PRINCIPI GENETIKE 8

Euhromatin i heterohromatin. Struktura i funkcija hromozoma. Genetičke osnove deobe ćelija.

Ponašanje hromozoma u mitozi i mejozi.Vanjedarno nasleđivanje.

Organizacija genoma mitohondrija

Struktura nukleoida E. coli. a) u izolovanom nespiralizovanom stanju. b) hromozom podeljen u nekoliko petlji povezanih malim RNK molekulima. c) svaka petlja se dodatno superspiralizuje. d) tretman spiralizovanog genoma endonukleazom dovodi do relaksacije DNK samo u tretiranim petljama e) tretman RNA-zom raspliće samo delove povezane malim RNK molekulima.

NUCLEUS

Nivoi pakovanja nasledneinformacije u ćeliji

Šematska ilustracija strukture nukleozomskog čvorića

Svaki nukleozomski čvorićkoji se sastoji od histonskog oktamera je obmotan saDNK koju čini 146 baznih parova. Ovaj proteinski histonski oktamer čini po dva elementa histona H2A, H2B, H3 i H4. Svaki histon se sastoji od 102-135 amino kiselina. Svaki histonski oktamer vezan je za susedni – slobodnim delom vezujuće DNK.

Građa nukleozoma

Hromatin je kompleks DNK, proteina i malih količina RNK .

Hemijske analize izolovanog hromatina govore da se sastoji iz DNK i proteina uz male količine RNK. Proteini su grupisani u dve velike klase: histoni i nehistonski hromozomski proteini.

Histoni imaju glavnu ulogu u strukturiranju hromatina. Prisutni su u hromatinu svih viših eukariota u količinama ekvivalentnim količiniDNK (približno isti težinski odnos). Histoni obuhvataju 5 različitihproteina: H1, H2a, H2b, H3 i H4, prisutnih skoro u svim tipovimaeukariotskih ćelija uz malobrojne izuzetke (u spermatozoidima se umesto histona nalaze mali bazni proteini tzv. Protamini).

Histoni su bazni proteini, bogati aminokiselinama lizinom i argininom(sadrže 20-30% arginina i lizina). Pozitivno naelektrisani ostaci baznihaminokiselina histona mogu lako da interreaguju sa kiselim fosfatnimgrupama u DNK. Histoni kompleksuju sa DNK i formiraju posebnestrukture nukleozome. Svaki nukleozom sadrži po četiri molekulahistona H2a, H2b, H3 i H4 (oktamer histona) oko kojih se nalazi DNK

Građa nukleozoma.

Struktura hromozoma

Lokalni region hromozoma se može ponašati kao posebna strukturna jedinica zahvaljujući specijalnoj ulogzi koju imaju histoni H1u povezivanju nukleozomskih oktamera. Otpuštanjem histona H1, region se može naglo dekondenzovati po primanju informacije od strane nekog spoljašnjeg faktora. Smatra se da se dekondenzacija ovog tipa dešava pri procesu aktivacije gena.

Histoni pomažu pakovanju DNK u hromozome; kod čovekase nalazi skoro 2 m DNK u diploidnom jedru. Otuda se postavljapitanje kako je DNK upakovana u hromozome. Danas je izvesno dase u svakom hromozomu nalazi isključivo jedan linearni molekulDNK, koji se pruža od jednog kraja hromozoma preko centromeredo drugog kraja hromozoma. Najveći hromozom u humanomgenomu ima DNK dužine oko 85 mm (85000μm). Ovaj DNK molekul upakuje se u metafazni hromozom dijametra 0,5 μm i dužineoko 10 μm. To znači da se od “golog” molekula DNK do hromozoma ostvaruje kondenazcija od oko10000 puta.

Nasuprot histonima, nehistonski proteini obuhvataju frakcijusastavljenu iz velikog broja jako heterogenih proteina. Sastavnehistonskih proteina jako varira ne samo između različitih vrsta, veći između različitih ćelija unutar istog organizma. Među nehistonskimproteinima treba, pored ostalog, tražiti regulatore genske aktivnosti.

Građa nukleozoma.

Pojam heterohromatina i euhromatina

HETEROHROMATIN – više kondenzovan, tamno obojen

a) KONSTITUTIVNI – DEO KONSTITUCIJE

- centromerni i telomerni regioni

b) FAKULTATIVNI – inaktivirani X – hromozom, Barovo telo

EUHROMATIN – svetliji, manje kondenzovan, aktivan

NUCLEUS

Humani kariotip (2n = 46, XY) obojen tehnikomG-traka

konstutivniheterohromatin

euhromatin

Centromerniheterohromatin

X hromozom

Genetičke analize ukazuju da je heterohromatin uglavnom genetičkineaktivan. Većina do danas okarakterisanih eukariotskih gena locirana je u euhromatinskim regionima hromozoma. Štaviše, heterohromatin je, popravilu, bogat visoko repetitivnim, tandemski raspoređenim DNK sekvencama.

Molekularno biološke analize eukariotskoh hromatina pokazale su dapostoje tri osnovna tipa DNK sekvenci:

- visoko repetitivni nizovi (satelitska DNK) sastavljeni odvišestruko ponovljenih kratkih nizova nukleotida, najčešće različitog baznogsastava od ukupne DNK. Prisutni su u svim, ili skoro svim, hromozomima, a sama funkcija ovih nizova još uvek nije dovoljno pojašnjena.

- intermedijarna (srednje repetitivna) DNK obuhvata DNK sekvence sa znatno manjim brojem kopija u genomu - u poređenju savisokorepetitivnom DNK. Pored ostalog, u srednje ponovljene nizovespadaju geni za rRNK, geni za tRNK, za histone, α i β globine, tubuline, aktine itd.-

- unikalni nizovi (“jedinstvene” sekvence) pokazuju velikuraznovrsnost i obuhvataju najveći broj strukturnih gena. Geni se mogujaviti samo u jednoj kopiji (engl. “single copy”) ili u svega 2-3 kopije u genomu.

Tipovi DNK sekvenci otkriveni su pre svega zahvaljujući proučavanjukinetike renaturacije DNK. Naime, rastavljanje lanaca DNK ostvarenodejstvom visokih temperatura ili hemijskih agenasa označeno je kaodenaturacija DNK. Suprotan proces - ponovno uspostavljanje dvolančanogheliksa do kojeg dolazi po uklanjanju agenasa za denaturaciju, naziva se renaturacija DNK. Stepen renaturacije uveliko zavisi od koncentracijeDNK u rastvoru i kompeksnosti DNK sekvence. Stoga je procesrenaturacije kod visokorepetitivnih DNK najbrži i njaefikasniji, dok se renaturacija unikalnih nizova ostvaruje najsporije.

Konačno, treba istaći da eukariotski hromozomi poseduju posebnestrukture na svojim krajevima, tzv. telomere.

Već decenijama se zna da telomerni regioni imaju jedinstvenekarakteristike. Barbara McClintock je pokazala da se odstranjivanjemtelomera formiraju “lepljivi krajevi’ hromozoma koji imaju tendencijuda se međusobno spajaju. Nasuprot tome, prirodni krajevi normalnihhromozoma stabilni su i nemaju tendenciju ka međusobnom spajanju. Danas se zna da postoji specifičan enzim telomeraza (transferazatelomera), sposoban da dodaje telomere na krajeve hromozoma.

Funkcija samih telomera verovatno se sastoji u:- stabilizaciji hromozoma usled sprečavanja egzonukleaza da vrše

degradaciju linearnih DNK s kraja hromozoma- sprečavanju fuzionisanja krajeva hromozoma sa drugim

DNK molekulima- olakšavanju replikacije krajeva linearnih DNK.

Naime, da nema telomera krajevi hromozoma bi se posle svakog ciklusareplikacije malo skraćivali - zato što na samom kraju lanca sadiskontinuiranom replikacijom (“lagging strand”) ne bi postojalaDNK koja omogućuje sintezu RNK početnice sa slobodnim 3′-OH krajem.

A. K A R I O T I P, B. K A R I O G R A M, C. I D I O G R A M

A

B

C

Četkasti hromozomi u ovocitima vodozemaca posmatrani pod svetlosnim

ČČetkasti hromozomi u ovocitima vodozemaca etkasti hromozomi u ovocitima vodozemaca posmatrani pod svetlosnimposmatrani pod svetlosnim

PoliteniPoliteni hromozomihromozomi pljuvapljuvaččnihnih žžlezdalezda Drosophila Drosophila melanogastermelanogaster posmatraniposmatrani podpod svetlosnimsvetlosnim mikroskopommikroskopom

Kariogram psa 2n=78,XY

Kariogram mačke2n=38,XY

Kariogram svinje 2n=38,XY

Kariogram govečeta 2n=60,XX

Kariotip bika obojentehnikom G-traka,

2n = 60, XY.

Kariogram jarca2n=60,XY

Kariogram ovna2n=54,XY

Kariogram kobile2n=64,XX

Kariogram kokoši 2n=18,ZW

Kariogram radilice medonosne pčele2n=32,XX

Normalni kariotip svinje (2n=38, XX)

FUNKCIJA HROMOZOMA

Poređenje kariotipova dve srodne vrste jelena: A. Muntacus reevesi i B. Muntiacus muntiak .

(2n=46,XX/XY ) (2n=7,XY1Y2)

Ne postoji direktna korelacija između stepena filogentskog razvoja i broja hromozoma. Mada se kod srodnih vrsta može da javi sličan brojhromozoma, poznati su primeri da broj hromozoma znatno razlikujekod veoma srodnih vrsta. Poređenjem broja hromozoma dve veomasrodne vrste jelena, utvrđeno je da vrsta Muntiacus munitak iz Indijeima samo dva para autozoma i tri polna hromozoma, dok vrstaMuntiacus reevesi iz Kine ima 22 autozoma i dva polna hromozoma

Pojava blokova sa identičnim rasporedom gena u kariotipovimasrodnih vrsta naziva se sintenijom hromozoma. Poređenjem genomamiša i čoveka pronađeno je ne samo da ove dve vrste imaju veliki brojzajedničkih gena, već veliki blokovi u genomu miša i čoveka sadržeisti redosled gena. Sintenija hromozoma svedoči o preuređivanjima(rearanžmanima) blokova gena tokom evolucije genoma.

Hromozomi svojim ponašanjem tokom ćelijskog ciklusa omogućavajuispoljavanje genetičkog materijala potrebno za ostvarivanje fenotipaćelije, kao i ravnomernu raspodelu genetičkog materijala u ćerke ćelijepri ćelijskoj deobi

U periodu između dve ćelijske deobe (interfaza) hromozomi su u relativno dekondenzovanom stanju, tako da su omogućeni procesitranskripcije i translacije. Sintezom specifičnih proteina ostvaruje se karakterističan izgled i funkcionisanje ćelije. Pored toga, u interfazidolazi do replikacije DNK, što predstavlja jedan od osnovnihpreduslova da se ćelija kasnije podeli. Nakon replikacije svakihromozom ima dve sestrinske hromatide, a svaka od njih sadrži istimolekul DNK.

Za vreme deobe ćelije, hromozomi se prevode u maksimalnokondenzovan oblik pri čemu svaki hromozom sadrži dva identičnamolekula DNK u svojim sestrinskim hromatidama. Visok stepenkondenzacije DNK i proteina u metafaznim hromozomima neophodanje radi ravnomerne podele naslednog materijala. Velika količina DNK u eukariotskim genomima stvorila je potrebu za evolutivnimpostankom kompleksno građenih hromozoma i ćeljskog ciklusa.

Šematski prikaz ćelijskog ciklusa

Faze ćelijskog ciklusa tipične ćelije sisara

Šematski prikaz osnovnih faza

deobe životinjske ćelije

Šematski prikaz deobnog vretena kod životinjskih ćelija

b

a

c

1a) ćelijski zid; b) citoplazma; c) jedro;

Mitoza somatskihćelija korenčića crnog luka

1. INTERFAZA

2

Mitoza somatskihćelija korenčića crnog luka

2. PROFAZAd) hromatin

d

3

Mitoza somatskihćelija korenčića crnog luka

3. METAFAZA

e) hromozomi u ekvatorijalnoj ravni; f) vlakna deobnog vretena;

e

f

4

Mitoza somatskihćelija korenčića crnog luka

4. ANAFAZAg) interhromozomska vlakna deobnog vretena; h) homologi hromozomi u razdvajanju;

hg

5

Mitoza somatskihćelija korenčića crnog luka

5. TELOFAZAi) fragmoblast

i

1

Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke

1. INTERFAZAa) ćelijska membrana; b) citoplazma; c) jedro;

b a

c

2

Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke

2. PROFAZAd) hromatin

d

3

eMitoza somatskih ćelija embriona pastrmke

3. METAFAZA

e) hromozomi u ekvatorijalnoj ravni; f) aster;

e

f

4

Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke

4. ANAFAZAg) interhromozomska vlakna deobnog vretena; h) homologi hromozomi u razdvajanju;

h

g

5

Mitoza somatskih ćelija embriona pastrmke

5. TELOFAZA

i) konstrikciona brazda

i

Ploidnost ćelije tokom mejoze i mitoze kod diploidnevrste organizama

Šematski prikaz mejoze I.

Sinaptonemalni komplekselektromikrografija

Šematski prikazSinaptonemalnog kompleksa

Sinaptonemalni kompleks: a) elektronska mikrografija; b) šematski prikaz

a) b)

Pahiten

Diploten

Shematski prikaz spermatogeneze (levo) i ovogeneze (desno) kod sisara

Faze gametogeneze

Uporedni prikaz spermatogeneze i oogeneze

Uporedni prikaz

mejoze i mitoze

Poređenje mitoze i mejoze.

Vanjedarno (ekstranuklearno) nasleđivanje

Pod vanjedarnim (ekstranuklearnim) nasleđivanjem podrazumeva se ne-Mendelovski način distribucije fenotipskih osobina kod potomaka determinisanih genima u mitohondrijama ili plastidima. Izuzetno, neke bakterije i virusi, takođe, mogu predstavljati materijalnu osonvu vanjedarnih genetičkih elemeanta. Osnovni kriterijumi po kojima se može utvrditi da je reč o vanjedarnom nasleđivanju su:

-razlike u fenotipskim odnosima pri recipročnim ukrštanjima. Pri recipročnim ukrštanjima sparuju se ženke soja A sa mužjacima soja B, a zatim mužjaci soja A sa ženkama soja B. Pod uslovom da se isključi nasleđivanje vezano za polne hromozome (odnosno u slučaju autozomalnih gena), razlike u fenotipskim odnosima pri recipročnim ukrštanjima ukazuju da jedan roditelj (najčešće ženka) ima veći uticaj na ispoljavanje osobine od drugog roditelja (mužjaka).

-ženski gamet obično sadrži znatno više citoplazme od muškog gameta, te se može očekivati da utiče na odstupanje od Mendelovih pravila. Organele i simbionti u citoplazmi mogu da se izoluju i analiziraju i ukoliko se vanjedarna DNK dovede u vezu sa prenošenjem praćenih osobina, smatra se da je dokazano vanjedarno nasleđivanje.

- hromozomalni geni imaju svoje mesto na hromozomima u odnosu na ostale gene. Ukoliko se ne može ustanoviti vezanost sa nekim od hromozomalnih gena, osnovano se pretpostavlja da on pripada vanjedarnim genetičkim sistemima.

-odsustvo Mendelovskog načina segregacije gena i nepostojanje tipičnih Mendelovih odnosa pri pojedinim tipovima ukrštanja navodina sumnju da je reć o vanjedarnom nasleđivanju,

- ukoliko se nakon eksperimenta zamene jedara, osobine prenose nezavisno od jedarnih gena, postoje jake indicije da su praćene osobine determinisane vanjedarnim genima.

Evolutivni put nastanka mitohondrija

- Mitohondrijalna DNK (mtDNK) nalazi se u nekoliko kopija u matriksu mitohondrija gde je obično raspoređena u nekoliko grupacija (nukleoidi). Nukleoidi su pričvršćeni za unutrašnju membranu mitohondrija. Po svojoj strukturnoj organizaciji nukleotidi su znatno bliži bakterijskim DNK, a ne eukariotskom hromatinu. Kao i kod bakterija, u sastavu mitohondrijalnih nukleoida nema histona.

Veličina mtDNK slična je virusnim DNK i kreće se u rasponu od oko 6000 bp (Plasmodium falciparum, izazivač malarije kod čoveka) do preko 300 000 bp kod nekih kopnenih biljaka. Kao i kodbakterija, molekuli mtDNK su većinom cirkularni, mada su primećene linearne mtDNK. Kod sisara je mitohondrijalni genom predstavljencirkularnom DNK od oko 16 500 bp (manje od 0,001% od veličine jedarnog genoma). Približno ista veličina mtDNK kao kod sisara, konstatovana je kod nekih jako udaljenih vrsta kao što su Drosophila i morski ježevi.

Organizam Tkivo ili tip ćelija

DNK molekula

po organeliOrganela po

ćeliji

% mtDNK od ukupne ćelijske DNK

Pacov Jetra 5-10 1000 1

Kvasac*Vegetativna

ćel.2-50 1-50 15

Žaba Jajna ćelija 5-10 107 99

Relativna količina mtDNK u nekim tipovima eukariotskih ćelija

U ćelijama sisara mtDNK zauzima manje od 1% ukupne ćelijske DNK (Tabela 1). Međutim, u jajniim ćelijama vodozemaca, gde su potrebne velike rezverve mitohondrija za ranu embirogenezu, mtDNK zauzimačak 99% ukupne ćelijske DNK .

Zahvaljujući relativno maloj veličini humane mtDNK, celokupna sekvenca od 16 569 nukleotidnih parova određena je još 1981. godine. Primećene su neke neobične karakteristike humane mtDNK kojih nema ne samo u jedarnom genomu, već isto tako ni kod DNK bakterija i hloroplasta.

Za razliku od ostalih genoma, u humanoj mtDNK skoro svaki nukleotid jedeo kodirajućih sekvenci (za protein ili za rRNK), tako da je količlina regulatornih DNK sekvenci svedena na minimum. Pored toga, postoje svega 22 tRNK koje učestvuju u sintezi proteina u humanim mihohondrijama (u hloroplastima ima bar 30 različitih tRNK). Stoga su normalna pravila sparivanja kodon-antikodon u mitohondrijama fleksibilna. Naime, veći broj tRNK prepoznaje samo prva dva kodona, dok na trećem kodonu postoji “kolebljivost”. Na taj način, sinteza proteina moguća je sa manjim brojem tRNK nego u drugim genomima.

Opšta organizacija humane mitohondrjalne DNK

- Konačno, možda najmarkantnija razlika, je da 4 od ukupno 64 kodona u sastavu humane mtDNK imaju drugačije značenje (odstupanje od univerzalnosti genetičkog koda)

Mitohondrijalni kodovi*

Kodon “Univerzalni” kod sisari

beskičmenjaci kvasci biljke

UGA STOP Trp Trp Trp STOP

AUA Ile Met Met Met Ile

CUA Leu Leu Leu Thr Leu

AGA ili AGG

Arg STOP Ser Arg Arg

* kodovi koji odstupaju od univerzalnosti predstavljeni belom bojom

Univerzalnost genetičkog koda predstavlja jedan od osnovnih dokaza da svi organizmi potiču od istih predaka (monofiletsko poreklo života na Zemlji). Smatra se da usled neobično malog broja proteina kodiranih mtDNK, mogu da se tolerišu povremene promene u značenjima kodona, dok bi takva promena u velikom genomu ugrozila funkciju mnogih proteina i doprinela uništavanju ćelije.

Ovu pretpostavku podržavaju nalazi da odstupanja od univerzalnosti genetičkog koda nisu ista u različitim gupama organizama.

Interesanto je da se u mtDNK zamena nukleotida tokom evolucije javlja oko 10 puta brže u poređenju sa jedarnom DNK. Uzrok ove pojave može se tražiti u smanjenoj vernosti replikacije i/ili nedovoljno efikasnoj reparaciji mtDNK. Relativno velika brzina evolucije mitohondrijalne DNK omogućava da se poređenjem nukleotidnih sekvenci mtDNK kod bliskih vrsta odrede njihovi filogenetski odnosi.

MATERINSKIO NASLEĐIVANJE

Pri materinskom nasleđivanju fenotip potomaka određen je jedarnim genima prisutnim u jajnoj ćeliji. Prema tome, za razliku od biparentalnog nasleđivanja u kome su fenotipske osobine potomaka određene jedarnim genima oba roditelja, pri materinskom nasleđivanju dolazi do prepisivanja (transkripcija) nasledne informacije ženskog gameta i akumulacije genskog produkta (iRNK ili protein) u jajnoj ćeliji. Nakon oplođenja, akumulirani genski produkti tokom ranog razvića utiču na ispoljavanje fenotipskih osobina kod potomaka.

Materinsko nasleđivanje može da se identifikuje na osnovu različitih fenotipskih odnosa kod potomaka iz recipročnih ukrštanja .

Opisani su primeri trajne promene fenotipa pod uticajem gena majke, kao što je oblik uvijanja ljušture kod puža Limnaea peregra.

Jedinke genotipa dd imaju sinistralne (uvijene na levo) ljušture, dok se kod ostalih (genotipovi DD i Dd) javljaju dekstralne (na desno uvijene) ljušture. S obzirom da su ovi puževi hermafroditi mogu se izvršiti različiti oblici ukrštanja i samooplođenja.

Pri recipročnim ukrštanjima rezultat zavisi od genotipa ženskog roditelja. Ženke genotipa DD ili Dd produkuju isključivo potomke sa dekstralnom ljušturom, dok su potomci dd ženki uvek sa sinistralnom ljušturom. Interesantno je da oblik ljušture zavisi samo od genotipa ženke, nezavisno od njenog fenotipa.

Istraživanja ranog razvića Limnaea pokazala su da orijentacija deobnog vretena u prvoj deobi nakon oplođenja odrećuje pravac uvrtanja ljušture. Orijentacija deobnog vretena zavisna od dejstva materinskih gena koji se ispoljavaju još tokom ovogeneze. Ustanovljeno je da DD ili Dd ženke imaju funkcionalan genski produkt D alela koji se akumulira u citoplazmi jajne ćelije. Čak i u slučaju kada ovocit kod ovih ženki nakon mejoze sadrži genski alel d i oplodi se spermatozoidom sa genskim alelom d, potomci su genotipa dd ali će ipak imati dekstralne ljušture.

Nasleđivanje oblika ljušture kod Limnaea peregra