotografías, esta debe preservarse en refrigeración a 4 grados C, para evitar de esta manera los cambios histológicos y no alterar los tejidos.

• Sin embargo se debe tomar una sección representativa y fijarla inmediatamente para evitar daños en el tejido especialmente para pruebas de inmunohistoquímica y patología molecular.

El recipiente con la muestra debe estar debidamente rotulado con el nombre del paciente, con letra legible, sitio de origen de la muestra y fecha.

LAS SOLUCIONES FIJADORAS

TIENEN POR OBJETO PRECIPITAR

las proteínas,

aumentar la consistencia de los tejidos,

inactivar las enzimas proteolíticas

inhibir el crecimiento bacteriano

y por lo tanto, preservar la constitución química y la morfología de los componentes

titulares.

SE PUEDEN CLASIFICAR EN LOS

SIGUIENTES MÉTODOS:

Por inmersión: pequeños trozos del tejido son

sumergidos en el líquido fijador.

Por perfusión: el líquido fijador se

aplica por inyección vascular.

Por vapores: consiste en utilizar líquidos

fijadores que emitan vapores, se debe

realizar bajo campana extractora

de gases.

La mayoría de las sustancias fijadoras son tóxicas por inhalación o por contacto, algunas de ellas cancerígenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilización.

ETANOL: CH3-CH2-OH

Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %.

Es un buen elemento para preservar moléculas, como

ciertas enzimas, propiedades antigénicas, glucógeno,

pigmentos y para las extensiones citológicas.

Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también

como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes

como el endurecimiento y la retracción de los tejidos. Carece

de efecto mordiente.

ÁCIDO ACÉTICO: CH3COOH

Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía

entre el 1 y el 5 %.

Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe

destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de membranas y citoplasma.

Se suele usar en combinación con otros fijadores

FORMALDEHÍDO: CH2=O.

Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares. Se utiliza a

concentraciones próximas al 4 %.

Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa

como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de

inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos.

GLUTARALDEHÍDO.

Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se usa a una proporción de entre el 0,5

y el 3 %.

Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular,

por lo que es el fijador de referencia para observación de ultra estructuras celulares con

el microscopio electrónico.

Pero hay que tener cuidado con su baja penetración tisular y puede producir retracciones.

MEZCLAS CON FORMALDEHÍDO:

El formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas

rutinarias como para otras como la inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos

nucleicos. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores.

Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una

osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que

contienen formaldehído y glutaraldehído.

La función del formaldehído es iniciar una fijación rápida, por su mayo capacidad de

penetración, mientras que el glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero

más lenta que afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehído ya ha realizado

una fijación previa. Glutaraldehído-tetróxido de osmio:Los

fijadores en combinación no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo.

Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente

fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para

posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada.

Este último es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo

membranas, en cooperación con los aldheídos. Esto es importante porque el

proceso para microscopía electrónica supone incubar el tejido en solventes orgánicos y

polimerización de resinas a 60 °C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.

DESHIDRATACIÓN

3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO

Luego de que la muestra ha sido fijada se debe eliminar el fijador y deshidratar. Para esto se utiliza una serie gradual de soluciones acuosas con una concentración de menor a mayor del agente deshidratante

se prefieren los alcohol es etílico e isopropìlico, El uso de los cuales no están en la lista de sustancias controladas.

Alcoholes graduados que vayan de la concentración más baja hasta la más El uso de procesadores automáticos perfeccionan el alta es de rutina. Procesamiento, utilizando calor, vacio, presión y agitación.

LA DESHIDRATACIÓN DE LOS

TEJIDOS TIENE DOS FINALIDADES

Un endurecimiento de las muestras

Extraer el agua del interior de las muestras para que la parafina ó las

resinas (epon), que no son miscibles con el agua, puedan penetrar

posteriormente en el proceso de inclusión

ACLARAMIENTO

3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO

Tiene que ser afines tanto con el agente deshidratante (alcohol) como con el agente

infiltrante (parafina)

El líquido comúnmente utilizado es el xilol. Esta

etapa se llama Aclaramiento debido a que el tejido se

vuelve transparente.

Posterior a la deshidratación el tejido se debe sumergir

en un líquido que sea miscible tanto en el medio

de inclusión como en el medio de deshidratación.

XYLENE

LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS

SON

Más utilizado

Se pone opaco (lechoso) cuando está contaminado

con agua

Reemplazar inmediatamente

Endurece el tejido

TOLUENO

Endurece menos el tejido Tolera más la presencia de

agua

Las procesadoras automáticas condensan agua en la tapa que

con los cambios de presión causan que le caiga agua al tejido durante los últimos pasos del procesamiento

BENCENO

LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS

SON

Rápida evaporación

Difícil de mantener

Tóxico, carcinógeno

CLOROFORMO

Lenta penetración al

tejido

Rápida evaporación

Difícil de mantener

LIMONENE (Sustituto de Xileno)

LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS

SON

Endurecen el tejido

Contaminan la parafina

Alergias Dificultad

respiratoria Dolor de cabeza

HIDROCARBONOS ALIFÁTICOS

Alkanes Nueva clase de agentes clarificanes

Cadenas cortas

Unas MARCAR mejores que

otras…

INFILTRACIÓN O INDUCCIÓN

3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO

Para poder obtener cortes delgados que puedan ser observados al microscopio óptico, los tejidos deben ser incluidos en una sustancia de consistencia firme, la cual puede ser hidrófila o hidrófoba.

Un medio hidrófobo que se puede utilizar es la parafina. Este último es una parafina altamente purificada a la cual se le han agregado cantidades variables de polímeros especiales, lo cual le dará distinta dureza y plasticidad al taco de inclusión.

PARAFINA

Mas común

Sustancia inerte

Derivado del petróleo Varían en su punto

(temperatura) de fusión [melting point]

IHQ usamos con bajo punto de fusión (55-

58ºC) protege antígenos buenas cintas

Demasiada infiltración causa achicamiento y

endurecimiento

L a in c lu s ió n c o n s i s t e e n imp r e g n a r l o s t e j i d o s e n u n a s u s t a n c i a l í q u id a , q u e p e n e t r e e n e l i n t e r io r d e l a mu e s t r a y

o c u p e lo s l u g a r e s d e l a g u a e x t r a íd a , y p o s t e r io r me n t e p a s e a u n e s t a d o s ó l id o

R a z o n e s d e p o r q u é h a y q u e d a r e s t e p a s o

E s t e p r o c e d im ie n t o s e r e a l i z a p a r a q u e l a s mu e s t r a s a d q u ie r a n u n a d u r e z a d e t e r mi n a d a y u n a e s t a b i l i d a d ho mo g é n e a y

a s í p o d e r o b t e n e r c o r t e s f i n o s y u n i f o r me s p a r a p o d e r lo s e s t u d ia r c o n e l mic r o s c o p io ó p t i c o o e l e c t r ó n ic o .

4.- INCLUSIÓN

Parafina.

Como medio de inclusión la parafina es la sustancia más

utilizada. Es una cera que tiene un punto de fusión entre 45º y

60º C y que solidifica a temperatura ambiente.

Permite secciones de 3 5 micras para estudio con microscopio

óptico

Plásticos (epon).

La inclusión en resinas acrílicas se basa en la polimerización de

una sustancia de bajo peso molecular y su transformación en un producto transparente y sólido de mayor dureza que la

parafina.

Debido a la dureza de los bloques así obtenidos es posible

realizar cortes de 50 Å con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electrónico.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE

INCLUSIÓN:

1. HIDRÓFOBOS O ANHIDROS:

• Se utilizan previa deshidratación de las muestras y pasajes por líquidos que sean miscibles con el deshidratante y con el medio de inclusión.

• Ejemplos:parafina,paraplast,resinas epoxi,resinas acrílicas,celoidina,paraplast-celoidina

2. HIDRÓFILOS O ACUOSOS:

• Se utilizan inmediatamente después del proceso de fijación y del lavado de las muestras en agua

• Ejemplos:carbowax,gelatina,agar

FACTORES QUE AFECTAN EL

PROCESO DE INCLUSIÓN:

El grosor de la muestra (ideal 1.5 a 5 mm de grosor para microscopía de luz)

La naturaleza del tejido Ej: tejidos densos como el cerebro, huesos, piel, requieren tiempos más largos que el riñón.

El fijador utilizado (si es coagulante o aditivo).

Los deshidratantes o líquidos intermediarios utilizados

El uso de vacío, a presión reducida, puede disminuir a la mitad el tiempo de impregnación en el medio de inclusión.

La temperatura, el calor aumenta el intercambio de líquidos, pero endurece los tejidos y provoca retracción

La viscosidad de los reactivos utilizados es directamente proporcional a los tiempos utilizados.

Se deben procesar los cortes suficientes de las lesiones más

representativas. La toma de los cortes se facilita cuando las piezas

han tenido un tiempo suficiente de fijación, para lo cual vale recordar lo siguiente:

5.- CORTE

1. El tamaño de la muestra y el volumen del

fijador.

2. El espesor de la muestra y la

penetración del fijador.

3. El contacto del fijador con la

superficie de la muestra.

4. El tipo de fijador y el tiempo de

fijación.

.

IDENTIFICACIÓN DE LOS CORTES

En cada cápsula o caseta porta tejidos deben colocarse los cortes tomados o “muestras”, identificados con una tira de papel.

Debe escribirse, con lápiz de grafito, el número de identificación correspondiente junto con las iniciales del paciente y a continuación, con letras y/o números, los diferentes cortes que se describen en el protocolo macroscópico como son: borde de resección, lados, niveles, regiones anatómicas, etc.

Con equipo especial se podrá imprimir en la caseta de plástico el número y las referencias en código de barras.

Los cortes que se van obteniendo se deben ir estirando, esto se puede realizar en un baño termoregulado (40-45 ºC). El estiramiento se basa en la dilatación de la parafina producto del calor

Luego estos cortes se van recogiendo con un portaobjetos.

6.- PESCA

7.- DESPARAFINIZACIÓN

Desparasitación de los cortes, la que se necesita desparafinar para que pueda ser

hidratado el corte de tejido, esta se realiza a través de distintos baños en xilol,

por un tiempo determinado.

7.- DESPARAFINIZACIÓN

Rutinariamente se utiliza la coloración clásica de hematoxilina eosina. El uso de coloraciones especiales depende de los datos clínicos y de los hallazgos y sospechas patológicas.

Para las biopsias de piel, riñón, hígado y médula ósea se utilizarán de rutina, además de H&E, las coloraciones de PAS y tricrómico de Masson, hierro, reticulina, mucicarmin, Giemsa, Pas alcian blue, fibras elásticas, rojo congo, plata (Jones) etc.

• En las biopsias pulmonares, además de las tinciones rutinarias H&E, fibras elásticas, tricrómico deben emplearse las tinciones para hierro y otros.

• Es indispensable contar con casos controles.

• A continuación describimos algunas técnicas para coloración de hematoxilina-eosina. Para tinciones especiales recomendamos revisar la bibliografía, particularmente en lo referente a tinciones histoquímicas para músculo y sistema nervioso.

Por el uso restringido del cloruro de mercurio, es preferible adquirir

hematoxilina en solución preparada y madurada sin la adición de

óxido rojo de mercurio, sin embargo cuando no sea posible conseguir

se describe a continuación la formula:

SOLUCIÓN DE COLORACIÓN

RUTINARIA DE H&E

9.- MONTAJE

Luego de teñir el tejido este debe ser deshidratado nuevamente, para esto hay que pasarlo por una serie de alcoholes en

grado ascendente.

Posteriormente hay que pasar el tejido por xilol, de modo de hacerlo miscible con el

medio de montaje. Finalmente se le agrega el medio de montaje y se le coloca el

cubreobjetos, teniendo cuidado en no dejar burbujas.